專利名稱：用于調(diào)節(jié)玉米中細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑樣多肽的物質(zhì)和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼具有細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑樣活性的多肽的分離或純化核酸分子，互補(bǔ)和反義核酸分子，載體，宿主細(xì)胞，具有CDK抑制劑樣活性的多肽以及用于抑制和上調(diào)一個(gè)或多個(gè)CDK抑制劑樣基因在玉米中表達(dá)的物質(zhì)和方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞周期蛋白所致的CDK的激活/滅活可驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期不同階段之間的轉(zhuǎn)變。CDK活性也可被稱作KRP(Kip-相關(guān)蛋白，其中“Kip”是“激酶抑制劑蛋白”的縮寫)的CDK抑制劑調(diào)節(jié)。來源于植物和動(dòng)物系統(tǒng)的其它CDK抑制劑也稱作CKI、ICK、Cip和Ink(De Veylder，2001，Plant Cell，131653-1667)和KIS(Jasinski等人，J.Cell.Sci.，115973-982(2002))。已經(jīng)在植物，包括鼠耳芥屬和煙草中鑒定出了CDK抑制劑。植物的CDK抑制劑在羧基末端具有與p21Cip1/p27Kip1/p57Kip2型動(dòng)物CDK抑制劑的氨基末端細(xì)胞周期蛋白/CDK-結(jié)合域同源的約35個(gè)氨基酸。在羧基-末端區(qū)外，迄今鑒定出來的植物CDK抑制劑在結(jié)構(gòu)上是不同的。
發(fā)明簡述CDK抑制劑樣基因表達(dá)的抑制可導(dǎo)致細(xì)胞增殖增加和/或有絲分裂指數(shù)增加。CDK抑制劑樣基因表達(dá)的抑制還可導(dǎo)致油增多和產(chǎn)量增加。
本發(fā)明提供來源于玉米的、編碼CDK抑制劑樣多肽的分離或純化核酸分子。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，該分子包含(i)SEQ ID NO1的核苷酸序列[ZmKRP1；“Zm”表示玉米；“KRP”表示Kip相關(guān)蛋白；數(shù)字是為特定基因指定的標(biāo)號(hào)，(ii)編碼SEQ ID NO2[ZmKRPl]的氨基酸序列的核苷酸序列，(iii)所編碼的氨基酸序列與SEQ IDNO2[ZMKRP1]的氨基酸序列具有至少約70％同一性且具有CDK抑制劑樣活性的核苷酸序列，或(iv)(i)-(iii)任何一個(gè)的片段，其中該片段包含至少約35個(gè)連續(xù)核苷酸。
在另一實(shí)施方案中，該分子包含(i)SEQ ID NO3[ZmKRP2]的核苷酸序列，(ii)SEQ ID NO4[ZmKRP2]的氨基酸序列的核苷酸序列，(iii)所編碼的氨基酸序列與SEQ ID NO4[ZmKRP2]的氨基酸序列具有至少約70％同一性且具有CDK抑制劑樣活性的核苷酸序列，或(iv)(i)-(iii)任何一個(gè)的片段，其中該片段包含至少約35個(gè)連續(xù)核苷酸。
在另一實(shí)施方案中，該分子基本上由(i)SEQ ID NO7[ZmKRP4]的核苷酸序列，(ii)編碼SEQ ID NO8[ZmKRP4]的氨基酸序列的核苷酸序列，或(iii)所編碼的氨基酸序列與SEQ ID NO8[ZmKRP4]的氨基酸序列具有至少約70％同一性且具有CDK抑制劑樣活性的核苷酸序列組成。
在另一實(shí)施方案中，該分子包含(i)SEQ ID NO9[ZmKRP5]的核苷酸序列，(ii)編碼SEQ ID NO10[ZmKRP5]的氨基酸序列的核苷酸序列，(iii)所編碼的氨基酸序列與SEQ ID NO10[ZmKRP5]的氨基酸序列具有至少約70％同一性且具有CDK抑制劑樣活性的核苷酸序列，或(iv)(i)-(iii)任何一個(gè)的片段，其中該片段包含至少約120個(gè)連續(xù)核苷酸。
