專利名稱：：修飾酶、生產(chǎn)修飾酶的方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及在苛刻的工業(yè)環(huán)境下，諸如增加的pH值和/或溫度下，具有增加的穩(wěn)定性的修飾酶。
背景技術(shù)：
：木聚糖酶存在于至少上百種不同生物體內(nèi)。木聚糖酶是糖基水解酶，其水解P-l,4-連接的吡喃木糖苷鏈。在Hcm'issat和Bairoch(1993)建立的對糖基水解酶家族基于序列的分類中，多數(shù)木聚糖酶出現(xiàn)于家族10和11(第10家族和第11家族)。家族ll中成員的共同特征包括高度的基因同源性，大約20kDa的大小，以及雙取代催化機制(Tenkanen等，1992;Wakarchuk等，1994)?，F(xiàn)在，根據(jù)其結(jié)構(gòu)相似性，這些家族被分類成部族(或者異種集團(Clans))(Henrissat和Davies,1995)。家族ll中的糖基水解酶，其主要為木聚糖酶，同家族12的酶一起歸于部族C(ClanC)中，已知家族12(第12家族)的酶都是纖維素酶。木聚糖酶常常可被用于重要的應(yīng)用，例如紙槳漂白、紡織品纖維修飾以及在動物飼料中(如木聚糖酶可以幫助動物消化，Prade，1996)。木聚糖酶在人類的食品生產(chǎn)中也有用處。例如，木聚糖酶改善面包生面團的性質(zhì)和面包質(zhì)量。木聚糖酶也可以通過改善包含木聚糖的啤酒的過濾性來輔助釀造過程。也可以用木聚糖酶來降解植物物質(zhì)，包括處理/利用農(nóng)業(yè)廢物和農(nóng)業(yè)產(chǎn)品加工中產(chǎn)生的廢物，包括以生物質(zhì)為原料生產(chǎn)燃料或者其它生物基產(chǎn)品和材料。然而，經(jīng)常性地，這些應(yīng)用過程中的極端條件，比如高溫度和/或高pH值等，致使木聚糖酶不如在常規(guī)條件下有效。比如，在紙槳的漂白中，從堿洗階段輸送而來的物料可能具有高溫，有時高于8(TC;以及高pH值，例如高于IO。由于大多數(shù)的木聚糖酶都不能在這樣的條件下很好地發(fā)揮作用，因此必須對紙漿冷卻和堿性pH中和之后，通常的木聚糖酶才能發(fā)揮作用?？紤]到其中某些步驟，因為必須做出改變來適應(yīng)木聚糖酶，該過程的成本會大大增加。在另外的例子中，木聚糖酶在動物詞料應(yīng)用中也有用處。在這種情況下，木聚糖酶在飼料生產(chǎn)過程中要經(jīng)受短時間的高溫條件(如在95。C或更高溫度下，0.5到5分鐘)。在這樣溫度條件下可能發(fā)生酶的鈍化，當(dāng)需要在較低溫度下比如37'C下時這些酶變成無用的。已發(fā)現(xiàn)具有改良性質(zhì)的木聚糖酶。已發(fā)現(xiàn)幾種熱穩(wěn)定的、嗜堿的和嗜酸的木聚糖酶，并己經(jīng)從嗜熱生物中克隆(Bodie等，1995;Fukunaga等，1998)。然而，常常難于以經(jīng)濟有效的數(shù)量進行酶的生產(chǎn)。另一方面，里氏木霉(rre"e/)產(chǎn)生木聚糖酶，其熱穩(wěn)定性不如來自嗜熱生物的木聚糖酶。已知里氏木霉(7>ees")產(chǎn)生不同的木聚糖酶，其中木聚糖酶I和II(分別是XynI和XynII)已經(jīng)被很好地表征(Tenkanen等，1992)。XynI的大小是19kDa，pl值是5.5，pH值為3到4。XynII的大小是20kDa，pl值是0.9，pH值最適值是5.0到5.5(T6n力nen和Rouvinen,1995)。這些木聚糖酶在許多應(yīng)用中顯示出有利的pH曲線、特異性和比活性，并且可以在大規(guī)模生產(chǎn)過程中經(jīng)濟地生產(chǎn)。為制得具有有利性質(zhì)的木聚糖酶已經(jīng)作出了許多努力。例如，有人嘗試通過添加二硫橋來改善環(huán)狀芽孢桿菌(Bac///^c/rcw/。ra)木聚糖酶的穩(wěn)定性，二硫橋連結(jié)該蛋白的N-末端到C-末端上，以及a螺旋的N-末端部分到鄰近的(3鏈上(Wakarchuk等，1994)。同時，Campbell等人為增加熱穩(wěn)定性(1995)，通過分子內(nèi)和分子間的二硫鍵來修飾環(huán)狀芽孢桿菌(5tf"7/wc/rcw/ara)木聚糖酶。相似地，里氏木霉(Z:木聚糖酶II的穩(wěn)定性也通過將其N末端區(qū)域改成嗜熱木聚糖酶的相應(yīng)部分而得到了改善(Sung等，1998)。除了改良的熱穩(wěn)定性以外，酶的活性范圍也拓展到包括了堿性pH值。單點突變也被用來增加環(huán)狀芽孢桿菌木聚糖酶(Boc/〃Mc//rw/araxylanase)的穩(wěn)定性(Arase等，1993)。通過比較嗜熱(thermophilic)和嗜溫(mes叩hilic)酶的結(jié)構(gòu)，得到了大量信息(Vogt等，1997)。嗜熱木聚糖酶的結(jié)構(gòu)分析也給出了關(guān)于影響木聚糖酶熱穩(wěn)定性的因素的信息(Gmber等，1998;Harris等，1997)。然而，當(dāng)前需要在工業(yè)條件中具有改良性質(zhì)的酶，特別是木聚糖酶。發(fā)明概述本發(fā)明涉及修飾酶(modifiedenzymes)。具體地說，本發(fā)明涉及在極端pH和溫度條件下具有改良性能的修飾酶(modifiedenzymes)。在第一個方面，本發(fā)明關(guān)于修飾木聚糖酶(modifiedxylanase)，其包含多肽，該多肽具有如SEQIDNO:l提出的氨基酸序列，其中該序列在選自下面的位置上具有至少一個被取代的氨基酸殘基，該位置選自2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。優(yōu)選地，取代選自2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180和+191。優(yōu)選地，修飾木聚糖酶具有至少一個取代，該取代選自H22K，S65C，N92C，F(xiàn)93W，N97R，V108H，H144C，H144K，F(xiàn)180Q和S186C。并且，優(yōu)選地，同野生型木聚糖酶相比，修飾木聚糖酶表現(xiàn)出改良的嗜熱性、嗜堿性或者二者的結(jié)合。在第二個方面，本發(fā)明關(guān)于修飾酶(modifiedenzyme)，該修飾酶包含了氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQIDNO:l提出的序列同源，該氨基酸序列在與選自下面的位置等價的位置上具有至少一個取代的氨基酸殘基2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。在優(yōu)選的實施方案中，該氨基酸序列在與選自下面的位置等價的位置上具有至少一個取代氨基酸殘基2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180和+191。在優(yōu)選實施方案中，該氨基酸序列具有至少一個選自下面的取代氨基酸殘基:H22K，S65C，N92C，F(xiàn)93W，N97R，V108H，H144C，H144K，F(xiàn)180Q和S186C。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，修飾酶(modifiedenzyme)是部族C(ClanC)的糖基水解酶(glycosylhydrolase),其包含一個氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQIDNO:l提出的序列同源，該氨基酸序列在與選自下面位置等價的位置上具有至少一個取代的氨基酸殘基2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。在優(yōu)選的實施方案中，該氨基酸序列在與選自下面位置等價的位置上具有至少一個取代氨基酸殘基2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180和+191。在優(yōu)選實施方案中，i亥氨基酸序列具有至少一個選自下面的取代氨基酸殘基H22K，S65C，N92C，F(xiàn)93W，N97R，V108H，I-1144C，H144K，F(xiàn)180Q和S186C。優(yōu)選的修飾酶如在此處公開的。在一個優(yōu)選的實施方案中，修飾酶是家族ll木聚糖酶(第ll家族的木聚糖酶)，其含有一個氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQIDNO:l提出的序列同源，該氨基酸序列在與選自下面位置等價的位置上具有至少一個取代的氨基酸殘基2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169,180，184，186，188，190和+191。在優(yōu)選的實施方案中，該氨基酸序列在與選自下面位置等價的位置上具有至少一個取代氨基酸殘基2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180和+191。在優(yōu)選實施方案中，該氨基酸序列具有至少一個選自下面的取代氨基酸殘基H22K，S65C，N92C，F(xiàn)93W，N97R，V108H，H144C，H144K，F(xiàn)180Q和S186C。優(yōu)選修飾的家族ll酶如此處公開的。在其它的優(yōu)選實施方案中，修飾酶是家族12纖維素酶(第12家族的纖維素酶)，其含有一個氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQIDNO:l提出的序列同源，該氨基酸序列在與選自下面位置等價的位置上具有至少一個取代的氨基酸殘基2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157'160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。在優(yōu)選的實施方案中，該氨基酸序列在與選自下面位置等價的位置上具有至少一個取代氨基酸殘基2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180和+191。在優(yōu)選實施方案中，該氨基酸序列具有至少一個選自下面的取代氨基酸殘基H22K，S65C，N92C，F(xiàn)93W，N97R，V108H，H144C，H144K，F(xiàn)180Q和S186C，其中該位置是等價位置，如此處定義的。優(yōu)選的家族12修飾酶如此處公開的。在一個優(yōu)選的實施方案中，家族12纖維素酶是7Wc/w&r,EGin纖維素酶(木霉EGIII纖維素酶)，如SEQIDNO:3中所闡明的，該修飾包括了至少一個選自下面的氨基酸2，13，28，34，77，80，86，122，123，134，137，140，164，174，183，209，215和218，這些位置的編號相對于SEQIDNO:3。在優(yōu)選實施方案中，該取代為至少一個選自下面的突變T2C，N13H，S28K，T34C，S77C，P80R，S86C，G122C，K123W，Q134H，Q134K，Q134R，V137H，G140C，N164C，N164K，N174C，K183H，N209C，A215D和N218C，位置編號相對于SEQIDNO:3。本發(fā)明的第一個和第二個方面的實施方案，如上面公開的，也提供編碼任何上述修飾酶的核酸，以及互補體(complements)。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供包含至少一種如此處公開的修飾酶以及另一成份的組合物。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供包含如此處公開的修飾酶的載體、包含修飾酶的細(xì)胞和表達(dá)修飾酶的方法。在第三個方面，本發(fā)明關(guān)于一種對酶進行修飾的方法，包括對酶的第一位點進行修飾，使得第一位點可以與酶的第二位點相結(jié)合。在優(yōu)選的實施方案中，第一位點位于與(3-折疊鄰近的環(huán)或序列中。在優(yōu)選的實施方案中，第二位點位于(3-折疊中。在優(yōu)選的實施方案中，修飾酶是木聚糖酶(xylanase)。