專利名稱：Pknb激酶和pstp磷酸酶以及鑒定抑制性物質(zhì)的方法
發(fā)明
背景技術(shù)：
領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種pknB激酶和一種pstP磷酸酶以及它們在鑒定抗菌物質(zhì)中的用途。
背景技術(shù)：
結(jié)核病(TB)是一個嚴重的公眾健康問題，全世界有1/3的人口被其病因，即結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)，所感染，每年有超過兩百萬的人死于該疾病(Dye et al.，1999，WHO Global SurveillanceMonitoring Project J Am Med Assoc 282677-686)。全球結(jié)核藥物開發(fā)聯(lián)盟(Global Alliance for TB Drug Development)已提出可以通過開發(fā)更有效的縮短治療持續(xù)時間的治療劑和通過納入對潛伏的桿菌起作用的藥物大大地改進目前的治療(Global Alliance for TB DrugDevelopment.(2001)Scientific blueprint for tuberculosis drugdevelopment.Tuberculosis 811-52)。面臨開發(fā)新的治療策略的緊迫性，更好地了解病原體的病理生理學及其與宿主免疫系統(tǒng)間的復雜關(guān)系顯得至關(guān)緊要。
吸入后，傳染性桿菌被肺中的肺泡巨噬細胞所吞噬并誘導局部促炎反應，這使得單核細胞從血流中補充到感染部位(Dannenberg，A.M.(1999)Pathophysiologybasic aspects.In Tuberculosis andNontuberculous Mycobacterial Infections.Schlossberg，D.，(ed.).PhiladelphiaW.B.Saunders Company，pp.17-47；Russell，2001，NatureRev Mol Cell Biol 2569-577)。通過在這些未激活的巨噬細胞中阻斷吞噬體與溶酶體的融合(Brown et al.，1969，Nature 221658-660；Sturgill-Koszycki et al.，1996，EMBO J 156960-6968)，結(jié)核分枝桿菌避免了被殺死，并大量繁殖。隨著免疫應答的進展，巨噬細胞和T細胞蓄積形成一肉芽腫，在該肉芽腫中含有以潛伏狀態(tài)存在的病原體(Parrish et al.，1998，TIBS 6107-112；Manabe and Bishai，2000，Nature Med 61327-1329)。該病原體可休眠多年，僅當免疫系統(tǒng)由于年老、營養(yǎng)不良或AIDS(獲得性免疫缺陷綜合征)而衰退時才復活。肉芽腫的中心隨后發(fā)生液化，結(jié)核分枝桿菌大量復制并被釋放到支氣管樹中，產(chǎn)生傳染性的咳嗽(Dannenberg，1999，Pathophysiologybasicaspects.In Tuberculosis and Nontuberculous Mycobacterial Infections.Schlossberg，D.，(ed.).PhiladelphiaW.B.Saunders Company，pp.17-47)。為了理解細菌對于宿主環(huán)境中的這些變化的應答，對參與分枝桿菌信號傳導的調(diào)節(jié)蛋白的研究因此是極為重要的。
磷酸化作用，一種簡單而有效的可逆地改變蛋白質(zhì)的生化特性的方式，是信號傳導和幾乎全部生物學功能的調(diào)節(jié)的主要機制。存在兩種主要的磷酸化信號傳導系統(tǒng)。原核生物最主要使用雙組分系統(tǒng)，其最簡單的形式中包含一具有組氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的信號傳感器和應答調(diào)節(jié)物，通常為轉(zhuǎn)錄因子(Wurgler-Murphy and Saito，1997，TIBS 22172-176；Stock et al.，2000，Annu Rev Biochem 69183-215)。這一簡單的單向機制使得可以對突然的環(huán)境變化產(chǎn)生快速應答。第二種系統(tǒng)依賴于絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基的可逆磷酸化作用，并被廣泛地使用于真核細胞中(Hanks and Hunter，1995，F(xiàn)ASEB J 9576-596；Hunter，1995，Cell 80225-236；Barford et al.，1998，Annu Rev Biophys BiomolStruct 27133-164；Hunter，2000，Cell 100113-127)。這一機制涉及到蛋白激酶和磷蛋白磷酸酶的級聯(lián)和網(wǎng)絡(luò)中的作用(Hunter，2000，Cell100113-127)，提供了一種用于傳導信號的快速調(diào)節(jié)的有效方式以服務(wù)于高度調(diào)節(jié)的功能。
自從幾年前鑒定到第一個細菌同源物( -Dorado et al.，1991，Cel 67995-1006)，基因組學現(xiàn)在已經(jīng)證明絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸蛋白激酶和磷酸酶也廣泛分布在于原核生物中(Zhang，1996，MolMicrobiol 209-15；Kennell.，2002，F(xiàn)EMS Microbiol Lett 2061-8)。原核生物中的這兩種磷酸化機制(雙組分系統(tǒng)和Ser/Thr/Tyr激酶和磷酸酶)可以調(diào)節(jié)不同的功能或在相同的信號途徑中共同作用。已經(jīng)提出了Ser/Thr和Tyr激酶和磷酸酶在原核生物中的存在似乎與復雜的多級發(fā)育周期有關(guān)，并且可能在調(diào)節(jié)生長和發(fā)育(異形囊胞、子實體或孢子形成)中發(fā)揮作用(Zhang 1996，Mol Microbiol 209-15；Shi etal.，1998，F(xiàn)EMS Microbiol Rev 22229-253)。盡管很少被了解，結(jié)核分枝桿菌的休眠狀態(tài)可以被認為在某些方面與孢子形成相似(Demaio etal.，1996，Proc Natl Acad Sci USA 932790-2794)并因此涉及到這些酶。
結(jié)核分枝桿菌使用了這兩種蛋白質(zhì)磷酸化系統(tǒng)。其具有15個傳感器His激酶和15個應答調(diào)節(jié)物，形成了至少11個功能對，以及11個推定的Ser/Thr蛋白激酶(STPK)、一個含磷-Ser/Thr磷酸酶(ppp，在本申請中被重新命名為pstP)和兩個Tyr磷酸酶(ptpA、ptpB)(Coleet al.，1998，Nature 393537-544)。這兩個Tyr磷酸酶，ptpA和ptpB，似乎沒有對應的Tyr激酶，此外這兩個Tyr磷酸酶可以被分泌(Koul etal.，2000，Microbiology 1472307-2314；Cowley et al.，2002，ResMicrobiol 153233-241)。這11個STPK中的8個被預測為是跨膜蛋白，其具有推定的胞外信號傳感器結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域。6個STPK(PknA、B、D、E、F、G)已經(jīng)作為重組蛋白被表達并顯示出是功能性激酶(Peirs et al.，1997，Eur J Biochem 244604-612；Av-Gayet al.，1999，Infect Immun 675676-5682；Koul et al.，2001，J Bacteriol1825425-5432；Chaba etal.，2002，Eur J Biochem 2691078-1085；PknE的數(shù)據(jù)未顯示)。
目前，還沒有清楚地證明這些來自結(jié)核分枝桿菌STPK或磷酸酶中的任一種的生理學功能，也未有剔除突變體被報道。
鑒于上述，仍然有發(fā)展用于分枝桿菌感染的新靶的和治療的必要。
發(fā)明概述


圖1幾種放線菌中包括pknB和pstP基因的推定的操縱子的保守結(jié)構(gòu)。編碼以下信號傳導元件PknA、PknB、PstP和兩種具有FHA結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的基因與兩種參與肽聚糖合成的基因，即pbpA和rodA，被協(xié)同定位。該基因簇在所有基因組中是保守的。這一基因簇在迄今為止已知的所有放線菌基因組中都是保守的，包括那些在本申請中提到的放線菌，結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)、麻風分枝桿菌(M.leprae)、谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)和天藍色鏈霉菌(S.coelicolor，注意在天藍色鏈霉菌基因組中缺少基因)以及例如白喉棒桿菌(C.diphteriae)、C.efficiens、嗜高溫放線菌(Thermobifida fusca)和長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)。
圖2A和2B圖2APstP的結(jié)構(gòu)組成，JM；近膜區(qū)域，TM；跨膜區(qū)域。
圖2BPstP的催化結(jié)構(gòu)域與人PP2C(SEQ ID NO1和2)的一級序列比對，保守殘基加框。與金屬離子和磷酸鹽的結(jié)合相關(guān)的PP2C的氨基酸用星號標示。序列上方給出了二級結(jié)構(gòu)元件。
圖3A-3C圖3A純化至PstP1-240同質(zhì)性。通過親和力和尺寸排阻層析純化具有組氨酸標簽的PstP1-240。然后通過SDS-PAGE電泳對純度進行檢測。PstP1-240在凝膠上作為獨立的離散帶顯示，其表觀分子量(32kDa)略高于預期值(27.6kDa)。
圖3B和3CPstP1-240對含磷殘基(phosphoresidues)的特異性分析。用[γ-33P]ATP在絲氨酸和蘇氨酸殘基上或在酪氨酸殘基上對MBP(圖3B)和α-酪蛋白(圖3C)進行磷酸化。用不同的含磷底物(phosphosubstrates)溫育濃度漸增的純化的PstP1-240后，對放射性同位素標記的無機磷酸鹽的釋放進行測定。
圖4A和4B圖4APknB的結(jié)構(gòu)組成。
圖4B細菌STPK的推定的傳感器結(jié)構(gòu)域的序列比對。進行BLAST搜索以探測與PknB C-末端結(jié)構(gòu)域最相似的蛋白質(zhì)序列。然后，本申請發(fā)明人從其中選擇了與結(jié)核分枝桿菌PknB最為相似的9個STPK，即來自麻風分枝桿菌(M.leprae)、谷氨酸棒桿菌、C.efficiens、嗜高溫放線菌、長雙歧桿菌、天藍色鏈霉菌和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的STPK(SEQ ID NO3-12)。用CLUSTALW對這些蛋白質(zhì)的C-末端結(jié)構(gòu)域序列進行比對。這些STPK的胞外結(jié)構(gòu)域由3-4個PASTA結(jié)構(gòu)域組成，用不同的框表示。這些重復結(jié)構(gòu)域可能是由于復制引起的。
圖5A和5B圖5APknB1-279的激酶活性自磷酸化和MBP磷酸化分析。在存在或不存在MnCl2的條件下，用[γ-33P]ATP單獨溫育純化的PknB1-279或同時溫育其與模型激酶底物MBP兩者。將反應產(chǎn)物溶解在考馬斯蘭染色的SDS-PAGE凝膠上(左側(cè)板)，然后進行干燥和放射自顯影(右板)。如在其它磷蛋白的觀測結(jié)果一樣，SDS-PAGE中的蛋白質(zhì)的表觀分子量顯著高于32kDa的預期值。二價陽離子對PknB1-279的激酶活性的影響。在MBP磷酸化分析中使用不同濃度的MnCl2或MgCl2。磷光成像(Phosphorlmager)分析后獲得了在MBP上摻入的磷酸鹽的相對定量。
圖6A和6B用堿性磷酸酶去磷酸化之前(圖6A)和之后(圖6B)，PknB的MALDI光譜。
圖7A和7C將PknB1-279用作PstP1-240的底物進行去磷酸化分析，以及PstP1-240對PknB1-279去磷酸化后對其激酶活性的影響。
圖7A在[γ-33P]ATP存在的情況下將自磷酸化的PknB1-279用作PstP1-240的底物。作為對照，將MnCl2從反應緩沖液中省略。在變性凝膠上對反應產(chǎn)物進行電泳。左側(cè)板考馬斯蘭染色的凝膠；右側(cè)板放射自顯影圖。
圖7B不經(jīng)預先標記，通過SDS-PAGE中的蛋白質(zhì)遷移的移動而觀察PknB的去磷酸化。
圖7C用或不用PstP1-240預溫育PknB1-279圖中指示的時間。然后將MBP和γATP用作底物測定激酶活性。隨著磷光成像(Phosphorlmager)的繪圖獲得了激酶活性的相對定量。
圖8A-8CPknB1-279中的磷酸化位點的鑒定圖8A用PstP處理前(上部板)和處理后(下部板)，PknB1-279的胰蛋白酶消化產(chǎn)物的HPLC分離。人工收集級分并通過MALDI-MS進行分析，當最后鑒定肽所必需時通過PSD-MS進行部分測序。僅與這一工作相關(guān)的肽被標注在層析圖中峰1，單磷酸化His-標簽肽(m/z＝1848.61，計算的單一同位素質(zhì)量＝1848.84)；峰2，His-標簽肽(m/z＝1768.91，計算的單一同位素質(zhì)量＝1768.84，序列GSSHHHHHHSSGLVPR-SEQ ID NO13)；峰3，雙磷酸化S162-R189肽(m/z＝2979.17，計算的單一同位素質(zhì)量＝2979.34)；和峰4，S162-189肽(m/z＝2819.53，計算的單一同位素質(zhì)量＝2819.41)。
圖8B用來自峰3的樣本獲得的詳細PSD光譜。對應于-80Da、-98Da、-(80+98)Da、-(98+98)Da的信號強烈地指示在被分析樣本中的絲氨酸和/或蘇氨酸殘基中存在兩個磷酸根基團。
圖8C整合PSD光譜以確認通過測序所鑒定到的肽(SEQ ID NO14)并定位磷酸化殘基(從y-離子系列得到的測量值，以Da計y3＝374.0；y5＝600.1；y6＝687.2；y7＝799.8；y8＝962.0；y9＝1091.0；y10＝1162.3；y11＝1262.5；y12＝1319.4；y13＝1433.1；y14＝1533.2；y15＝1603.3；y16＝1674.4；y17-98＝1757.3；y18-98＝1886.1；y19-98-98＝1969.0；y19-98＝2067.4；y19＝2165.4)。
圖9A和9BPknB中推定的磷酸鹽結(jié)合位點。
圖9A根據(jù)電荷用顏色編碼的PknB(PDB代碼1O6Y)的表面圖解。4個暴露的精氨基酸殘基簇能夠提供所述兩個磷酸化蘇氨酸殘基Thr171和Thr173的結(jié)合位點。來自活化環(huán)(連接Ile163到Ala180并包括這兩含磷蘇氨酸)的16個殘基在結(jié)晶結(jié)構(gòu)中是無序的。