在另一實(shí)施方案中，該分子基本上由(i)SEQ ID NO11[ZmKRP6]的核苷酸序列，(ii)編碼SEQ ID NO12[ZmKRP6]的氨基酸序列的核苷酸序列，(iii)所編碼的氨基酸序列與SEQ ID NO12[ZmKRP6]的氨基酸序列具有至少約70％同一性且具有CDK抑制劑樣活性的核苷酸序列，或(iv)(i)-(iii)任何一個(gè)的片段，其中該片段包含至少約390個(gè)連續(xù)核苷酸組成。
鑒于上面所述，本發(fā)明還提供包含上述核酸分子的載體。還提供包含任選為載體形式的該分離或純化核酸分子的宿主細(xì)胞。
鑒于上面所述，本發(fā)明還提供由上述核酸分子編碼的分離或純化多肽。還提供任選為載體形式的分離或純化核酸分子，其包含與上述某些分子，SEQ ID NOS13、15、和17互補(bǔ)且反義的序列，和編碼SEQID NOS6、14、16、和18的氨基酸序列的核苷酸序列或基本上由所述核苷酸序列組成。當(dāng)該序列是SEQ ID NO1時(shí)，編碼SEQ ID NO2，是SEQ ID NO3時(shí)，或編碼SEQ ID NO4，該互補(bǔ)或反義序列包含至少35個(gè)連續(xù)核苷酸。
還提供包含至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄核苷酸序列的核酸，其表達(dá)導(dǎo)致選自下組的內(nèi)源性核苷酸序列的抑制SEQ ID NO1[ZmKRPl]，編碼SEQ ID NO2[ZmKRPl]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ ID NO3[ZmKRP2]，和編碼SEQ IDNO4[ZmKRP2]的氨基酸序列的核苷酸序列，上述可轉(zhuǎn)錄核苷酸序列是單獨(dú)的或與至少一個(gè)其它核苷酸序列進(jìn)一步組合，所述至少一個(gè)其它核苷酸的表達(dá)導(dǎo)致選自下組的內(nèi)源性核苷酸序列的抑制SEQ ID NO5[ZmKRP3]，編碼SEQ IDNO6[ZmKRP3]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ IDNO7[ZmKRP4]，編碼SEQ ID NO8[ZmKRP4]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ ID NO9[ZmKRP5]，編碼SEQ ID NO10[ZmKRP5]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ ID NO11[ZmKRP6]，編碼SEQ IDNO12[ZmKRP6]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ IDNO13[ZmKRP7]，編碼SEQ ID NO14[ZmKRP7]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ ID NO15[ZmKRP8]，編碼SEQ ID NO16[ZmKRP8]的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ ID NO17[ZmKRP9]，和編碼SEQ IDNO18[ZmKRP9]的氨基酸序列的核苷酸序列，其中，當(dāng)該核酸構(gòu)建體包含兩個(gè)或多個(gè)可轉(zhuǎn)錄核苷酸序列時(shí)，該核苷酸序列可以任何順序存在于該核酸構(gòu)建體上且可以是多順反子的，其中每個(gè)可轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列包含至少約100個(gè)連續(xù)核苷酸，且其中每個(gè)可轉(zhuǎn)錄核苷酸序列的表達(dá)任選誘導(dǎo)基因抑制。