例如，在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明關(guān)于修飾的木聚糖酶(modifiedxylanase)，其中木聚糖酶被用下面方法中的至少一種進行修飾(i)通過修飾N末端序列，使得N末端序列通過二硫鍵橋結(jié)合到鄰近的卩鏈上；(ii)通過修飾C末端序列，使得C末端序列結(jié)合到鄰近的(3鏈上；(iii)通過修飾a螺旋或者鄰近(i螺旋的序列，使得oi螺旋或者鄰近(x螺旋的序列更加牢固地結(jié)合在蛋白質(zhì)的主體上；(iv)通過修飾與卩鏈鄰近的序列，使得與(3鏈鄰近的序列可以更牢固地結(jié)合在鄰近的序列上。例如，在優(yōu)選的實施方案中，可以在毗鄰于索(cord)的(3鏈上進行修飾。附圖簡述圖l顯示的是家族ll木聚糖酶中的氨基酸比對。氨基酸的編號與里氏木霉木聚糖酶II(n"e/XylanaseII)進行比較，如序列的最上面所示的。與家族11木聚糖酶的至少75%相同的殘基被劃了線。下述各項在圖中進行了比對(用縮寫)XYN2一TRIRE內(nèi)-1,4-3-木聚糖酶2前體(EC3.2丄8)(木聚糖酶2)(1,4-P-D-木聚糖木聚糖水解酶2)-里氏木霉(Trichodermareesei(Hypocreajecorina))>sp|P36217|;XYN1—TRIRE內(nèi)-1，4-3-木聚糖酶1前體(￡03.2丄8)(木聚糖酶1)(1,4-e-D-木聚糖木聚糖水解酶l)-里氏木霉(Trichodermareesei(Hypocreajecorina))>sp!P36218|;XYN2_BACST內(nèi)-1,4-J3-木聚糖酶前體(EC3.2丄8)(木聚糖酶)(1,4-P-D-木聚糖木聚糖水解酶)-嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillusstearothermophilus)>sp|P45703i;XYN1_HUMIN內(nèi)-l,4-P-木聚糖酶l前體(EC3.2丄8)(木聚糖酶l)(1,4-e-D-木聚糖木聚糖水解酶1)-孤獨腐質(zhì)霉(HumicolaInsolens)>splP55334|;XYN1—ASPAW內(nèi)-l,4-P-木聚糖酶I前體(EC3.2丄8)(木聚糖酶I)(1,4-e-D-木聚糖木聚糖水解酶I)-泡盛曲霉(Aspergillusawamori)>sp|P55328|;XYNA—BACST內(nèi)-1,4-P-木聚糖酶A前體(EC3.2丄8)(木聚糖酶A)(1,4-P-0-木聚糖>3|45705|。圖2顯示了家族12纖維素酶與XynlI的氨基酸比對。下述各項在圖中進行了比對(用縮寫)1ENX術(shù)褒潔藤//7>/^0^加^'(里氏木霉)，和cell2家族成員Q8NJY2Jspe,^〃附mwmon'(泡盛曲霉)，Q8NJY3T/w/w/coA3gr/seo(腐質(zhì)霄菌)，Q81SfJY47>/c/0(afe;7"<3v/nVfe(鄉(xiāng)錄色木霉)，Q8NJY5Zfypoc7柳&om>g77，Q8NJY6場戶C7柳sc/n術(shù)'mte/z'，Q8NJY7Stoc/7y6c^，ec/^.wafa，Q8NJY8歷owecf7"7'(3oc/zra/ema，Q8NJY9歷cwec/Waoc/^o/ewc"，Q8NJZ0歷cwec/r/aoc/ra/eMc"，Q8NJZ15/o/7ecfr/aoc/z廠o/eMC(3，Q8NJZ2Fuszzn'M7Mw/aw/(iwZ^p.CwcwrZnYae」(f廉刀菌)，Q8NJZ3FMran'w77"o/am丫rafep.CwcwA/to^，Q8NJZ4A腦rz'鵬巧w'5幼'(Fi^an'wwsc/rpy(木賊鐮刀菌(薦草鐮刀菌))，Q8NJZ5五7wen'ce//(3Je5eWo',w7M，Q8NJZ6CTzoefom/wwZ^os77z'e/zse，Q9KIH16teptom，ewp./L4GS(鏈霉菌種11AG8)。在圖中，兩個箭頭指出的是二硫鍵橋的位置(信號序列沒有去除)。圖3顯示的是用來進行木聚糖酶誘變的里氏木霉寡核苷酸(Tiichodermareeseioligonucleotides)的核苷酸序列，改變的密碼子用下劃線標(biāo)出。圖4出示一個圖表，顯示的是同野生型XynII相比，Y2和Y5突變的木聚糖酶的活性隨溫度變化的情況。突變的木聚糖酶具有下面的突變K58R并且一個天冬氨酸添加到190位的C末端絲氨酸上(+191D)(=Y2);T2C，T28C，K58R+191D，(=Y5)。這個圖示例性說明了鹽橋單獨不能增加嗜熱性和熱穩(wěn)定性。確切的說，引入二硫鍵橋增加了穩(wěn)定性和溫度依賴性活性。活性測量按照^n'/ey等，1992進行。圖5的圖比較了Xynn野生型和Y5突變的木聚糖酶的活性隨pH值變化的情況。Y5突變的木聚糖酶具有下面的突變T2C，T28C，K58R連同添加在190位置的C末端絲氨酸的天冬氨酸(+191D)?；钚詼y量按照5w7。/等，1992進行。圖6的圖比較了XynlI野生型和Y5突變的木聚糖酶的活性隨溫度變化的情況。Y5突變的木聚糖酶具有下面的突變T2C，T28C,K58R連同添加在C末端絲氨酸190位上的天冬氨酸(+191D)?；钚詼y量按照B"/fe少等，1992進行。圖7的圖比較Y5突變的木聚糖酶和野生型XynlI木聚糖酶，在pH8下鈍化后，二者在pH5.0下的殘留活性隨溫度變化情況。Y5突變的木聚糖酶具有下面的突變T2C，T28C，K58R連同添加在C末端絲氨酸l卯位上的天冬氨酸(+191D)?；钚詼y量按照^n7ey等，1992進行。圖8的圖比較了Y5突變的木聚糖酶和XynII木聚糖酶(SS105/162),在pH8下鈍化后，二者在pH5.3下的殘留活性隨溫度的變化情況。其中XynII木聚糖酶(SS105/162)具有下面的額外突變Q162C和L105C。按照^z7ej;等，1992進行活性測量。圖9的圖比較了Y5突變的木聚糖酶和XynlI木聚糖酶(P9)，在pH9下鈍化后，二者在pH5下殘留的活性隨溫度的變化情況。其中的XynII木聚糖酶(P9)具有下面的額外的突變F93W，N97R和H144K。按照B"http://^等，1992進行活性測量。圖10的圖比較了Y5突變的木聚糖酶和XynlI木聚糖酶(P12)，在pH5下鈍化后，二者在pH5下殘留的活性隨溫度的變化情況。其中的XynII木聚糖酶(P12)具有下面的額外的突變H144C和N92C。按照等，1992進行活性測量。圖ll的圖比較了Y5突變的木聚糖酶和XynlI木聚糖酶(P12)，在pH9下鈍化后，二者在pH5下殘留的活性隨溫度的變化情況。其中的XynII木聚糖酶(P12)具有下面的額外的突變H144C和N92C。按照等，1992進行活性測量。圖12的圖比較了Y5突變的木聚糖酶和XynlI木聚糖酶(P15)，在pH8下鈍化后，二者在pH5.2下殘留的活性隨溫度的變化情況。其中的XynII木聚糖酶(P15)具有下面的額外的突變F180Q，H144C和N92C。按照^n7ey等，1992進行活性測量。圖13的圖比較了Y5突變的木聚糖酶和XynlI木聚糖酶(P21)，在pH8下鈍化后，二者在pH5下殘留的活性隨溫度變化情況。其中的XynII木聚糖酶(P21)具有下面的額外的突變H22K，F(xiàn)180Q，H144C和N92C。按照Bfl7gv等，1992進行活性測量。圖14的圖比較了Y5突變的木聚糖酶和Xynn木聚糖酶(P20)，在pH7.8下鈍化后，二者在pH5.n下殘留的活性隨溫度變化情況。其中的XynII木聚糖酶(P20)具有下面的額外的突變H22K和F180Q?；钚詼y量按照S^7g;等，1992進行。圖15的圖比較了Y5突變的木聚糖酶和XynlI木聚糖酶(J17)在pH8下活性隨溫度變化的情況，其中的XynII木聚糖酶(J17)具有下面的額外的突變V108H。按照^n7^等，1992進行活性測量。圖16的圖比較了Y5突變的木聚糖酶和XynlI木聚糖酶(J21)在pH8下活性隨溫度變化的情況，其中的XynII木聚糖酶(J21)具有下面的額外的突變S65C和S186C(圖中的J21)。按照Sm7^等，1992進行活性測量。圖17顯示的是里氏木霉木聚糖酶II(7Hc/w血，awew/xylanasell)(XynII,PDB1ENX,藍(lán)色)和里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III(Zh'cWe/窗7苗e/endoglucanasein)(Call2A，PDB1H8V，紅色)的結(jié)構(gòu)比對。圖18列出了XynII序列的核苷酸氨基酸。圖19列出了EGIII序列的核苷酸氨基酸。圖20列出了XynlI序列的核苷酸氨基酸。優(yōu)選實施方案的詳細(xì)描述本發(fā)明現(xiàn)在將通過參考的方式、僅僅使用下面給出的定義和實施例進行詳細(xì)描述。除非在此處另外定義，所有此處使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都和本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通:技術(shù)人員所通常理解的術(shù)語意義相-同。Singleton等所著的由紐約JohnWileyandSons于1994年出版的二版，以及由Hale和Marham所著，由紐約HarperPerennial于1991年出版的THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY,向技術(shù)人員提供用于本發(fā)明中的許多術(shù)語的綜合詞典。盡管與此處的描述相似或等價的任何材料和方法可以在本發(fā)明的實際應(yīng)用和試驗中使用，本發(fā)明還是描述了優(yōu)選的方法和材料。數(shù)字范圍包括了界定范圍的數(shù)字。除非另外指出，分別地，核酸按照5'到3'的方向從左到右寫出；氨基酸序列按照從氨基到羧基的方向從左到右寫出。特別地，從業(yè)者可以參照Sambrook等，1989和AusubelFM等，1993來理解本領(lǐng)域的定義和術(shù)語。應(yīng)該理解，本發(fā)明不局限于所描述的具體方法學(xué)、方案和試劑，因為這些是可以改變的。此處提供的標(biāo)題并不是對本發(fā)明多個方面和實施方案的限制，通過參考作為整體的說明書可以知曉本發(fā)明各個方面和實施方案。因此，接下來定義的術(shù)語是通過參考作為整體的說明書而被更完整地定義出來。在此明確地引入此處所引用的所有出版物作為參考，以此來描述和公開可能與本發(fā)明共同使用的組合物和方法學(xué)。正如此處所用，術(shù)語"多肽(polypeptide)"，指的是由氨基酸殘基以肽鍵相連而成的單鏈構(gòu)成的化合物。此處的術(shù)語"蛋白"可以與術(shù)語"多肽"同義，或者可以另外指兩個或多個多肽的復(fù)合物。正如此處所用，術(shù)語"表達(dá)(e鄧ression)"，指的是基于基因的核酸序列產(chǎn)生出多肽的過程。該過程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯。正如此處所用，術(shù)語"基因(gene)"，意思是參與多肽鏈產(chǎn)生的DNA片段，它可以包含或者也可以不包含編碼區(qū)域之前或者之后的區(qū)域。如此處用到的，當(dāng)提到位置編號時，術(shù)語"等價(equivalent)"指的是如此處提供的、以里氏木霉木聚糖酶II(TrichodermareeseixylanaseII)(XynII)作為參考序列或參考結(jié)構(gòu)，通過序列和結(jié)構(gòu)比對而確定的位置(參見，例如，圖2是多序列比對以及里氏木霉(Trichodermareesei)XynII與其它序列比對，圖17是里氏木霉(Trichodermareesei)內(nèi)切葡聚糖酶III與里氏木霉木聚糖酶II(TrichodermareeseiXynll)的結(jié)構(gòu)比對)。位置的編號相對于里氏木霉XynII(TrichodermareeseiXynll),如SEQIDNO:l所描述。即便可以使用特定的序列作為堿基參考點，編號系統(tǒng)同樣適用于所有相關(guān)的同源序列。蛋白質(zhì)之間的序列同源性可以這樣確定，用已知的和如此處所描述的比對程序，以及使用此處所描述的雜交技術(shù)。正如此處所用，術(shù)語"鄰近(adjacent)"指的是蛋白質(zhì)的氨基酸殘基或區(qū)域或范圍之間的線性靠近或者空間靠近。例如，第一個殘基或第一個區(qū)域或第一個范圍分別鄰近于第二個殘基或第二個區(qū)域或第二個范圍(在線性的意義上)，它們之間將優(yōu)選地有約7個，優(yōu)選地約5個，優(yōu)選地約2個插入其中的氨基酸殘基?？