圖9B小鼠PKA(PDB代碼1ATP)的等價圖，其中對應于PknB中缺少的區(qū)域示于stick representation中。含磷-Thr197的磷酸根基團使氫鍵結(jié)合與兩個精氨酸和一個組氨酸殘基相互作用。
圖10PknB的活化環(huán)突變體的激酶活性。已經(jīng)對丙氨酸突變體和野生型PknB1-279進行了平行的MBP磷酸化分析。以磷光成像獲得激酶活性的相對定量T171A、T173A和T171/173A突變體的活性分別約小于PknB1-279的活性的15、20和300倍。
發(fā)明詳述在一個操縱子中發(fā)現(xiàn)了pknB和pstP基因以及pknA(圖1)，該操縱子也包括rodA和pbpA(Cole et al.，1998，Nature 393537-544)，兩個編碼參與細胞生長過程中肽聚糖合成的形態(tài)發(fā)生蛋白的基因(Matsuhashi，1994，Utilization of lipid-linked precursors and theformation of peptidoglycan in the process of cell growth and division.InBacterial Cell Wall.Ghuysen，J.-M.，and Hakenbeck，R.，(eds).Amsterdam-LondonElsevier)。此外，這一基因組區(qū)域在近親麻風分枝桿菌中保持不變(Fsihi et al.，1996，Microbiology 1423147-3161)，盡管在這一桿菌中存在大量的基因衰變，所述衰變?nèi)コ驕缁盍顺^2400個基因包括編碼所有其它STPK(除PknL和PknG外)和兩個Tyr磷酸酶的基因(Eiglmeier et al.，2001，Leprosy Rev 72387-398)。因此，在麻風分枝桿菌中靠近染色體復制原點pknA、pknB和pstP基因的保守性強有力地表明，對應的酶可以調(diào)節(jié)重要功能，可能涉及細胞生長或分枝桿菌的潛伏。
本申請的發(fā)明人證明了Pstp特異性地進行含磷-Ser/Thr殘基的去磷酸化，其活性嚴格依賴于二價陽離子的存在。本申請發(fā)明人還報道了PknB的催化結(jié)構(gòu)域，如同源物模型所定義的那樣，是一種以其磷酸化形式存在的活性蛋白激酶。Pstp能夠使PknB去磷酸化，其隨后呈現(xiàn)出將低的激酶活性。質(zhì)譜分析在PknB的活化環(huán)中鑒定到兩個含磷蘇氨酸殘基。在丙氨酸中誘變這些蘇氨酸證明了它們在調(diào)節(jié)PknB激酶活性中的作用。因此，Pstp和PknB可以在體內(nèi)在相同的傳導路徑中相互影響，并討論了這些酶在分枝桿菌中的推定的調(diào)節(jié)功能。
在原核生物中，參與同一細胞過程的基因通常簇集在一起常常形成操縱子。因此，pknB和pstP基因在相同基因組區(qū)域中的協(xié)同定位(圖1)強化了這樣一個假設(shè)，即這些酶能參與相同的信號傳導途徑。此外，這一基因組區(qū)域的組成表明包括了額外的信號傳導元件，包括另一個STPK(即PknA)和兩個含有FHA結(jié)構(gòu)域(Rv0019c和Rv0020c)蛋白質(zhì)，所有這些在其它放線菌中也是保守的(圖1)。FHA結(jié)構(gòu)域是小(130aa)蛋白組分，其經(jīng)識別靶子分子上的磷酸化蘇氨酸介導蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用(Durocher and Jackson，2002，F(xiàn)EBS Lett 51358-66)。在真核細胞中，它們以眾多信號蛋白和調(diào)節(jié)蛋白如激酶、磷酸酶、RNA-結(jié)合蛋白以及轉(zhuǎn)錄因子的形式存在。Rv0019c(155aa)對應于一個單獨的FHA結(jié)構(gòu)域；而Rv0020c(527aa)具有兩個結(jié)構(gòu)域，CtFHA結(jié)構(gòu)域和Nt結(jié)構(gòu)域，該Nt結(jié)構(gòu)域與任何已知蛋白除了其在麻風分枝桿菌中的定向進化同源物(ML0022)外都沒有顯示出具有同源性。最近已經(jīng)表征了Rv0020c的FHA結(jié)構(gòu)域結(jié)合磷酸化肽配體的能力(Durocher et al.，2000，Mol Cell 61169-1182)。
在同一保守操縱子(圖1)中還發(fā)現(xiàn)兩個基因，pbpA和rodA，其編碼參與控制細胞形狀和細胞生長過程中肽聚糖的合成的蛋白質(zhì)(Matsuhashi，1994，Utilization of lipid-linked precursors and theformation of peptidoglycan in the process of cell growth and division.InBacterial Cell Wall.Ghuysen，J.-M.，and Hakenbeck，R.，(eds).Amsterdam-LondonElsevier)。細胞生長和發(fā)育要求細胞壁具有動態(tài)結(jié)構(gòu)。實際上，細胞壁在生長和發(fā)育的過程中例如孢子形成過程中以及在應答環(huán)境變化的過程中持續(xù)地變化。此外，形態(tài)學上的適應例如細胞壁增厚可能對于緩慢生長的致病性分枝桿菌在厭氧條件下的生存是非常重要具有決定性的(Cunningham and Spreadbury，1998，JBacteriol 180801-808)。通過青霉素結(jié)合蛋白(PBP)合成交聯(lián)的細菌細胞壁的主要成分肽聚糖，其是錨定于膜的具有兩個外部催化組分的酶。一些PBP僅與生長或發(fā)育的特異相的轉(zhuǎn)糖基酶活性有關(guān)，它們分別與一個膜蛋白配偶體相連接。因此在大腸桿菌中，PBP2和RodA負責細胞延長過程中肽聚糖合成和桿狀的決定，而PBP3和FtsW涉及細胞分裂(分割作用)過程中的肽聚糖合成。在枯草芽孢桿菌中，同源配偶體(PBP和SpoVE)被認為參與了孢子形成。
因此，PknA、PknB和PstP，以及其它信號調(diào)節(jié)子，并列調(diào)節(jié)生長過程中的細胞延長。實際上，近來的數(shù)據(jù)表明了PknA在細胞延長中的調(diào)節(jié)作用(Chaba et al.，2002，Eur J Biochem 2691078-1085)，且已推測PknB的胞外結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合未連接的肽聚糖(Yeats et al.，2002，TIBS 27438-440)。激酶和磷酸酶可能在控制這種復雜的整合路徑上具有相反的作用。細胞延長過程的嚴格調(diào)節(jié)因此可能是分枝桿菌發(fā)育過程中的一個關(guān)鍵因素，并且提供了胞內(nèi)/胞外生長期與肉芽腫內(nèi)潛在的生活方式之間的聯(lián)系。本申請所給出的數(shù)據(jù)支持了本申請所述的信號調(diào)節(jié)子用于開發(fā)抗菌制劑的這一目的，所述制劑例如有能靶向處于其生活周期的不同階段的結(jié)核分枝桿菌的抗結(jié)核制劑。
本發(fā)明的pstp2磷酸酶包含如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。本發(fā)明的pknB蛋白激酶包含如SEQ ID NO3所的氨基酸序列。編碼所述氨基酸序列的多核苷酸可以利用已知的遺傳密碼子和密碼子的簡并性容易地確定在一個實施方式中，與本申請所述pstp2和pknB氨基酸序列或編碼所述氨基酸序列的多核苷酸具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％和至少99％相同性的蛋白質(zhì)或多核苷酸也包括在本發(fā)明中。優(yōu)選，所述蛋白質(zhì)具有如本申請所述的蛋白激酶或磷酸酶活性。這些蛋白質(zhì)保留了本申請所述的蛋白激酶或磷酸酶活性的至少5％、10％、15％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或能超過本申請所述的蛋白激酶或磷酸酶活性的100％。
這些多核苷酸能在嚴格條件下與pknB和pstp2氨基酸序列的編碼多核苷酸序列雜交。術(shù)語“嚴格條件”或“嚴格雜交條件”包括某一多核苷酸將與其靶序列雜交至相對于與其它序列的雜交更可被檢測這樣的條件(例如至少超過背景的2倍)。高度嚴格條件包括于37℃在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中進行雜交，并于60-65℃在0.1XSSC中進行洗滌。氨基酸和多核苷酸相同性、同源性和/或相似性可以用ClustalW運算法則(MEGALIGNTM，Lasergene，Wisconsin)確定。
編碼pknB和pstp2蛋白質(zhì)的多核苷酸可以位于單一的多核苷酸分子中，例如載體或相連的多核苷酸分子。在一個實施方式中，編碼pknB和pstp2蛋白質(zhì)的多核苷酸存在于一個多核苷酸分子上，利于存在于一個細菌操縱子中。編碼pknB和pstp2蛋白質(zhì)的多核苷酸也可以在同一多核苷酸例如載體中含有rodA(SEQ ID NO19)和/或pbpA基因(SEQ ID NO20)。所述多核苷酸也可以存在于重組細菌宿主細胞中，例如大腸桿菌或分枝桿菌(例如結(jié)核分支桿菌)。在這些細菌細胞中，所述基因可以從一個獨立的多核苷酸例如載體或操縱子被表達；或可以各自不同地表達；以及可以是與殘留蛋白質(zhì)之間的兩個或三個的組合而在分離的多核苷酸上表達。
本發(fā)明的一個實施方式是篩選調(diào)節(jié)本申請所述的pknB和pstp2蛋白質(zhì)中之一或兩者的活性的物質(zhì)。調(diào)節(jié)pknB和pstp2中的之一或兩者的活性的物質(zhì)可以被用做抗菌制劑，尤其是用于治療由分枝桿菌例如結(jié)核分枝桿菌所引起的感染。篩選物質(zhì)的方法包括用本申請所述的pknB和pstp2蛋白質(zhì)中之一或兩者接觸宿主細胞，測定pknB和pstp2蛋白質(zhì)中之一或兩者的蛋白激酶和/或磷酸酶活性，并比較接觸前宿主細胞中的或已用所述物質(zhì)接觸過的對照組宿主細胞中的pknB和pstp2蛋白質(zhì)中之一或兩者的活性。pknB和pstp2蛋白質(zhì)中之一或兩者的相對活性的變化表明所述物質(zhì)在調(diào)節(jié)那些活性中是有效的。
從而，本發(fā)明還包括用于鑒定調(diào)節(jié)pknB蛋白激酶活性的物質(zhì)的方法，該方法包括
用所述物質(zhì)接觸重組細菌細胞，其中所述重組細菌細胞表達pknB蛋白激酶，且其中所述pknB蛋白激酶包含SEQ ID NO3的氨基酸序列或與SEQ ID NO3有至少70％，或75％、80％、85％、90％、95％和98％的相同性并具有蛋白激酶活性的氨基酸序列；測量來自所述細菌細胞的所述pknB蛋白激酶活性；和將來自用所述物質(zhì)接觸過的重組細菌細胞和來自未用所述物質(zhì)接觸的細菌細胞的pknB蛋白激酶活性進行比較，其中來自用所述物質(zhì)接觸過的重組細菌細胞的蛋白激酶活性相對于來自未用所述物質(zhì)接觸的細菌細胞的蛋白激酶活性的變化表明所述物質(zhì)調(diào)節(jié)pknB蛋白激酶的活性。
另一方面，本發(fā)明還包括一種用于鑒定調(diào)節(jié)pstp2磷酸酶活性的物質(zhì)的方法，該方法包括用所述物質(zhì)接觸重組細菌細胞，其中所述重組細菌細胞表達pstp2磷酸酶，且其中所述pstp2磷酸酶包含SEQ ID NO1的氨基酸序列或與SEQ ID NO1有至少70％，或75％、80％、85％、90％、95％和98％的相同性并具有磷酸酶活性的氨基酸序列；測量來自所述重組細菌細胞的所述pstp2磷酸酶活性；和將來自用所述物質(zhì)接觸過的重組細菌細胞和來自未用所述物質(zhì)接觸的細菌細胞的pstp2磷酸酶活性進行比較，其中來自用所述物質(zhì)接觸過的重組細菌細胞的磷酸酶活性相對于來自未用所述物質(zhì)接觸的細菌細胞的磷酸酶活性的變化表明所述物質(zhì)調(diào)節(jié)pstp2磷酸酶的活性。
在另一個實施方式中，上述鑒定的物質(zhì)可以被用于檢測抗菌活性，例如抑制分枝桿菌優(yōu)選結(jié)核分枝桿菌。該方法將包括用所述物質(zhì)接觸一個或一群待測細胞并測定相對于未用所述物質(zhì)接觸的細胞或用所述物質(zhì)接觸前的相同細菌細胞該細菌細胞的生長和/或存活是否被削弱了。
上面鑒定的物質(zhì)可以通過任何化學或生物方法合成。
上面鑒定的物質(zhì)可以被制備在含有一種或多種已知的在生理學上可接受的稀釋劑和/或載體的配制品中。所述物質(zhì)也能被用于或施用于需要抗菌治療的哺乳動物患者，例如被結(jié)核分枝桿菌感染的人。
實施例實驗程序序列分析和建模為了進行生化和結(jié)構(gòu)(Ortiz-Lombardía et al.，2003，J Biol Chem27813094-13100)的研究，最初用同源性模型方法定義了PknB的催化激酶核心。從蛋白數(shù)據(jù)庫中選擇了10個最接近的序列，用CLUSTALW進行多重比對。手動編輯比對結(jié)果后，將與PknB享有最高相同性的5條序列(即C.elegans Twitchin kinase、兔磷酸化酶激酶、小鼠PKA以及人CDK6和CDK2)用做模板用于同源性模型。使用這些模板的不同組合構(gòu)建起了不同的模型家族，并用MODELLER程序(v.4.0)進行精修。最前后一致的模型的比較使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)ly 279鑒定為可能是限定激酶催化核心的C-末端的α螺旋I的端點。
克隆和誘變將含pknB(Rv0014c)和pstP(Rv0018c)的粘粒MTCY10H4用于亞克隆實驗中。首次獲得了對應于推定的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(催化結(jié)構(gòu)域+近膜序列-氨基酸1-331)的PknB結(jié)構(gòu)，由于激酶核心外部的一些區(qū)域能夠穩(wěn)定所述催化結(jié)構(gòu)域。以下引物被用于PCR擴增正向引物(具有NdeI位點)5′-GATAGCCATATGACCACCCCTTCC-3′(SEQ ID NO15)和反向引物(5′-TAA密碼子+HindIII位點)5′-AAACCGAAGCTTAACGGC CCACCG-3′(SEQ ID NO16)。利用基因工程化的NdeI和HindIII位點將經(jīng)消化并純化的PCR產(chǎn)物被連接到pET28表達載體中。PknB1-331被作為一種主要的異源蛋白表達，這可能反映出其磷酸化狀態(tài)的異源性，因為在近膜區(qū)域檢測到了不同的磷酸化殘基(數(shù)據(jù)未顯示)。因此獲得了對應于核心催化結(jié)構(gòu)域(氨基酸1-279)的一個較短的結(jié)構(gòu)，其通過定點誘變引入了一個終止密碼子。PknB突變體(T171A、T173A、T171/173A)都通過相同的方法從這一最后結(jié)構(gòu)獲得。
