專利名稱：制造有機酸銨溶液的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及制造有機酸銨溶液例如琥珀酸銨溶液的方法。更具體地，本發(fā)明涉及制造有機酸銨溶液的方法，該方法適合于由諸如葡萄糖(glucose)、右旋糖(dextrose)和纖維素等生物來源的原料通過微生物轉化來制造有機酸。
背景技術：
有機酸包括富馬酸、馬來酸、蘋果酸和琥珀酸等。其中，琥珀酸及其衍生物廣泛用作諸如生物可降解聚脂和聚酰胺等聚合物的原料或食品、藥品或化妝品等的原料。
目前，諸如琥珀酸等有機酸可以通過馬來酸的氫化作用而進行工業(yè)制造，所述馬來酸是來自于石油的原料。最近有了利用發(fā)酵操作的方法由來自于植物的原料制造有機酸的研究。
在通過發(fā)酵所進行的有機酸制造中，培養(yǎng)基的pH隨著有機酸的生成而降低。然而，由于發(fā)酵中所使用的微生物通常在低pH條件下不能顯示出足夠的活性，因此必須對發(fā)酵溶液進行中和。常用的中和劑的例子包括氫氧化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、氨、碳酸銨、碳酸氫銨、尿素、氫氧化鈣、碳酸鈣、氫氧化鎂和碳酸鎂。然而，當使用這樣的中和劑時，從發(fā)酵罐中得到的有機酸是與堿形成的鹽的形式，因此不能使用作為常規(guī)分離/純化技術的蒸餾操作。
鑒于上述情況，提出了從由發(fā)酵形成的有機酸鹽來分離/純化有機酸的方法，例如利用電滲析的方法(專利文獻1)；利用離子交換樹脂的方法(專利文獻2)；利用硫酸分解琥珀酸鈣的法，所述琥珀酸鈣以氫氧化鈣進行中和的同時通過發(fā)酵來制造(專利文獻3)；用硫酸通過鹽交換反應而進行反應結晶的方法(專利文獻4或5)；以及反應提取法(專利文獻6)。
在發(fā)酵中，特別優(yōu)選的中和劑受到微生物性質的限制。同時，上述每種純化方法不一定可以采用任意的中和劑，或者不一定可以采用限定的中和劑。因此，發(fā)酵中所選擇的中和劑與純化中所限定的中和劑相互之間必須完全一致。
在利用電滲析的方法中，中和劑必須是單價陽離子。雙價陽離子會在電滲析膜中作為石膏沉淀，并顯著降低了膜的性能。因此，優(yōu)選氨、鈉和鉀作為中和劑。
在利用離子交換樹脂的方法中，形成了副產物鹽，并且應選擇供應穩(wěn)定且市場價格低的中和劑。因此，氨和鈉是優(yōu)選的中和劑，而鉀和鈣、以及鎂依次次之。然而，由于副產物鹽的形成會需要處理成本，因此利用離子交換樹脂的方法不是非常優(yōu)選的方法。
在用胺進行的反應提取法中，中和劑仍作為碳酸鹽而殘留在水相中。因而，如果在水中的溶解度過低，作為中和劑的碳酸鹽會沉淀，從而不能在高壓提取塔中進行操作。因此，優(yōu)選氨、鈉和鉀作為中和劑。
在用硫酸進行的利用酸沉淀的方法中，硫酸鹽會作為副產物而形成(石膏法專利文獻3)。因此，如同在利用離子交換樹脂的方法中那樣，應選擇供應穩(wěn)定且市場價格低的中和劑。而且，副產物鹽的形成會需要處理成本，因此利用酸沉淀的方法不是非常優(yōu)選的方法。
作為所述問題的解決方案，專利文獻4和5提出了包括以下步驟的方法在等于或高于300℃使硫酸銨熱分解，以硫酸氫銨形式重復利用硫酸，并利用氨作為中和劑。這些文獻提出了將鈉中和轉換成氨中和的方法。
也就是說，當用氨作為中和劑時，硫酸銨具有防止副產物鹽的形成的優(yōu)點。即使在使用離子交換樹脂的方法中通過使用硫酸氫銨來回收樹脂也獲得同樣的結果。
如上所述，氨中和可以應用于大多數不同的純化方法。當采用專利文獻4和5中所述的方法時，氨是具有防止副產物鹽形成的優(yōu)點的中和劑。
通過專利文獻4和5中所述的方法可以將鈉轉換成氨，并且還可以根據各自環(huán)境而直接用于各種不同的純化方法。
也就是說，如果發(fā)酵溶液中含有銨鹽/鈉鹽，可以選擇最適合于世界范圍內的各種經濟環(huán)境和氣候環(huán)境的純化方法。
同時，如專利文獻3中所述，鈣是相對經濟和合理的中和劑。
如上所述，鎂雖然是微生物反應必需的金屬離子，但是僅允許用于非常有限的純化，因此作為中和劑少有評價。
JP-A-02-283289[專利文獻2]US 6,284,904[專利文獻3]JP-A-03-030685[專利文獻4]JP-A-2001-514900[專利文獻5]US 5,958,744[專利文獻6]WO 98/0141
發(fā)明內容本發(fā)明的一個目的是提供有效地制造有機酸銨溶液的方法。
鑒于上述情況，本發(fā)明的發(fā)明人經過深入研究，考慮到通過將有機酸鎂鹽轉換成有機酸銨鹽，可以選擇在各種經濟環(huán)境下最適合的純化有機酸的方法。結果本發(fā)明人發(fā)現，通過在添加有鎂化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物并利用銨化合物對所產生的有機酸鎂鹽進行鹽交換，可以有效地制造有機酸銨溶液。
本發(fā)明的發(fā)明人經過進一步研究，發(fā)現通過對作為副產物形成的碳酸鎂/碳酸銨復鹽進行加熱，可以獲得基本不含有氨的碳酸鎂，據此通過重復利用鎂化合物可以制造有機酸銨鹽，而且沒有產生廢棄物。
如上所述，本發(fā)明的發(fā)明人完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明如下所示。
(1)一種制造有機酸銨溶液的方法，該方法包括發(fā)酵步驟，該步驟通過在鎂化合物存在時利用具有制造有機酸能力的微生物，獲得含有有機酸鎂的發(fā)酵液；鹽交換步驟，該步驟通過利用銨化合物，使包含在所述發(fā)酵液中的有機酸鎂生成有機酸銨和鎂化合物；以及鎂分離步驟，該步驟分離所制得的鎂化合物，以獲得有機酸銨溶液。
(2)如(1)所述的制造有機酸銨溶液的方法，其中將在所述鎂分離步驟中所分離的鎂化合物作為所述發(fā)酵步驟中的鎂化合物而重復利用。
(3)如(1)或(2)所述的制造有機酸銨溶液的方法，其中所述鎂化合物是碳酸鎂且所述銨化合物是碳酸銨。
(4)如(1)～(3)任一項所述的制造有機酸銨溶液的方法，其中在所述鹽交換步驟中，使用通過將二氧化碳和氨提供至發(fā)酵液中而產生的碳酸銨作為銨化合物。
(5)如(4)所述的制造有機酸銨溶液的方法，其中所提供的二氧化碳的摩爾量為發(fā)酵液中的鎂的摩爾量的0.3～10倍。
(6)如(4)所述的制造有機酸銨溶液的方法，該方法進一步包括以下步驟對所述鎂分離步驟中獲得的有機酸銨溶液進行加熱以使存在于該溶液中的過量二氧化碳和氨蒸發(fā)和分離，并在所述鹽交換步驟中重復利用所分離的二氧化碳和氨。
(7)如(1)所述的制造有機酸銨溶液的方法，該方法進一步包括以下步驟對所述鎂分離步驟中分離的碳酸鎂進行加熱以使其分解為氧化鎂和二氧化碳，通過向氧化鎂中加水而產生氫氧化鎂，并在所述發(fā)酵步驟中重復利用該氫氧化鎂作為鎂化合物。
(8)如(1)所述的制造有機酸銨溶液的方法，其中所述鎂化合物是氫氧化鎂或氫氧化鎂和碳酸鎂的混合物，而氨用于所述鹽交換步驟中。
(9)如(8)所述的制造有機酸銨溶液的方法，該方法進一步包括以下步驟向所述鎂分離步驟中獲得的有機酸銨溶液中加入碳酸銨以進一步產生有機酸銨和碳酸鎂，并通過分離所述碳酸鎂而獲得有機酸銨溶液。
(10)如(1)～(9)任一項所述的制造有機酸銨溶液的方法，其中所述鹽交換步驟在pH為7～12的范圍進行。
(11)如(1)～(10)任一項所述的制造有機酸銨溶液的方法，其中所述有機酸是琥珀酸且所述有機酸銨是琥珀酸銨。
(12)如(1)所述的制造有機酸銨溶液的方法，該方法進一步包括以下步驟對通過所述鎂分離步驟分離到的鎂化合物中所包含的碳酸鎂和碳酸銨的復鹽進行加熱或干燥以從所述復鹽中除去碳酸銨和獲得碳酸鎂，并在所述發(fā)酵步驟中重復利用該碳酸鎂。
(13)如(12)所述的制造有機酸銨溶液的方法，其中除去碳酸銨以使所述復鹽中的氨的摩爾含量變?yōu)殒V的摩爾含量的1/10或1/10以下。
(14)如(12)所述的制造有機酸銨溶液的方法，其中除去碳酸銨以使所述復鹽中的氨的摩爾含量變?yōu)殒V的摩爾含量的1/30或1/30以下。
(15)如(12)所述的制造有機酸銨溶液的方法，其中在不低于160℃的溫度對所述復鹽進行加熱。


圖1顯示質粒pKMB1的構建程序和限制性酶切圖譜。
圖2顯示質粒pKMB1/ΔLDH的構建程序。
圖3顯示質粒pTZ4的構建程序。
圖4顯示質粒pMJPC1的構建程序。
圖5顯示質粒pFRPC1.1的構建程序。
具體實施例方式
下文將對本發(fā)明進行詳細描述。
本發(fā)明涉及制造有機酸銨溶液的方法，該方法包括發(fā)酵步驟，該步驟通過在鎂化合物存在時利用具有制造有機酸能力的微生物，獲得含有有機酸鎂的發(fā)酵液；鹽交換步驟，該步驟通過利用銨化合物，使包含在所述發(fā)酵液中的有機酸鎂生成有機酸銨和鎂化合物；以及鎂分離步驟，該步驟分離所制得的鎂化合物，以獲得有機酸銨溶液。
對所述有機酸銨的種類沒用特別限制，只要該有機酸銨是利用微生物通過發(fā)酵而制得的有機酸的銨鹽即可，但是優(yōu)選為二羧酸或三羧酸的銨鹽。二羧酸的例子包括琥珀酸、富馬酸、馬來酸、蘋果酸、酒石酸、天冬氨酸、戊二酸、谷氨酸、己二酸、辛二酸、衣康酸和對苯二酸。三羧酸的例子包括檸檬酸。
在本發(fā)明中，“有機酸銨”一詞包括有機酸單銨和有機酸多元銨。
在發(fā)酵步驟中，通過在鎂化合物存在時利用具有制造有機酸能力的微生物，獲得包含有機酸鎂的發(fā)酵液。
所用的微生物是“具有制造有機酸能力的微生物”?！熬哂兄圃煊袡C酸能力的微生物”一詞是指當該微生物培養(yǎng)在含有下述碳源的培養(yǎng)基中時，具有在所述培養(yǎng)基中制造和積累有機酸的能力的微生物。所述微生物的例子包括諸如厭氧螺菌(Anaerobiospirillum)屬細菌(US 5,143,833)、放線桿菌(Actinobacillus)屬細菌(美國專利5,504,004)和埃希氏菌(Escherichia)屬細菌(美國專利No.5,770,435的說明書)等兼性厭氧菌，以及諸如屬于短桿菌屬(Brevibacterium)、棒桿菌屬(Corynebacterium)或節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)等的棒狀細菌(JP-A-11-113588)等好氧菌。更優(yōu)選分類到谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、產氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)或乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)中的微生物。