蛇x地，例如，當(dāng)?shù)谝粋€殘基集或者第一個區(qū)域或者第一個范圍鄰近于第二個殘基集或者第二個區(qū)域或者第二個范圍時，那么該第一個殘基集或者第一個區(qū)域或者第一個范圍將最接近于第二個殘基集或者第二個區(qū)域或者第二個范圍(在空間上，例如，由蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)所顯示)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在可能的情況下，將會知道怎樣解析蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。如此處所使用，當(dāng)涉及到序列位置的時候，整數(shù)前面的標(biāo)記"+"的意思是多肽被修飾，使其在由該整數(shù)具體指明的假定位置包含一個或多個額外的氨基酸。例如，標(biāo)記+191是指在正常狀態(tài)下具有19Q個氨基酸的氨基酸序列的多肽有了一個添加的氨基酸。如此處使用的，術(shù)語"核酸分子(nucleicacidmolecule)"包括RNA，DNA和cDNA分子?？梢岳斫?，由于遺傳密碼的簡并性，可能產(chǎn)生多個編碼一個給定蛋白質(zhì)的核酸序列，諸如編碼本發(fā)明的突變蛋白的的核酸序列。如此處使用的，術(shù)語"二硫橋(disulphidebridge)"或者"二硫鍵(disulphidebond)"指的是，在多肽或蛋白質(zhì)中，在半胱氨酸殘基的硫原子之間形成的鍵。在本發(fā)明中，二硫橋或二硫鍵可以是非自然發(fā)生的以及可通過點突變方式引入的。如此處使用的，術(shù)語"鹽橋(saltbridge)"指的是多^:或蛋白中的電性相反的殘基，氨基酸間形成的鍵。在本發(fā)明中，鹽橋可以是非自然發(fā)生的并且可通過點突變方式引入。如此處使用的，"酶(enzyme)"指的是催化化學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)或多肽。如此處使用的，術(shù)語"活性(activity)"指的是與特定蛋白相關(guān)的生物活性，比如與蛋白酶相關(guān)的酶活性。生物活性指的是本領(lǐng)域技術(shù)人員一般將其歸屬于該蛋白質(zhì)的任何活性。如此處使用的，術(shù)語"木聚糖酶(xylanase)"指的是水解(3-1,4-連接的吡喃木糖苷鏈的糖基水解酶。如此處使用的，"XynI"指的是里氏木霉木聚糖酶(rr/c/wAr腿reew/xylanase)，木聚糖酶I。XynI的大小是19kDa，pl值為5.5，最適pH值是3到4之間。此處用到的"XynII"指的是里氏木霉木聚糖酶(Tr/c/w^n憩reesefxylanase)，木聚糖酶II。XynII的大小是20kDa，pl值是9.0，最適pH值是5到5.5之間。如此處使用的，"吡喃木糖苷(xylopyranoside)，，指的是木糖的卩-l,4-連接聚合物，包括木糖的取代聚合物，即支化的p-D-l,4連接吡喃木糖聚合物，其被乙?；⒗腔吞侨┗?uronyl)基團高度取代(參見，例如，Biely,P.(1985)MicrobialXylanolyticSystems.TrendsBiotechnol.,3,286-290.)。如此處使用的，術(shù)語"糖基水解酶(glycosylhydrolase)"指的是水解兩個或多個糖類間、或者糖類和非糖類部分間的糖苷鍵的酶。糖苷鍵的酶促水解通過一般的酸催化來發(fā)生，需要兩個關(guān)鍵的殘基一個質(zhì)子供體和一個親核體/堿基。糖基水解酶的IUB-MB酶命名法是根據(jù)底物特異性，有時也根據(jù)分子機理。如此處使用的，術(shù)語"水解酶(hydrolase)"指的是催化化學(xué)鍵酶切反應(yīng)的酶，在該反應(yīng)中，通過添加一個水分子將化學(xué)鍵酶切。如此處使用的，"水解(hydrolysis)"指的是通過添加一個水分子將化學(xué)鍵切開的反應(yīng)過程。如此處使用的，"部族C(ClanC)"指的是擁有共同的三維折疊和相同催化機理的家族的集合。(參見，例如，Henrissat,B.禾nBaii'och，A.,(1996)Biochem.J.,316,695-696)。如此處使用的，"家族ll"指的是一個酶家族，正如d3Henrissat和Bairoch(1993)BiochemJ.,293,781-788(同樣參見，Henrissat和Davies(1997)CurrentOpinioninStructuralBiol.1997,&637-644)所建立的。家族ll成員的共同性質(zhì)包括高度基因同源性，大小為大約20kDa以及雙取代催化機理(參見Tenkanen等，1992;Wakarchuk等，1994)。家族11木聚糖酶的結(jié)構(gòu)包括兩個大的(3折疊，其由(3鏈和a螺旋組成。家族ll的木聚糖酶包括下面的成員黑曲酶(^^rg/〃w"/爐0XynA,白曲酉每(A戸，g77/twfe3麗c/7")XynC,y^戸'g/〃"51/^/gern^XynA,環(huán)狀芽孢桿菌(fi"c/腸c/7rw/謹(jǐn))XynA,短小芽孢桿菌(5"c,〃w^畫7z^)XynA,禾古草芽抱桿菌(5ocz7/船sm&z7/s)XynA,A^oc"〃/ma邊'x/(^n'cz'arM附XynA,變fS青f連酉每菌(6V7一eptom少cay"vzWamOXynB,變1&青鏈酶菌(6^e/7to7M_ycM//vz'(ims)XynC,熱紫鏈酶菌(5"freptowyc"Aenwov/o/ocews)XynII,褐色絮l單f包菌(r/2erm07wcwas/wa/kc")XynA,哈茨木酶(7Hc/W簡a/2wz/畫7w)Xyn,里氏木酶(r7'/c/zO(ierma廠eese/)XynI,里氏木酉每(7h.c/zc^enM"7"easez')XynII,綠色木酉每(7h.c/z(9(ie7'廳vz.nVfe)Xyn。如此處使用的，"家族12"是指由Henrissat和Bairoch(1993)建立的一個酶家族，其中已知的糖基水解酶被根據(jù)氨基酸序列相似性劃分成了家族。目前，所有的家族12的酶都是纖維素酶。家族12的酶通過雙取代反應(yīng)(doubledisplacementreaction)和葡糖基-酶中間體水解纖維素中的(3-l,4-糖苷鍵，該葡糖基-酶中間體使產(chǎn)物的端基異構(gòu)構(gòu)型(anomericconfiguration)得以保持。對家族12成員的結(jié)構(gòu)研究揭示了一個緊密的P夾層結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)被彎曲從而形成一個延展的底物結(jié)合位點，位于卩折疊凹面上。如此處使用的，術(shù)語"蛋白酶(protease)"指的是一種酶，它通過水解其肽鍵中至少一些肽鍵進行降解。如此處使用的，術(shù)語"肽鍵(peptidebond)"指的是一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的氨基之間的化學(xué)鍵。如此處使用的，"野生型(wild-type)"指的是天然的或自然發(fā)生的序列或蛋白質(zhì)。如此處使用的，"點突變(pointmutations)"指的是DNA中單核苷酸的改變，尤其是在這個改變將會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的改變的情況下。-如此處使用的，"突變型(mutant)"指的是生物體或蛋白不同于野生型的類型。這種改變可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法加以實現(xiàn)，例如，通過點突變，其中得到的蛋白質(zhì)就可以被稱為突變型。如此處使用的，"誘變(mutagenesis)"指的是實現(xiàn)從野生型變?yōu)橥蛔冃偷倪^程。如此處使用的，"取代的(substituted)"和"修飾的(modified)"被交替使用，指的是一個序列，諸如包含多肽的氨基酸序列，其包括對自然發(fā)生序列的刪除、插入、替換或截斷。例如經(jīng)常出現(xiàn)在本發(fā)明的文件中的，取代的序列指的將是對自然發(fā)生殘基的替換。如此處使用的，"修飾酶(modifiedenzyme)"指的是一種SI，它包含對自然存在序列的刪除、插入、替換和截斷。如此處使用的，"(3鏈((3-strands)"指的是氨基酸序列的部分，該氨基酸序列構(gòu)成出現(xiàn)于財斤疊中的線性序列。如此處使用的，"財斤疊(p-sheets)"指的是當(dāng)氨基酸通過氫鍵相互連結(jié)從而形成折疊狀結(jié)構(gòu)的時候，所得到的折疊型結(jié)構(gòu)。如此處使用的，"a螺旋(a-helix)"指的是這種情況下所形成的結(jié)構(gòu)單條多肽鏈繞著自身規(guī)則地旋轉(zhuǎn)，從而形成剛性圓柱體，其中每個肽鍵都規(guī)則地和附近鏈上的其他肽鍵通過氫鍵相互作用。如此處使用的，"拇指(thumb)"指的是位于XynI和XynII中的(3鏈B7和B8之間的環(huán)(參見，例如在To誦en,A.andRouvinen,J.;Biochemistry1995,34，847-856中)。如此處使用的，"索(cord)"指的是P鏈B7和B8之間形成拇指的環(huán)以及在裂縫一端橫穿而過的卩鏈B6a和B9之間環(huán)的一部分(參見，例如在Torronen,A.andRouvinen,J.;Biochemistry1995,34,847-856中)。如此處使用的，"堿性(alkaline)"指的是堿性的狀態(tài)或性質(zhì)。如此處使用的，"嗜堿(alkalinophilic)"指的是在堿性環(huán)境下比非嗜堿成員更加茁壯的性質(zhì)。例如，嗜堿生物指的是一個生物，它可以在普通生物不能生存或不能健壯生長的堿性條件下生存或健壯生長，嗜堿蛋白質(zhì)是在堿性條件下具有活性或者活性更好的蛋白質(zhì)，而在這種條件下普通的蛋白質(zhì)活性將相對較小。如此處使用的，"酸性(acidic)"指的是酸性的狀態(tài)或性質(zhì)。如此處使用的，"嗜酸(acidophilic)"指的是在酸性環(huán)境下比非嗜酸成員更加茁壯的性質(zhì)。例如，嗜酸生物指的是一個生物，它可以在普通生物不能生存或不能健壯生長的酸性條件下生存或健壯生長，嗜酸蛋白質(zhì)是在酸性條件下具有活性或者活性更好的蛋白質(zhì)，而在這種條件下普通的蛋白質(zhì)活性將相對較小。如此處使用的，"熱穩(wěn)定的(thermostable)"指的是在涉及溫度的環(huán)境下保持穩(wěn)定的性質(zhì)。例如，熱穩(wěn)定生物指的是特定溫度條件下比非熱穩(wěn)定生物更穩(wěn)定的生物。如此處使用的，"熱穩(wěn)定性(thermostability)"指的是熱穩(wěn)定的如此處使用的，"嗜熱(thermophilic)"指的是在熱環(huán)境下比非嗜熱成員更加茁壯的性質(zhì)。例如，嗜熱生物指的是一個生物，它可以在普通生物不能生存或健壯生長的熱條件下生存或健壯生長；嗜熱蛋白是在熱條件下具有活性或者活性更好的蛋白，而在這種條件下普通蛋白的活性將相對較小。如此處使用的，"嗜溫(mesopMic)"指的是在通常環(huán)境下比非嗜溫成員更加茁壯的性質(zhì)。例如，嗜溫生物體指的是一個生物體，它可以在其它生物體不能生存或健壯生長的通常條件下生存或健壯生長；嗜溫蛋白是在通常條件下具有活性或者活性更好的蛋白，而在這種條件下其它蛋白的活性將相對較小。如此處使用的，"寡核苷酸(oligonucleotides)"指的是短核苷酸序列，它可能用來，例如，作為形成突變蛋白的反應(yīng)中的引物。如此處使用的，"密碼子，，指的是DNA或mRNA分子中的由三個核苷酸組成的序列，其代表將特定氨基酸引入多肽鏈的指示。如此處使用的，"Y5"指的是突變體木聚糖酶，例如在公布號為WO01/27252中公開的木聚糖酶。如此處所使用，下列標(biāo)識指的是下面的突變體"P2"=N97R+H144K/Y5"P3，、F93W+Y5中H144K"P8"=Y5中F180Q"P9，，=F93W中N97R十Y5中H144K-"P12"=H144C+Y5中N92C"P15，，=H144C中F180Q+Y5中N92C"P16，，=H144C中N97R+Y5中N92C"P18"=Y5中H22K"P20"=H22K+Y5中F180Q"P21，,=H22K+F180Q+H144C+Y5中N92C"J17"=Y5中V108H"J21，，=S65C+Y5中S186C其中位置編號相對于XynII。