在另一實(shí)施方案中，該核酸構(gòu)建體包含至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄核苷酸序列，其表達(dá)導(dǎo)致選自SEQ ID NO7[ZmKRP4]和/或SEQ IDNO17[ZmKRP9]的內(nèi)源性核酸序列的抑制，其中一個(gè)或兩個(gè)可轉(zhuǎn)錄核苷酸序列與至少一個(gè)其它可轉(zhuǎn)錄核苷酸序列進(jìn)一步組合，其表達(dá)導(dǎo)致選自下組的內(nèi)源性核苷酸序列的抑制(i)SEQ ID NO1[ZmKRPl]或編碼SEQ ID NO2[ZmKRPl]的氨基酸序列的核苷酸序列，(ii)SEQ ID NO3[ZmKRP2]或編碼SEQ ID NO4[ZmKRP2]的氨基酸序列的核苷酸序列，
(iii)SEQ ID NO5[ZmKRP3]或編碼SEQ ID NO6[ZmKRP3]的氨基酸序列的核苷酸序列，條件是該可轉(zhuǎn)錄核苷酸序列與SEQ ID NO5的核苷酸175-342不完全對(duì)應(yīng)，(iv)SEQ ID NO9[ZmKRP5]或編碼SEQ ID NO10[ZmKRP5]的氨基酸序列的核苷酸序列，條件是該可轉(zhuǎn)錄核苷酸序列與SEQ ID NO9的核苷酸450-570不完全對(duì)應(yīng)，(v)SEQ ID NO11[ZmKRP6]或編碼SEQ ID NO12[ZmKRP6]的氨基酸序列的核苷酸序列，條件是該可轉(zhuǎn)錄核苷酸序列與SEQ ID NO11的核苷酸380-765不完全對(duì)應(yīng)，(vi)SEQ ID NO13[ZmKRP7]或編碼SEQ ID NO14[ZmKRP7]的氨基酸序列的核苷酸序列，條件是該可轉(zhuǎn)錄核苷酸序列與SEQ ID NO13的核苷酸335-718不完全對(duì)應(yīng)，和(vii)SEQ ID NO15[ZmKRP8]或編碼SEQ ID NO16[ZmKRP8]的氨基酸序列的核苷酸序列，條件是該可轉(zhuǎn)錄核苷酸序列與SEQ IDNO15的核苷酸350-405或420-698不完全對(duì)應(yīng)，其中可轉(zhuǎn)錄核苷酸序列可以任何順序存在于該核酸構(gòu)建體上且可以是多順反子的，其中每個(gè)可轉(zhuǎn)錄核苷酸序列包含至少約100個(gè)連續(xù)核苷酸，且其中每個(gè)可轉(zhuǎn)錄核苷酸序列的表達(dá)任選誘導(dǎo)基因抑制。
在另一實(shí)施方案中，該核酸構(gòu)建體包含至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄核苷酸序列，其表達(dá)導(dǎo)致選自下組的內(nèi)源性核苷酸的抑制(i)SEQ ID NO1[ZMKRP1]或編碼SEQ ID NO2[ZmKRP1]的氨基酸序列的核苷酸序列，(ii)SEQ ID NO3[ZmKRP2]或編碼SEQ NO4[ZmKRP2]的氨基酸序列的核苷酸序列，(iii)SEQ ID NO5[ZmKRP3]或編碼SEQ ID NO6[ZmKRP3]的氨基酸序列的核苷酸序列，條件是該可轉(zhuǎn)錄核苷酸序列與SEQ ID NO5的核苷酸175-342不完全對(duì)應(yīng)，(iv)SEQ ID NO9[ZmKRP5]或編碼SEQ ID NO10[ZmKRP5]的氨基酸序列的核苷酸序列，條件是該可轉(zhuǎn)錄核苷酸序列與SEQ ID NO9的核苷酸450-570不完全對(duì)應(yīng)，(v)SEQ ID NO11[ZmKRP6]或編碼SEQ ID NO12[ZmKRP6]的氨基酸序列的核苷酸序列，條件是SEQ ID NO11的可轉(zhuǎn)錄核苷酸序列與SEQ ID NO11的核苷酸380-765不完全對(duì)應(yīng)，(vi)SEQ ID NO13[ZmKRP7]或編碼SEQ ID NO14[ZmKRP7]的氨基酸序列的核苷酸序列，條件是該可轉(zhuǎn)錄核苷酸序列與SEQ ID NO13的核苷酸335-718不完全對(duì)應(yīng)，(vii)SEQ ID NO15[ZmKRP8]或編碼SEQ ID NO16[ZmKRP8]的氨基酸序列的核苷酸序列，條件是該可轉(zhuǎn)錄核苷酸序列與SEQ IDNO15的核苷酸350-405或420-698不完全對(duì)應(yīng)，和(viii)SEQ ID NO17[ZmKRP9]或編碼SEQ ID NO18[ZmKRP9]的氨基酸序列的核苷酸序列，條件是該可轉(zhuǎn)錄核苷酸序列與SEQ IDNO17的核苷酸1-183不完全對(duì)應(yīng)，其中該可轉(zhuǎn)錄核苷酸序列可以任何順序存在于核酸構(gòu)建體上且可以是多順反子的，其中每個(gè)可轉(zhuǎn)錄核苷酸序列包含至少約100個(gè)連續(xù)核苷酸，且其中每個(gè)可轉(zhuǎn)錄核苷酸序列的表達(dá)任選誘導(dǎo)基因抑制。