使用以下引物將完整的pstP基因亞克隆到pET28表達載體中正向因物(具有NdeI位點)5′-CGGGGGCATATGGC GCGCGTGA-3′(SEQ ID NO17)和反向引物(TAA密碼子+HindIII位點)5′-GCAGTCGTAAGCTTATGCCGCCG-3′(SEQ ID NO18)。然后通過定點誘變引入一個終止密碼子從而獲得了對應于PstP的催化結(jié)構(gòu)域(氨基酸1-240)。
所有的誘變都根據(jù)Quick Change Strata gene程序進行。按如下購買酶T4DNA連接酶、NdeI和DpnI限制性酶購自Biolabs，HindIII和BglII限制性酶購自Pharmacia，Pfu和Pfu turbo聚合酶購自Stratagene。所有結(jié)構(gòu)都通過DNA測序進行鑒定。
蛋白質(zhì)表達和純化于37℃，在含抗生素(卡那霉素，30μg/ml)的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中生長用適當?shù)馁|(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)細菌直至對數(shù)生長后期。添加1mM IPTG后，于低溫下(15℃)誘導表達12-16小時。在蛋白酶抑制劑存在的情況下，于50mM Hepes緩沖Ph7、0.2MNaCl中重懸細菌顆粒，并進行超聲波處理。通過離心(20,000g，30min-1h)除去裂解產(chǎn)物。使用FPLC系統(tǒng)將含有可溶解蛋白質(zhì)的上清液施用于Ni-柱(Pharmacia)并用咪唑梯度(0-0.5M)進行洗提。需要進行進一步的凝膠過濾(Superdex 75)步驟以從蛋白質(zhì)分離出團聚物質(zhì)單體蛋白質(zhì)并除去咪唑和絕大多數(shù)的Ni2+陽離子。隨后通過Macro-和Micro-sep濃縮器(Pall/Gellman)對蛋白質(zhì)進行濃縮。用Bio-Rad蛋白質(zhì)分析測定蛋白濃度。通過SDS-PAGE電泳檢測樣本的純度。
蛋白激酶分析在含有2mM MnCl2、100μM ATP和1μCi[γ-33P]ATP的20μl激酶緩沖液(Hepes 50mM pH7，DTT 1mM，Brij350.01％)中進行激酶分析。為分析二價陽離子偏好使用了不同濃度的MnCl2或MgCl2，如圖5中所指出的那樣。為了分析自磷酸化使用了5μM最終的純化PknB。為了分析PknB或PknB突變體對MBP底物的磷酸化作用，酶/底物的比率為1∶20，激酶含量為0.5μM。隨著所述激酶的添加反應開始，并于30℃進行反應10min。為了分析PknB和PknB突變體對MBP磷酸化的動力學，在每一指示時間取出10μl等分量的共60μl的反應混合物。添加SDS-PAGE樣本緩沖液和EDTA(終濃度25mM)終止反應。將10μl的反應產(chǎn)物用于電泳。在每種情況中，在12％的SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離所述反應產(chǎn)物，并通過放射自顯影術(shù)顯示放射性同位素標記的蛋白質(zhì)。為了獲得放射性同位素標記的ATP摻入的相對定量，也使用磷光成像工具(STORM，Molecular Dynamics)對該放射性樣本進行分析。為了檢測用PstP溫育不同時間后的PknB的激酶活性，分別以硫代-γATP和[35S]ATP-γS替代ATP和[γ-33P]ATP。[γ-33P]ATP和[35S]ATP-γS購自Amersham Biosciences。MBP購自Invitrogen。
蛋白磷酸酶分析用MBP或α-酪蛋白(SIGMA)分析PstP對含磷Ser/Thr或含磷Tyr蛋白質(zhì)的去磷酸化作用。用PKA的催化亞單位或Abl蛋白酪氨酸激酶通過蛋白質(zhì)的磷酸化作用制備磷酸化[33P]Ser/Thr-底物或[33P]Tyr-底物。在每種情況中，在含有1mM ATP、75μCi[γ-33P]ATP、200μM底物和25單位PKA或10單位Abl激酶的200μl緩沖液(50mM HepespH7.5、5mM MgCl2、1mM EGTA、2mM DTT、0.01％Brij35)中進行激酶反應。于30℃溫育該反應物5h。通過TCA沉淀回收磷酸化底物，并于4℃相對于含有0.1mM EDTA、2mM DTT和0.01％Brij35的25mM Tris緩沖液pH7.5進行大量透析。在25μl含有50mM Hepes緩沖液pH7.5、0.1mM EDTA、1mM DTT和0.01％Brij35、5mM MnCl2的反應混合物中進行去磷酸化分析。磷酸化的[33P]底物所使用的終濃度對應于10μM摻入的磷酸鹽。隨著不同濃度(直至200ng/25μl，≈0.3μM)的純化PstP的添加反應開始，并于30℃溫育10min。通過添加冷卻的20％TCA終止該反應。離心后，將可溶解物質(zhì)添加到閃爍液中并計算無機磷酸鹽的釋放。絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶PP1和酪氨酸磷酸酶T-細胞PTP被分別用作含磷Ser/Thr底物和含磷Tyr底物的去磷酸化作用的對照(未顯示)。首先使用根據(jù)上述方案制備的自磷酸化[33P]-PknB進行PstP對PknB的去磷酸化作用，除不添加額外的激酶外。在15μl的50mM Hepes緩沖液pH7、1mM DTT、0.01％Brij35和2mM MnCl2中進行反應。分別在5μM和1μM時使用[33P]-PknB和PstP，并于30℃溫育30min。將反應產(chǎn)物在SDS-PAGE凝膠上進行解析，干燥凝膠的放射自顯影圖顯示出標記的丟失。PstP對PknB的去磷酸化作用也通過在凝膠上出現(xiàn)了對應于去磷酸化PknB的更低的條帶而簡單地被檢測。于30℃在10μl相同的緩沖液中進行該反應10min，不同之處在于使用1μM的PknB底物，添加從50-300nM的不同濃度的磷酸酶PstP。
質(zhì)譜分析通過在整個肽混合物以及用胰蛋白酶(Promega，在50mM的碳酸氫銨緩沖液中每20-50μg蛋白質(zhì)樣本0.5μg，pH 8.4，于35℃溫育過夜)消化的蛋白質(zhì)的純化HPLC級分中的質(zhì)量測量進行磷酸化位點的鑒定。從而鑒定到了覆蓋PknB1-279序列的90％的26種胰蛋白酶處理的肽(數(shù)據(jù)未顯示)，而不能檢測到產(chǎn)生小于5個氨基酸殘基的消化肽產(chǎn)物。在一些試驗中，在蛋白酶裂解前用磷酸酶對蛋白質(zhì)進行處理購自Roche Diagnostics的堿性磷酸酶(根據(jù)廠商所提供的指示于35℃溫育1h的分析混合物中的每20-40μg蛋白質(zhì)為20酶單位)或本部分其它地方所描述的純化的PstP酶。
在裝有N2激光源(λ＝337nm)的Voyager DE-PRO系統(tǒng)(AppliedBiosystems)進行MALDI-TOF質(zhì)譜分析。在20kV的加速電壓下獲得了線性和反射模式的陽離子質(zhì)譜。對肽使用α-氰基-4-肉桂酸或?qū)Φ鞍踪|(zhì)使用芥子酸(均作為乙腈-H2O中的0.2％三氟乙酸中的飽和溶液(50％，v/v))對基質(zhì)進行預處理。在單一同位素溶液的條件下，在反射模式中測量肽的質(zhì)量，外部校準后的精確度接近于50p.p.m.。為了這一目的，以下肽質(zhì)量標準的混合物被包括在內(nèi)([MH]+單一同位素質(zhì)量，濃度)血管緊張素I(1296.68，2pmol/μl)、ACTH 18-39clip(2093.08，2pmol/μl)、ACTH 18-39clip(2465.20，1.5pmol/μl)和ACTH7-38clip(3657.93，3pmol/μl)。當不時用存在于PknB胰蛋白酶消化產(chǎn)物中的已表征好的肽進行內(nèi)部質(zhì)量校準時獲得了更好的精確性。對于線性模式中的PknB蛋白的質(zhì)量測量，面包酵母的烯醇酶(質(zhì)子化分子離子[MH]+的平均質(zhì)量＝46.672，[MH2]+2＝23.336)被用校準標準。用于MS的樣本通常是通過直接在樣本平板上點滴0.5μl基質(zhì)溶液和0.5μl肽溶液，或來自基質(zhì)溶液所洗提的脫鹽微柱的小滴(見以下)而制備。
遵循儀器制造商所提供的用法說明，所選擇的分離自HPLC的肽通過產(chǎn)生自樣本的y-離子系列的PSD-MS分析進行測序(Kaufmann etal.，1993，Rapid Comme7 Mass Spectrum 7902-910)。當需要有額外的數(shù)據(jù)以通過MS測序確認磷酸化位點時，遵循公開的程序(Resing etal.，1995，Biochemistry 349477-9487)，用Ba(OH)2處理相應的胰蛋白酶處理的肽以對絲氨酸或蘇氨酸殘基進行去磷酸化。
在裝有于H2O中的0.1％三氟乙酸(溶劑A)的反向柱(VydacC18，150×2.1mm)中進行HPLC分離，并用于乙腈中的0.07％三氟乙酸梯度(溶劑B)進行洗提。層析條件如下流速0.2ml/min、記錄紙2mm/min；梯度為0min-20min為高達10％的B、20min-100min為高達30％的B、100min-110min為高達50％的B、110min-115min為高達100％的B，然后用等度100％B再處理5min；于220nm通過UV進行檢測。
計算了野生型和突變體PknB酶的顯示出不同的磷酸化程度和模式的胰蛋白酶處理的肽A162-R189的相對量(表1)。測量經(jīng)純化和鑒定的HPLC峰的峰大小(根據(jù)MS和PSD-MS測量)并通過各個肽的層析回應進行校正，所述層析回應預先在如上述相同的層析條件下進行檢測。
為了進行質(zhì)量測量，不時在N2氣流下對HPLC級分進行濃縮、凍干或固定化到反相Poros 10 R2珠(Applied Biosystems)上。后者也是用于除去批量或自制微柱中的小肽或蛋白質(zhì)樣本的鹽分的有用程序(Gobom et al.，1999，J Mass Spectrom 34105-116)。用GPMAW32(v.4.02)程序(Lighthouse Data)進行實際的胰蛋白酶消化和其它質(zhì)量計算。
結(jié)果PstP是一種Ser/Thr蛋白磷酸酶PstP基因(Rv0018c)編碼一種推定的514aa的跨膜蛋白(Cole etal.，1998，Nature 393537-544)，其具有一富含脯氨酸和絲氨酸殘基的C末端胞外結(jié)構(gòu)域(196aa)(圖2A)。推定的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(301aa)與真核Ser/Thr蛋白磷酸酶PPM家族的成員同源(Bork et al.，1996，Protein Sci 51421-1425)。PstP與人PP2C的催化結(jié)構(gòu)域(PPM家族的原型成員)的序列比對的結(jié)果示于圖2B。盡管PstP僅顯示出與人的酶有17％的相同性，所有對應于關(guān)鍵結(jié)構(gòu)元件的基序(Bork et al.，1996，Protein Sci 51421-1425)都存在于PstP序列中。人PP2C的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)揭示了金屬離子催化的去磷酸化機制(Das et al.，1996，EMBO J 156798-6809)。如圖2B中所示，所有參與金屬陽離子和磷酸鹽結(jié)合的殘基在PstP中都是保守的，這暗示了磷酸鹽識別和催化的一個共同機制。
PstP與其它PPM磷酸酶家族成員的多重比對預測Asp 240是催化結(jié)構(gòu)域的最后一個殘基。因此，His-標簽構(gòu)建體PstP1-240作為可溶解蛋白質(zhì)在大腸桿菌中被生產(chǎn)(圖3A)。使用不同的底物對蛋白磷酸酶活性和對含磷氨基酸的特異性進行檢測。用蛋白激酶A(PKA)在絲氨酸和蘇氨酸殘基中的任一種上對髓磷脂堿性蛋白(MBP)和α-酪蛋白進行磷酸化，或使用放射標記的ATP以Abl激酶在酪氨酸殘基上進行磷酸化。如圖3A和3B中所示，PstP使含磷Ser/Thr底物去磷酸化，但對含磷Tyr底物顯示出少量的活性或沒有活性。此外，PstP磷酸酶活性嚴格依賴于二價陽離子，相對于Mg2+更優(yōu)選Mn2+(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，與基于序列同源性的預測相一致，這些結(jié)果證明PstP的胞內(nèi)區(qū)域是一種屬于PPM家族的Ser/Thr蛋白磷酸酶。
PknB的C末端結(jié)構(gòu)域與在多種細菌STPK中發(fā)現(xiàn)的C末端結(jié)構(gòu)域相似PknB被預測為是一626aa的跨膜蛋白，其具有一胞內(nèi)N-末端激酶結(jié)構(gòu)域(331aa)和一胞外C-末端結(jié)構(gòu)域(276aa)(圖4)。STPK的這一結(jié)構(gòu)組成被發(fā)現(xiàn)在植物中存在并作為脊椎動物中的轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)家族細胞因子的受體，其中C-末端結(jié)構(gòu)域是一信號傳感器。這也適用于來自原核生物的跨膜STPK。PknB的C-末端結(jié)構(gòu)域與幾種原核STPK的C-末端結(jié)構(gòu)域，包括放線菌(棒狀桿菌、鏈霉菌、雙歧桿菌)和其它革蘭氏陽性細菌(李斯特氏菌、芽孢桿菌、鏈球菌)，顯示出一定程度的序列相似性(圖4B)。這些蛋白質(zhì)呈現(xiàn)出具有最近被描述的PASTA結(jié)構(gòu)域(代表青霉素結(jié)合蛋白和絲氨酸/蘇氨酸激酶相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，Yeats et al.，2002，TIBS 27438-440)的不同拷貝數(shù)，PknB中4個。這表明所有這些激酶都能夠應答于一種相似類型的配體。實際上，已推測所述PASTA結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合未連接的肽聚糖(Yeats et al.，2002，TIBS 27438-440)，不過沒有試驗證據(jù)可用于證實這一主張。值得注意的是，在上述微生物的相同基因組區(qū)域發(fā)現(xiàn)了編碼推定的Ser/Thr蛋白磷酸酶的基因，這表明了與STPK的功能性相關(guān)。實際上，最近已經(jīng)公開了來自枯草芽孢桿菌的PrkC激酶和PrpC磷酸酶形成了這樣的一個體內(nèi)配對，它們對穩(wěn)定期生理具有相反的影響(Gaidenko et al.，2002，J Bacteriol 1846109-6114)。
PknB的催化結(jié)構(gòu)域是一種功能性激酶先前已經(jīng)表征了全長的重組PknB蛋白，結(jié)果顯示其擁有STPK活性(Av-Gay et al.，1999，Infect Immun 675676-5682)。為了進行詳細的生化和結(jié)構(gòu)研究，本申請發(fā)明人已將注意力集中在其催化結(jié)構(gòu)域上。與Ser/Thr蛋白激酶家族成員的多重序列比對以及基于可利用的三維結(jié)構(gòu)的同源建模指出Gly 279是該催化結(jié)構(gòu)域的C-末端α螺旋中最后一個殘基。因此，對應于PknB(PknB1-279)的第1-279位氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)域已作為一種可溶解的、單體His-標簽蛋白在大腸桿菌中被制備(圖5A)。