本發(fā)明涉及極端條件，例如溫度和pH值下具有改進性能的修飾酶。在第一個方面，本發(fā)明涉及一種修飾酶，該修飾酶包含含有SEQIDNO:1中列出的氨基酸序列的多肽，其中該序列在選自下面的位置具有至少一個取代氨基酸殘基2，5，io，u，i6，i9，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191，其中位置編號是對于SEQIDNO:l而言。優(yōu)選地，取代選自2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180，186和+191。優(yōu)選地，修飾木聚糖酶具有至少一個選自下面的取代H22K，S65C，N92C，F(xiàn)93W，N97R，V108H，H144C，H144K，F(xiàn)180Q和S186C。同時，優(yōu)選地，修飾木聚糖酶和野生型木聚糖酶相比，具有改良的嗜熱性(thei'mophilicity)、嗜堿性(alkalophilicity)或者二者的結(jié)合。在第二個方面，本發(fā)明涉及一種修飾酶，該修飾酶包含氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQIDN0:1中提出的序列同源，該氨基酸序列在與選自下面的位置等價的位置上具有至少一個取代氨基酸殘基2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，44，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191，其中位置編號是關(guān)于SEQIDN0:1而言。在優(yōu)選的實施方案中，該氨基酸序列在與選自下面位置等價的位置上具有至少一個取代氨基酸殘基2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180，186和+191。在優(yōu)選實施方案中，氨基酸序列具有至少一個選自下面的取代氨基酸殘基H22K，S65C，N92C，F(xiàn)93W，N97R，V108H，H144C，H144K，F(xiàn)180Q和S186C。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，修飾酶是部族C(ClanC)中的糖基水解酶(glycosylhydrolase),其含有一個氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQIDNO:沖提出的序列同源，該氨基酸序列在與選自下面的位置等價的位置上具有至少一個取代氨基酸殘基2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38"57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，110，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。在優(yōu)選的實施方案中，該氨基酸序列在與選自下面位置等價的位置上具有至少一個取代氨基酸殘基2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180，186和+191。在優(yōu)選的實施方案中，該氨基酸序列具有至少一個選自下面的取代氨基酸殘基H22K，S65C，N92C，F(xiàn)93W，N97R，V108H，H144C，H144K，F(xiàn)180Q和S186C。優(yōu)選的修飾酶如此處公開的。在優(yōu)選的實施方案中，修飾酶是家族ll木聚糖酶，包含一個氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQIDNO:l提出的序列同源，該氨基酸在與選自下面位置等價的位置上具有至少一個取代氨基酸殘基2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58,61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111,113，132,143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。在優(yōu)選的實施方案中，該氨基酸序列在與選自下面位置等價的位置上具有至少一個取代氨基酸殘基2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180，186和+191。在優(yōu)選的實施方案中，該氨基酸序列具有至少一個選自下面的取代氨基酸殘基H22K，S65C，N92C，F(xiàn)93W，N97R,V108H，H144C，H144K，F(xiàn)180Q和S186C。優(yōu)選的家族ll的修飾酶如此處公開的。在又一優(yōu)選實施方案中，修飾酶是家族12纖維素酶，包含一個氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQIDN0:1提出的序列同源，該氨基酸在與選自下面位置等價的位置上具有至少一個取代氨基酸殘基2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。在優(yōu)選的實施方案中，該氨基酸序列在與選自下面位置等價的位置上具有至少一個取代氨基酸殘基2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180，186和+191。在優(yōu)選的實施方案中，該氨基酸序列具有至少一個選自下面的取代氨基酸殘基H22K，S65C，N92C，F(xiàn)93W，N97R，V108H，H144C，H144K，F(xiàn)180Q和S186C。優(yōu)選的家族12的修飾酶如此處公開的。在優(yōu)選的實施方案中，家族12纖維素酶是如SEQIDNO:3提出的木霉EGIII纖維素酶(rr/c/7odm加EGnicellulase)，修飾包含至少一個選自下面的氨基酸2，13,28,34，77,80，86,122,123,134，137,140，164,174,183，209,215和218，位置編號是相對于SEQIDNO:3而言。在優(yōu)選的實施方案中，取代是至少一個選自下面的突變T2C,N13H，S28K,T34C,S77C,P80R,S86C，G122C,K123W,Q134H,Q134K,Q134R,V137H，G140C,N164C,N164K,N174C,K183H,N209C,A215D和N218C,位置編號是相對于SEQIDNO:3而言。Xynll顯示出與家族ll其它成員顯著的氨基酸同源性，大約20-90%，以及整體結(jié)構(gòu)相似性。此處使用的同源性可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員測定。特別地，至少20%，優(yōu)選為30%或以上，優(yōu)選為40%或以上，優(yōu)選為50%或以上，優(yōu)選為60%或以上，優(yōu)選為70%或以上，優(yōu)選為80%或以上，優(yōu)選為90%或以上，優(yōu)選為95%或以上以及優(yōu)選為97%或以上的同源性是所考慮的(正如在氨基酸水平以及核酸水平上計算的，以及正如本文所用的)。第11家族和第12家族的酶之間具有結(jié)構(gòu)相似性。(3蛋白具有兩個堆砌的財斤疊，并且有一個a螺旋，該(x螺旋壓靠其中一個財斤疊，形成所謂的P-果凍巻結(jié)構(gòu)(beta-jellyrollstmcture)。(參見Stirk，H丄，Woolfson,D.N.,Hutchison,E.G.andThornton,J,M.(1992)DepictingtopologyandHandednessinjellyrollstructures.FEBSLetters308pl-3)。基于這種結(jié)構(gòu)相似-性，-兩個酶家族被歸于一個"超家族(superfamily)",稱為"部方矣C(ClanC)，,(參見Sandgren,M.等，J.Mol.Bio.(2001)308,295-310)。盡管家族11和家族12間的序列同源性低，但兩個家族的整體結(jié)構(gòu)相似性是顯著的，如從圖2和圖16的比較可以看出的。連結(jié)兩個卩折疊的環(huán)的長度構(gòu)成了家族之間的主要結(jié)構(gòu)差異(Sandgren等，J.Mol.,Biol.,2001)。當(dāng)前，己知，任何一個家族ll的酶都不包含N末端的二硫橋，而許多家族12的纖維素酶總體上都顯示出包含N末端附近的二硫橋(例如，rreae/Cel12A的殘基4和32之間)。家族12酶中的二硫橋處于木霉(Y5)(Triclioderma(Y5))變異體引入二硫橋的位置附近，盡管這個位置遠(yuǎn)離N-末端(參見，例如，出版物WO01/27252)。在7Hc/zw/m憩,"eew/(里氏木霉)xylanaseII(XynII)中，檢驗了約束作用的重要性，該約束作用穩(wěn)定了家族ll酶的N-末端區(qū)域。通過在殘基間(T2C和T28C)插入非天然的二硫橋，獲得的Tm增加為irC。在家族11和家族12這兩個結(jié)構(gòu)類似的家族中，N-末端的二硫橋起著類似的與穩(wěn)定性相關(guān)的作用。在Cell2A中用一個丙氨酸替換32位的半胱氨酸導(dǎo)致Tm顯著減少了18.5"，這證實了上面提到的作用。有趣的是，通過向XynII中加入一個非自然的N-末端二硫鍵所得到的穩(wěn)定性的改變程度，比得上與通過去除Cel12A中一個自然的二硫鍵所得到的穩(wěn)定性的改變程度(參見表A)。表A酶ATmTm(攝氏度。C)WTCel12A54,4C32A-18.535.9WTxynII58.6Y5+10.769.3表A顯示了野生型Cel12A的解鏈溫度Tm與32位取代的變異體的對比情況，以及野生型XynlI與該酶Y5變異體的對比。三種已為公眾所知的家族12糖基水解酶(Trichodermareesei-PDB1H8V(里氏木霉-PDB1H8V),Aspergillusniger-PDB1KS5(黑曲霉-PDB1KS5),Streptomyceslividans-PDB2NLR(變鉛青鏈霉菌—-PDB2NLR))結(jié)構(gòu)中N末端二硫橋的三維結(jié)構(gòu)，與Y5木聚糖酶中2位和28位間的非自然二硫橋相比，顯示在二硫橋的位置上有位移。表B顯示了Y5木聚糖酶("PDBlENX"為野生型XynII木聚糖酶)和三種已知家族12結(jié)構(gòu)中二硫橋的位置。在Y5木聚糖酶的2和28處突變的結(jié)構(gòu)位置可以被翻譯到Cd12結(jié)構(gòu)上相應(yīng)的殘基上。在每種情況下，來自Y5的非自然的二硫鍵更加靠近N-末端；對于黑曲霉(A.niger)的結(jié)構(gòu)(PDB1KS5)，可以設(shè)計一個能夠利用N末端殘基本身的二硫鍵(在殘基Q1C、V35C處，依據(jù)黑曲霉(Amgw)編號)。不受其自然序列所限制，可以用X射線數(shù)據(jù)來對N末端的延長和平截進行設(shè)計，從而有助于特異性連結(jié)新N-末端殘基的非自然二硫鍵。表B編碼野生型N-末端S-S位置對應(yīng)于xynll的2-28在N末端上，可以插入s-s的位置(根據(jù)結(jié)構(gòu))PDB1ENX無-Y5C2-C28T2-T28T2C-T28CPDB1H8VC4-C32T2-T34T2C-T34CPDB1KS5C4-C32T2-Y34Q1C-V35CPDB2NLRC5-C31T3-T33T3C-T33C已知大量的家族12序列(表C)可以潛在地通過N末端二硫橋使其穩(wěn)定，特別是那些可以引入非自然的二硫橋的或者天然二硫鍵可以被移到更接近N-末端的分子。表C列出一些序列，其中信號序列的預(yù)測性移除產(chǎn)生出成熟蛋白序列，其與已知的家族12結(jié)構(gòu)非常相似的成熟蛋白序列相似。表C也列出了兩個N末端半胱氨酸(26-28氨基酸)之間的距離，其與Y5中的二硫鍵相似。在切割位點預(yù)測中，以具有己知的、公認(rèn)參數(shù)的手段，理論地移除信號序列(參見，例如，"Identificationofprokai'yoticandeukai'yoticsignalpeptidesandpredictionoftheircleavagesites".HenrikNielsen,JacobEngelbrecht,S0renBmnakandGunnarvonHeijne,戶rato》10,1-6(1997))。