還提供一種抑制一個(gè)或多個(gè)CDK抑制劑樣基因在玉米細(xì)胞、玉米組織、玉米器官、或玉米植物中表達(dá)的方法。該方法包括使所述玉米細(xì)胞、玉米組織、玉米器官或玉米植物與上述核酸構(gòu)建體接觸。
在這點(diǎn)上，還提供一種玉米細(xì)胞、玉米組織、玉米器官或玉米植物，其中CDK抑制劑樣基因的表達(dá)已經(jīng)按照這種方法被抑制。還提供一種從其中一個(gè)或多個(gè)CDK抑制劑樣基因的表達(dá)已被抑制的植物獲得的種子。
附圖簡述

圖1是本發(fā)明多肽與鼠耳芥屬CDK抑制劑公開序列的氨基酸序列比對(duì)。鼠耳芥屬的序列在實(shí)施例1中表示。
圖2是pMON71270的構(gòu)建圖。
圖3是pMON71279的構(gòu)建圖。
圖4是表示引物區(qū)和方向(A)及組裝過程(B)的dsRNA中間構(gòu)建體的簡圖。
圖5是表示引物區(qū)和方向(A)及組裝過程(B)的dsRNA中間構(gòu)建體的簡圖。
序列簡述SEQ ID NO1是ZmKRP1的核苷酸序列。
SEQ ID NO2是ZMKRP1的氨基酸序列。
SEQ ID NO3是ZmKRP2的核苷酸序列。
SEQ ID NO4是ZmKRP2的氨基酸序列。
SEQ ID NO5是ZmKRP3的核苷酸序列。
SEQ ID NO6是ZmKRP3的氨基酸序列。
SEQ ID NO7是ZmKRP4的核苷酸序列。
SEQ ID N08是ZmKRP4的氨基酸序列。
SEQ ID NO9是ZmKRP5的核苷酸序列。
SEQ ID NO10是ZmKRP5的氨基酸序列。
SEQ D) NO11是ZmKRP6的核苷酸序列。
SEQ ID NO12是ZmKRP6的氨基酸序列。
SEQ ID NO13是ZmKRP7的核苷酸序列。
SEQ ID NO14是ZmKRP7的氨基酸序列。
SEQ ID NO15是ZmKRP8的核苷酸序列。
SEQ ID NO16是ZmKRP8的氨基酸序列。
SEQ ID NO17是ZmKRP9的核苷酸序列。
SEQ ID NO18是ZmKRP9的氨基酸序列。
SEQ ID NO19是來源于ZmKRP1(F1)3’末端的200個(gè)堿基對(duì)(bp)的核苷酸序列。
SEQ ID NO20是來源于ZmKRP2(F2)近3’末端的200bp的核苷酸序列。
SEQ ID NO21是來源于ZmKRP3(F3)3’末端的200bp的核苷酸序列。
SEQ IID NO22是來源于ZmKRP4(F4)3’末端的200bp的核苷酸序列。
SEQ ID NO23是來源于ZmKRP5(F5)3’末端的200bp的核苷酸序列。
SEQ ID NO24是來源于ZmKRP6和ZmKRP7(F6)近3’末端的200bp核苷酸序列。
SEQ ID NO25是來源于ZmKRP8(F7)近3’末端的200bp的核苷酸序列。
SEQ ID NO26是來源于ZmKRP8(F8)3’末端的183bp的核苷酸序列。
SEQ ID NO27是ZmDnaK內(nèi)含子片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO28是引物Pl-StuI的核苷酸序列。
SEQ ID NO29是引物P1-2R的核苷酸序列。
SEQ ID NO30是引物P2-3的核苷酸序列。
SEQ ID NO31是引物P4-Bgl的核苷酸序列。
SEQ ID NO32是引物P3-4的核苷酸序列。
SEQ ID NO33是引物P5-Bam的核苷酸序列。
SEQ ID NO34是引物P5-Bgl的核苷酸序列。
SEQ ID NO35是引物Pl-SseBam的核苷酸序列。
SEQ ID NO36是引物Pi-Bgl的核苷酸序列。
SEQ ID NO37是引物Pi-Bam的核苷酸序列。
SEQ ID NO38是引物P5-Nco的核苷酸序列。
SEQ ID NO39是引物P5-6的核苷酸序列。
SEQ ID NO40是引物P6-7的核苷酸序列。
SEQ ID NO41是引物P8-Bgl的核苷酸序列。