在自磷酸化檢測中或使用MBP作為建模底物對PknB1-279的激酶活性進行檢測。與全長復性PknB相似(Av-Gay et al.，1999，InfectImmun 675676-5682)，PknB1-279進行自磷酸化，并對MBP進行磷酸化(圖5A)。凝血酶消化的PknB1-279(即沒有His-標簽)也發(fā)生自磷酸化，這表明在PknB催化結(jié)構(gòu)域上存在特定的自磷酸化位點(數(shù)據(jù)未顯示)。激酶活性依賴于二價陽離子(圖5A)，PknB1-279清楚地顯示出比Mg2+更強的Mn2+偏好(圖5B)。這些觀測結(jié)果證明，當獨立表達時，PknB的催化結(jié)構(gòu)域具有固有的激酶活性，這暗示了該蛋白的其它區(qū)域(例如近膜區(qū)域)不是穩(wěn)定活性構(gòu)象所必需的。
最近在2.2分辨率(Ortiz-Lombardía et al.，2003，J Biol Chem27813094-13100)和3分辨率(Young et al.，2003，Nature Struct Biol10168-174)測定的與核苷酸復合的PknB的催化核心的結(jié)構(gòu)為這些觀測結(jié)果提供了進一步的支持。PknB催化結(jié)構(gòu)域被發(fā)現(xiàn)與其真核同源物非常相似并共享許多最初被描述于PKA的基本特點(Knighton etal.，1991，Science 253407-414)。特別地，在它們的活性構(gòu)象中發(fā)現(xiàn)了所有的氨基酸殘基和對催化作用重要的其它結(jié)構(gòu)元件(Ortiz-Lombardía et al.，2003，JBiol Chem 27813094-13100)。
PknB1-279的不同制劑在MALDI-TOF質(zhì)譜試驗中產(chǎn)生了相對寬的綜合質(zhì)量峰，在m/z＝32538時具有最大強度，在分別接近80Da、98Da或160Da時信號較微弱(數(shù)據(jù)未顯示)。用PstP或堿性磷酸酶處理后，峰移向m/z＝32291(未剪切的PknB1-279的序列預測平均質(zhì)量為32281Da)，這表明至少除去了3個連接到該蛋白質(zhì)上的磷酸根基團(圖6A和6B)。但是，本申請發(fā)明人沒有在PknB的3D結(jié)構(gòu)中檢測到任何磷酸化殘基(Ortiz-Lombardía et al.，2003，J Biol Chem27813094-13100)。由于整個催化結(jié)構(gòu)域(除覆蓋大部分活化環(huán)的殘基A164-T179外)在電子密度圖中很好地定義，這表明推定的含磷殘基應該在該蛋白的無序或可變部分被發(fā)現(xiàn)，即延伸到催化核心外和/或在該活化環(huán)自身內(nèi)的N-末端肽，與最近由Yong et al.，提出的這一區(qū)域的推定的磷酸化位點一致(Yong et al.，2003，Nature Struct Biol 10168-174)。
PstP使PknB去磷酸化并抑制其激酶活性全長PknB已經(jīng)顯示出在Ser和Thr殘基上發(fā)生了自磷酸化(Av-Gay et al.，1999，Infect Immun 675676-5682)，所引起的問題是PknB1-279是否可以成為PstP的底物。為了闡明這一可能性，在存在或不存在MnCl2的條件下用PstP進行溫育前，用放射性ATP對PknB1-279進行自磷酸化。如圖7中所示，PstP能使PknB去磷酸化。磷酸鹽水解也被凝膠上的PknB遷移伴隨標記丟失的變化所反映，更低的條帶對應于去磷酸化PknB。在凝膠遷移率上的這些差異被利用以進一步監(jiān)測磷酸酶反應而無需前述的放射性標記(圖7B)。PstP對PknB的去磷酸化也表明在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組激酶在體內(nèi)是磷酸化的。
然后，本申請發(fā)明人尋求PknB的去磷酸化是否能對它的激酶活性產(chǎn)生影響。為了闡明這個問題，用Pstp預溫育PknB，在激酶反應中用硫代-γATP替換ATP。該分析的合理性在于PknB使底物硫代磷酸化的能力，而PstP對這些硫代含磷底物(thiophosphosubstrates)沒有活性(數(shù)據(jù)未顯示)。在這些條件下，可以在沒有來自磷酸酶活性的干擾的情況下測量激酶活性。圖7C表示用PstP對PknB預先去磷酸化抑制了對MBP的激酶活性。這些結(jié)果強有力地表明PknB的磷酸化狀態(tài)對于維持完整活性的激酶很重要。
PknB的活化環(huán)中的兩個含磷蘇氨酸的鑒定將質(zhì)譜用于鑒定在PknB1-279中檢測到的含磷殘基。PknB1-279或PstP-處理的PknBt-279的胰蛋白酶消化產(chǎn)物(覆蓋了PknB1-279序列的90％)反相層析圖的比較揭示了一些被選擇的肽的洗提模式中的變化(圖8A)。這一觀測結(jié)果與在反射和線性模式中獲自對應的完整肽混合物的MS的結(jié)果相一致(數(shù)據(jù)未顯示)。在線性模式中，可以從未經(jīng)處理的PknB1-279鑒定到兩個含磷肽。在m/z＝1850.1時的信號被指定給His-標簽肽和一個磷酸根基團([MH]+肽的計算的平均質(zhì)量＝1849.9)，在m/z＝2981.3時的一個強信號被指定給雙磷酸化胰蛋白酶處理的肽A162-R189(計算質(zhì)量＝2981.0)，其包括活化環(huán)的一大部分。值得注意的是，除了當用磷酸酶例如堿性磷酸酶或PstP預處理PknB1-279時以外，沒有檢測到非磷酸化A162-R189肽的MS信號(計算質(zhì)量＝2821.1)。僅在這種情況下在線性和反射模式中都觀測到明顯的質(zhì)量信號(m/z＝2820.8)。
當在反射模式中進行MS測量鑒定分離的肽級分時進一步確認了這些結(jié)果。因此，編號為1和2的峰(圖8A)被分別指定給非單磷酸化和非磷酸化His-標簽肽，而峰3被指定給雙磷酸化A162-R189肽。一旦用PstP進行處理，峰1的大小減少，峰2大小增加以及峰3幾乎消失，推測產(chǎn)生了對應于未磷酸化的A162-R189肽的峰4。
來自峰3的樣本的源后衰變質(zhì)譜(Post-source decay massspectrometry，PSD-MS)測量確認了在肽中存在兩個磷酸根基團(圖8B)。通過對純化自不同獨立批次的PknB組的HPLC峰3的PSD-MS測序獲得了所述磷酸化殘基的最終鑒定和定位。這一分析表明A162-R189肽在Thr171和Thr173上是磷酸化的(圖8C)。在所有的情形中，這些位點的磷酸化接近100％，表明這些蘇氨酸被系統(tǒng)地和均勻地連接到磷酸鹽上。PknB胰蛋白酶消化產(chǎn)物隨著時間和蛋白質(zhì)的不同制劑的HPLC模式極其恒定并可復制。但是，在一些實驗中，可以觀測到肩狀部或甚至觀察到小峰(只在圖8中的峰3前)，其m/z＝3061.1(數(shù)據(jù)未顯示)。這被鑒定為A162-R189肽的一個三磷酸化類型(計算質(zhì)量＝3061.3)。第3個含磷位點是一個絲氨酸，其不能通過測序明確確定，并可能對應于Ser166或Ser169中之一。
上述MS結(jié)果鑒定了兩個來自活化環(huán)的蘇氨酸殘基作為PknB自磷酸化和PstP去磷酸化的靶的，Thr171和Thr173。這些殘基是這兩個PknB晶體結(jié)構(gòu)的部分無序區(qū)域(Ortiz-Lombardía et al.，2003，JBiol Chem 27813094-13100；Young et al.，2003，Nature Struct Biol 10168-174)。但是，該蛋白質(zhì)的分子表面的電荷分布檢測揭示了一個暴露的堿性殘基簇，這些殘基被優(yōu)先定位以為含磷蘇氨酸殘基提供一個錨定位點(圖9A)。在晶體結(jié)構(gòu)中這些精氨酸殘基具有部分無序或可變的側(cè)鏈，這可能反映了沒有結(jié)合的底物。當與結(jié)合活化環(huán)中的含磷-Thr197的PKA(Knighton et al.，1991，Science 253407-414)中的一個相似的聚簇比較時(圖9B)，發(fā)現(xiàn)PknB中的正電荷區(qū)域涵蓋了更寬的表面區(qū)域，提高了這一區(qū)域結(jié)合Thr 171和Thr 173兩者的磷酸根基團的可能性。
PknB的活化環(huán)突變體為了確認并進一步分析鑒定到的含磷蘇氨酸在PknB激酶活性中的作用，這些殘基被單獨或組合突變?yōu)楸彼帷Ｖ苽鋯瓮蛔凅wT171A、T173A和雙突變體T171/173A，并且MBP磷酸化檢測中對其進行分析。通過所述突變體進行MBP磷酸化的動力學比較(圖10)表明各單突變對激酶活性的影響程度相似，分別比PknB的活性低15和20倍。雙突變的活性低300倍，這表明兩個含磷蘇氨酸對激酶活性的組合效應。這些結(jié)果確認活化環(huán)的雙磷酸化是完整的激酶活性所必需的，并明確地證明兩種含磷蘇氨基酸都參與其中。
遵循上述用于野生型酶的相同的實驗方案，這些突變體也被用于檢測磷酸化氨基酸殘基的存在和定位以及在每一位點的磷酸化程度(表1)。當與野生型酶相比較時，N-末端His-標簽肽在3個突變體中顯示出一致的低磷酸化程度，這反映了突變體較低的活性。對于野生型酶，突變體T171A主要在活化環(huán)中被去磷酸化，涉及到的殘基為Ser169和Thr173。但是，Ser169的磷酸化沒有恢復野生型活性且看上去沒有扮演功能性角色。另一方面，T173A突變體顯示出主要在Thr171發(fā)生單磷酸化(一個更小的HPLC信號可以被指定給在殘基Thr171和Ser166或Ser169發(fā)生雙磷酸化類型)。對來自胰蛋白酶消化的雙突變體T171/173A的肽的分析證明了非磷酸化(36％)和一個單磷酸化(在Ser166或Ser169)A162-R189肽類型的存在。概而言之，兩個單突變在剩余的蘇氨酸上均仍然顯示出完全磷酸化，且單突變和雙突變的活性降低沒有顯示出協(xié)同的行為，這表明Thr171和Thr173是獨立的含磷位點。此外，丟失每個含磷位點也觀測到相似的激酶活性的降低，這表明這兩個含磷蘇氨酸對于PknB活性是同等重要的。
表1


盡管結(jié)核分枝桿菌編碼11個STPK(Cole et al.，1998，Nature 393537-544)，只存在一個清楚的絲氨酸/蘇氨基蛋白磷酸酶，PstP，其是PPM家族的一個成員(Bork et al.，1996，Protein Sci 51421-1425)。本申請的發(fā)明人在本發(fā)明中表明其催化結(jié)構(gòu)域，PstP1-240，使已經(jīng)在絲氨酸或蘇氨酸上發(fā)生磷酸化的底物去磷酸化，而不是使已經(jīng)在酪氨酸殘基上發(fā)生磷酸化的底物去磷酸化。此外，其活性嚴格依賴于Mn2+或Mg2+離子，這與推論的該家族的金屬離子催化的去磷酸化作用機制相一致(Das et al.，1996，EMBO J 156798-6809)。
在它的氨基酸序列的基礎(chǔ)上，PknB(和所有其它分枝桿菌STPK)已經(jīng)被分類于原核STPK的Pkn2家族(Leonard et al.，1998，GenomeRes 81038-1047)，該基因簇最類似于它們的真核對應體以及可能是隨著復雜的發(fā)育周期從真核早期橫向轉(zhuǎn)移到細菌的而產(chǎn)生。重組全長PknB已被顯示擁有激酶活性并在絲氨酸和蘇氨酸殘基上都擁有自磷酸化位點(Av-Gay et al.，1999，Infect Immun 675676-5682)。如序列同源性所限定的那樣，本申請發(fā)明人研究了限于所述催化核心結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，PknB1-279。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這一結(jié)構(gòu)是一種活性激酶，表明近膜區(qū)域不是活性所必需的，不過它仍然參與了進一步的穩(wěn)定或活性調(diào)節(jié)(見以下)。
已描述了真核蛋白激酶的各種調(diào)節(jié)機制(Johnson et al.，1996，Cell 85149-158；Hubbard and Till，2000，Annu Rev Biochem 69373-398；Huse and Kuriyan，2002，Cell 109275-282)。經(jīng)過對接近催化和/或底物結(jié)合位點的控制，或通過參與催化作用或底物識別的結(jié)構(gòu)元件的重排列可以發(fā)生活性和失活形式之間的轉(zhuǎn)變。此外，可以發(fā)生與其它蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或輔因子的相互作用。值得注意的是，經(jīng)自催化機制或通過其他相關(guān)激酶和磷酸酶的作用，這些調(diào)節(jié)機制中有很多涉及磷酸化作用/去磷酸化作用(催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)部或外部)。
本發(fā)明的研究表明PknB的催化結(jié)構(gòu)域在體外發(fā)生自磷酸化，且當在大腸桿菌中表達時被磷酸化。為了了解是否PknB自磷酸化可以發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，本申請發(fā)明人首先鑒定了PknB中的磷酸化位點。質(zhì)譜分析表明所述活化環(huán)的兩個蘇氨酸殘基(Thr171和Thr173)被系統(tǒng)地磷酸化(推測為自磷酸化)。其它真核蛋白激酶也在其活化環(huán)中顯示出兩個磷酸化位點，例如MKK1(兩個Ser殘基，Alessi et al.，1994.EMBO J 01610-1619)或ERK2(一個Thr和一個Tyr殘基，兩個殘基都必須被磷酸化以形成活性酶，Robbins et al.，1993，J Biol Chem2685097-5106)。活化環(huán)是大量激酶中活性/失活構(gòu)象轉(zhuǎn)變的主要控制元件(Steinberg et al，1993，Mol Cell Biol 132332-2341；Johnson et al，1996，Cell 85149-158；Huse and Kuriyan.2002，Cell 109275-282)，所述激酶的構(gòu)象通常取決于它們的磷酸化狀態(tài)(Johnson et al.，1996 Cell85149-158)。根據(jù)其結(jié)構(gòu)定位，這一環(huán)可以控制對催化位點的接近和所述底物的結(jié)合。一個寬范圍的調(diào)節(jié)特性已經(jīng)被指定給這一環(huán)，例如有助于催化殘基的適當比對、校正這兩個裂片(lobes)的相對方位、使得底物結(jié)合和/或刺激ATP結(jié)合(Huse and Kuriyan，2002 Cell109275-282)。
PknB的去磷酸化作用對它的激酶活性的抑制效應表明磷酸化對于完整的活性是必需的。通過活化環(huán)蘇氨酸殘基的誘變研究對此進行了進一步確認。與野生型酶比較，這兩個單突變體仍然在剩余的蘇氨酸上被磷酸化，呈現(xiàn)出可供比較的、降低的活性，而所述雙突變進一步增加了活性。因此，Thr171和Thr173發(fā)揮獨立和相當?shù)牡珔s互補的功能以達到最大激酶活性。