表C中大批三維結(jié)構(gòu)未知的序列落入家族12酶的結(jié)構(gòu)相似的集群中，其在N末端、在5+/-2殘基的位點上以相似的方式具有半胱氨酸殘基，與32+/-7的殘基形成二硫橋，使得第一個P鏈或者(3折疊的多個I3鏈可以結(jié)合在鄰近的(3折疊上。所有這些序列都可以使用圍繞表B進行的討論中所描述的方式進行處理，以便改進穩(wěn)定性。表CID序列真核生物/預(yù)測的適當(dāng)?shù)陌胫炼蜴I革蘭氏陰切割胱氨酸編中第二個性/革蘭氏位點號(二硫鍵半胱氨酸陽性中的第一個)的氨基酸數(shù)目，JY2內(nèi)切葡聚糖酶(Eendoglucmiase){GENE:CEL12B}泡盛曲霉(Aspergillusawamoi力(var.kawachi)Eu16-17628Q8NJY4內(nèi)切葡聚糖酶(Eendoglucanase){GENE:CEL12A}-綠色木霉(Trichodermaviride)EU16-17428Q8NJY5內(nèi)切葡聚糖酶{GENE:CEL12A}-HypocreakoningiiEu16-17428Q8NJY6內(nèi)切葡聚糖酶(Eendoglucanase){GENE:CEL12A}-HypocreaschweinitziiEu16-17428Q8NJY7內(nèi)切葡聚糖酶Eu16-1742825<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>[OlOq表D進一步列出了具有未切割信號序列的家族12酶的一些序列。它們都有由30-39個氨基酸分開的半胱氨酸，并且在信號序列去除以后(去除可以如同表C進行)，這些半胱氨酸在結(jié)構(gòu)上能夠在N-末端形成二硫橋(如可以在公眾所知的結(jié)構(gòu)中看到的，參見表B)。建議突變的位點與Y5突變體的位點2-28之間的二硫橋所對應(yīng)的部位相關(guān)。使用MOE程序(ChemicalComputingCorp)、使用標(biāo)準(zhǔn)序列匹配方法(standardsequencematchingmethod)，對糖基水角軍酶序列進行比對。表DTr094218Ceil2AspergillusaculeatusD22C/G52C<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>TrP96492AF435072AF434180AF434181AF434182AF434183AF434184A-F43-5063AF435064AF435065AF435066AF435071AF435068Cell2Cell2ACeU2ACell2ACell2ACell2ACell2BCell2ACell2BCell2CCell2DCell2ACell2AThermotogaV20C/K56CneopolitanaAspergillusKawachiQ20C/T52C(白曲霉)ChaetiumbrasilienceEmericelladesertorumFusariumequiseti(木賊鐮刀菌)S28C/Y61CD30C/G63CD19C/H51CNectriaipomoeaeNectriaipomoeaeBionectriaochroleucaBionectriaochroleucaBionectriaochroleucaBionectriaochroleucaHumicolagriseaQ25C/T58CT32C/T65CT20C/Y52CT34C/T66CA18C/T50CS19C/Y51CS34C/Y67CT18C/T50CHypochreaschweinitziiAF435067Cel]2AStachybotrysS18C/Y50Cechinata不僅家族ll和12的N-末端區(qū)域表現(xiàn)出了高度的結(jié)構(gòu)相似性；而且兩個家族都顯示出手形結(jié)構(gòu)(handlikestructure),如T6rr6nen等.1997中描述的"半握的右手"中的手形結(jié)構(gòu)。兩個(3折疊形成"拇指以外的手指(fmgers)"，從一個(3折疊和a螺旋而來的一個扭曲成對物形成了"手掌"。(3鏈B7和B8間的長環(huán)形成了"拇指"，(3鏈B6b(xynII中的95-102殘基和Cell2A中的125-131殘基)和B9間的環(huán)的一部分形成了"索(cord)"，其在一端上穿過該裂縫(TorronenA.和Rouvinen,J.Biochem.1995,34,847-0856)。在卩鏈B6b和鄰近的環(huán)和/或"索"之間插入剛性化取代的穩(wěn)定化效果可以在92、93、144位的突變(N92C-H144C,下面突變中的至少一個N97R、F93W+H144K(Xyn11))中看到，并且可以使用類似的辦法引入到家族12的相應(yīng)部位。表E顯示在xynII和Cel12A之間選擇結(jié)構(gòu)等價位點的編號。兩個家族之間的高度結(jié)構(gòu)相似性使大量的類似取代成為可能(對于結(jié)構(gòu)比較，參見Sandgren等，J.Mol.,Biol.,2001)。表E<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>本發(fā)明的修飾酶可含有上面所述的突變以外的一個或多個突變。也可能包括在一個或多個其它位置的其它突變，諸如刪除、插入、取代、顛換、轉(zhuǎn)換和倒位(inversions).同樣地，修飾酶也可缺少上面所述取代中的至少一個。修飾酶也可包括保守性取代，保守性取代可以以相似-對-相似取代(like-for-likesubstitution)發(fā)生(例如，堿性的對堿性的，酸性的對酸性的，極性的對極性的等等)。非保守性取代也可能發(fā)生，即，從一種類型的殘基到另一種，或者可選擇地涉及引入非自然的氨基酸，諸如鳥氨酸、二氨基丁酸鳥氨酸，正亮氨酸鳥氨酸，吡啶丙氨酸(pyriylalanine)，噻吩丙氨酸，萘丙氨酸，和苯甘氨酸。序列也可具有氨基酸殘基的復(fù)數(shù)個刪除、復(fù)數(shù)個插入或者復(fù)數(shù)個取代，這些產(chǎn)生沉默的變化，形成功能等價的物質(zhì)。有意的氨基酸取代可基于氨基酸性質(zhì)(諸如極性，電荷，溶解性，疏水性，親水性以及/或者殘基的兩性性質(zhì))的相似性來進行，因此將氨基酸在功能組中分組在一起是有用的。氨基酸可以僅基于其側(cè)鏈的性質(zhì)分組在一起。然而同時包括突變數(shù)據(jù)在內(nèi)更有用處。這樣生成的氨基酸集合可能出于結(jié)構(gòu)的原因而是保存性的。這些集合可以用Vemi表(Venndiagram)的開鄉(xiāng)式被描述(LivingstoneC.D.和BartonG丄(1993)"Proteinsequencealignments:astrategyforthehierarchicalanalysisoftheresidueconservation"C函戶A^p/S/osc/.9:745-756)(TaylorW.R.(1986)"Theclassificationofaminoacidconservation"/772eor-199:205-218)。亍呆守性取代可以如此進行，例如根據(jù)下面的表進行，下面的表描述了將氨基酸分組的普遍接受的Venn表。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>變異體氨基酸序列也可包括插入于該序列中的任意兩個氨基酸殘基之間的適當(dāng)?shù)拈g隔基(spacergroups),除了氨基酸間隔基諸如甘氨酸或p-丙氨酸殘基之外，還包括烷基基團，諸如甲基、乙基或丙基。進一步的突變形式還包括一個或多個以甘氨酸胺基取代的陽離子寡聚合物(類肽(peptoid))形式存在的氨基酸殘基。同源性比較(homologycomparisons)可以用肉眼來進行，或者更經(jīng)常地，借助容易獲得的序列比較程序來進行。這些可通過商業(yè)途徑獲得的計算機程序可以計算兩個或多個序列間的同源性百分?jǐn)?shù)?？梢栽谙噜彽男蛄猩嫌嬎阃葱园俜?jǐn)?shù)，即一個序列同另一個序列進行比對，一個序列上的每個氨基酸都直接同另一個序列上的相應(yīng)的氨基酸進行比較，每次進行一個殘基的比較。這稱為"無空位(imgapped)"比對。一般地，這樣的無空位比對僅在數(shù)目相對較少的殘基上進行。盡管這是一個非常簡單和一貫的方法，但它沒有考慮到，例如，在另外的相同序列對中，一個插入或者刪除將會導(dǎo)致后面的氨基酸殘基無法進行比對，從而在進行全局比對的時候潛在地導(dǎo)致同源性百分?jǐn)?shù)上的大幅減小。因此，大多數(shù)序列比較方法都設(shè)計成產(chǎn)生優(yōu)化的比對過程，考慮可能的插入和刪除而不過度懲罰總同源性分?jǐn)?shù)。這通過這樣的手段實現(xiàn)在序列比對中插入"空位(gap)"以便使局部同源性最大化。然而，這些更加復(fù)雜的方法給比對中出現(xiàn)的每個空位賦予"空位罰分(gappenalties)",以至于對于相同氨基酸的相同數(shù)目來說，一個具有盡可能少空位的序列比對一反映被比較的兩個序列的更高相關(guān)性(rdatedness)—將比具有許多空位的序列比對得到更高的分?jǐn)?shù)。"仿射空位罰分(affmegapcost)"—般被用來對空位的存在施加一個相對較高的罰分，對該空位中每個后來的殘基施加較小的罰分。這是最普遍應(yīng)用的空位打分系統(tǒng)(gapscoringsystem)。高空位罰分當(dāng)然會產(chǎn)生優(yōu)化的比對，具有較少的空位。多數(shù)的比對程序允許對空位罰分進行修正。然而，在使用這些軟件進行序列比較的時候優(yōu)選使用默認(rèn)值。例如，在使用GCGWisconsinBestfit軟件包的時候，對氨基酸序列的默認(rèn)的空位罰分是每個空位為-12，及每個延長為-4。因此最大％同源性的計算首先要求生產(chǎn)優(yōu)化的比對，考慮空位罰分。能夠?qū)崿F(xiàn)這樣的比對的一個合適的計算機程序是GCGWisconsinBestfit軟件包(Devereux等，1984Nuc.AcidsResearch12p387)。可進行序列比較的其它軟件的例子包括，但不僅限于BLAST軟件包(參見Ausubel等，1999ShortProtocolsinMolecularBiology,4thEd-Chapter18)，F(xiàn)ASTA(Atschul等，19卯J.Mol.Biol.403-4IO)和GENEWORKS比較工具包。BLAST和FASTA都可用于離線搜索和在線搜索(參見Ausubel等，1999,ShortProtocolsinMolecularBiology,第7-58頁至第7-60頁)。然而，在一些應(yīng)用中，優(yōu)選使用GCGBestfit程序。BLAST2Sequences也是可得到的、用于比較蛋白和核酸序列的程序(參見FEMSMicrobiolLett1999174(2):247-50;FEMSMicrobiolLett1999177(1):187-8以及tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。盡管最終的同源性百分?jǐn)?shù)可以根據(jù)同一性(identity)來衡量，但比對過程本身一般并不基于一種全或無的序列對比較(all-or-nothingpaircomparsion)。做為代替，一般使用成比例相似性打分矩陣(scaledsimilarityscorematrix),它基于化學(xué)禾目j以性或進4七距離(evolutionarydistance)給每個成對的比較打分。這種矩陣的一個普遍使用的例子是BLOSUM62矩陣一BLAST程序包的默認(rèn)矩陣。GCGWisconsin程序一般使用公用的默認(rèn)值或者定制的符號比較表，如果提供了的話(進一步的細(xì)節(jié)參見使用者手冊)。在一些應(yīng)用中，優(yōu)選使用GCG軟件包的公用默認(rèn)值，或者在使用其它軟件的時候，使用默認(rèn)矩陣，例如BIX)SUM62。替代地，同源性百分?jǐn)?shù)可以使用DNASIStm(HitachiSoftware)中的多比對特征進行計算，其基于類似于CLUSTAL(HigginsDG&SharpPM(1988),Gene73(1),237-244)的算法。