SEQ ID NO42是引物P7-8的核苷酸序列。
SEQ ID NO43是引物P8-i的核苷酸序列。
SEQ ID NO44是ZmKRP1的5’非翻譯區(qū)(UTR)的核苷酸序列。
SEQ ID NO45是ZmKRP1的3′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO46是ZmKRP2的5′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO47是ZmKRP2的3′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO48是ZmKRP3的3′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO49是ZmKRP4的5′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO50是ZmKRP4的3′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO51是ZmKRP5的5′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO52是ZmKRP5的3′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO53是ZmKRP6的5′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO54是ZmKRP6的3′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO55是ZmKRP7的5′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO56是ZmKRP7的3′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO57是ZmKRP8的5′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO58是ZmKRP9的3′UTR的核苷酸序列。
SEQ ID NO59是來源于特定多肽C-末端區(qū)的保守序列。
發(fā)明詳述CDK抑制劑樣基因表達(dá)的抑制可導(dǎo)致細(xì)胞增殖增加和/或有絲分裂指數(shù)增加。例如，細(xì)胞增殖增加可導(dǎo)致胚大小增加和油量增多。
CDK抑制劑樣基因表達(dá)的抑制還可導(dǎo)致產(chǎn)量增加。很多農(nóng)學(xué)性狀均可影響“產(chǎn)量”。例如，這些可能包括，但不限于，植物高度、莢果數(shù)、莢果在植物上的位置、節(jié)間數(shù)、莢果掉落的發(fā)生率、谷粒大小、生節(jié)和氮固定的效率、營養(yǎng)吸收的效率、對(duì)生物和非生物脅迫的抗性、碳的同化、植物結(jié)構(gòu)、抗倒伏、種子發(fā)芽的百分比、幼苗活力、和幼苗性狀。例如，這些還可包括，但不限于，發(fā)芽效率(包括在脅迫狀況下發(fā)芽)、生長速度(包括在脅迫狀況下的生長速度)、抽穗數(shù)、每穗的種子數(shù)、種子大小、種子的組成(淀粉、油、蛋白)、種子飽滿的特征?！爱a(chǎn)量”可以很多方式測量，這些可包括測試重量、種子重量、每株植物的種子數(shù)、種子重量、每單位面積的種子數(shù)(即，每英畝的種子、或種子重量)、每英畝的蒲式耳數(shù)、每英畝的公噸數(shù)、每英畝的噸數(shù)、每公頃的千克數(shù)。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物可表現(xiàn)出產(chǎn)量部分特征的提高。提高的特征是植物的特征或表型，與基因型相同或非常相似的非-轉(zhuǎn)基因植物相比，其在某種程度上的改變被看作是農(nóng)學(xué)改進(jìn)。