PknB中的含磷蘇氨酸殘基的結(jié)構(gòu)功能仍然不清楚，因為所述活化環(huán)在晶體結(jié)構(gòu)中是無序的(Ortiz-Lombardía et al.，2003 J Biol Chem27813094-13100；Young et al.，2003 Nature Struct Biol 10168-174)。這在激酶結(jié)構(gòu)中不罕見。這在活性和失活激酶中都被觀測到，且沒有顯示出特定的磷酸化狀態(tài)。在一些激酶中，所述環(huán)的磷酸化固定了其構(gòu)象(Johnson et al.，1996 Cell 85149-158)，因此無序能夠指示部分磷酸化。但是，對于PknB似乎不是這種情形，因為盡管兩個蘇氨酸被完全磷酸化，但所述活化環(huán)在晶體結(jié)構(gòu)中沒有定義的結(jié)構(gòu)。相反，PknB環(huán)的穩(wěn)定可以基于肽底物的結(jié)合發(fā)生，這可以經(jīng)過誘導的合適機制或通過與激酶核心外的其它因子的額外的分子內(nèi)或分子間相互作用完成。在任一情形中，在PknB結(jié)構(gòu)中在預期的含磷蘇氨酸結(jié)合位點觀測到正電荷區(qū)域，等價于在PKA中的結(jié)合單磷酸化蘇氨酸，Thr197，的相似聚簇(圖9A-9B)。
總之，這些結(jié)果強有力地表明PknB激酶活性可以經(jīng)自磷酸化作用機制，通過其活化環(huán)的在體內(nèi)的磷酸化狀態(tài)而被調(diào)節(jié)。觀測來自其它結(jié)核分枝桿菌STPK的活化環(huán)序列可以得出有意思的結(jié)果。一個或兩個蘇氨酸在除兩個STPK(具有較短環(huán)的PknG和PknI)以外的所有STPK中都是保守的，這表明這些酶也應該通過在它們的活化環(huán)中的自磷酸化作用被調(diào)節(jié)。因此，除相同的總3D結(jié)構(gòu)和催化機制外，真核生物和原核生物激酶還可能享有該調(diào)節(jié)機制，盡管原來認為在原核生物中缺少這一過程(Motley and LorL，1999 Infect Immun675386-5394)。顯然需要進一步研究以確定PstP對PknB的去磷酸化作用與該蛋白磷酸酶對其它激酶的效應之間的生理學相關(guān)性，尤其是存在于相同操縱子的特定PknA。
可以存在其他的激酶調(diào)節(jié)機制。PknB被推定為是一種跨膜蛋白質(zhì)，其具有一推定的外部配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、與在傳感器組氨酸激酶(Parkinson，1993 Cell 73857-871)和受體酪氨酸激酶(Schlessinger，2000 Cell 103211-225)中發(fā)現(xiàn)的組織相似。配體與后者的胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合通常促進了受體二聚化和/或結(jié)構(gòu)重排，所述結(jié)構(gòu)重排引起自磷酸化并因此激活該激酶結(jié)構(gòu)域。有趣地，最近已經(jīng)報道了PrkC的二聚化(Madec et al.，2002 Mol Microbiol 46571-586)，PrkC是來自枯草芽孢桿菌的跨膜STPK，其與PknB在Nt和Ct結(jié)構(gòu)域都同源(圖4B)。另一調(diào)節(jié)機制，被描述適用于I型TGF-β受體或絲氨酸/蘇氨酸激酶(Huse et al.，1999 Cell 96425-436)和Ephrin受體酪氨酸激酶(EphB2)(Wybenga-Groot et al.，2001 Cell 106745-757)，包括經(jīng)近膜區(qū)域與激酶結(jié)構(gòu)域的相互作用對滅活狀態(tài)的保持。一旦發(fā)生EphB2的配體刺激，近膜序列中的Tyr殘基的自磷酸化解除了抑制并使得這一序列可用以與靶蛋白的SH2結(jié)構(gòu)域進一步相互作用(Wybenga-Groot et al.，2001 Cell 106745-757)。在PknB1-279中缺失近膜區(qū)域。也制備了一個PknB的重組結(jié)構(gòu)，其對應于所述激酶的催化核心加上近膜序列(參見實驗程序)。在近膜序列中鑒定到包括Thr294和Thr309在內(nèi)的3個磷酸化位點(數(shù)據(jù)未顯示)。
顯然，在上述教導下可以對本發(fā)明做大量的修飾和變化。因此，應理解成在所附加的權(quán)利要求的范圍內(nèi)，可以按與本申請中具體記載的方式所不同的方式實施本發(fā)明。
序列表<110>巴斯德研究院<120>PKNB激酶和PSTP磷酸酶以及鑒定抑制性物質(zhì)的方法<130>D22486<140>PCT/IB2004/003096<141>2004-07-19<150>US 60/487,943<151>2003-07-18<160>20<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>514<212>PRT<213>Mycobacterium tuberculosis<400>1Met Ala Arg Val Thr Leu Val Leu Arg Tyr Ala Ala Arg Ser Asp Arg1 5 10 15Gly Leu Val Arg Ala Asn Asn Glu Asp Ser Val Tyr Ala Gly Ala Arg20 25 30Leu Leu Ala Leu Ala Asp Gly Met Gly Gly His Ala Ala Gly Glu Val35 40 45Ala Ser Gln Leu Val Ile Ala Ala Leu Ala His Leu Asp Asp Asp Glu50 55 60Pro Gly Gly Asp Leu Leu Ala Lys Leu Asp Ala Ala Val Arg Ala Gly65 70 75 80Asn Ser Ala Ile Ala Ala Gln Val Glu Met Glu Pro Asp Leu Glu Gly85 90 95Met Gly Thr Thr Leu Thr Ala Ile Leu Phe Ala Gly Asn Arg Leu Gly100 105 110Leu Val His Ile Gly Asp Ser Arg Gly Tyr Leu Leu Arg Asp Gly Glu115 120 125Leu Thr Gln Ile Thr Lys Asp Asp Thr Phe Val Gln Thr Leu Val Asp130 135 140Glu Gly Arg Ile Thr Pro Glu Glu Ala His Ser His Pro Gln Arg Ser145 150 155 160Leu Ile Met Arg Ala Leu Thr Gly His Glu Val Glu Pro Thr Leu Thr165 170 175
Met Arg Glu Ala Arg Ala Gly Asp Arg Tyr Leu Leu Cys Ser Asp Gly180 185 190Leu Ser Asp Pro Val Ser Asp Glu Thr Ile Leu Glu Ala Leu Gln Ile195 200 205Pro Glu Val Ala Glu Ser Ala His Arg Leu Ile Glu Leu Ala Leu Arg210 215 220Gly Gly Gly Pro Asp Asn Val Thr Val Val Val Ala Asp Val Val Asp225 230 235 240Tyr Asp Tyr Gly Gln Thr Gln Pro Ile Leu Ala Gly Ala Val Ser Gly245 250 255Asp Asp Asp Gln Leu Thr Leu Pro Asn Thr Ala Ala Gly Arg Ala Ser260 265 270Ala Ile Ser Gln Arg Lys Glu Ile Val Lys Arg Val Pro Pro Gln Ala275 280 285Asp Thr Phe Ser Arg Pro Arg Trp Ser Gly Arg Arg Leu Ala Phe Val290 295 300Val Ala Leu Val Thr Val Leu Met Thr Ala Gly Leu Leu Ile Gly Arg305 310 315 320Ala Ile Ile Arg Ser Asn Tyr Tyr Val Ala Asp Tyr Ala Gly Ser Val325 330 335Ser Ile Met Arg Gly Ile Gln Gly Ser Leu Leu Gly Met Ser Leu His340 345 350Gln Pro Tyr Leu Met Gly Cys Leu Ser Pro Arg Asn Glu Leu Ser Gln355 360 365Ile Ser Tyr Gly Gln Ser Gly Gly Pro Leu Asp Cys His Leu Met Lys370 375 380Leu Glu Asp Leu Arg Pro Pro Glu Arg Ala Gln Val Arg Ala Gly Leu385 390 395 400Pro Ala Gly Thr Leu Asp Asp Ala Ile Gly Gln Leu Arg Glu Leu Ala405 410 415Ala Asn Ser Leu Leu Pro Pro Cys Pro Ala Pro Arg Ala Thr Ser Pro420 425 430Pro Gly Arg Pro Ala Pro Pro Thr Thr Ser Glu Thr Thr Glu Pro Asn435 440 445Val Thr Ser Ser Pro Ala Ser Pro Ser Pro Thr Thr Ser Ala Pro Ala450 455 460Pro Thr Gly Thr Thr Pro Ala Ile Pro Thr Ser Ala Ser Pro Ala Ala465 470 475 480Pro Ala Ser Pro Pro Thr Pro Trp Pro Val Thr Ser Ser Pro Thr Met
485 490 495Ala Ala Leu Pro Pro Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ile Asp Cys Arg Ala500 505 510Ala Ala<210>2<211>382<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Gly Ala Phe Leu Asp Lys Pro Lys Met Glu Lys His Asn Ala Gln1 5 10 15Gly Gln Gly Asn Gly Leu Arg Tyr Gly Leu Ser Ser Met Gln Gly Trp20 25 30Arg Val Glu Met Glu Asp Ala His Thr Ala Val Ile Gly Leu Pro Ser35 40 45Gly Leu Glu Ser Trp Ser Phe Phe Ala Val Tyr Asp Gly His Ala Gly50 55 60Ser Gln Val Ala Lys Tyr Cys Cys Glu His Leu Leu Asp His Ile Thr65 70 75 80Asn Asn Gln Asp Phe Lys Gly Ser Ala Gly Ala Pro Ser Val Glu Asn85 90 95Val Lys Asn Gly Ile Arg Thr Gly Phe Leu Glu Ile Asp Glu His Met100 105 110Arg Val Met Ser Glu Lys Lys His Gly Ala Asp Arg Ser Gly Ser Thr115 120 125Ala Val Gly Val Leu Ile Ser Pro Gln His Thr Tyr Phe Ile Asn Cys130 135 140Gly Asp Ser Arg Gly Leu Leu Cys Arg Asn Arg Lys Val His Phe Phe145 150 155 160Thr Gln Asp His Lys Pro Ser Asn Pro Leu Glu Lys Glu Arg Ile Gln165 170 175Asn Ala Gly Gly Ser Val Met Ile Gln Arg Val Asn Gly Ser Leu Ala180 185 190Val Ser Arg Ala Leu Gly Asp Phe Asp Tyr Lys Cys Val His Gly Lys195 200 205Gly Pro Thr Glu Gln Leu Val Ser Pro Glu Pro Glu Val His Asp Ile210 215 220
Glu Arg Ser Glu Glu Asp Asp Gln Phe Ile Ile Leu Ala Cys Asp Gly225 230 235 240Ile Trp Asp Val Met Gly Asn Glu Glu Leu Cys Asp Phe Val Arg Ser245 250 255Arg Leu Glu Val Thr Asp Asp Leu Glu Lys Val Cys Asn Glu Val Val260 265 270Asp Thr Cys Leu Tyr Lys Gly Ser Arg Asp Asn Met Ser Val Ile Leu275 280 285Ile Cys Phe Pro Asn Ala Pro Lys Val Ser Pro Glu Ala Val Lys Lys290 295 300Glu Ala Glu Leu Asp Lys Tyr Leu Glu Cys Arg Val Glu Glu Ile Ile305 310 315 320Lys Lys Gln Gly Glu Gly Val Pro Asp Leu Val His Val Met Arg Thr325 330 335Leu Ala Ser Glu Asn Ile Pro Ser Leu Pro Pro Gly Gly Glu Leu Ala340 345 350Ser Lys Arg Asn Val Ile Glu Ala Val Tyr Asn Arg Leu Asn Pro Tyr355 360 365Lys Asn Asp Asp Thr Asp Ser Thr Ser Thr Asp Asp Met Trp370 375 380<210>3<211>271<212>PRT<213>Mycobacterium tuberculosis<400>3Ile Thr Arg Asp Val Gln Val Pro Asp Val Arg Gly Gln Ser Ser Ala1 5 10 15Asp Ala Ile Ala Thr Leu Gln Asn Arg Gly Phe Lys Ile Arg Thr Leu20 25 30Gln Lys Pro Asp Ser Thr Ile Pro Pro Asp His Val Ile Gly Thr Asp35 40 45Pro Ala Ala Asn Thr Ser Val Ser Ala Gly Asp Glu Ile Thr Val Asn50 55 60Val Ser Thr Gly Pro Glu Gln Arg Glu Ile Pro Asp Val Ser Thr Leu65 70 75 80Thr Tyr Ala Glu Ala Val Lys Lys Leu Thr Ala Ala Gly Phe Gly Arg85 90 95Phe Lys Gln Ala Asn Ser Pro Ser Thr Pro Glu Leu Val Gly Lys Val100 105 110