具有制造琥珀酸能力的棒狀細菌的具體例子包括乳酸脫氫酶活性降低了的黃色短桿菌MJ233Δldh菌株(JP-A-11-206385)、丙酮酸羧化酶活性或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性提高了的黃色短桿菌MJ233/pPCPYC菌株(WO 01/27258)、黃色短桿菌MJ-233(FERM BP-1497)、黃色短桿菌MJ-233AB-41(FERM BP-1498)、產氨短桿菌ATCC6872、谷氨酸棒桿菌ATCC31831和乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869。
黃色短桿菌MJ-233于1975年4月28日保藏在通商產業(yè)省工業(yè)技術院微生物工業(yè)技術研究所(即現在的獨立性政法人產業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心)(日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6號)，其登錄號為FERM P-3068，隨后于1981年5月1日按照布達佩斯條約轉為國際保藏，所給予的登錄號為FERM BP-1497。產氨短桿菌ATCC6872等可以由American Type Culture Collection(12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，美國)分讓。
發(fā)酵步驟中所用的微生物可以是經過改進而使其制造有機酸的能力得以增強了的微生物。經過改進而具有增強了的制造琥珀酸的能力的微生物的例子包括丙酮酸羧化酶基因的表達增強了的微生物(JP-A-11-196888)和乳酸脫氫酶基因被破壞了的微生物(JP-A-11-206385)。另外，也可以使用如下述參考例中所述的富馬酸還原酶基因的表達增強了的微生物。
本發(fā)明中所用的具有制造有機酸的能力的微生物并不限于上述的那些微生物。在本發(fā)明中，也可以使用其它的制造琥珀酸的微生物，還可以使用可由常規(guī)方法獲得的制造蘋果酸的微生物、制造富馬酸的微生物、制造檸檬酸的微生物和制造異檸檬酸的微生物等。
本發(fā)明中所用的具有制造有機酸的能力的微生物可以具有制造兩種或兩種以上類型的有機酸的能力。
培養(yǎng)所述微生物所使用的液體培養(yǎng)基是含有碳源的培養(yǎng)基。對所述碳源沒有限制，只要該碳源可以被微生物所同化即可。所述碳源的例子包括諸如半乳糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、果糖、甘油、蔗糖、蔗精(saccharose)、淀粉以及纖維素等碳水化合物；諸如包括丙三醇、甘露醇、木糖醇、核糖醇等在內的聚醇等可發(fā)酵糖類。其中，可以優(yōu)選使用葡萄糖、果糖或甘油，特別優(yōu)選使用葡萄糖。另外，可以優(yōu)選使用紙的主要組分纖維素作為廣義上來自于植物的原料。另外，也可以使用各自含有上述可發(fā)酵的糖類的糖化淀粉液或糖蜜等。所述碳源可以單獨使用，也可以以兩種或兩種以上的所述碳源組合使用。
對所用的碳源濃度沒有特別的限制，但是如果有機酸的制造沒有受到限制，盡可能地提高碳源濃度是有利的。所使用的碳源的濃度范圍通常為5％～30％(w/v(重量/體積))，優(yōu)選為10％～20％(w/v)。隨著反應的進行，可以根據碳源的下降而補加碳源。
除了碳源之外，液體培養(yǎng)基優(yōu)選含有氮源、無機鹽等。對氮源沒有特別的限制，只要其能夠被本發(fā)明微生物所同化來制造有機酸即可。氮源的具體例子包括各種有機氮化合物和無機氮化合物，例如銨鹽、硝酸鹽、尿素、大豆水解產物、酪蛋白水解物、蛋白胨、酵母提取物、肉提取物和谷物浸液。也可以使用磷酸鹽、硫酸鹽、諸如鎂鹽、鉀鹽、錳鹽、鐵鹽和鋅鹽等金屬鹽作為無機鹽。另外，為了促進微生物的生長，如果需要也可以添加諸如維生素(例如生物素、泛酸、肌醇和煙酸等)、核苷酸和氨基酸等因子。而且，優(yōu)選預先在反應水溶液中添加適量市售的消泡劑，以在反應過程中抑制泡沫的形成。
為了在所述液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述的微生物，可以直接使用通過在諸如瓊脂培養(yǎng)基等固體培養(yǎng)基上斜面培養(yǎng)獲得的微生物，或者優(yōu)選使用預先在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(接種培養(yǎng))上述微生物而獲得的細菌細胞。在這種情況中，對反應中使用的細菌細胞的量沒有特別的限制，但是通常為1g/L～700g/L，優(yōu)選為10g/L～500g/L，更優(yōu)選為20g/L～400g/L。
隨著發(fā)酵發(fā)應的進行，會制造出有機酸，并且培養(yǎng)液的pH會下降。因此，向該培養(yǎng)液中添加中和劑。所用的中和劑通常為堿上金屬化合物，優(yōu)選為鎂化合物。鎂化合物由于其促進琥珀酸的制造并且具有窄的pH波動范圍，因此是優(yōu)選的。用作中和劑的鎂化合物優(yōu)選在水溶液中解離成堿性物質，其例子包括氫氧化鎂(Mg(OH)2)、碳酸鎂(MgCO3)和碳酸氫鎂(Mg(HCO3)2)。其中，從pH調節(jié)的容易程度來看，特別優(yōu)選氫氧化鎂?？梢允褂脙煞N或兩種以上的鎂化合物。
對添加鎂化合物的方式并沒有特別的限制，只要使培養(yǎng)液經控制具有適當的pH即可。例如，鎂化合物可以作為粉末添加。鎂化合物可以在培養(yǎng)開始時添加到培養(yǎng)基中，也可以在培養(yǎng)過程中添加?；蛘?，鎂化合物可以在培養(yǎng)開始時添加到培養(yǎng)基中，并且可以根據需要在培養(yǎng)過程中進一步添加。根據所用的微生物的種類，利用鎂化合物將培養(yǎng)基的pH值調節(jié)到微生物表現出最有效地制造有機酸的能力的范圍內。通常將pH值調節(jié)到4～10，優(yōu)選為約6～9。
發(fā)酵步驟中的諸如溫度和壓力等培養(yǎng)條件因所用的微生物而異?？梢愿鶕恳环N具體情況選擇適合獲得有機酸的條件。例如培養(yǎng)溫度通常為25℃～40℃，優(yōu)選為30℃～37℃。反應時間優(yōu)選為1小時～168小時，更優(yōu)選為3小時～72小時。
培養(yǎng)結束后，發(fā)酵液含有由微生物制造的有機酸，并含有中和劑中的鎂所形成的有機酸鎂，該有機酸鎂可以解離成有機酸離子和鎂離子。優(yōu)選通過離心等去除細菌細胞等后，將發(fā)酵溶液用于鹽交換步驟。分離出細菌細胞后的發(fā)酵溶液可以在進一步經過純化操作后用于鹽交換步驟。另外，發(fā)酵液可以在經過濃縮操作后用于鹽交換步驟。濃縮操作可以采用常規(guī)方法進行，并且例如可以使用鍋形再沸器或蒸發(fā)器。多效蒸發(fā)器可以用于大規(guī)模生產，其中能量消耗是重要的。
鹽交換步驟是通過采用氨化合物對發(fā)酵液中的有機酸鎂進行鹽交換來制造有機酸銨并同時生成、沉淀諸如碳酸鎂、碳酸鎂的復鹽或氫氧化鎂等鎂化合物的步驟。在該步驟中所制造的有機酸銨可以解離成有機酸離子和銨離子。
氨化合物的例子包括氨和碳酸銨。氨和碳酸銨都可以添加。用于鹽交換步驟的設備可以是通常所使用的諸如攪拌罐、通流管、結晶奧斯陸(crystal oslo)型結晶罐或雙推進器。對所述設備的形狀、方法和結晶階段的數量沒有特別的限制，只要該設備能夠通過固液平衡現象獲得結晶即可。
下文對琥珀酸鎂的鹽交換進行解釋。其它有機酸鎂的鹽交換也按如下所述的相同方式進行。另外，反應條件可以在本領域技術人員的知識范圍內進行適當的改變。
首先解釋通過采用碳酸銨的鹽交換。采用碳酸銨的鹽交換可以通過添加碳酸銨(如以下反應式(I)所示)或通過添加氨和二氧化碳(如以下反應式(II)所示)進行。
(I)(II)當添加碳酸銨時，以摩爾計碳酸銨的添加量為提供至反應罐的發(fā)酵液中的鎂的量的0.3～10倍，優(yōu)選為0.5～5倍，更優(yōu)選為1～4倍。本文所用的短語“發(fā)酵液中的鎂”是指鎂的總量，其包括發(fā)酵液中的琥珀酸鎂和鎂化合物以及鎂離子的總量。當添加氨和二氧化碳時，以摩爾計提供至反應罐的二氧化碳的量為提供至反應罐的發(fā)酵液中的鎂的量的0.3～10倍，優(yōu)選為0.5～5倍，更優(yōu)選為1～4倍。優(yōu)選氨的添加量使得pH處于二氧化碳保持預定溶解度的范圍，即pH為7～12，更優(yōu)選為7.5～11，尤其優(yōu)選為8～10的堿性pH。鹽交換反應所需要的時間因琥珀酸鎂反應溶液的體積而異，并沒有特別的限制，但是優(yōu)選為0.1～4小時。在攪拌下，鹽交換在pH范圍優(yōu)選為7～12、更優(yōu)選在7.5～11、尤其優(yōu)選在8～10的條件下進行。
在采用碳酸銨的鹽交換中(反應式(I)或(II))，鎂的回收率等于或大于90％，琥珀酸的收率基本等于這一數值。因此，可以利用含有琥珀酸鎂的溶液有效地制造琥珀酸銨、并回收鎂。
接著，對采用氨的鹽交換進行解釋。在此種情況中，按如下反應式(III)所示的方式生成琥珀酸銨和氫氧化鎂。
(III)氨的添加量優(yōu)選為發(fā)酵液中鎂的量的2～15倍。鹽交換所需要的時間因含有琥珀酸鎂的發(fā)酵液的體積而異而且并沒有特別的限制，但是優(yōu)選為0.1小時～4小時。鹽交換在pH范圍優(yōu)選為7～12、更優(yōu)選為7.5～11、尤其優(yōu)選為8～10的條件下進行。在采用氨的鹽交換中，產生了氫氧化鎂。因此，添加到發(fā)酵液中的鎂化合物優(yōu)選為氫氧化鎂，或者氫氧化鎂和碳酸鎂的混合物。
在采用氨的鹽交換中(反應式(III))，溶解在琥珀酸銨水溶液的鎂的濃度為約0.5重量％。為了提高回收率，必須減少作為溶劑的水的體積，但是水溶液不能濃縮到超出琥珀酸銨的溶解度。為了獲得具有低濃度鎂的琥珀酸銨水溶液，可進一步向由反應式(III)表示的鹽交換后獲得的濾液中添加碳酸銨，然后進行由反應式(I)或(II)表示的鹽交換，以生成并沉淀碳酸鎂，接著除去該碳酸鎂。據此可以將溶液中的鎂的濃度降低到約0.01重量％。
鎂分離步驟是對諸如所制得的碳酸鎂、碳酸鎂的復鹽或氫氧化鎂等鎂化合物進行分離，并獲得有機酸銨溶液的步驟。所述鎂化合物幾乎不溶于水，因此可以通過諸如過濾等常規(guī)方法除去。為了完全過濾鎂化合物，可以采用加壓過濾、減壓過濾或離心過濾等。或者，可以將鎂化合物離心為上清液和高度濃縮的漿料，所得上清液和漿料均通過泵進行轉移。按上述方法去除鎂化合物，據此獲得有機酸銨水溶液。
所去除的鎂化合物也可以作為發(fā)酵罐中的中和劑而重復利用。也就是說，在鎂分離步驟中獲得的鎂化合物優(yōu)選經濟地作為發(fā)酵步驟中的鎂化合物而重復利用。在此種情況中，通常進行加熱滅菌，以防止細菌的污染。具體地，當將鎂化合物作為高濃度漿料進行轉移時，可以采用諸如多管式熱交換器或平板式熱交換器等常規(guī)熱交換器進行滅菌。在加熱滅菌后，可以進行過濾，或者將經過加熱滅菌的鎂化合物直接提供到發(fā)酵罐中。即使在所述鎂化合物的完全過濾之后，也可以應用蒸汽對鎂化合物進行滅菌。