本發(fā)明提供編碼具有CDK抑制劑樣活性的玉米的多肽的分離或純化核酸分子等?！癈DK抑制劑樣活性”是指在組蛋白H1激酶測定法中降低CDK活性的能力(見，實(shí)施例14)。優(yōu)選，CDK活性降低至少約10％、更優(yōu)選至少約20％、甚至更優(yōu)選至少約30％、甚至更優(yōu)選至少約40％、50％、60％、70％或80％，且最優(yōu)選至少約90％或更多。“分離的”是指已被從其自然環(huán)境中除去。如果是核酸，分離的是指核酸與其它核酸分子的分離，如果是通過重組技術(shù)產(chǎn)生，是指與其它細(xì)胞物質(zhì)和培養(yǎng)基的基本分離，或者如果是合成的，是指與化學(xué)前體的基本分離?！凹兓摹笔侵讣兌仍黾?，其中“純度”是相對(duì)術(shù)語，不能被解釋為絕對(duì)純度。“核酸分子”包括DNA(例如，cDNA或基因組DNA)或RNA(例如，mRNA)的聚合物，即，多核苷酸，其可以是單鏈或雙鏈的，可包含嵌合DNA/RNA寡核苷酸，且其可包含非-天然或改變的核苷酸。
在其中一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種分離或純化的核酸分子，它包含(i)SEQ ID NO1[ZmKRP1]的核苷酸序列，(ii)編碼SEQ IDNO2[ZmKRP1]的氨基酸序列的核苷酸序列，(iii)所編碼的氨基酸序列與SEQ ID NO2[ZmKRP1]的氨基酸序列具有至少約70％(或75％、80％、85％、90％、95％或99％)同一性且具有CDK抑制劑樣活性的核苷酸序列，或(iv)上述(i)-(iii)任何一個(gè)的片段，其中該片段包含至少約35個(gè)(或40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多)連續(xù)核苷酸。
在另一實(shí)施方案中，提供一種分離或純化的核酸分子，它包含(i)SEQ ID NO3[ZmKRP2]的核苷酸序列，(ii)編碼SEQ IDNO4[ZmKRP2]的氨基酸序列的核苷酸序列，(iii)所編碼的氨基酸序列與SEQ ID NO4[ZmKRP2]的氨基酸序列具有至少約70％(或75％、80％、85％、90％、95％或99％)同一性且具有CDK抑制劑樣活性的核苷酸序列，或(iv)上述(i)-(iii)任何一個(gè)的片段，其中該片段包含至少約35個(gè)(或40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多)連續(xù)核苷酸。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離或純化的核酸分子，它基本上由(i)SEQ ID NO7[ZmKRP4]的核苷酸序列，(ii)編碼SEQ IDNO8[ZmKRP4]的氨基酸序列的核苷酸序列，或(iii)所編碼的氨基酸序列與SEQ ID NO8[ZmKRP4]的氨基酸序列具有至少約70％(或75％、80％、85％、90％、95％或99％)同一性且具有CDK抑制劑樣活性的核苷酸序列組成。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離或純化的核酸分子，它包含(i)SEQ ID NO9[ZmKRP5]的核苷酸序列，(ii)編碼SEQ IDNO10[ZmKRP5]的氨基酸序列的核苷酸序列，(iii)所編碼的氨基酸序列與SEQ ID NO10[ZmKRP5]的氨基酸序列具有至少約70％(或75％、80％、85％、90％、95％或99％)同一性且具有CDK抑制劑樣活性的核苷酸序列，或(iv)上述(i)-(iii)任何一個(gè)的片段，其中該片段包含至少約120個(gè)(或125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200或更多)連續(xù)核苷酸。
還提供一種分離或純化的核酸分子，它包含(i)SEQ IDNO11[ZmKRP6]的核苷酸序列，(ii)編碼SEQ ID NO12[ZmKRP6]的氨基酸序列的核苷酸序列，(iii)所編碼的氨基酸序列與SEQ IDNO12[ZmKRP6]的氨基酸序列具有至少約70％(或75％、80％、85％、90％、95％或99％)同一性且具有CDK抑制劑樣活性的核苷酸序列，或(iv)上述(i)-(iii)任何一個(gè)的片段，其中該片段包含至少約390個(gè)(或400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500或更多)連續(xù)核苷酸。