Ile Gly Thr Asn Pro Pro Ala Asn Gln Thr Ser Ala Ile Thr Asn Val115 120 125Val Ile Ile Ile Val Gly Ser Gly Pro Ala Thr Lys Asp Ile Pro Asp130 135 140Val Ala Gly Gln Thr Val Asp Val Ala Gln Lys Asn Leu Asn Val Tyr145 150 155 160Gly Phe Thr Lys Phe Ser Gln Ala Ser Val Asp Ser Pro Arg Pro Ala165 170 175Gly Glu Val Thr Gly Thr Asn Pro Pro Ala Gly Thr Thr Val Pro Val180 185 190Asp Ser Val Ile Glu Leu Gln Val Ser Lys Gly Asn Gln Phe Val Met195 200 205Pro Asp Leu Ser Gly Met Phe Trp Val Asp Ala Glu Pro Arg Leu Arg210 215 220Ala Leu Gly Trp Thr Gly Met Leu Asp Lys Gly Ala Asp Val Asp Ala225 230 235 240Gly Gly Ser Gln His Asn Arg Val Val Tyr Gln Asn Pro Pro Ala Gly245 250 255Thr Gly Val Asn Arg Asp Gly Ile Ile Thr Leu Arg Phe Gly Gln260 265 270<210>4<211>271<212>PRT<213>Mycobacterium leprae<400>4Asn Thr Arg Asp Val Gln Val Pro Asp Val Arg Gly Gln Val Ser Ala1 5 10 15Asp Ala Ile Ser Ala Leu Gln Asn Arg Gly Phe Lys Thr Arg Thr Leu20 25 30Gln Lys Pro Asp Ser Thr Ile Pro Pro Asp His Val Ile Ser Thr Glu35 40 45Pro Gly Ala Asn Ala Ser Val Gly Ala Gly Asp Glu Ile Thr Ile Asn50 55 60Val Ser Thr Gly Pro Glu Gln Arg Glu Val Pro Asp Val Ser Ser Leu65 70 75 80Asn Tyr Thr Asp Ala Val Lys Lys Leu Thr Ser Ser Gly Phe Lys Ser85 90 95
Phe Lys Gln Ala Asn Ser Pro Ser Thr Pro Glu Leu Leu Gly Lys Val100 105 110Ile Gly Thr Asn Pro Ser Ala Asn Gln Thr Ser Ala Ile Thr Asn Val115 120 125Ile Thr Ile Ile Val Gly Ser Gly Pro Glu Thr Lys Gln Ile Pro Asp130 135 140Val Thr Gly Gln Ile Val Glu Ile Ala Gln Lys Asn Leu Asn Val Tyr145 150 155 160Gly Phe Thr Lys Phe Ser Gln Ala Ser Val Asp Ser Pro Arg Pro Thr165 170 175Gly Glu Val Ile Gly Thr Asn Pro Pro Lys Asp Ala Thr Val Pro Val180 185 190Asp Ser Val Ile Glu Leu Gln Val Ser Lys Gly Asn Gln Phe Val Met195 200 205Pro Asp Leu Ser Gly Met Phe Trp Ala Asp Ala Glu Pro Arg Leu Arg210 215 220Ala Leu Gly Trp Thr Gly Val Leu Asp Lys Gly Pro Asp Val Asp Ala225 230 235 240Gly Gly Ser Gln His Asn Arg Val Ala Tyr Gln Asn Pro Pro Ala Gly245 250 255Ala Gly Val Asn Arg Asp Gly Ile Ile Thr Leu Lys Phe Gly Gln260 265 270<210>5<211>274<212>PRT<213>Corynebacterium glutamicum<400>5Ser Thr Ala Thr Ser Ala Ile Pro Asn Val Glu Gly Leu Pro Gln Gln1 5 10 15Glu Ala Leu Thr Glu Leu Gln Ala Ala Gly Phe Val Val Asn Ile Val20 25 30Glu Glu Ala Ser Ala Asp Val Ala Glu Gly Leu Val Ile Arg Ala Asn35 40 45Pro Ser Val Gly Ser Glu Ile Arg Gln Gly Ala Thr Val Thr Ile Thr50 55 60Val Ser Thr Gly Arg Glu Met Ile Asn Ile Pro Asp Val Ser Gly Met65 70 75 80Thr Leu Glu Asp Ala Ala Arg Ala Leu Glu Asp Val Gly Leu Ile Leu
85 90 95Asn Gln Asn Val Arg Glu Glu Thr Ser Asp Asp Val Glu Ser Gly Leu100 105 110Val Ile Asp Gln Asn Pro Glu Ala Gly Gln Glu Val Val Val Gly Ser115 120 125Ser Val Ser Leu Thr Met Ser Ser Gly Thr Glu Ser Ile Arg Val Pro130 135 140Asn Leu Thr Gly Met Asn Trp Ser Gln Ala Glu Gln Asn Leu Ile Ser145 150 155 160Met Gly Phe Asn Pro Thr Ala Ser Tyr Leu Asp Ser Ser Glu Pro Glu165 170 175Gly Glu Val Leu Ser Val Ser Ser Gln Gly Thr Glu Leu Pro Lys Gly180 185 190Ser Ser Ile Thr Val Glu Val Ser Asn Gly Met Leu Ile Gln Ala Pro195 200 205Asp Leu Ala Arg Met Ser Thr Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Arg Ala210 215 220Ala Gly Trp Thr Ala Pro Asp Gln Ser Leu Ile Val Gly Asp Pro Ile225 230 235 240His Thr Ala Ala Leu Val Asp Gln Asn Lys Ile Gly Phe Gln Ser Pro245 250 255Thr Pro Ala Thr Leu Phe Arg Lys Asp Ala Gln Val Gln Val Arg Leu260 265 270Phe Glu<210>6<211>268<212>PRT<213>Thermobifida fusca<400>6Gly Arg Tyr Glu Thr Val Pro Asp Leu Val Gly Val Glu Ser Asp Glu1 5 10 15Ala Arg Arg Asp Leu Arg Met Leu Gly Phe Arg Val Gln Thr Ala Glu20 25 30Glu Pro Ala Tyr Ser Asp Glu Ala Pro Pro Gly Thr Val Ala Ala Thr35 40 45Asp Pro Glu Ala Gly Ser Arg Leu Leu Pro Asp Thr Leu Val Thr Leu50 55 60
Ile Leu Ser Ala Gly Pro Gln Tyr Val Glu Met Pro Asp Val Glu Gly65 70 75 80Ala Ser Val Ala Glu Ala Arg Asp Ala Leu Lys Glu Val Gly Leu Thr85 90 95Asp Ile Val Glu Asp Glu Ile Thr Ser Phe Asp Asn Pro Pro Gly Thr100 105 110Val Ile Thr Thr Lys Pro Ala Pro Gly Glu Lys Ala Asn Arg Glu Glu115 120 125Ser Val Thr Leu Thr Ile Ser Ala Gly Phe Pro Met Pro Asn Val Val130 135 140Gly Gln Lys Val Asp Asp Ala Arg Arg Leu Leu Glu Ser Ser Asp Leu145 150 155 160Glu Val Thr Val Val Glu Glu His His Asp Glu Val Pro Glu Gly His165 170 175Val Ile Ser Gln Glu Pro Glu Ala Glu Thr Thr Val Gly Ala Gly Gln180 185 190Ser Val Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Pro Glu Leu Val Glu Val Pro195 200 205Asp Ile Arg Gly Trp Lys Val Asp Lys Ala Arg Lys Glu Leu Glu Glu210 215 220Arg Gly Phe Glu Val Thr Val His Gln Val Ile Gly Asn Arg Val Gly225 230 235 240Asp Tyr Asn Pro Lys Gly Glu Ala Pro Lys Gly Ser Thr Ile Glu Ile245 250 255Trp Thr Ser Pro Phe Gly Arg Glu Arg Asp Arg Asp260 265<210>7<211>274<212>PRT<213>Corynebacterium efficiens<400>7Ser Ala Ser Thr Gln Gln Ile Pro Asn Ile Val Gly Leu Pro Glu Asn1 5 10 15Glu Ala Val Leu Glu Leu Glu Arg Leu Gly Phe Thr Val Val Leu Thr20 25 30Thr Glu Pro Ser Pro Asp Val Ala Glu Gly Leu Val Ile Arg Thr Ser35 40 45
Pro Asn Val Gly Ser Glu Ile Arg Glu Gly Ala Thr Val Thr Leu Thr50 55 60Ile Ser Ser Gly Arg Glu Val Val Thr Ile Pro Asp Val Thr Gly Leu65 70 75 80Thr Leu Ala Glu Ala Thr Arg Glu Ile Glu Gly Ala Gly Leu Val Leu85 90 95Asp Gln Ser Ile Arg Glu Glu Asn Ser Asp Asp Tyr Pro Ala Gly Thr100 105 110Val Ile Gln Gln Asn Pro Arg Ala Gly Gly Glu Thr Ser Val Gly Ala115 120 125Ser Ile Thr Leu Thr Val Ser Thr Gly Pro Ser Leu Val Arg Val Pro130 135 140Val Ile Thr Gly Met Gln Trp Ser Gln Ala Glu Ser Asn Ile Thr Ser145 150 155 160Leu Gly Leu Val Pro Asp Ile Tyr Tyr Val Asp Ser Leu Leu Pro Glu165 170 175Gly Gln Val Ile Ser Ala Ser Gly Gln Gly Thr Glu Leu Pro Arg Gly180 185 190Ser Thr Val Thr Val Glu Ile Ser Asn Gly Met Leu Ile Glu Ala Pro195 200 205Asp Leu Ala Arg Leu Asp Val Asp Asn Ala Leu Lys Ala Leu Arg Asp210 215 220Ala Gly Trp Thr Ala Pro Asp Thr Ser Leu Ile Glu Gly Ala Pro Ile225 230 235 240Pro Thr Gly Ala Leu Val Asp Gln Gly Arg Ile Gly Phe Gln Asp Pro245 250 255Ser Pro Gly Gln Pro Leu Arg Lys Asp Ala Val Val Asn Ile Arg Leu260 265 270Tyr Arg<210>8<211>212<212>PRT<213>Thermobifida fusca<400>8Gly Thr Asp Asn Ile Thr Ile Pro Asn Val Ala Gly Met Ser Val Glu1 5 10 15Glu Ala Thr Glu Thr Leu Gln Glu Lys Gly Phe Glu Asn Ile Glu Val20 25 30