碳酸鎂可以通過二氧化碳和氫氧化鎂形式而重復利用。也就是說，首先，通過熱將碳酸鎂分解為二氧化碳和氧化鎂。所得二氧化碳可以重復利用到由反應式(II)表示的鹽交換反應中。同時，氧化鎂可以通過與水反應而轉變成氫氧化鎂并作為基于鎂的中和劑而重復利用到第一步驟中。
如JP-B-01-133919或reveu de Chimie minerale t22，1985，第692-698頁所述，已知碳酸鎂在存在高濃度的二氧化碳的條件下形成復鹽。因此，當將碳酸銨用作銨化合物時，鹽交換步驟中產生的一部分鎂化合物作為碳酸鎂和碳酸銨的復鹽存在。在該步驟中，優(yōu)選回收含有盡可能少的鎂的琥珀酸銨。然而，二氧化碳量的下降確實提高了鎂基于溶度積常數的溶解量。因此，復鹽的形成是不可避免的。同時，鎂很難以復鹽的形式直接回收。因此，對含有該復鹽的漿料進行分離，然后加熱或干燥，由此從復鹽中除去碳酸銨，并獲得碳酸鎂。然后，優(yōu)選將所述碳酸鎂循環(huán)加入到發(fā)酵步驟中。
含有復鹽的鎂化合物通過常規(guī)方法進行分離。為了完全過濾鎂化合物，可以采用加壓過濾、減壓過濾或離心過濾等?；蛘?，可以將鎂化合物離心為上清液和高度濃縮的漿料，所得上清液和漿料均通過泵進行轉移。優(yōu)選地，通常用氨等洗滌如此獲得的結晶或漿料，以除去有機物質，然后提供到加熱設備以進行后續(xù)加熱操作。
加熱含有碳酸鎂和碳酸銨的復鹽，據此選擇性地分解碳酸銨，并獲得高純度的碳酸鎂。加熱溫度優(yōu)選為108℃～210℃，更優(yōu)選為120℃～180℃。加熱時間因所述復鹽的量和加熱設備的變化而變化并且沒有特別的限制，但是優(yōu)選為15分鐘～2小時，更優(yōu)選為30分鐘～1小時。通過加熱所述復鹽而獲得的碳酸鎂不需要具有100％的純度，而是可以含有痕量的殘留碳酸銨。在此種情況中，以摩爾計復鹽中氨的量優(yōu)選為不超過復鹽中鎂的量的1/10倍，更優(yōu)選為不超過1/30倍。
所用的加熱設備可以是任意類型的加熱設備，只要該設備能夠將結晶加熱至超過預定溫度的溫度即可。加熱設備的例子包括干燥爐、干燥器和加熱器。當結晶可以是片狀時，可以使用熱板、帶型加熱器或烘干爐。通常，由于粉末形式的中和劑分散性好，易于操作，因此是優(yōu)選的。在此種情況中，優(yōu)選使用回轉式干燥爐或流化干燥器。
當對采用碳酸銨進行有機酸鎂的鹽交換而形成的復鹽進行加熱時，優(yōu)選用氨水洗滌所述復鹽以從所述復鹽中除去有機酸，然后再加熱。對氨水的濃度沒有特別的限制，例如可以使用25％的工業(yè)氨水等。洗滌可以進行一次或數次。
在通過加熱從復鹽中除去碳酸銨后所回收的碳酸鎂可以重復利用，據此提高有機酸發(fā)酵生產的效率。也就是說，碳酸鎂可以作為發(fā)酵步驟中的中和劑而重復利用?；蛘呷缟纤觯蓪⑻妓徭V轉變成氫氧化鎂和二氧化碳，并將所述氫氧化鎂和二氧化碳分別重復利用到發(fā)酵步驟和鹽交換步驟中。
同時，從鎂分離步驟所獲得的有機酸銨溶液可以含有已過量添加的未反應的二氧化碳(在溶液中以碳酸根(HCO3-)存在)和氨。在此種情況中，可以根據二氧化碳和氨的溶解度高度依賴于溫度的性質，通過加熱進行蒸發(fā)和汽化很容易地對二氧化碳和氨進行分離。在此種情況中，二氧化碳和氨同時汽化，因此可能在冷卻時作為碳酸銨而沉淀，并可能導致反應罐的堵塞。因此，優(yōu)選汽化氣體的溫度高于碳酸銨熔點(即108℃)。然而，即使該溫度低于108℃，碳酸銨也可以例如在常壓下在等于或高于80℃，優(yōu)選90℃充分地除去。通常在80℃在常壓下不能獲得足夠體積的水蒸汽，并且根據冷卻水平有可能發(fā)生堵塞。即使在這種情況中，如果通過控制壓力而允許共存一定體積的水蒸汽，堵塞也不會發(fā)生。因此，在等于或低于108℃，必須通過壓力來控制一定體積的共存水。特別優(yōu)選的條件包括在汽化時將有機酸銨水溶液加熱到等于或大于108℃，即以在等于或大于108℃對碳酸和氨進行汽化并允許共存足量的水。
回收和重復利用經汽化的碳酸和氨的安全方法的例子包括通過利用足夠體積的水吸收碳酸和氨，使全部量的碳酸和氨溶解成為碳酸銨；將所述碳酸銨貯藏在緩沖罐中；從該緩沖罐中將所述碳酸銨提供到鹽交換反應罐中和重復利用。然而，在該方法中，溶解碳酸銨所需的水同時被供應到鹽交換反應罐中。因此，從節(jié)省能量的觀點出發(fā)，優(yōu)選將碳酸和氨直接以氣體提供到鹽交換反應罐中進行重復利用。在等于或大于108℃，在稍微加壓的條件下，將從有機酸銨水溶液中分離的碳酸和氨作為氣體提供到鹽交換反應罐中。
由本發(fā)明方法獲得的有機酸銨可以用以獲得有機酸。對由有機酸銨獲得有機酸的方法沒有特別的限制。其例子包括利用電滲析的方法(JP-A-02-283289)；利用離子交換樹脂的方法(US 6,284,904或WO01/66508)；利用硫酸分解有機酸鈣的方法，其中所述有機酸鈣以利用氫氧化鈣進行中和并同時發(fā)酵的方法制造(JP-A-03-030685)；利用硫酸通過鹽交換反應而進行反應結晶的方法(JP-A-2001-514900或US 5,958,744)；反應提取法(WO 98/01413)以及利用乙酸的方法(WO 03/95409)。
實施例下文將參考實施例對本發(fā)明進行更為詳細的描述。在實施例中對琥珀酸銨溶液的制造進行描述，但是諸如有機酸鎂等其它溶液也可以采用下述相同方式制造。
首先，在實施例1和實施例2中描述鹽交換步驟以及后續(xù)步驟。
實施例1采用氨的鹽交換(1)琥珀酸鎂溶液的制備(琥珀酸鎂濃度12.3重量％，30kg)將25.35kg蒸餾水加入100L攪拌容器中，并用錨爪(anchor blade)在30rpm攪拌。通過使水在夾層中流通而將攪拌容器控制至常溫。向攪拌罐中加入1.54kg氫氧化鎂(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)，據此制備懸浮液。在監(jiān)測該懸浮液的溫度的同時，向該懸浮液中逐漸加入3.12kg的琥珀酸(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)。該中和反應提供30kg的琥珀酸鎂水溶液。
(2)采用氨水的鹽交換反應在上述操作之后，將25％氨水(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)混入所述琥珀酸鎂水溶液(30kg)中以進行鹽交換。混合方法如下在約1小時的時間內，添加15kg氨水(25％)；添加結束后，攪拌該混合物60分鐘，以完成鹽交換反應。于是獲得含有氫氧化鎂沉淀的漿料(45kg)。取該漿料的少量樣品，并通過0.2μm膜過濾器(Millipore Corporation)對該樣品進行過濾。通過離子色譜法(電導率檢測儀)分析如此獲得的含有琥珀酸銨的濾液的Mg濃度。結果，Mg濃度為0.39重量％。
(負載的Mg量)2.14(重量％)/100×30(kg)＝0.642(kg)(上清液中的Mg量)0.39(重量％)/100×45(kg)＝0.176(kg)(Mg去除率) (1-0.176/0.642)×100＝72.6(％)(3)用螺旋傾析器進行漿料的固液分離對通過上述操作獲得的漿料進行固液分離。使用螺旋傾析器(Sharpless Super Decanter P-660，由Tomoe Engineering Co.，Ltd.制造)進行固液分離。將所述傾析器的內筒和外筒分別設定為3900rpm和5100rpm。在該條件下，以每小時30L使?jié){料流過傾析器，以進行連續(xù)固液分離。發(fā)現從液體排出口排出的液體包含少量的粉末。取一部分該液體樣品，向該樣品添加少量酒石酸以溶解所述粉末，借以分析Mg濃度。結果，Mg濃度為0.49重量％。以上述相同方式分析排出固體的Mg濃度。用蒸餾水將該固體稀釋50倍，并向其中加入酒石酸直到該固體完全溶解，據此制備均質溶液。作為該溶液的分析結果，Mg濃度為14.6重量％。另外，對回收的液體和回收的固體的琥珀酸濃度進行分析。結果，琥珀酸的濃度分別為6.79％和7.89％。最終，通過固液分離回收的液體的量為42kg，而回收的固體的量為3kg。
回收的液體中Mg的量0.49(重量％)/100×42(kg)＝0.206(kg)回收的固體中Mg的量14.6(重量％)/100×3(kg)＝0.438(kg)相對于所負載的Mg的量，Mg的回收率 (1-0.206/0.642)×100＝67.9(％)回收的液體中琥珀酸的量 6.79(重量％)/100×42(kg)＝2.85(kg)回收的固體中琥珀酸的量 7.89(重量％)/100×3(kg)＝0.24(kg)相對于所負載的琥珀酸的量，琥珀酸的回收率 2.85/3.12×100＝91.5％實施例2采用碳酸銨的鹽交換(1)琥珀酸鎂溶液的合成(琥珀酸鎂濃度12.3％，10kg)將8.45kg蒸餾水加入15L攪拌容器中，并用傾斜槳板(paddle blade)在200rpm攪拌。通過使水在夾層中流通而將攪拌容器控制在常溫。向攪拌罐中加入0.51kg氫氧化鎂(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)，據此制備懸浮液。在監(jiān)測該懸浮液的溫度的同時，向該懸浮液中逐漸加入1.04kg的琥珀酸(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)。該中和反應提供10kg的琥珀酸鎂水溶液。
(2)采用碳酸銨的鹽交換反應在上述操作之后，將碳酸銨(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)混入所述琥珀酸鎂水溶液(10kg)中以進行鹽交換?；旌戏椒ㄈ缦略诩s1小時內，添加2.1kg碳酸銨；添加結束后，攪拌該混合物60分鐘，以完成鹽交換反應。于是獲得含有氫氧化鎂沉淀的漿料(12.1kg)。取該漿料的少量樣品，并通過0.2μm膜過濾器(可獲自Millipore Corporation)對該樣品進行過濾。通過離子色譜法(電導率檢測儀)分析如此獲得的含有琥珀酸銨的濾液的Mg濃度。結果，Mg濃度為0.01重量％。
(負載的Mg量)2.14(重量％)/100×10(kg)＝0.214(kg)(上清液中的Mg量)0.01(重量％)/100×12.1(kg)＝0.0012(kg)(Mg的去除率) (1-0.0012/0.214)×100＝99.4(％)
(3)用加壓過濾進行漿液的固液分離對通過上述操作中獲得的漿料進行固液分離。使用10L壓濾器(Advantech Co.，Ltd.)進行固液分離。作為濾紙使用高純度濾紙No.5C(Advantech Co.，Ltd.)。進行兩次連續(xù)過濾。在4kg的表壓進行過濾，并當不再有液體排出時將該壓力恢復到常壓。然后導入另外的漿料。在所述條件下，對該漿料進行固液分離。在回收的濾液中沒有觀察到固體內含物。分析該濾液的Mg，結果Mg濃度為0.01重量％。以上述同樣的方式分析回收的固體的Mg濃度。用蒸餾水將該固體稀釋50倍，并向其中加入酒石酸直到該固體完全溶解，據此制備均質溶液。作為該溶液的分析結果，Mg濃度為7.48重量％。另外，對回收的液體和回收的固體的琥珀酸濃度進行分析。結果，琥珀酸的濃度分別為10.1％和4.4％。最終，通過固液分離回收的液體的量為9.1kg，而回收的固體的量為2.8kg。