—旦軟件生成了優(yōu)化的比對，就可能計算同源性百分?jǐn)?shù)，優(yōu)選為序列同一性百分?jǐn)?shù)。軟件一般把這做為序列比較的一部分并生成數(shù)字結(jié)果。本發(fā)明的第一個和第二個方面的實施方案，如上面公開的，提供了編碼如上提出的修飾酶的核酸及其互補物(comple認(rèn)nts)。在又一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供包括至少一種此處公開的修飾酶以及其它成份的組合物。在另外的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供包含此處公開的修飾酶的載體、包含修飾酶的細(xì)胞以及表達(dá)修飾酶的方法。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會了解核酸序列和多肽序列之間的關(guān)系，特別是遺傳密碼和該密碼的簡并性，并且能夠輕易地構(gòu)建這樣的修飾酶。例如，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會知道，對于每個修飾酶序列的氨基酸中的取代，都可能有一個或多個編碼該取代氨基酸的密碼子。因此，顯而易見，依賴于該特定氨基酸殘基相關(guān)遺傳密碼的簡并性，可以產(chǎn)生一個或多個修飾酶核酸序列，它們對應(yīng)于該修飾酶多肽序列。在氨基酸序列和核酸序列中的突變可以用本領(lǐng)域所知許多技術(shù)中的任意技術(shù)來進行。在特別優(yōu)選的實施方案中，通過PCR(聚合酶鏈反應(yīng))，使用合適的引物向親代序列中引入突變，如實施例中所說明的。親代酶可能在氨基酸水平或者核酸水平被修飾，產(chǎn)生此處描述的修飾酶序列。因此，優(yōu)選的實施方案通過向編碼修飾酶的核苷酸序列中引入一個或多個相應(yīng)的密碼子改變來提供修飾酶的產(chǎn)生。應(yīng)該理解，可以在任何修飾酶核酸序列中做出上述的密碼子改變。例如，可以對此處描述的任何同源序列做出序列改變。修飾酶可包含"全(complete)"酶，即具有它在自然界存在(或突變的)的完整長度，或者它可能包含其截短的形式。從此衍生而來的修飾酶可因此為如此截短的或者是"全長的(full-length)"。截短可在N-末端或C-末端。修飾酶可缺少一個或多個部分，諸如亞序列(sub-sequence)、信號序歹ll(signalsequence)、域(domain)或者部分(moiety)，無論其是有活性的或者無活性的。編碼具有如此處定義的特殊性質(zhì)的酶，或者編碼適合做出修飾的酶，如修飾酶的核苷酸序列可從產(chǎn)生上述酶的任何細(xì)胞或者生物體中被鑒定和/或被分離和/或被純化出來。有多種在本領(lǐng)域熟知的鑒定和/或分離和/或純化核苷酸序列的方法。舉例來說，一旦合適的序列被鑒定和域分離和/或純化，就可以使用PCR擴增技術(shù)來制備--個序列的多個拷貝。迸一步舉例，可以使用來自產(chǎn)生酶的生物體中的染色體DNA或者信使RNA來構(gòu)建基因組DNA禾n/或cDNA文庫。如果酶的氨基酸序列或者酶的氨基酸序列的一部分己知，就可以合成標(biāo)記的寡核苷酸探針,并用于鑒別從生物體制備的基因文庫中的酶編碼克隆(enzyme-encodingclone)。替代地，含有標(biāo)記寡核苷酸探針的序列，其與另一個已知酶基因是同源的，可以被用來鑒別酶編碼克隆。在后一種情況中，使用嚴(yán)格程度相對較低的雜交和洗滌條件?？蛇x地，酶編碼克隆可以這樣鑒別向表達(dá)載體，諸如質(zhì)粒中插入基因組DNA片段；用作為結(jié)果而形成的基因組DNA文庫轉(zhuǎn)化酶陰性細(xì)菌(enzyme-negativebacteria);然后將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌鋪板于含有酶的底物的瓊脂平板上，從而使克隆表達(dá)該將要被鑒別的酶。在更進一步的可選方案中，編碼修飾酶的核苷酸序列可以使用已經(jīng)建立的標(biāo)準(zhǔn)方法合成制備，例如，BeucageS丄.等，(1981)TetrahedronLetters22,p1859-1869中描述的磷酸酰胺(phosphoroamidite)方法或者Matthes等，(1984)EMBOJ.3,p801-805中描述的方法。在phosphoroamidite方法中，寡核苷酸被合成，例如在DNA自動合成儀中；被純化；被退火；被連接；和在合適的載體中被克隆。核苷酸序列可具有混合基因組的及合成的來源，可具有混合合成的及cDNA的來源，或者可具有混合基因組的及cDNA的來源，依照標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，通過連接合成的、基因組的或者cDNA起源的片段來制備。每個連接起來的片段相應(yīng)于整個核苷酸序列的不同部分。DNA序列也可以通過聚合酶鏈反應(yīng)，使用特定的引物來制備，例如在US4,683,202或SaikiRK等，(Science(1998)239,pp487-491)中描述的。此處描述的以及適合用于此處描述的方法和組合物的核苷酸序列，可在它們之內(nèi)包括合成的或修飾的核苷酸。己知本領(lǐng)域有許多不同類型的對寡核苷酸的修飾。這些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架和/或在分子的3'末端和/或5'末端添加吖啶或聚賴氨酸鏈。為了本文件的目的，應(yīng)該理解，此處描述的核苷酸序列可使用本領(lǐng)域可使用的任何方法進行修飾。進行這些修飾是為了增強核苷酸序列的體內(nèi)活性或者延長壽命跨度。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案提供核苷酸序列以及核苷酸序列的用途，該核苷酸序列與此處提出的序列、或者任何衍生物、片段或者其衍生物是互補的。如果序列與其中的片段互補，那么該序列可以用作探針，在其它生物體等等中鑒別相似的編碼序列。不與修飾酶序列100%同源的多核苷酸可以用許多手段獲得。此處描述序列的其它變體可以通過例如探測用一定范圍的個體制得的DNA文庫來獲得，例如，所述個體來自不同種群。另外，可以得到其它同系物并且這些同系物及其片段通常能夠選擇性地與在此列出的序列列表中所展示的序列雜交。這樣的序列可以通過如下方式獲得探測從其它物種制得的cDNA文庫或者基因組DNA文庫；以及在中等到高度嚴(yán)格條件下，使用探針來探測這些文庫，其中使用的探針包含所附序歹U歹lJ表(attachedsequencelisting)中任何序列之一的全部或一部分。相似的考慮用來得到此處描述的多肽或核苷酸序列的物種同系物和等位基因變異體。變異體和株/禾中同系物也可以通過簡并PCR(degeneratePCR)獲得，其中PCR使用被設(shè)計靶向在變異體和同系物之中的序列，這些序列編碼保守的氨基酸序列。簡并PCR中使用的引物將包含一個或多個簡并位置，并且在比針對己知序列用單個序列弓I物克隆序列中所采用條件的嚴(yán)格性更低的條件下被使用。保守序列可以通過例如比對來自幾個變異體/同系物的氨基酸序列來預(yù)測。序列比對可以使用此處描述的本領(lǐng)域所知的計算機軟件來進行?？蛇x地，這樣的多核苷酸可以通過如此處提供的已表征序列的定點誘變(sitedirectedmutagenesis)來得到。在有些場合這可能會有用，例如需要沉默密碼子序列改變，以便優(yōu)化密碼子對特定宿主細(xì)胞的優(yōu)先選擇性，其中在該宿主細(xì)胞中多核苷酸序列得到表達(dá)。為了引入限制酶識別位點，或者改變多核苷酸編碼的多肽的性質(zhì)或功能，也可能需要作出其它的序列改變。多核苷酸可以用來產(chǎn)生引物，例如PCR引物、交替擴增反應(yīng)(alternativeamplificationreaction)的引物；產(chǎn)生探針，例如使用放射性或者非放射性標(biāo)記，通過傳統(tǒng)方法用顯色標(biāo)記(revealinglabel)進行標(biāo)記的探針，或者多核苷酸可以被克隆進入載體。這樣的引物、探針以及其它片段的長度將有至少15個，優(yōu)選為至少20個，例如至少25個、30個、40個核苷酸，并且也包含在術(shù)語多核苷酸內(nèi)。多核苷酸，諸如DNA多核苷酸和探針可以以重組、合成或者本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用的任何方法來制得。它們也可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)被克隆。一般地，引物用合成方法來制得，該方法涉及每次一個核苷酸的逐步制造期望核酸序列。在本領(lǐng)域已經(jīng)可以容易地獲得實現(xiàn)這些的自動化技術(shù)。更長的多核苷酸一般使用重組的方法來制得，例如使用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))克隆技術(shù)。引物可以被設(shè)計成，包含合適的限制酶識別部位，以使得擴增的DNA可以被克隆進入合適的克隆載體。優(yōu)選地，變異體序列至少與此處提出的序列具有同樣的生物活性。本發(fā)明優(yōu)選的實施方案包括與修飾酶互補的序列或者能夠雜交到修飾酶的核苷酸序列上的序列(包括此處提出的那些互補序列)，以及可與修飾酶核苷酸序列雜交的序列互補的核苷酸序列(包括此處提出的那些互補序列)。優(yōu)選的實施方案提供在中等到最大嚴(yán)格性條件下能夠雜交到此處提出的核苷酸序列的多核苷酸序列。優(yōu)選的實施方案包括在嚴(yán)格條件下(例如5(TC，0.2xSSC下)可以雜交到修飾酶核酸的核苷酸序列，或者其互補序列的核苷酸序列。更加優(yōu)選地，該核苷酸序列可以在高度嚴(yán)格條件下(例如65i:，O.lxSSC下)雜交到修飾酶的核苷酸序列，或者其互補體上。期望對序列進行突變來制備修飾酶。因此，可以從此處提供的修飾酶來制備突變體。可以通過合成的寡核苷酸來引入突變。這些寡核苷酸包括位于期望突變位點的側(cè)翼的核苷酸序列。Morinaga等，(歷otec/wo/ogK1984)2,p646-649)中公開了一個合適的方法。在NelsonandLong04ra/;^'ca/所oc/^冊;^乂1989),180,p147-151)中描述了另一個向酶編碼核苷酸序列引入突變的方法。SarkarandSommer(所otec/7m々Mes(1990),8,p404-407"Themegaprimermethodofsitedirectedmutagenesis")描述了又一方法。對序列進行突變的其它方法也在此處使用和公開。在優(yōu)選的實施方案中，此處描述的方法和組合物中用到的序列為重組序列一即使用重組DNA技術(shù)制備的序列。這樣的技術(shù)在文獻中得到解釋，例如J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989,Afo/ecw/wC7ow'"gvJ丄a60rato7Ma77認(rèn)/，SecondEdition,Books1-3,ColdSpringHarborLaboratoryPress.另外的實施方案提供含有修飾酶的組合物和配方。該組合物含有修飾酶，同時還含有其它成份。另外的實施方案提供包含修飾酶的載體、包含修飾酶的細(xì)胞和表達(dá)修飾酶的方法。此處描述的方法和組合物中使用的核苷酸序列可被摻入到重組可復(fù)制載體上。該載體可以用來復(fù)制以及在相容的宿主細(xì)胞中和/或從可相容的宿主細(xì)胞，以酶的形式表達(dá)核苷酸序列。表達(dá)過程可以用調(diào)控序列，例如調(diào)節(jié)序列進行調(diào)控。通過表達(dá)核苷酸序列由宿主重組細(xì)胞產(chǎn)生的酶可以被分泌出來或者內(nèi)含于胞內(nèi)，這取決于使用的序列和/或載體。編碼序列可以設(shè)計成具有信號序列，該信號序列引導(dǎo)物質(zhì)編碼序列分泌通過原核或真核細(xì)胞膜。多核苷酸可以被插入到重組可復(fù)制載體中。該載體可以用來在相容性宿主細(xì)胞中復(fù)制核酸。包含多核苷酸序列的載體可以轉(zhuǎn)化進入合適的宿主細(xì)胞內(nèi)。合適的宿主包括細(xì)菌、酵母菌、昆蟲和真菌細(xì)胞。修飾酶及其多核苷酸可以通過向可復(fù)制載體引入多核苷酸，向相容性宿主細(xì)胞中引入該載體以及在可使載體復(fù)制的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞來表達(dá)。