Ala Asp Glu Pro Thr Pro Ser Asn Glu Ile Glu Glu Gly Lys Val Val35 40 45Gly Thr Asp Pro Glu Ile Gly Glu Thr Val Pro Pro Asp Thr Glu Ile50 55 60Thr Ile Leu Ile Ser Gly Gly Pro Glu Met Ile Glu Met Pro Asp Leu65 70 75 80Val Gly Met Ser Gln Ala Asp Ala Leu Gly Glu Ile Asn Arg Ala Gly85 90 95Leu Ala Arg Gly Glu Ile Thr His Gln Glu Ser Asp Glu Pro Gln Gly100 105 110Thr Val Leu Ser Thr Asp Pro Lys Ala Gly Thr Glu Val Glu Pro Gly115 120 125Thr Lys Val Asn Leu Val Val Ala Lys Ala Ser Thr Lys Val Glu Val130 135 140Pro Ser Leu Ala Gly Met Asn Glu Asp Gln Ala Arg Glu Arg Leu Ala145 150 155 160Glu Leu Gly Leu Thr Leu Glu Ala Gln Thr Gln Glu Thr Ser Asp Ala165 170 175Thr Pro Gly Thr Ala Ile Ala Gln Ser Pro Gln Ala Gly Thr Lys Val180 185 190Glu Arg Gly Thr Thr Val Thr Val Thr Phe Ala Lys Glu Pro Gln Arg195 200 205Pro Glu Pro Pro210<210>9<211>278<212>PRT<213>Bifidobacterium longum<400>9Ser Glu Asp Thr Val Thr Ile Pro Glu Val Cys Asn Ala Ser Thr Ser1 5 10 15Lys Asp Ser Ile Glu Leu Lys Leu Lys Ala Ser Gly Leu Lys Met Thr20 25 30Glu Lys Gln Asp Thr Asp Ser Thr Glu Pro Glu Gly Thr Cys Thr Lys35 40 45Met Ser Pro Asp Ala Gly Ser Lys Val Ala Lys Gly Ser Ala Val Lys50 55 60Val Trp Phe Ser Ala Gly Pro Gln Ser Thr Gln Val Pro Asp Val Lys
65 70 75 80Glu Arg Ser Gln Glu Glu Ala Arg Ser Ile Leu Glu Ser Ala Gly Phe85 90 95Lys Val Asn Ala Ala Val Lys Thr Glu Asp Ser Ala Asp Ile Ala Lys100 105 110Asp Met Val Thr Lys Thr Asp Pro Ala Ala Gly Gln Ser Val Pro Lys115 120 125Gly Thr Thr Ile Thr Ile Tyr Val Ser Ser Gly Met Thr Thr Val Pro130 135 140Ser Asn Leu Val Gly Gln Ser Lys Asp Ser Val Leu Gln Gln Tyr Glu145 150 155 160Gly Lys Phe Ser Phe Thr Val Glu Gln Glu Ser Ser Asp Thr Val Glu165 170 175Ala Gly Leu Ile Thr Arg Val Ser Pro Asp Ser Gly Ser Ser Ile Ala180 185 190Gln Gly Gly Phe Ile Thr Ile Trp Val Ser Thr Gly Lys Glu Lys Val195 200 205Ala Val Pro Asn Ile Thr Ala Gly Thr Asp Tyr Val Thr Ala Glu Leu210 215 220Met Leu Lys Ala Val Gly Leu Lys Ala Gln Ala Asn Gly Pro Thr Gly225 230 235 240Ser Thr Ala Val Val Val Ser Ile Asn Pro Gly Ala Gly Ser Gln Val245 250 255Asp Ala Gly Ser Thr Val Thr Ile Thr Thr Lys Ala Gly Ser Thr Gly260 265 270Gly Gly Thr Gly Thr Gly275<210>10<211>268<212>PRT<213>Streptomyces coelicolor<400>10Ser Gly Gln Phe Thr Lys Val Pro Pro Leu Leu Ser Lys Thr Glu Ala1 5 10 15Gln Ala Arg Asp Arg Leu Asp Asp Ala Gly Leu Asp Val Gly Lys Val20 25 30Arg His Ala Tyr Ser Asp Thr Val Glu Arg Gly Lys Val Ile Ser Thr35 40 45
Asp Pro Gly Val Gly Asp Arg Ile Arg Lys Asn Asp Ser Val Ser Leu50 55 60Thr Val Ser Asp Gly Pro Asp Thr Val Lys Leu Pro Asp Val Thr Gly65 70 75 80Tyr Lys Leu Asp Lys Ala Arg Thr Leu Leu Glu Asp Glu Gly Leu Glu85 90 95Pro Gly Met Val Thr Arg Ala Phe Ser Asp Glu Val Ala Arg Gly Phe100 105 110Val Ile Ser Thr Lys Pro Gly Ser Gly Thr Thr Val Arg Ala Gly Ser115 120 125Ala Val Ala Leu Val Val Ser Lys Gly Ser Pro Val Asp Val Pro Asp130 135 140Val Thr Gly Asp Asp Leu Asp Glu Ala Arg Ala Glu Leu Glu Gly Ala145 150 155 160Gly Leu Lys Val Lys Thr Ala Asp Glu Arg Val Asn Ser Glu Tyr Asp165 170 175Ser Gly Arg Val Ala Arg Gln Thr Pro Glu Pro Gly Gly Arg Ala Ala180 185 190Glu Gly Asp Thr Val Thr Leu Thr Val Ser Lys Gly Pro Arg Met Ile195 200 205Glu Val Pro Asp Val Val Gly Asp Ser Val Asp Asp Ala Lys Gln Lys210 215 220Leu Glu Asp Ala Gly Phe Glu Val Asp Glu Asp Arg Gly Leu Leu Gly225 230 235 240Leu Phe Gly Asp Thr Val Lys Lys Gln Ser Val Asp Gly Gly Asp Thr245 250 255Ala Pro Glu Gly Ser Thr Val Thr Ile Thr Ile Arg260 265<210>11<211>279<212>PRT<213>Streptomyces coelicolor<400>11Gly Asn Asp Lys Val Pro Val Pro Ala Phe Ile Gly Leu Ser Lys Ala1 5 10 15Asp Ala Gln Gln Gln Ala Asp Asn Ile Asp Leu Val Leu Thr Phe Lys20 25 30Gln Gln Glu Cys Glu Asp Gln Pro Lys Gly Asn Ile Cys Ala Gln Asp
35 40 45Pro Lys Gln Gly Thr Asp Val Asp Lys Glu Ser Thr Val Asn Leu Val50 55 60Val Ser Thr Gly Ala Pro Lys Val Ala Val Pro Asn Val Ile Asp Lys65 70 75 80Asn Ile Asp Glu Ala Lys Lys Gln Leu Glu Asp Lys Gly Phe Glu Val85 90 95Glu Thr Lys Gln Thr Glu Ser Ser Gln Asp Glu Gly Thr Ile Leu Ser100 105 110Gln Asn Pro Asp Pro Gly Lys Glu Leu Glu Lys Gly Ser Thr Val Thr115 120 125Leu Glu Val Ala Lys Ala Glu Glu Lys Ala Thr Val Pro Asp Val Val130 135 140Gly Arg Thr Cys Asp Glu Ala Lys Ala Gln Val Glu Ser Gly Gly Asp145 150 155 160Leu Thr Ala Val Cys Thr Asp Gln Pro Thr Asn Asp Pro Asn Gln Val165 170 175Gly Lys Val Ile Ser Thr Thr Pro Gln Ser Ser Thr Gln Val Asp Pro180 185 190Gly Ser Lys Val Thr Ile Val Val Gly Lys Ala Val Glu Lys Thr Lys195 200 205Val Pro Glu Val Arg Gly Lys Thr Leu Ala Glu Ala Arg Gln Ile Leu210 215 220Gln Gln Ser Gly Phe Thr Asn Val Gln Val Ala Gln Gly Ser Pro Gly225 230 235 240Asp Asp Asn Ala Lys Val Phe Ala Ser Asn Pro Gln Pro Gly Ser Glu245 250 255Val Asp Asp Pro Ala Ala Thr Pro Ile Thr Leu Met Thr Val Pro Gly260 265 270Asp Gly Gly Asn Gly Asn Gly275<210>12<211>277<212>PRT<213>Bacillus subtilis<400>12Met Pro Lys Asp Val Lys Ile Pro Asp Val Ser Gly Met Glu Tyr Glu
1 5 10 15Lys Ala Ala Gly Leu Leu Glu Lys Glu Gly Leu Gln Val Asp Ser Glu20 25 30Val Leu Glu Ile Ser Asp Glu Lys Ile Glu Glu Gly Leu Met Val Lys35 40 45Thr Asp Pro Lys Ala Asp Thr Thr Val Lys Glu Gly Ala Thr Val Thr50 55 60Leu Tyr Lys Ser Thr Gly Lys Ala Lys Thr Glu Ile Gly Asp Val Thr65 70 75 80Gly Gln Thr Val Asp Gln Ala Lys Lys Ala Leu Lys Asp Gln Gly Phe85 90 95Asn His Val Thr Val Asn Glu Val Asn Asp Glu Lys Asn Ala Gly Thr100 105 110Val Ile Asp Gln Asn Pro Ser Ala Gly Thr Glu Leu Val Pro Ser Glu115 120 125Asp Gln Val Lys Leu Thr Val Ser Ile Gly Pro Glu Asp Ile Thr Leu130 135 140Arg Asp Leu Lys Thr Tyr Ser Lys Glu Ala Ala Ser Gly Tyr Leu Glu145 150 155 160Asp Asn Gly Leu Lys Leu Val Glu Lys Glu Ala Tyr Ser Asp Asp Val165 170 175Pro Glu Gly Gln Val Val Lys Gln Lys Pro Ala Ala Gly Thr Ala Val180 185 190Lys Pro Gly Asn Glu Val Glu Val Thr Phe Ser Leu Gly Pro Glu Lys195 200 205Lys Pro Ala Lys Thr Val Lys Glu Lys Val Lys Ile Pro Tyr Glu Pro210 215 220Glu Asn Glu Gly Asp Glu Leu Gln Val Gln Ile Ala Val Asp Asp Ala225 230 235 240Asp His Ser Ile Ser Asp Thr Tyr Glu Glu Phe Lys Ile Lys Glu Pro245 250 255Thr Glu Arg Thr Ile Glu Leu Lys Ile Glu Pro Gly Gln Lys Gly Tyr260 265 270Tyr Gln Val Met Val275<210>13<211>16<212>PRT<213>Mycobacterium tuberculosis
<400>13Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg1 5 10 15<210>14<211>28<212>PRT<213>Mycobacterium tuberculosis<400>14Ala Ile Ala Asp Ser Gly Asn Ser Val Pro Gln Thr Ala Ala Val Ile1 5 10 15Gly Thr Ala Gln Tyr Leu Ser Pro Glu Gln Ala Arg20 25<210>15<211>24<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>synthetic oligonucleotide<400>15gatagccata tgaccacccc ttcc<210>16<211>24<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>synthetic oligonucleotide<400>16aaaccgaagc ttaacggccc accg<210>17<211>22<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>synthetic oligonucleotide<400>17cgggggcata tggcgcgcgt ga<210>18