回收的液體中Mg的量0.01(重量％)/100×9.1(kg)＝0.00091(kg)回收的固體中Mg的量7.48(重量％)/100×2.8(kg)＝0.209(kg)相對于所負載的Mg量，Mg的回收率 (1-0.00091/0.214)×100＝99.6(％)回收的液體中琥珀酸的量 10.1(重量％)/100×9.1(kg)＝0.919(kg)回收的固體中琥珀酸的量 4.4(重量％)/100×2.8(kg)＝0.123(kg)相對于所負載的琥珀酸的量，琥珀酸的回收率 0.919/1.04×100＝88.4％通過采用氨的鹽交換或采用碳酸銨的鹽交換方式從琥珀酸鎂中回收鎂，而獲得了琥珀酸銨溶液。相對于采用氨的鹽交換，采用碳酸銨的鹽交換可以使鎂的回收效率更高，基本被完全回收。
以下實施例3描述發(fā)酵步驟、鹽交換步驟、鎂分離步驟以及從鎂分離步驟中獲得的碳酸鎂/碳酸銨復鹽獲得碳酸鎂的步驟。實施例4描述從發(fā)酵步驟中的復鹽獲得的碳酸鎂的重復利用。
實施例3利用發(fā)酵進行琥珀酸鎂溶液的制備和復鹽的制備(1)細菌細胞的制備將100mL培養(yǎng)基加入500mL錐形瓶中，并在120℃加熱該培養(yǎng)基20分鐘進行滅菌，然后冷卻到室溫，所述培養(yǎng)基在1000mL蒸餾水中含有4g尿素、14g硫酸銨、0.5g磷酸二氫鉀、0.5g磷酸氫二鉀、0.5g硫酸鎂七水合物、20mg硫酸亞鐵七水合物、20mg硫酸錳水合物、200μg D-生物素、200μg氯化硫胺、1g酵母提取物和1g酪蛋白氨基酸。然后，向其中加入4mL預先滅菌的50％葡萄糖水溶液和50μL經過濾滅菌的5％卡那霉素溶液。在其中接種在下述參考例中構建的黃色短桿菌MJ233/FRD/PC/ΔLDH菌株，并在30℃進行24小時的種子培養(yǎng)。在該菌株中，富馬酸還原酶基因和丙酮酸羧化酶基因的表達得到了增強，而乳酸脫氫酶基因的表達則受到了破壞。
將下述培養(yǎng)基加入5L發(fā)酵罐中，并在120℃對該培養(yǎng)基進行20分鐘的加熱滅菌，然后冷卻到室溫，所述培養(yǎng)基在2500mL蒸餾水中含有12g尿素、42g硫酸銨、1.5g磷酸二氫鉀、1.5g磷酸氫二鉀、1.5g硫酸鎂七水合物、60mg硫酸亞鐵七水合物、60mg硫酸錳水合物、600μg D-生物素、600μg氯化硫胺、3g酵母提取物、3g酪蛋白氨基酸和1mL的消泡劑(Adekanol LG294，可獲自Asahi Denka Co.Ltd.)。然后，向其中加入500mL預先滅菌的12％葡萄糖水溶液。向其中加入全量的上述種子培養(yǎng)液，并在30℃進行保溫。對該培養(yǎng)物進行通氣并攪拌以進行培養(yǎng)，通氣速度為每分鐘500mL，攪拌速度為500rpm。12小時后，葡萄糖基本被消耗完。在8000rpm對該培養(yǎng)液離心5分鐘，去除上清液，據此獲得用于以下發(fā)酵反應的細菌細胞。
(2)發(fā)酵反應將下述培養(yǎng)基加入5L罐中，并在120℃加熱該培養(yǎng)基20分鐘以進行滅菌，然后冷卻到室溫，所述培養(yǎng)基在2600mL的蒸餾水中含有0.36g磷酸二氫鉀、0.36g磷酸氫二鉀、1.8g硫酸鎂七水合物、72mg硫酸亞鐵七水合物、72mg硫酸錳水合物、720μg D-生物素、720μg氯化硫胺。然后，將該培養(yǎng)基加入從上述從培養(yǎng)物中收集的細菌細胞中對細菌細胞進行懸浮使其O.D.(660nm)為60。將2600mL的所述懸浮液和1000mL預先滅菌的36％葡萄糖水溶液加入5L罐(jar)中，向其中加入349g的4MgC03.Mg(OH)2.5H2O和27g琥珀酸銨并混合。將所述反應懸浮液保持在35℃，并在300rpm攪拌的同時進行反應。發(fā)酵結束后，在8000rpm對該培養(yǎng)液離心5分鐘。獲得作為發(fā)酵液的上清液，回收沉淀的細菌細胞。利用回收的細菌細胞以相同的方法進行6次發(fā)酵反應和分離操作，據此總共獲得20L的上清液。在這6次操作中，琥珀酸的平均累積量為89.5g/L，琥珀酸的平均收率為82％。另外，用分子截止量為20000的UF膜對所述上清液進行過濾，據此獲得含有琥珀酸鎂的發(fā)酵液。
(3)鹽交換將20L通過發(fā)酵獲得的琥珀酸鎂水溶液加入50L的攪拌罐中，在常溫常壓下向其中加入4.0kg的碳酸銨(特級，Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)。攪拌該混合物，立即析出結晶。攪拌120分鐘后，用螺旋傾析器(3000G，Tomoe Engineering，Inc.)對該混合物進行離心，據此獲得19.9kg琥珀酸銨溶液和4.1kg碳酸鎂/碳酸銨復鹽。
(4)復鹽的分解對上述獲得的復鹽進行取樣，并按如下所述對其進行洗滌和加熱。通過改變洗滌次數、加熱溫度和加熱時間來加以研究。表1顯示各實驗例的包括溫度、時間和洗滌次數等在內的條件。
(洗滌)取通過索爾韋(Solvay)鹽交換獲得的碳酸鎂/碳酸銨復鹽樣品并將其放入燒杯中，向其中加入與該復鹽等重量的25％工業(yè)氨水(MitsubishiChemical Corporation)，以在懸浮液中進行洗滌。用Nutsche對所得懸浮液進行抽濾，以進行固液分離，據此回收固體。洗滌和過濾操作進行一次或兩次。
(加熱)將通過洗滌操作獲得的固體加入至總體積為500mL的圓底燒瓶中，并用旋轉蒸發(fā)器在預定溫度加熱預定的時間。分析所得加熱固體中的Mg、氨和琥珀酸的量。
表1顯示所得加熱固體的分析結果。實驗1～實驗6顯示，當在120℃～180℃加熱復鹽時，氨在復鹽中的比例顯著下降，鎂的比例上升。該結果表明，復鹽中的碳酸銨得到有效的去除并獲得了高純度的碳酸鎂。同時，當在90℃加熱復鹽時(實驗7)，在復鹽中殘留了大量的氨，而且碳酸銨也沒有得到充分的去除。利用25％氨水洗滌，去除了吸附到復鹽上的琥珀酸，并且通過洗滌兩次更為有效地去除實施例中的琥珀酸。
表1

實施例4通過分解發(fā)酵步驟中的復鹽而獲得的碳酸鎂的重復利用首先，通過實施例3方法(1)獲得用于發(fā)酵反應的細菌細胞。接著，使用通過實施例3中分解復鹽步驟中獲得的碳酸鎂作為中和劑進行發(fā)酵反應。將下述培養(yǎng)基導入500mL錐形瓶中，并在120℃對該培養(yǎng)基進行20分鐘的加熱滅菌，然后冷卻到室溫，所述培養(yǎng)基在200mL的蒸餾水中含有0.04g磷酸二氫鉀、0.04g磷酸氫二鉀、0.2g硫酸鎂七水合物、8mg硫酸亞鐵七水合物、8mg硫酸錳水合物、80μg D-生物素、80μg氯化硫胺。然后，將該培養(yǎng)基加入從上述培養(yǎng)物中收集的細菌細胞中對細菌細胞進行懸浮使其O.D.(660nm)為60。將200mL的所述懸浮液和200mL預先滅菌的20％葡萄糖水溶液加入1L罐中，向其中加入42g的碳酸鎂(在實施例1部分(4)中獲得的碳酸鎂或商購的碳酸鎂)和3g琥珀酸銨并混合。將所述反應懸浮液保持在35℃，并在400rpm攪拌的同時進行反應。在反應開始后9小時，葡萄糖基本被消耗完。琥珀酸的累積量為91g/L，琥珀酸的收率為83％。
表2顯示所述結果。表2中實驗1、2、4和5顯示上述琥珀酸的發(fā)酵制造的實驗結果，其中使用表1中相應實驗中獲得的碳酸鎂作為中和劑進行重復利用。試劑1和試劑2顯示使用商購的碳酸鎂進行上述琥珀酸的發(fā)酵制造的實驗結果。反應結果表明，當采用通過加熱復鹽獲得的碳酸鎂進行琥珀酸的發(fā)酵制造時，可以獲得與采用商購的碳酸鎂的實驗基本等量的琥珀酸。該結果表明，由加熱復鹽獲得的碳酸鎂可以得到有效的重復利用。
表2

參考例這里描述用于實施例3和實施例4的發(fā)酵反應中的微生物的構建方法。
參考例1基因破壞載體的構建(A)枯草桿菌(Bacillus subtilis)基因組DNA的提取在10mL的LB培養(yǎng)基[組成溶解于1L蒸餾水中的10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g NaCl]中培養(yǎng)枯草桿菌ISW1214，直到對數生長后期，并收集細菌細胞。將所得的細菌細胞懸浮于0.15mL含有10mg/mL溶菌酶的10mM NaCl/20mM Tris緩沖液(pH 8.0)/1mM EDTA.2Na中。然后，將蛋白酶K以100μg/mL的終濃度加入懸浮液中，并在37℃保持1小時。然后，以0.5％的終濃度向其中加入十二烷基硫酸鈉溶液，并在50℃保持6小時以進行裂解。向該裂解液中加入等量酚/氯仿溶液，在室溫下輕搖10分鐘。然后，對全部懸浮液進行離心(5000×g，20分鐘，10℃～12℃)，取上清液組分。以0.3M的濃度向該上清液組分加入乙酸鈉溶液，然后加入兩倍量的乙醇并混合。通過離心(15000×g，2分鐘)回收沉淀，然后用70％乙醇洗滌并進行空氣干燥。向所得DNA中加入5mL的10mMTris緩沖液(pH 7.5)/1mM EDTA.2Na。使所得溶液在4℃靜置過夜，并用作PCR的模板DNA。
(B)通過PCR擴增和克隆SacB基因利用上述部分(A)中制備的DNA作為模板，并用基于所報道的枯草桿菌SacB基因(GenBank Database登錄號為X02730)的核苷酸序列設計的合成DNA(SEQ ID NOS1和2)進行PCR，獲得枯草桿菌SacB基因。
反應溶液的組成如下。將1μL模板DNA、0.2μL PfxDNA聚合酶(可獲自Invitrogen)、1倍濃度的提供的緩沖液、0.3μM相應引物、1mMMgSO4和0.25μM dNTPs混合，并將反應溶液的總體積調節(jié)到20μL。
反應溫度條件如下使用由MJ Research Co.Ltd.制造的DNAThermal Cycler PTC-200，采用94℃，20秒和68℃，2分鐘的循環(huán)重復35次。對于第一個循環(huán)，在94℃保持加熱1分鐘20秒。對于最后一個循環(huán)，在68℃保持加熱5分鐘。
對擴增產物進行分析，該分析通過將擴增產物在0.75％瓊脂糖(SeaKem GTG瓊脂糖，可獲自FMC BioProducts)凝膠電泳中進行分離，采用溴化乙啶染色來使之可視化，據此檢測到約2kb的片段。通過采用QIA Quick Gel Extraction Kit(可獲自GIAGEN)從凝膠中回收目標DNA片段。
用T4多核苷酸激酶(可獲自Takara Shuzo Co.Ltd.)對所回收的DNA片段的5′端進行磷酸化，并利用Ligation Kit ver.2(可獲自Takara ShuzoCo.Ltd.)將其插入到大腸桿菌(Escherichia coli)載體(pBluescript II可獲自STRATEGENE)的EcoRV位點上，用所得質粒DNA轉化大腸桿菌(DH5α菌株)。將所得重組的大腸桿菌鋪在含有50μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL的X-Gal的LB瓊脂培養(yǎng)基(1L蒸餾水中溶解有10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl和15g瓊脂)上。