載體可以從宿主細(xì)胞中回收。修飾酶核酸可以操控性地連接在感興趣的宿主細(xì)胞中的活性轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控元件之上。修飾酶核酸也可以編碼融合蛋白，該融合蛋白包含信號序列，諸如，例如那些從來自Sc/w朋m'omyc^occf&"tofo的葡糖淀粉酶基因、來自&cc/zaram少cenceWs&e的a-因子交配型基因以及來自米曲霉的TAKA-淀粉酶衍生出的序列?？蛇x地，修飾酶核酸可編碼包括膜結(jié)合區(qū)(membranebindingdomain)的融合蛋白。在宿主生物體中使用表達(dá)載體，可以使修飾酶在期望的水平被表達(dá)。包含修飾酶核酸的表達(dá)載體可以是能夠在所選宿主生物體中表達(dá)編碼修飾酶核酸序列的基因的任何載體，并且載體的選擇取決于其將被引入的宿主細(xì)胞。因此，載體可以為自主復(fù)制載體，即，以游離實體存在的載體，其復(fù)制獨立于染色體復(fù)制，諸如，例如質(zhì)粒、噬菌體或者附加體成份、微型染色體或者人工染色體?？蛇x地，載體可以是這樣的載體，當(dāng)被引入宿主細(xì)胞時，它被整合到宿主細(xì)胞的基因組并且與染色體一同被復(fù)制。表達(dá)載體一般包括克隆載體的組分，諸如，例如允許載體在選出的宿主生物體中自主復(fù)制的成份，以及一個或多個出于選擇目的的表型地探測的標(biāo)記物。表達(dá)載體通常包含控制核苷酸序列，該控制核苷酸序列編碼啟動子、操縱基因、核糖體結(jié)合部位、翻譯起始信號以及任選地，阻遏基因或者一個或多個激活基因。另外，表達(dá)載體可以包含編碼氨基酸序列的序列，該氨基酸序列能夠?qū)⑿揎椕赴邢蛩拗骷?xì)胞細(xì)胞器，如過氧化物酶體或者靶向特定宿主細(xì)胞區(qū)室。這樣的靶向序列包括但不僅限于SKL序列。對于在調(diào)控序列引導(dǎo)下的表達(dá)，修飾酶核酸序列以與表達(dá)相關(guān)的合適的方式可操控地連接于調(diào)控序列(controlsequence)上。優(yōu)選地，載體中的多核苷酸可操控地連接于調(diào)控序列上，該調(diào)控序列能夠提供宿主細(xì)胞對編碼序列的表達(dá)，即該載體是表達(dá)載體。調(diào)控序列可以被修飾，例如，通過添加進一步的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件來使調(diào)控序列所指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平對轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑更加響應(yīng)。該調(diào)控序列(controlsequence)可以特別地包含啟動子。在載體中，編碼修飾酶的核酸序列可操控地與合適的啟動子序列相結(jié)合。啟動子可以是在選定的宿主生物體中具有轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，并且可以衍生自與宿主生物體同源或異源的基因。指導(dǎo)修飾核苷酸序列轉(zhuǎn)錄，諸如細(xì)菌宿主中修飾酶核酸的轉(zhuǎn)錄的合適的啟動子例子包括五co/z丫丈i,蘑)的/ac操縱子的啟動子，幼，tomyc"coe//co/o<天f經(jīng)楚霉瓊脂糖酶基因啟動子，Sa"7/ay//c/犯w》r/m's(0^^"^/應(yīng)/f萄a-淀私、酶基因(a,w少丄)啟動子，5ac/〃附■^"fcr/z^P^^/f/^^tlaprE啟云力子，_6ac///z他ara^r;7，M附67,濕^^"^^^f蘑9麥芽糖淀粉酶基因(fl"，W)的啟動子，^"7/w""^/o/fgwe/ac^rafif^^^^/^^f^a-淀粉酶基因(a,wj;2)的啟動子，^ac///^raM/^祐享^^"潛/f葡矽L4和x少/6基因的啟動子以及衍生自丄actococcusp.(乳球菌種)-衍生啟動子的啟動子，包括P170啟動子。當(dāng)編碼修飾酶的基因在菌種，諸如Eco/《;t應(yīng)/f萄中得到表達(dá)，就可以從例如包括T7啟動子和噬菌體X啟動子(phagelambdapromoter)的噬菌體啟動子中挑選出合適的啟動子。對真菌種中的轉(zhuǎn)錄，有用的啟動子例子是那些衍生自編碼^^wg///^07，fle^e必霉卩TAKA淀粉酶、i/7/zo7wcor/加'e/2e/d7^/,老萄天冬氨酸蛋白酶、爿^wg7'〃ws"/ge/(黑必導(dǎo)中性oc-淀粉酶、A"/g^丫黑威尋酸穩(wěn)定a-淀粉酶、A葡H淀粉酉每、i/2/zo"wco/"7加'e/7e/f",7^凝毛^)月旨酉每、爿^ergz7/Ms00;zae(^e，導(dǎo)堿性蛋白酶、Ape^7/w0/7加4^*萄丙糖磷酸異構(gòu)酶或A;^g///^"油/朋<溝#俯導(dǎo)乙酰胺酶的基因的啟動子。適合在酵母種中表達(dá)的啟動子的例子包括但不僅限于^acc/7aromj/ceracerev&'ae的Gall和Gal10啟動子以及尸/c/由;mton^伊^^^綴AOX1或AOX2啟動子。合適的細(xì)菌宿主生物體的例子是那些革蘭氏陽性細(xì)菌菌種，諸5ac/〃船//c/zemybr/w.5^邀-^,潛/f萄、5"c/〃ms/e"加(^象,遭/f萄、潛,萄、Sacf〃wsa汰a/opM附、Bac///z咖cz'em^，淀教,遺/f萄、Badscoag^/am"卩凝券芽潛/f葡、S"c飾s/a幽s、^"7/w51"犯g她"'朋《f乂,逾/f萄^Bac/〃w51決腦'"g/e服1^^,金,潛/f熟；iS/廠e^cw;ycay卩凝""^^熟菌禾中，諸如幼"e/to/w少cas/"w/"船，包括丄actococcw51spp.(乳球菌屬)的乳酸菌種，諸如丄actococc附/"ctof^麼^承廣)，Z^cto6acz'〃wsspp.(字L桿菌屬)，包括丄flctoZw"'〃1^〖丫磁虎離/7^韻,Lewco"astocsp/Y剪審豫,厲義i^(i/ococcwsspp.(片球菌屬)禾口6y/"tococ(^5p/.卩楚/fW厲?？蛇x地，屬于五"feraZ。cter/"cg"e卩#//慮衫入包括五.co/《7t厲,萄，或者屬于i^ez^omwM^ceae(Y度卓/資^Wj的革蘭氏陰性細(xì)菌菌株可以被選為宿主生物體。合適的酵母酵母宿主生物體可以從生物技術(shù)相關(guān)的酵母菌種中選出，諸如但不僅限于這些酵母菌種，例如戶/cA/fl乎f，i/""化"w/"^f汰邀縻學(xué)厲9MiT/i(yveram;/c&s^克魯/君摩^)，K77了cw/7w'a菌禾中或Sacc/7a7"/7yc"菌禾中，包J舌&cc/2<aram_yc￡scwevz\s/ae卩激#"摩母J或者屬于Sacc/加raw少ce白勺菌種，諸如，例如5^om6^^^^,母j菌種。優(yōu)選使用甲基營養(yǎng)酵母菌種P/c/由戸加n'^伊,摩徵菌株作為宿主生物體。優(yōu)選地，宿主生物體為//，"肌/<汰遜##母卩菌種。絲狀真菌中合適的宿主生物體包括/1s^wg/〃M^俯^^菌禾中，例如^sperg7'〃wsm'g^Y,幕游^j,j^ergi〃ws(9/，。gf^/^萄，^印e/'g7'〃Mw6扭"i7^，y^戸《/〃附"職"。/《液:^應(yīng)萄或v4s/erg/〃z^m'甴/mM(^^^應(yīng)萄?？蛇x地，使用i^"arz'MOTf^77萄種的菌株，例如尸w似n'w附ox;^/07，7《;^潛^Z7萄或者i/z/zo"wcwY凝導(dǎo)禾中的菌株，諸如i^'zo,鼎cor卵:e/^丫;^,裙霉作為宿主生物體。其它合適的菌株包括27^廠附cw^ce^〃,藥萄禾口iWwco/丫老尋菌禾中。包含多核苷酸的宿主細(xì)胞可以用來表達(dá)多肽，諸如此處公開的修飾酶及其片段、同系物、變體或者衍生物。宿主細(xì)胞可以在允許蛋白表達(dá)的合適的條件下培養(yǎng)。多肽的表達(dá)可以為組成型(constitutive),使得它們可以不斷地被生產(chǎn)出來；或者為誘導(dǎo)型，需要刺激來引發(fā)表達(dá)。在誘導(dǎo)型表達(dá)的情況下，在需要的時候可以通過例如向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物，例如地塞米松或IPTG來引發(fā)蛋白生產(chǎn)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的多種技術(shù)將多肽從宿主細(xì)胞中提取出來，這些技術(shù)包括酶學(xué)的、化學(xué)的和/或滲透裂解(osmoticlysis)以及物理的破壞。多肽也可以在體外無細(xì)胞系統(tǒng)中重組地生產(chǎn)，諸如TnTTM(Promega)兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)(TnT(Promega)rabbitreticulocytesystem)。在第三個方面，本發(fā)明涉及對酶進行修飾的方法，包括在結(jié)構(gòu)定義區(qū)域的酶部分上修飾第一位點，使得第一位點可以結(jié)合第二位點上。在優(yōu)選的實施方案中，第一位點在環(huán)上或者在鄰近卩折疊的序列上。在優(yōu)選的實施方案中，第二位點位于P折疊中。在優(yōu)選的實施方案中，修飾酶為木聚糖酶或者部族C酶。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及修飾的木聚糖酶或?qū)δ揪厶敲?或修飾酶)進行修飾的方法，該方法依照下面至少一條(i)修飾N-末端序列，使得N末端區(qū)域被二硫橋結(jié)合在鄰近的p鏈上(參見Gmber,等，1998，r固ez'XynII中分別對應(yīng)氨基酸l-4和24-30);(ii)對C-末端(r7狄w'XynlI中氨基酸183-190，參見Gmber，等，1998)進行修飾，使得它連接在鄰近的(3鏈上；(iii)對酶的a螺旋進行修飾，使其更加牢固地結(jié)合在蛋白質(zhì)的主體上；(iv)對至少一個鄰近的環(huán)進行修飾，使其與鄰近的(3鏈B6a相結(jié)合(T.reeseiXynII中氨基酸91-94，Gmber等，1998)或者(v)對XynII的等價殘基進行修飾，如上面提供的。如另一個實施方案，(通過實施例)可以用誘變，在不同區(qū)域形成二硫橋、鹽橋和獨立的點突變(pointmutation)。例如，酶可以被修飾，形成至少一個二硫橋，使得在至少一個的二硫橋處可以1)穩(wěn)定N-末端區(qū)域或者將N-末端(3鏈連接到鄰近的I3折疊上(XynII上2-28,5-19，7-16,10-29位，或者等價的位置，如此處公開的)；2)穩(wěn)定a螺旋區(qū)域(XynlI上105-162,57-153，110-151，111-151,或者如此處公開的等價的位置)；3)穩(wěn)定C-末端區(qū)域(Xynll中63-188,61-190,36-186或34-188，或者如此處公開的等價的位置)；或者4)通過結(jié)合到在諸如B6b(Xynll中92-144,113443或者如此處公開的等價的位置)的卩鏈上來穩(wěn)定環(huán)，以及/或者5)穩(wěn)定J3折疊(XynII中26-38,61-149,63-147,65-186,67-184位，或者如此處公開的等價位置)?？梢栽诿傅牟煌恢?例如XynlI中的22,180,58或者+191D位，或者等價的位置，如此處公開的)生成鹽橋，并且可以在分子的不同位置(例如XynII中108,26,30,67,93,97，132,157,160,165,169或者186位，或者等價位置，如此處公開的)引入單點突變，從而增加蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性和/或嗜熱性和域嗜堿性。如Y5突變體中，作為重組改變，添加一個氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)，使得C-末端可以與酶的主體結(jié)合得更牢固，該氨基酸可以隨后在C-末端和酶的主體之間形成鹽橋。如果合適的話，可以在蛋白質(zhì)的主體上進行適當(dāng)?shù)陌被崽鎿Q，使其可以通過(X螺旋或者(X螺旋的鄰近區(qū)域，形成鹽橋或者穩(wěn)定酶的C-末端部分。依照本發(fā)明的這個方面，可以產(chǎn)生另外的突變型。