這種核酸分子可按照標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)，使用cDNA、mRNA或基因組DNA作為模板以及適宜的寡核苷酸引物擴(kuò)增?？蛇x擇性地，可使用標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)，如自動(dòng)化DNA合成儀合成。
上述分離或純化的核酸分子的特征部分根據(jù)“序列同一性百分比”表征。關(guān)于這一點(diǎn)，可通過在比較窗進(jìn)行核酸序列的最佳比對(duì)而將給定核酸分子與上述核酸分子(即，參考序列)進(jìn)行比較，其中比較窗中的多核苷酸序列的部分可包含與參考序列相比而言的添加或缺失(即，空位)，參考序列不包含添加或缺失，用于兩個(gè)序列的最佳比對(duì)。序列同一性百分比是通過確定在兩個(gè)序列中出現(xiàn)的相同核酸堿基的位置數(shù)，即，相匹配的位置數(shù)，用相匹配的位置數(shù)除以比較窗中的位置總數(shù)，并將所得結(jié)果乘以100得到序列同一性百分比。用于比較的序列最佳比對(duì)可通過已知算法的計(jì)算機(jī)化執(zhí)行而進(jìn)行。序列比對(duì)和同一性百分比的計(jì)算可通過Clustal算法(Higgins等人，CABIOS，5(2)151-153(1989))進(jìn)行，其中使用LASARGENE生物信息學(xué)計(jì)算程序組的Megalign程序的缺省參數(shù)(DNASTAR Inc.，Madison，WI)，此后稱作“Clustal W算法”。其它計(jì)算機(jī)化執(zhí)行包括GCG Wisconsin軟件包(Accelrys，San Diego，CA)中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA或National Center for Biotechnology Information，Bethesda，MD的BlastN和BlastX。此外，序列比對(duì)可通過目測進(jìn)行。通常使用具有缺省參數(shù)的BESTFIT或BlastN對(duì)序列進(jìn)行比較。確定同一性的優(yōu)選方法是Clustal W算法，其中參考實(shí)施例1給出的參數(shù)。
然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，兩個(gè)多核苷酸序列在核酸水平上可顯著不同，但由于遺傳密碼的簡并性，仍然編碼基本相似(如果不同)的氨基酸序列。本發(fā)明的目的在于包括這種多核苷酸序列。關(guān)于這一點(diǎn)，應(yīng)注意上述核酸分子的片段可被用作探針而鑒定其它多核苷酸序列。
還提供一種分離或純化的核酸分子，它包含與上述分離或純化的核酸分子，以及SEQ ID NOS13、15、和17互補(bǔ)或反義的序列(或其片段，如包含至少約35個(gè)連續(xù)核苷酸的片段)，以及編碼SEQ IDNOS6、14、16、和18的氨基酸序列的核苷酸序列或基本由所述序列組成。該分離或純化的核酸分子任選為載體形式。
如果需要，上述分離或純化的核酸分子可與啟動(dòng)子可操作性連接。啟動(dòng)子包括，但不限于，在細(xì)菌、噬菌體、質(zhì)體或植物細(xì)胞中發(fā)揮作用的啟動(dòng)子，包括優(yōu)先在雄性生殖組織中表達(dá)的啟動(dòng)子。如下所述，可使用任何適宜的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子的例子包括，但不限于，玉米的SILKY1啟動(dòng)子(Ambrose等人，Molec.Cell，5(3)569-579(2000))、煙草的NTM19啟動(dòng)子(Oldenhof等人，Plant Molec.Biol.，31213-225(1996)；美國專利US6,407,314；和WO97/30166)、煙草的NPG1啟動(dòng)子(見，例如，美國申請(qǐng)
發(fā)明者B·薩維奇, W·鄭 申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)有限公司