將在該培養(yǎng)基上形成白色菌落的各克隆轉移到含有50μg/mL氨芐青霉素和10％蔗糖的LB瓊脂培養(yǎng)基上，并在37℃培養(yǎng)24小時。在這些克隆中，采用常規(guī)方法對在含有蔗糖的培養(yǎng)基上不生長的克隆進行液體培養(yǎng)，然后分離質粒DNA。SacB基因進行功能性表達的大腸桿菌株必然不能生長在含有蔗糖的培養(yǎng)基中。用限制酶SalI和PstI消化所得的質粒DNA。對具有約2kb的插入片段的質粒進行確認，并將該質粒稱為pBS/SacB。
(C)抗氯霉素SacB載體的構建在37℃將500ng的大腸桿菌質粒載體pHSG396(氯霉素抗性標記，可獲自Takara Shuzo Co.Ltd.)與10個單位的限制酶PshBI反應1小時，并通過酚/氯仿提取和乙醇沉淀進行回收。用Klenow片段(可獲自TakaraShuzo Co.Ltd.)使所得DNA的兩個末端均成為平末端，并通過利用Ligation Kit ver.2(可獲自Takara Shuzo Co.Ltd.)將MluI接頭(可獲自Takara Shuzo Co.Ltd.)連接到所述末端上，以形成環(huán)狀質粒。用所得質粒轉化大腸桿菌(DH5α菌株)。將所得重組的大腸桿菌鋪在含有34μg/mL氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。采用常規(guī)方法從所得克隆中分離出質粒DNA。選擇具有限制酶MluI的切割位點的克隆，并將其稱為pHSG396Mlu。
同時，用限制酶SalI和PstI消化上述部分(B)中構建的pBS/SacB，用Klenow片段使所得DNA的兩個末端均成為平末端，并通過利用Ligation Kit ver.2(可獲自Takara Shuzo Co.Ltd.)將MluI接頭連接到所述末端上。然后將約2.0kb的含有SacB基因的DNA片段在0.75％瓊脂糖凝膠上電泳分離并回收。通過利用Ligation Kit ver.2(可獲自Takara ShuzoCo.Ltd.)將所述SacB基因片段連接到以限制酶MluI消化pHSG396Mlu并經小牛小腸堿性磷酸酶(可獲自Takara Shuzo Co.Ltd.)磷酸化而獲得的片段上，用所得DNA轉化大腸桿菌(DH5α菌株)。將所得重組的大腸桿菌鋪在含有34μg/mL氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。
將所得克隆轉移到含有34μg/mL氯霉素和10％蔗糖的LB瓊脂培養(yǎng)基上，并在37℃培養(yǎng)24小時。在這些克隆中，采用常規(guī)方法從在含有蔗糖的培養(yǎng)基上不能生長的克隆中分離質粒DNA。將所得質粒DNA進行MluI消化并分析。結果，該質粒DNA經確認具有約2.0kb的插入片段，并將該質粒稱為pCMB1。
(D)卡那霉素抗性基因的獲得采用大腸桿菌質粒載體pHSG299(卡那霉素抗性標記，Takara ShuzoCo.Ltd.)的DNA作為模板，并用合成的DNA(顯示在SEQ ID NOS3和4)作為引物，通過進行PCR獲得卡那霉素抗性基因。反應溶液的組成如下將1ng模板DNA、0.1μL Pyrobest DNA聚合酶(可獲自Takara ShuzoCo.Ltd.)、1倍濃度添加的緩沖液、0.5μM相應引物和0.25μM dNTPs混合，并將反應溶液的總體積調節(jié)到20μL。
反應溫度條件如下使用由MJ Research Co.Ltd.制造的DNAThermal Cycler PTC-200，采用94℃，20秒和62℃，15秒以及72℃，1分鐘20秒的循環(huán)重復20次。對于第一個循環(huán)，在94℃保持加熱1分鐘20秒。對于最后一個循環(huán)，在72℃保持加熱5分鐘。
對擴增產物進行分析，該分析通過將擴增產物在0.75％瓊脂糖(SeaKem GTG瓊脂糖，可獲自FMC BioProducts)凝膠電泳中進行分離，采用溴化乙啶染色來使之可視化，據此檢測到約1.1kb的片段。通過采用QIA Quick Gel Extraction Kit(可獲自GIAGEN)從凝膠中回收目標DNA片段。用T4多核苷酸激酶(可獲自Takara Shuzo Co.Ltd.)對所回收的DNA片段的5′端進行磷酸化。
(E)卡那霉素抗性SacB載體的構建以限制酶Van91I和ScaI消化在上述部分(C)中所構建的pCMB1，獲得約3.5kb的DNA片段，將該DNA片段于0.75％瓊脂糖凝膠電泳中進行分離并回收。將所得DNA與上述部分(D)中制備的卡那霉素抗性基因混合并用Ligation Kit ver.2(可獲自Takara Shuzo Co.Ltd.)將所得DNA連接到該基因上，用所得質粒DNA轉化大腸桿菌(DH5α菌株)。將所得重組的大腸桿菌鋪在含有50μg/mL卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。
生長在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上的菌株經證實不能生長在含有蔗糖的培養(yǎng)基上。另外，用限制酶HindIII消化的制自同一菌株的質粒DNA出現354bp、473bp、1807bp和1997bp的片段。于是斷定該質粒具有如圖1所示的結構，并將該質粒稱為pKMB1。
參考例2LDH基因破壞菌株的構建(A)黃色短桿菌MJ233-ES菌株的基因組DNA的提取采用常規(guī)方法(WolfH等，J.Bacteriol.1983，156(3)1165-1170；KurusuY等，Agric Biol Chem，1990，54(2)443-447)清除黃色短桿菌MJ-233菌株(FERM BP-1497)的內源質粒，將所得質粒清除的菌株黃色短桿菌MJ233-ES用于以下轉化。
將黃色短桿菌MJ233-ES菌株培養(yǎng)在10mL的A培養(yǎng)基(1L蒸餾水中溶解有2g尿素、7g(NH4)2SO4、0.5g KH2PO4、0.5g K2HPO4、0.5gMgSO4.7H2O、6mg FeSO4.7H2O、6mg MnSO4.4-5H2O、200μg生物素、100μg硫胺、1g酵母提取物、1g酪蛋白氨基酸和20g葡萄糖)中直到對數生長后期。通過以上參考例1部分(A)所述方法，制備所得細菌細胞的基因組DNA。
(B)乳酸脫氫酶基因的克隆利用上述部分(A)中制備的DNA作為模板，并用基于JP11-206385A中所描述的基因的核苷酸序列設計的合成DNA(SEQ ID NOS5和6)，通過進行PCR獲得MJ233菌株的乳酸脫氫酶基因。反應溶液的組成如下將1μL模板DNA、0.2μL TaqDNA聚合酶(可獲自Takara Shuzo Co.Ltd.)、1倍濃度添加的緩沖液、0.2μM相應引物和0.25μM dNTPs混合，并將反應液體的總體積調節(jié)到20μL。
反應溫度條件如下使用由MJ Research Co.Ltd.制造的DNAThermal Cycler PTC-200，采用94℃，20秒和55℃，20秒以及72℃，1分鐘的循環(huán)重復30次。對于第一個循環(huán)，在94℃保持加熱1分鐘20秒。對于最后一個循環(huán)，在72℃保持加熱5分鐘。
對擴增產物進行分析，該分析通過將擴增產物在0.75％瓊脂糖(SeaKem GTG瓊脂糖，可獲自FMC BioProducts)凝膠電泳中進行分離，采用溴化乙啶染色來使之可視化，據此檢測約0.95kb的片段。通過采用QIA Quick Gel Extraction Kit(可獲自GIAGEN)從凝膠中回收目標DNA片段。
將所回收的DNA片段與PCR產物克隆載體pGEM-T Easy(可獲自Promega Corporation)混合，并用Ligation Kit ver.2(可獲自Takara ShuzoCo.Ltd.)將該DNA片段連接到所述載體上，用所得質粒DNA轉化大腸桿菌(DH5α菌株)。將所得重組的大腸桿菌鋪在含有50μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL X-Gal的LB瓊脂培養(yǎng)基上。
采用常規(guī)方法對該培養(yǎng)基上形成白色菌落的各克隆進行液體培養(yǎng)，然后純化質粒DNA。用限制酶SacI和SphI切割所得的質粒DNA。經證實，該質粒DNA具有約1.0kb的插入片段，并將該質粒稱為pGEMT/CgLDH。
(C)用于破壞乳酸脫氫酶基因的質粒的構建用限制酶EcoRV和XbaI消化以上部分(B)中制備的pGEMT/CgLDH，以除去約0.25kb的乳酸脫氫酶編碼區(qū)。用Klenow片段使余下約3.7kb的DNA片段的各個末端成為平末端，并Ligation Kit ver.2(可獲自TakaraShuzo Co.Ltd.)進行自連接。用所得質粒轉化大腸桿菌(DH5α菌株)。將所得重組的大腸桿菌鋪在含有50μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。
采用常規(guī)方法對在該培養(yǎng)基上生長的菌株進行液體培養(yǎng)，然后分離質粒DNA。用限制酶SacI和SphI切割所得的質粒DNA。選擇具有約0.75kb插入片段的克隆，并將該克隆稱為pGEMT/ΔLDH。
將以限制酶SacI和SphI消化pGEMT/ΔLDH而獲得的約0.75kb的DNA片段于0.75％瓊脂糖凝膠電泳中進行分離并回收，以此制備其部分區(qū)域已被缺失的乳酸脫氫酶基因片段。將該DNA片段與參考例1中構建并經限制酶SacI和SphI消化的pKMB1混合，并用Ligation Kit ver.2(可獲自Takara Shuzo Co.Ltd.)將該DNA片段連接到所述pKMB1上，用所得質粒DNA轉化大腸桿菌(DH5α菌株)。將所得重組的大腸桿菌鋪在含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL X-Gal的LB瓊脂培養(yǎng)基上。
采用常規(guī)方法對在該培養(yǎng)基上形成白色菌落的各克隆進行液體培養(yǎng)，然后分離質粒DNA。用限制酶SacI和SphI消化所得的質粒DNA。選擇具有約0.75kb插入片段的克隆，并將該克隆稱為pKMB1/ΔLDH(圖2)。
(D)來自黃色短桿菌MJ233-ES菌株的乳酸脫氫酶基因破壞菌株的構建采用氯化鈣法(Journal of Molecular Biology，53，159，1970)以pKMB1/ΔLDH對大腸桿菌JM110菌株進行轉化，從所得的轉化菌株中分離用于黃色短桿菌MJ-233菌株轉化的質粒DNA。