<211>23<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>synthetic oligonucleotide<400>18gcagtcgtaa gcttatgccg ccg<210>19<211>469<212>PRT<213>Mycobacterium tuberculosis<400>19Met Thr Thr Arg Leu Gln Ala Pro Val Ala Val Thr Pro Pro Leu Pro1 5 10 15Thr Arg Arg Asn Ala Glu Leu Leu Leu Leu Cys Phe Ala Ala Val Ile20 25 30Thr Phe Ala Ala Leu Leu Val Val Gln Ala Asn Gln Asp Gln Gly Val35 40 45Pro Trp Asp Leu Thr Ser Tyr Gly Leu Ala Phe Leu Thr Leu Phe Gly50 55 60Ser Ala His Leu Ala Ile Arg Arg Phe Ala Pro Tyr Thr Asp Pro Leu65 70 75 80Leu Leu Pro Val Val Ala Leu Leu Asn Gly Leu Gly Leu Val Met Ile85 90 95His Arg Leu Asp Leu Val Asp Asn Glu Ile Gly Glu His Arg His Pro100 105 110Ser Ala Asn Gln Gln Met Leu Trp Thr Leu Val Gly Val Ala Ala Phe115 120 125Ala Leu Val Val Thr Phe Leu Lys Asp His Arg Gln Leu Ala Arg Tyr130 135 140Gly Tyr Ile Cys Gly Leu Ala Gly Leu Val Phe Leu Ala Val Pro Ala145 150 155 160Leu Leu Pro Ala Ala Leu Ser Glu Gln Asn Gly Ala Lys Ile Trp Ile165 170 175Arg Leu Pro Gly Phe Ser Ile Gln Pro Ala Glu Phe Ser Lys Ile Leu180 185 190Leu Leu Ile Phe Phe Ser Ala Val Leu Val Ala Lys Arg Gly Leu Phe195 200 205Thr Ser Ala Gly Lys His Leu Leu Gly Met Thr Leu Pro Arg Pro Arg
2l0 215 220Asp Leu Ala Pro Leu Leu Ala Ala Trp Val Ile Ser Val Gly Val Met225 230 235 240Val Phe Glu Lys Asp Leu Gly Ala Ser Leu Leu Leu Tyr Thr Ser Phe245 250 255Leu Val Val Val Tyr Leu Ala Thr Gln Arg Phe Ser Trp Val Val Ile260 265 270Gly Leu Thr Leu Phe Ala Ala Gly Thr Leu Val Ala Tyr Phe Ile Phe275 280 285Glu His Val Arg Leu Arg Val Gln Thr Trp Leu Asp Pro Phe Ala Asp290 295 300Pro Asp Gly Thr Gly Tyr Gln Ile Val Gln Ser Leu Phe Ser Phe Ala305 310 315 320Thr Gly Gly Ile Phe Gly Thr Gly Leu Gly Asn Gly Gln Pro Asp Thr325 330 335Val Pro Ala Ala Ser Thr Asp Phe Ile Ile Ala Ala Phe Gly Glu Glu340 345 350Leu Gly Leu Val Gly Leu Thr Ala Ile Leu Met Leu Tyr Thr Ile Val355 360 365Ile Ile Arg Gly Leu Arg Thr Ala Ile Ala Thr Arg Asp Ser Phe Gly370 375 380Lys Leu Leu Ala Ala Gly Leu Ser Ser Thr Leu Ala Ile Gln Leu Phe385 390 395 400Ile Val Val Gly Gly Val Thr Arg Leu Ile Pro Leu Thr Gly Leu Thr405 410 415Thr Pro Trp Met Ser Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Leu Ala Asn Tyr Ile420 425 430Leu Leu Ala Ile Leu Ala Arg Ile Ser His Gly Ala Arg Arg Pro Leu435 440 445Arg Thr Arg Pro Arg Asn Lys Ser Pro Ile Thr Ala Ala Gly Thr Glu450 455 460Val Ile Glu Arg Val465<210>20<211>491<212>PRT<213>Mycobacterium tuberculosis<400>20
Met Asn Ala Ser Leu Arg Arg Ile Ser Val Thr Val Met Ala Leu Ile1 5 10 15Val Leu Leu Leu Leu Asn Ala Thr Met Thr Gln Val Phe Thr Ala Asp20 25 30Gly Leu Arg Ala Asp Pro Arg Asn Gln Arg Val Leu Leu Asp Glu Tyr35 40 45Ser Arg Gln Arg Gly Gln Ile Thr Ala Gly Gly Gln Leu Leu Ala Tyr50 55 60Ser Val Ala Thr Asp Gly Arg Phe Arg Phe Leu Arg Val Tyr Pro Asn65 70 75 80Pro Glu Val Tyr Ala Pro Val Thr Gly Phe Tyr Ser Leu Arg Tyr Ser85 90 95Ser Thr Ala Leu Glu Arg Ala Glu Asp Pro Ile Leu Asn Gly Ser Asp100 105 110Arg Arg Leu Phe Gly Arg Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Gly Arg Asp115 120 125Pro Arg Gly Gly Asn Val Asp Thr Thr Ile Asn Pro Arg Ile Gln Gln130 135 140Ala Gly Trp Asp Ala Met Gln Gln Gly Cys Tyr Gly Pro Cys Lys Gly145 150 155 160Ala Val Val Ala Leu Glu Pro Ser Thr Gly Lys Ile Leu Ala Leu Val165 170 175Ser Ser Pro Ser Tyr Asp Pro Asn Leu Leu Ala Ser His Asn Pro Glu180 185 190Val Gln Ala Gln Ala Trp Gln Arg Leu Gly Asp Asn Pro Ala Ser Pro195 200 205Leu Thr Asn Arg Ala Ile Ser Glu Thr Tyr Pro Pro Gly Ser Thr Phe210 215 220Lys Val Ile Thr Thr Ala Ala Ala Leu Ala Ala Gly Ala Thr Glu Thr225 230 235 240Glu Gln Leu Thr Ala Ala Pro Thr Ile Pro Leu Pro Gly Ser Thr Ala245 250 255Gln Leu Glu Asn Tyr Gly Gly Ala Pro Cys Gly Asp Glu Pro Thr Val260 265 270Ser Leu Arg Glu Ala Phe Val Lys Ser Cys Asn Thr Ala Phe Val Gln275 280 285Leu Gly Ile Arg Thr Gly Ala Asp Ala Leu Arg Ser Met Ala Arg Ala290 295 300Phe Gly Leu Asp Ser Pro Pro Arg Pro Thr Pro Leu Gln Val Ala Glu
305 310 315 320Ser Thr Val Gly Pro Ile Pro Asp Ser Ala Ala Leu Gly Met Thr Ser325 330 335Ile Gly Gln Lys Asp Val Ala Leu Thr Pro Leu Ala Asn Ala Glu Ile340 345 350Ala Ala Thr Ile Ala Asn Gly Gly Ile Thr Met Arg Pro Tyr Leu Val355 360 365Gly Ser Leu Lys Gly Pro Asp Leu Ala Asn Ile Ser Thr Thr Val Gly370 375 380Tyr Gln Gln Arg Arg Ala Val Ser Pro Gln Val Ala Ala Lys Leu Thr385 390 395 400Glu Leu Met Val Gly Ala Glu Lys Val Ala Gln Gln Lys Gly Ala Ile405 410 415Pro Gly Val Gln Ile Ala Ser Lys Thr Gly Thr Ala Glu His Gly Thr420 425 430Asp Pro Arg His Thr Pro Pro His Ala Trp Tyr Ile Ala Phe Ala Pro435 440 445Ala Gln Ala Pro Lys Val Ala Val Ala Val Leu Val Glu Asn Gly Ala450 455 460Asp Arg Leu Ser Ala Thr Gly Gly Ala Leu Ala Ala Pro Ile Gly Arg465 470 475 480Ala Val Ile Glu Ala Ala Leu Gln Gly Glu Pro485 490
權(quán)利要求
1.一種用于鑒定調(diào)節(jié)pknB蛋白激酶活性的物質(zhì)的方法，該方法包括用所述物質(zhì)接觸重組細菌細胞，其中所述重組細菌細胞表達pknB蛋白激酶，且其中所述pknB蛋白激酶包含SEQ ID NO3的氨基酸序列或與SEQ ID NO3有至少70％的相同性并具有蛋白激酶活性的氨基酸序列；測量來自所述細菌細胞的所述pknB蛋白激酶活性；和將來自用所述物質(zhì)接觸過的重組細菌細胞和來自未用所述物質(zhì)接觸的細菌細胞的pknB蛋白激酶活性進行比較，其中來自用所述物質(zhì)接觸過的重組細菌細胞的蛋白激酶活性相對于來自未用所述物質(zhì)接觸的細菌細胞的蛋白激酶活性的變化表明所述物質(zhì)調(diào)節(jié)pknB蛋白激酶的活性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述pknB蛋白激酶包含SEQ ID NO3的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述pknB蛋白激酶包含與SEQ IDNO3有至少70％相同性并具有蛋白激酶活性的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述pknB包含與SEQ ID NO3有至少80％相同性并具有蛋白激酶活性的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述pknB包含與SEQ ID NO3有至少90％相同性并具有蛋白激酶活性的氨基酸序列。
6.一種用于鑒定調(diào)節(jié)pstp2磷酸酶活性的物質(zhì)的方法，該方法包括用所述物質(zhì)接觸重組細菌細胞，其中所述重組細菌細胞表達pstp2磷酸酶，且其中所述pstp2磷酸酶包含SEQ ID NO1的氨基酸序列或與SEQ ID NO1有至少70％的相同性并具有磷酸酶活性的氨基酸序列；測量來自所述重組細菌細胞的所述pstp2磷酸酶活性；和將來自用所述物質(zhì)接觸過的重組細菌細胞和來自未用所述物質(zhì)接觸的細菌細胞的pstp2磷酸酶活性進行比較，其中來自用所述物質(zhì)接觸過的重組細菌細胞的磷酸酶活性相對于來自未用所述物質(zhì)接觸的細菌細胞的磷酸酶活性的變化表明所述物質(zhì)調(diào)節(jié)pstp2磷酸酶的活性。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述pstp2磷酸酶包含SEQ ID NO1的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述pstp2磷酸酶包含與SEQ ID NO1有至少70％相同性并具有磷酸酶活性的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求6的方法，其中所述pstp2磷酸酶包含與SEQ ID NO1有至少80％相同性并具有磷酸酶活性的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求6的方法，其中所述pknB磷酸酶包含與SEQ ID NO1有至少90％相同性并具有磷酸酶活性的氨基酸序列。
11.一種鑒定抗菌物質(zhì)的方法，該方法包括根據(jù)權(quán)利要求1-5鑒定一種物質(zhì)；用所述物質(zhì)接觸細菌細胞；和比較用所述物質(zhì)接觸過的細菌細胞與未用所述物質(zhì)接觸的細菌細胞的生長和/或存活，其中細菌細胞在生長和/或存活上的削弱指示該物質(zhì)是一種抗菌物質(zhì)。
12.一種鑒定抗菌物質(zhì)的方法，該方法包括根據(jù)權(quán)利要求6-10鑒定一種物質(zhì)；用所述物質(zhì)接觸細菌細胞；和比較用所述物質(zhì)接觸過的細菌細胞與未用所述物質(zhì)接觸的細菌細胞的生長和/或存活，其中細菌細胞在生長和/或存活上的削弱指示該物質(zhì)是一種抗菌物質(zhì)。
13.一種用于制備具有抗微生物活性的物質(zhì)的方法，該方法包括根據(jù)權(quán)利要求1-5鑒定一種物質(zhì)；和合成所述物質(zhì)。
14.一種用于制備具有抗微生物活性的物質(zhì)的方法，該方法包括根據(jù)權(quán)利要求6-10鑒定一種物質(zhì)；和合成所述物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種pknB激酶和一種pstP磷酸酶以及它們在鑒定抗菌物質(zhì)中的用途。
文檔編號C12Q1/42GK1852989SQ200480026844
公開日2006年10月25日 申請日期2004年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月18日
發(fā)明者佩德羅·阿爾澤里, 布里吉特·布瓦泰爾, 安德烈亞·維拉里諾, 巴勃羅·費納德斯, 斯圖爾特·科爾 申請人:巴斯德研究院