采用電脈沖法(Res.Microbiol.第144卷，第181-185頁，1993)對黃色短桿菌MJ233-ES菌株進行轉化，并將所得轉化體鋪在含有50μg/mL卡那霉素的LBG瓊脂培養(yǎng)基(在1L蒸餾水中溶解有10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl、20g葡萄糖和15g瓊脂)上。
由于pKMB1/ΔLDH是不能在黃色短桿菌MJ233-ES菌株中復制的質粒，所以作為質粒上的乳酸脫氫酶基因與黃色短桿菌MJ-233菌株的基因組的同一基因之間的同源重組的結果，生長在該培養(yǎng)基上的菌株必然會在其基因組上插入來自質粒的卡那霉素抗性基因和SacB基因。
接著，在含有50μg/mL卡那霉素的LBG培養(yǎng)基中對通過同源重組獲得的菌株進行液體培養(yǎng)。將推測含有約1,000,000個細菌細胞的培養(yǎng)溶液鋪在含有10％蔗糖的LBG培養(yǎng)基上。結果獲得10個其中SacB基因通過第二次同源重組去除的蔗糖不敏感菌株。
所得菌株中包括乳酸脫氫酶基因被來自pKMB1/ΔLDH的缺失型所取代的菌株以及乳酸脫氫酶基因回復為野生型的菌株。乳酸脫氫酶基因是缺失型還是野生型，可以通過對在LBG培養(yǎng)基中以液體培養(yǎng)獲得的菌株進行直接PCR并檢測乳酸脫氫酶基因而加以證實。用引物(SEQ IDNOS7和8)進行PCR擴增而對乳酸脫氫酶基因進行分析，結果野生型的DNA片段為720bp，而缺失型的DNA片段為471bp。
作為采用上述方法分析蔗糖不敏感菌株的結果，選擇到只具有缺失型基因的菌株，并將其稱為黃色短桿菌MJ233/ΔLDH。
參考例3用于棒狀細菌的表達載體的構建(A)用于棒狀細菌的啟動子片段的制備使用JP07-95891 A所公開的如SEQ ID NO4所示的DNA片段，該片段據報道在棒狀細菌中具有高啟動子活性(下文稱為TZ4啟動子)。該啟動子片段通過PCR獲得，所述PCR使用在參考例2部分(A)中制備的黃色短桿菌MJ233基因組DNA作為模板，并用基于JP07-95891 A中的SEQ ID NO4所述序列設計的合成DNA(SEQ ID NOS9和10)作為引物。
反應溶液的組成如下將1μL模板DNA、0.2μL PfxDNA聚合酶(可獲自Invitrogen Japan K.K.)、1倍濃度添加的緩沖液、0.3μM相應引物、1mM MgSO4和0.25μM dNTPs混合，并將反應溶液總體積調節(jié)到20μL。
反應溫度條件如下使用由MJ Research Co.Ltd.制造的DNAThermal Cycler PTC-200，采用94℃，20秒和60℃，20秒以及72℃，30秒的循環(huán)重復35次。對于第一個循環(huán)，在94℃保持加熱1分鐘20秒。對于最后一個循環(huán)，在72℃保持加熱2分鐘。
對擴增產物進行分析，該分析通過將擴增產物在2.0％瓊脂糖(SeaKem GTG瓊脂糖，可獲自FMC BioProducts)凝膠電泳中進行分離，并采用溴化乙啶染色來使之可視化，據此檢測出約0.25kb的片段。通過采用QIA Quick Gel Extraction Kit(可獲自GIAGEN)從凝膠中回收目標DNA片段。
用T4多核苷酸激酶(可獲自Takara Shuzo Co.Ltd.)對所回收的DNA片段的5′端進行磷酸化并利用Ligation Kit ver.2(可獲自Takara Shuzo Co.Ltd.)將其連接到大腸桿菌載體pUC19(Takara Shuzo Co.Ltd.)的SmaI位點上，用所得質粒DNA轉化大腸桿菌(DH5α菌株)。將所得的重組大腸桿菌鋪在含有50μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL X-Gal的LB瓊脂培養(yǎng)基上。
采用常規(guī)方法對在該培養(yǎng)基上形成白色菌斑的6個克隆分別進行液體培養(yǎng)，然后分離質粒DNA，并測定核苷酸序列。選擇其中插入有TZ4啟動子而在相對于pUC19上的lac啟動子的相反方向上具有轉錄活性的克隆，并將其稱為pUC/TZ4。
接著，向通過利用限制酶BamHI和PstI消化Puc/TZ4而制備的DNA片段中加入由合成DNA(SEQ ID NOS11和12)構成的DNA接頭，所述合成DNA各自具有磷酸化5′末端且具有各對應于BamHI和PstI的粘性末端，并用Ligation Kit ver.2(可獲自Takara Shuzo Co.Ltd.)將所制備的DNA片段與所述接頭相互連接，并用所得質粒DNA轉化大腸桿菌(DH5α菌株)。所述DNA接頭包括核糖體結合序列(AGGAGG)和位于該核糖體結合序列下游的的克隆位點(自上游起按PacI、NotI和ApaI的順序)。
采用常規(guī)方法對在該培養(yǎng)基上形成白色菌落的各克隆分別進行液體培養(yǎng)，然后分離質粒DNA。在所得的質粒DNA中，選擇能夠被限制酶NotI所切割的質粒DNA，并將其稱為pUC/TZ4-SD。
通過利用限制酶PstI消化pUC/TZ4-SD，用Klenow片段使其具有平末端，并用限制酶KphI進行切割，獲得約0.3kb的啟動子片段，將該片段以2.0％瓊脂糖凝膠電泳進行分離及回收。
(B)用于棒狀細菌的表達載體的構建將JP12-93183A中所述的pHSG298par-rep用作能夠在棒狀細菌中穩(wěn)定和自主復制的質粒。該質粒包括復制區(qū)、停滯短桿菌(Brevibacteriumstationis)IFO12144菌株所保守具有的天然質粒pBY503的復制區(qū)域以及具有穩(wěn)定功能的區(qū)域、來自大腸桿菌載體pHSG298(Takara Shuzo Co.Ltd.)的卡那霉素抗性基因和用于大腸桿菌的復制區(qū)。
利用限制酶SseI消化pHSG298par-rep，用Klenow片段使其具有平末端，并用限制酶KpnI消化，將所得DNA與以上部分(A)中制備的TZ4啟動子片段混合并用Ligation Kit ver.2(可獲自Takara Shuzo Co.Ltd.)進行連接，用所得質粒DNA轉化大腸桿菌(DH5α菌株)。將所得重組的大腸桿菌鋪在含有50μg/mL卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。
采用常規(guī)方法對該培養(yǎng)基上生長的菌株進行液體培養(yǎng)，然后純化質粒DNA。在所得質粒DNA中，選擇能夠被限制酶NotI消化的質粒DNA，并將其稱為pTZ4(圖3顯示了構建程序)。
參考例4丙酮酸羧化酶活性增強菌株的構建(A)丙酮酸羧化酶基因的獲得利用以上參考例2部分(A)中制備的DNA作為模板，并采用以全部基因組序列已被報道(GenBank Database登錄號為AP005276)的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032菌株的丙酮酸羧化酶基因序列為基礎進行設計的合成DNA(SEQ ID NOS13和14)，通過PCR獲得來自黃色短桿菌MJ233菌株的丙酮酸羧化酶基因。
反應溶液的組成如下將1μL模板DNA、0.2μL PfxDNA聚合酶(可獲自Invitrogen Japan K.K.)、1倍濃度添加的緩沖液、0.3μM相應引物、1mM MgSO4和0.25μM dNTPs混合，將反應液體的總體積調節(jié)到20μL。
反應溫度條件如下使用由MJ Research Co.Ltd.制造的DNAThermal Cycler PTC-200，采用94℃，20秒和68℃，4分鐘的循環(huán)重復35次。對于第一個循環(huán)，在94℃保持加熱1分鐘20秒。對于最后一個循環(huán)，在68℃保持加熱10分鐘。PCR結束后，加入0.1M的Takara ExTaq(Takara Shuzo Co.Ltd.)并在72℃保持30分鐘。
對擴增產物進行分析，該分析通過將擴增產物在0.75％瓊脂糖(SeaKem GTG瓊脂糖，可獲自FMC BioProducts)凝膠電泳中進行分離，采用溴化乙啶染色來使之可視化，據此檢測出約3.7kb的片段。通過采用QIA Quick Gel Extraction Kit(可獲自GIAGEN)從凝膠中回收目標DNA片段。
將所回收的DNA片段與PCR產物克隆載體pGEM-TEasy(可獲自Promega Corporation)混合并用Ligation Kit ver.2(可由Takara Shuzo Co.Ltd.獲得)將該DNA片段連接到該載體上，用所得質粒DNA轉化大腸桿菌(DH5α菌株)。將所得重組的大腸桿菌鋪在含有50μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL X-Gal的LB瓊脂培養(yǎng)基上。
采用常規(guī)方法對在該培養(yǎng)基上形成白色菌落的各克隆分別進行液體培養(yǎng)，然后分離質粒DNA。用限制酶PacI和ApaI消化所得的質粒DNA。經證實，該質粒DNA具有約3.7kb的插入片段，并將其稱為pGEM/MJPC。
通過利用核苷酸測序設備(377XL型，由Applied Biosystems制造)和BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit ver.3(由Applied Biosystems制造)，對pGEM/MJPC中的插入片段的核苷酸序列進行測定。上述結果獲得的DNA堿基序列如SEQ ID NO15所示。由該核苷酸序列推斷的氨基酸序列與來自谷氨酸棒桿菌ATCC 13032菌株的氨基酸高度同源(99.4％)，斷定pGEM/MJPC插入片段是來自黃色短桿菌MJ233菌株的丙酮酸羧化酶基因。
(B)用于增強丙酮酸羧化酶活性的質粒的構建接著，利用限制酶PacI和ApaI消化以上部分(A)中制備的pGEM/MJPC，獲得約3.7kb的丙酮酸羧化酶基因片段，將該片段在0.75％瓊脂糖凝膠電泳中進行分離并回收。
將該DNA片段與參考例3中經限制酶PacI和ApaI消化的pTZ4混合并用Ligation Kit ver.2(可獲自Takara Shuzo Co.Ltd.)進行連接，用所得質粒DNA轉化大腸桿菌(DH5α菌株)。將所得重組的大腸桿菌鋪在含有50μg/mL卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。
采用常規(guī)方法對在該培養(yǎng)基上生長的菌株進行液體培養(yǎng)，然后純化質粒DNA。用限制酶PacI和ApaI消化所得質粒DNA。選擇具有約3.7kb插入片段的克隆，并將其稱為pMJPC1(圖4)。
(C)黃色短桿菌MJ233/ΔLDH菌株的轉化從以上部分(B)中轉化的大腸桿菌(DH5α菌株)中分離能夠在黃色短桿菌MJ233菌株中復制的質粒DNA pMJPC1。
采用電脈沖法(Res.Microbiolo.第144卷，第181-185頁，1993)對黃色短桿菌MJ233/ΔLDH菌株進行轉化，并將所得轉化體鋪在含有50μL/mL卡那霉素的LBG瓊脂培養(yǎng)基(1L蒸餾水中溶解有10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl、20g葡萄糖和15g瓊脂)上。
采用常規(guī)方法對該培養(yǎng)基上生長的菌株進行液體培養(yǎng)，然后提取質粒DNA，并用限制酶消化進行分析。結果證實該菌株保留有pMJPC1，并將該菌株稱為黃色短桿菌MJ233/PC/ΔLDH菌株。
參考例5大腸桿菌富馬酸還原酶基因的克隆(A)大腸桿菌DNA的提取在10mL的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌JM109，直到對數生長后期，然后采用參考例1部分(A)所述方法用所得的細菌細胞來制備基因組DNA。
(B)大腸桿菌富馬酸還原酶基因的克隆通過利用以上部分(A)中制備的DNA作為模板，并采用所有基因組序列已被報道(GenBank Database登錄號為U00096)的大腸桿菌K12-MG1655菌株的基因序列為基礎進行設計的合成DNA(SEQ ID NOS16和17)，通過進行PCR獲得大腸桿菌富馬酸還原酶基因。
反應溶液的組成如下將1μL模板DNA、0.2μL PfxDNA聚合酶(由Invitrogen Co.Ltd.制造)、1倍濃度的提供的緩沖液、0.3μM相應引物、1mM MgSO4和0.25μM dNTPs混合，并將總體積調節(jié)到20μL。
反應溫度條件如下使用由MJ Research Co.Ltd.制造的DNAThermal Cycler PTC-200，采用94℃，20秒和68℃，4分鐘的循環(huán)重復35次。對于第一個循環(huán)，在94℃保持加熱1分鐘20秒。對于最后一個循環(huán)，在68℃保持加熱10分鐘。PCR結束后，加入0.1μL的Takara ExTaq(Takara Shuzo Co.Ltd.)并在72℃保持30分鐘。
對擴增產物進行分析，該分析通過將擴增產物在0.75％瓊脂糖(SeaKem GTG瓊脂糖，可獲自FMC BioProducts)凝膠電泳中進行分離，然后采用溴化乙啶染色來使之可視化，據此檢測出約3.8kb的片段。通過采用QIA Quick Gel Extraction Kit(由GIAGEN制造)從凝膠中分離感興趣的DNA片段。
將所回收的DNA片段與PCR產物克隆載體pT7 Blue T-Vector(由Novagen制造)混合并用Ligation Kit ver.2(由Takara Shuzo Co.Ltd.制造)將該片段連接到該載體上，用所得質粒DNA轉化大腸桿菌(DH5α菌株)。將所得重組的大腸桿菌鋪在含有50μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL X-Gal的LB瓊脂培養(yǎng)基上。
根據常規(guī)方法將在該培養(yǎng)基上形成白色菌落的克隆培養(yǎng)在液體培養(yǎng)物中，然后純化該質粒DNA。用限制酶HindIII和KpnI消化所得的質粒DNA，據此證實約3.9kb的插入片段，并將其稱為pFRD6.0。
通過利用由Applied Biosystems Inc.制造的核苷酸測序設備(377XL型)和BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit ver.3，對pFRD6.0的插入片段的核苷酸序列進行測定。所得核苷酸序列如SEQ ID NO18所示。
參考例6丙酮酸羧化酶/富馬酸還原酶活性增強的菌株的構建(A)pMJPC1限制酶識別位點的修飾用限制酶KpnI對在參考例3中構建的pMJPC1進行完全消化，并通過與小牛小腸堿性磷酸酶(Takara Shuzo Co.Ltd.)的反應使其5′末端磷酸化，得到DNA片段。將由帶有磷酸化5′末端的合成DNA組成的DNA接頭(SEQ ID NOS19和20)與所得DNA片段混合并用Ligation Kit ver.2(可獲自Takara Shuzo Co.Ltd.)進行連接，用所得質粒DNA轉化大腸桿菌(DH5α菌株)。將所得重組的大腸桿菌鋪在含有50μg/mL卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。
采用常規(guī)方法對該培養(yǎng)基上生長的菌株進行液體培養(yǎng)，然后分離質粒DNA。在所得質粒DNA中，選擇能夠被限制酶NdeI消化的質粒DNA，并將其稱為pMJPC1.1。
(B)用于增強丙酮酸羧化酶和富馬酸還原酶活性的質粒的構建利用限制酶HindIII消化參考例5中制備的pFRD6.0，用Klenow片段使其具有平末端，并用限制酶KpnI進行消化，獲得約3.9kb的DNA片段。將該DNA片段在0.75％瓊脂糖凝膠電泳中進行分離并回收。將所制備含有大腸桿菌富馬酸還原酶基因的片段以及以上部分(A)中制備的pMJPC 1.1分別用限制酶NdeI消化，然后用Klenow片段使其具有平末端、接著用限制酶KpnI消化，將所獲得的DNA混合并用Ligation Kit ver.2(可獲自Takara Shuzo Co.Ltd.)進行連接。用所得質粒DNA轉化大腸桿菌(DH5α菌株)。將所得重組的大腸桿菌鋪在含有50μg/mL卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。
采用常規(guī)方法對在該培養(yǎng)基上生長的菌株進行液體培養(yǎng)，然后分離該質粒DNA。所獲得的質粒DNA經限制酶HindIII消化后出現505bp、2132bp、2675bp、3775bp和4193bp的片段。于是斷定該DNA具有如圖5所示的結構，并將該質粒稱為pFRPC1.1。
(B)黃色短桿菌MJ233/ΔLDH菌株的轉化通過如參考例4部分(C)中所述的方法，用pFRPC1.1轉化黃色短桿菌MJ233/ΔLDH菌株，據此獲得具有質粒pFRPC 1.1的菌株。將該菌株稱為黃色短桿菌MJ233/FRD/PC/ΔLDH菌株。
工業(yè)實用性本發(fā)明提供制造有機酸銨溶液的新方法。本發(fā)明的方法可以通過重復利用用作中和劑或在鹽交換使用的碳酸、氨等而有效地制造諸如琥珀酸銨溶液等有機酸銨溶液。從本發(fā)明所制造的琥珀酸銨溶液獲得的琥珀酸可用作諸如生物可降解聚酯和聚酰胺等聚合物、食品、藥品和化妝品等的原料。
序列表<110>三菱化學株式會社味之素株式會社<120>制造有機酸銨溶液的方法<130>FCI06JP0847<150>JP2003-378732<151>2003-11-07<150>JP2004-79488<151>2004-03-19<160>20<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>1cctttttaac ccatcacata tacctgccgt tcac 34<210>2<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>2aaaggttagg aatacggtta gccatttgcc tg32<210>3<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>3gaggtctgcc tcgtgaagaa g21
<210>4<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>4ctcattagaa aaactcatcg agcatca 27<210>5<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>5cgatgaaaga aaccgtcggc 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>6cgtcagaaga actgcttctg 20<210>7<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>7agttgcatac gcatacgcac tga 23<210>8<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物
<400>8gagactggga ctgcaacgtc ttg 23<210>9<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>9gatctttcag ctgctcacac gtga 24<210>10<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>10gatcttaggt cactaaaact aattcag 27<210>11<211>39<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>11gatccaggag gcattaatta agcggccgcg ggccctgca 39<210>12<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>12gggcccgcgg ccgcttaatt aatgcctcct g 31<210>13<211>43<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>引物<400>13accttaatta atgtcgactc acacatcttc aacgcttcca gca 43<210>14<211>44<212>DNA<213>人工的<220>
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<211>3847<212>DNA<213>大腸桿菌<400>18ccacctgcag gactccacga tcggcaaaga aacgacggat ctccgccata atcgccgcgc 60gttttaataa gttaggaatg gatgcgctcg gctgccagga tgccgtttcg ctcatagtta 120aatctccagt ttttgacaag ggcacgaagt ctactcgcaa cgcgacggcg agacaaattt 180tacgcaggaa tcaaacagcg gtgggcagtg actaaaaaaa gcacgatctg atggtttagt 240aattaaatta atcatcttca gtgataattt agccctcttg cgcactaaaa aaatcgatct 300cgtcaaattt cagacttatc catcagacta tactgttgta cctataaagg agcagtggaa 360tagcgttcgc agaccgtaac tttcaggtac ttaccctgaa gtacgtggct gtgggataaa 420aacaatctgg aggaatgtcg tgcaaacctt tcaagccgat cttgccattg taggcgccgg 480tggcgcggga ttacgtgctg caattgctgc cgcgcaggca aatccgaatg caaaaatcgc 540actaatctca aaagtatacc cgatgcgtag ccataccgtt gctgcagaag ggggctccgc 600cgctgtcgcg caggatcatg acagcttcga atatcacttt cacgatacag tagcgggtgg 660cgactggttg tgtgagcagg atgtcgtgga ttatttcgtc caccactgcc caaccgaaat 720gacccaactg gaactgtggg gatgcccatg gagccgtcgc ccggatggta gcgtcaacgt 780acgtcgcttc ggcggcatga aaatcgagcg cacctggttc gccgccgata agaccggctt 840ccatatgctg cacacgctgt tccagacctc tctgcaattc ccgcagatcc agcgttttga 900cgaacatttc gtgctggata ttctggttga tgatggtcat gttcgcggcc tggtagcaat 960gaacatgatg gaaggcacgc tggtgcagat ccgtgctaac gcggtcgtta tggctactgg1020cggtgcgggt cgcgtttatc gttacaacac caacggcggc atcgttaccg gtgacggtat1080gggtatggcg ctaagccacg gcgttccgct gcgtgacatg gaattcgttc agtatcaccc1140aaccggtctg ccaggttccg gtatcctgat gaccgaaggt tgccgcggtg aaggcggtat1200tctggtcaac aaaaatggct accgttatct gcaagattac ggcatgggcc cggaaactcc1260gctgggcgag ccgaaaaaca aatatatgga actgggtcca cgcgacaaag tctctcaggc1320cttctggcac gaatggcgta aaggcaacac catctccacg ccgcgtggcg atgtggttta1380tctcgacttg cgtcacctcg gcgagaaaaa actgcatgaa cgtctgccgt tcatctgcga1440actggcgaaa gcgtacgttg gcgtcgatcc ggttaaagaa ccgattccgg tacgtccgac1500cgcacactac accatgggcg gtatcgaaac cgatcagaac tgtgaaaccc gcattaaagg1560tctgttcgcc gtgggtgaat gttcctctgt tggtctgcac ggtgcaaacc gtctgggttc1620taactccctg gcggaactgg tggtcttcgg ccgtctggcc ggtgaacaag cgacagagcg1680tgcagcaact gccggtaatg gcaacgaagc ggcaattgaa gcgcaggcag ctggcgttga1740acaacgtctg aaagatctgg ttaaccagga tggcggcgaa aactgggcga agatccgcga1800cgaaatgggc ctggctatgg aagaaggctg cggtatctac cgtacgccgg aactgatgca1860gaaaaccatc gacaagctgg cagagctgca ggaacgcttc aagcgcgtgc gcatcaccga1920cacttccagc gtgttcaaca ccgacctgct ctacaccatt gaactgggcc acggtctgaa1980cgttgctgaa tgtatggcgc actccgcaat ggcacgtaaa gagtcccgcg gcgcgcacca2040gcgtctggac gaaggttgca ccgagcgtga cgacgtcaac ttcctcaaac acaccctcgc2100cttccgcgat gctgatggca cgactcgcct ggagtacagc gacgtgaaga ttactacgct2160gccgccagct aaacgcgttt acggtggcga agcggatgca gccgataagg cggaagcagc2220caataagaag gagaaggcga atggctgaga tgaaaaacct gaaaattgag gtggtgcgct2280ataacccgaa agtcgatacc gcaccgcata gcgcattcta tgaagtgcct tatgacgcaa2340ctacctcatt actggatgcg ctgggctaca tcaaagacaa cctggcaccg gacctgagct2400accgctggtc ctgccgtatg gcgatttgtg gttcctgcgg catgatggtt aacaacgtgc2460caaaactggc atgtaaaacc ttcctgcgtg attacaccga cggtatgaag gttgaagcgt2520tagctaactt cccgattgaa cgcgatctgg tggtcgatat gacccacttc atcgaaagtc2580tggaagcgat caaaccgtac atcatcggca actcccgcac cgcggatcag ggtactaaca2640tccagacccc ggcgcagatg gcgaagtatc accagttctc cggttgcatc aactgtggtt2700tgtgctacgc cgcgtgcccg cagtttggcc tgaacccaga gttcatcggt ccggctgcca2760ttacgctggc gcatcgttat aacgaagata gccgcgacca cggtaagaag gagcgtatgg2820cgcagttgaa cagccagaac ggcgtatgga gctgtacttt cgtgggctac tgctccgaag2880tctgcccgaa acacgtcgat ccggctgcgg ccattcagca gggcaaagta gaaagttcga2940aagactttct tatcgcgacc ctgaaaccac gctaaggagt gcaacatgac gactaaacgt3000aaaccgtatg tacggccaat gacgtccacc tggtggaaaa aattgccgtt ttatcgcttt3060
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<223>引物<400>20cgggtttcat atgtac 1權利要求
1.一種制造有機酸銨溶液的方法，該方法包括發(fā)酵步驟，該步驟通過在鎂化合物存在時利用具有制造有機酸能力的微生物，獲得含有有機酸鎂的發(fā)酵液；鹽交換步驟，該步驟通過利用銨化合物，使包含在所述發(fā)酵液中的有機酸鎂生成有機酸銨和鎂化合物；以及鎂分離步驟，該步驟分離所制得的鎂化合物，以獲得有機酸銨溶液。
2.如權利要求1所述的制造有機酸銨溶液的方法，其中將在所述鎂分離步驟中所分離的鎂化合物作為所述發(fā)酵步驟中的鎂化合物而重復利用。
3.如權利要求1或2所述的制造有機酸銨溶液的方法，其中所述鎂化合物是碳酸鎂且所述銨化合物是碳酸銨。
4.如權利要求1～3任一項所述的制造有機酸銨溶液的方法，其中在所述鹽交換步驟中，使用通過將二氧化碳和氨提供至發(fā)酵液中而產生的碳酸銨作為銨化合物。
5.如權利要求4所述的制造有機酸銨溶液的方法，其中所提供的二氧化碳的摩爾量為發(fā)酵液中的鎂的摩爾量的0.3～10倍。
6.如權利要求4所述的制造有機酸銨溶液的方法，該方法進一步包括以下步驟對所述鎂分離步驟中獲得的有機酸銨溶液進行加熱以使存在于該溶液中的過量二氧化碳和氨蒸發(fā)和分離，并在所述鹽交換步驟中重復利用所分離的二氧化碳和氨。
7.如權利要求1所述的制造有機酸銨溶液的方法，該方法進一步包括以下步驟對所述鎂分離步驟中分離的碳酸鎂進行加熱以使其分解為氧化鎂和二氧化碳，通過向氧化鎂中加水而產生氫氧化鎂，并在所述發(fā)酵步驟中重復利用該氫氧化鎂作為鎂化合物。
8.如權利要求1所述的制造有機酸銨溶液的方法，其中所述鎂化合物是氫氧化鎂或氫氧化鎂和碳酸鎂的混合物，而氨用于所述鹽交換步驟中。
9.如權利要求8所述的制造有機酸銨溶液的方法，該方法進一步包括以下步驟向所述鎂分離步驟中獲得的有機酸銨溶液中加入碳酸銨以進一步產生有機酸銨和碳酸鎂，并通過分離所述碳酸鎂而獲得有機酸銨溶液。
10.如權利要求1～9任一項所述的制造有機酸銨溶液的方法，其中所述鹽交換步驟在pH為7～12的范圍進行。
11.如權利要求1～10任一項所述的制造有機酸銨溶液的方法，其中所述有機酸是琥珀酸且所述有機酸銨是琥珀酸銨。
12.如權利要求1所述的制造有機酸銨溶液的方法，該方法進一步包括以下步驟對通過所述鎂分離步驟分離到的鎂化合物中所包含的碳酸鎂和碳酸銨的復鹽進行加熱或干燥以從所述復鹽中除去碳酸銨和獲得碳酸鎂，并在所述發(fā)酵步驟中重復利用所述的碳酸鎂。
13.如權利要求12所述的制造有機酸銨溶液的方法，其中除去碳酸銨以使所述復鹽中的氨的摩爾含量變?yōu)殒V的摩爾含量的1/10或1/10以下。
14.如權利要求12所述的制造有機酸銨溶液的方法，其中除去碳酸銨以使所述復鹽中的氨的摩爾含量變?yōu)殒V的摩爾含量的1/30或1/30以下。
15.如權利要求12所述的制造有機酸銨溶液的方法，其中在不低于160℃的溫度對所述復鹽進行加熱。
全文摘要
本發(fā)明通過以下步驟制造有機酸銨溶液通過在鎂化合物存在時利用具有產生有機酸能力的微生物，獲得含有有機酸鎂的發(fā)酵液；利用銨化合物，通過對包含在所述發(fā)酵液中的有機酸鎂進行鹽交換，生成有機酸銨和鎂化合物；以及分離上述生成的鎂化合物以獲得有機酸銨溶液。
文檔編號C12P7/40GK1878868SQ200480032790
公開日2006年12月13日 申請日期2004年11月5日 優(yōu)先權日2003年11月7日
發(fā)明者磯谷篤志, 池田英雄, 山岸兼治, 青山龍介 申請人:三菱化學株式會社, 味之素株式會社