家族11和12酶的N末端I3鏈A1或者N末端環(huán)的結(jié)構(gòu)，被描述成先于/直到通向卩鏈Bl的卩轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的P鏈、財斤疊A的一部分，或者被描述為財斤疊的第一個卩鏈之前的N-末端環(huán)(參見T6n'6nen等，Biochemistry1995，34,847-856;Sandgren,等，J.Mol.Bio.(2001)308,295-310;Gmber,等，1998)。N-末端區(qū)域的B1(3鏈被描述成先于/直到(3轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的(3折疊B的(3鏈部分，該(3轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)通向(3鏈B2，或者被描述為財斤疊的第一個(3鏈之前的環(huán)。卩鏈Al區(qū)域優(yōu)選結(jié)合于(3鏈A2或者結(jié)合于任何鄰近的其它區(qū)域(XynlI或者它的等價物)。(3鏈Bl區(qū)域優(yōu)選結(jié)合于f3鏈B2或者結(jié)合于任何鄰近的其它區(qū)域(XynII或者它的等價物)。在XynlI中Al包含殘基l-4，A2包括殘基25-30，Bl包含殘基6-10，B2包含殘基13-19。家族11和12酶中C末端卩鏈A4或者C末端環(huán)的結(jié)構(gòu)為(3鏈A3和A5之間財斤疊的(3鏈部分或者如下面的卩折疊A4的環(huán)(參見T6rr加en等，Biochemistry1995,34,847-856;Sandgren,等，J.Moi.Bio,(2001)308，295-310;Graber,等，1998)。卩鏈A4區(qū)域優(yōu)選結(jié)合于(3鏈A3或A5或者結(jié)合于任何其它鄰近區(qū)域。在XynlI中A4為殘基183-190，A3為殘基33-39，A5為殘基61-69。家族ll和12的索被描述為連接卩鏈B6b與B9的環(huán)。家族11和12B6b的卩鏈被描述為索之前的(3鏈(參見T加6nen等，Biochemistry1995,34,847-856;Sandgren,等，J.Mol.Bio.(2001)308，295-310;Gmber,等，1998)。p鏈B6b區(qū)域可以連接于索或者(3鏈A6和B7之間的環(huán)上，或者連接于任何其它鄰近的區(qū)域上。在XynII中，B6b為殘基卯-94，B9為殘基103-H0，索為95-102，卩鏈A6為殘基148-152，卩鏈B7為殘基134-142,卩鏈A6和B7之間的環(huán)為143-147。家族11和12酶的螺旋被描述成(3鏈A6后面的區(qū)域并且形成平行于卩鏈B9的螺旋結(jié)構(gòu)(T6rronen等，Biochemistry1995,34，847-856;Sandgren,等，J.Mol.)。家族11和12酶的螺旋優(yōu)選結(jié)合于(3鏈B9或者其它任何鄰近的區(qū)域。在XynII中，螺旋為殘基153-162，(3鏈A6為殘基148-152禾叩鏈B9為殘基103-110。實施例實施例l用于木聚糖酶II表達(dá)和誘變模板的質(zhì)粒編碼rn'c/w^mwmes丫f歷術(shù)霉^7^//基因產(chǎn)品的開放式閱i賣冷苣(openreadingframe)，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，從r,Y"ez丫f氏術(shù)霉卩cDNA文庫被擴增。XYNIIcDNA被克隆進入pKKtac(VTT,Espoo,Finland)或者可選地被克隆進入pALK143(ROAL,Rajam汰i，F(xiàn)inland)。實施例2用定點誘變來產(chǎn)生木聚糖酶II突變體正如在實施例l中描述的，包含cDNA編碼木聚糖酶II的表達(dá)載體，被用作連續(xù)PCR擴增中分步定點誘變的模板。包含X-Y突變的改變密碼子的合成寡核苷酸引物，被用來將期望的改造插入到天然木聚糖酶II原來的氨基酸序列中。通過該方法，產(chǎn)生了野生型酶突變體的92,93和144位的殘基，將xynlI上環(huán)N143-S146結(jié)合到鄰近的(3鏈上。另夕卜，執(zhí)行誘變過程，在木聚糖酶原先序列的22,65,97和108位產(chǎn)生突變。圖3顯示了誘變中使用的寡核苷酸序列。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程，如QuickChangeSite-directedmutagenesis(十夬速i3女變定^U秀變)(Stratagene,LaJolla，Ca，USA)中所述，進行PCR。用iyi/Turbo(Stratagene)作為DNA聚合酶來擴增質(zhì)粒DNA。定點誘變PCR擴增得到的質(zhì)粒DNA被轉(zhuǎn)化入五.c^XL-lblue，然后經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞在LB上進行繁殖，用100嗎/ml的氨芐青霉素，進行質(zhì)粒DNA的選擇和突變DNA的擴增。質(zhì)粒被分離和測序，以確認(rèn)其包含期望的突變。編碼突變變異體的突變質(zhì)粒DNA在Eco/沖被過量表達(dá)，以檢査誘變對7:w^e/木聚糖酶Y5突變體酶性質(zhì)的影響。實施例3五."http://'菌株中修飾^1^//基因產(chǎn)物的產(chǎn)生以及木聚糖酶活性的測試對于木聚糖酶II的突變變異體過量表達(dá)的Eco/f菌株，在補充了1%樺木木聚糖(Sigma,Steinheim,Germany)以及考馬斯亮蘭(RhemazolBrilliantBlue)的平板中被培養(yǎng)?？捡R斯亮蘭加上木聚糖可以用來檢測木聚糖酶的活性，由于細(xì)菌菌落周圍藍(lán)色的消失顯示木聚糖酶的活性，因此通過特征環(huán)的形成可以很容易地顯示木聚糖酶的活性(Biely等，1985)。突變的木聚糖酶基因(參見上面的實施例2)，于+37'C，在搖瓶中，在LB培養(yǎng)基中，在￡.co/f中被表達(dá)。對表達(dá)酶突變體的細(xì)胞培養(yǎng)物進行離心，細(xì)胞沉淀從包含酶的上清液中分離出來，該酶是從細(xì)胞中分泌到培養(yǎng)基中的。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的方法，對木聚糖酶的酶活性進行檢測。包含分泌的木聚糖酶突變體的生長培養(yǎng)基被置于1%的樺木木聚糖(Sigma)中，在5(TC下，在50mM檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(ph5.0-t)以及50mMpH7-9的Tris-HCl中，溫育10分鐘(Bailey等，1992)。如果需要的話，用高溫滅活生長培養(yǎng)基稀釋樣品。突變變異體的酶促活性與野生型和Y5突變酶，在不同的條件下對照檢測(參見Bailey等，1992)。實施例4測定木聚糖酶II突變體的溫度依賴穩(wěn)定性和pH依賴活性作為溫度函數(shù)的活性突變變異體的木聚糖酶活性在不同的溫度和選定的pH之下被測定(參見此處的圖)。突變體用1%的樺木木聚糖(Sigma)，在50mM檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(ph4.5-7)或者50mMpH7-9的Tris-HC沖溫育10分鐘。對釋放的還原性糖的相對量，用實施例3中描述的DNS方法進行檢測。殘留活性突變變異體在無底物的條件下，在不同溫度下溫育10分鐘。滅活以后，樣品在冰中冷卻，用實施例3中描述的DNS方法檢測殘留活性。pH依賴活性pH依賴的木聚糖酶活性是通過檢測pH變化范圍為XX-YY下的酶活性來確定，該酶在選定溫度(參見圖)下，P/。樺木木聚糖中，在50mM檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(ph4.5-7)以及50mMpH為7，5-9的Tris-HCl中，溫育lO分鐘。這依照實施例3中描述的DNS檢測。實施例5制備和測試改進性質(zhì)的突變木聚糖酶突變木聚糖酶被制備成，在分子不同區(qū)域上具有一個或多個取代。該取代或者為與其它獨立點突變相聯(lián)系的獨立點突變，或者它們被制備成，對普遍存在于家族11和12酶的結(jié)構(gòu)要素起作用。如實施例所述對酶進行檢測。"結(jié)構(gòu)，，取代("structural"substitution)的例子在此被公開并在實施例中顯示。二硫橋可以放置于2位和28位(T2C,T28C)之間。圖4顯示了在取代野生型的殘基以得到更嗜熱的突變體的過程中N-末端區(qū)域的重要性。相似地，去除T.seeseiEGlII中原有的二硫橋(Cel12A編號，C4和C32殘基)對酶的穩(wěn)定性造成了巨大的影響，如提供的圖中以及此處的表中所顯示(特別參見表A)。被稱為(3鏈B6b(如在Gruber等)的家族ll和12所普遍擁有的p折疊區(qū)域，顯示出對穩(wěn)定性很重要，特別是在堿性條件下。這個影響可以在取代中(與Y5變異體比較)看到，如對P12，pH9與pH5比較，穩(wěn)定性改善，如圖中顯示(參見，例如，圖9，圖10，圖ll)。可以通過影響相同P鏈的不同突變集合(盡管處于相同區(qū)域)，清楚地證明該區(qū)域的重要性。當(dāng)93位、97位和144位被取代(F93W,N97RH144K,圖中的尸9)時，可以在圖9中看到，對酶穩(wěn)定性的影響與取代92位和144位(N92C,H144C二圖中P72)時相似。下面可以看到在22位和180位獨立取代的改進性質(zhì)的例子。包含H22K和F180Q取代(圖14中的P20)的變異體在pH7.8下，比Y5顯示出了增強的熱穩(wěn)定性。C-末端區(qū)域同樣對穩(wěn)定性很重要。在取代S65C、S186C(圖中的J21)，酶在pH8下對于溫度顯示了改進的活性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會很容易地意識到，本發(fā)明可以被很好地改動，以實施對象，獲得提及的結(jié)果和好處，以及其中所固有的結(jié)果和好處。在此所描述的分子復(fù)合物、方法、過程、處理、分子、特定化合物目前都是優(yōu)選實施方式的代表，都是示例性的，并且并不意欲對本發(fā)明的范圍進行限制。對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，顯而易見，可以對此處公開的發(fā)明進行各種替代和修飾而不背離本發(fā)明的范圍和精神。本說明書中提及的所有專利和出版物都表示本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的水平。在此引入所有專利和出版物作為參考，其引用程度如同每個出版物個體都特別地和單獨地被引用來作為參考。在此說明性地適當(dāng)描述的本發(fā)明，在缺少此處沒有特別公開的一個或多個任何成份、一個或多個限制條件的情況下，也可以被實施。所使用的術(shù)語和表達(dá)方式是作為描述的術(shù)語，而并不是作為限制的術(shù)語，并且并不意圖使用這些術(shù)語和表達(dá)來排除所示和所述特性的任何等價特性或其部分，但應(yīng)該認(rèn)識到，在本發(fā)明要求保護的范圍內(nèi)，多種修飾都是可行的。因此，應(yīng)該理解，盡管本發(fā)明通過優(yōu)選實施方案和優(yōu)化的特性被具體地公開，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對此處所公開的概念進行修飾和改變，并且這些修飾和改變被認(rèn)為落入所附權(quán)項要求所定義的本發(fā)明的范圍內(nèi)。在此寬泛地和一般性地描述了本發(fā)明。每個落入總的公開內(nèi)容之內(nèi)的較窄范圍的種類和從屬種類集合也形成本發(fā)明的部分。這包括用附帶條款和負(fù)向限制對本發(fā)明的總體描述，這些附帶條款和負(fù)向限制從類別中去除任何從屬的內(nèi)容，無論去除的材料是否在此處被特別地陳述。權(quán)利要求1.核酸，其編碼修飾的木聚糖酶，所述木聚糖酶包含具有如SEQIDNO1所示的氨基酸序列的多肽，其中所述序列在選自下面的位置上具有至少一個取代的氨基酸殘基2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。2.如權(quán)利要求l所述的核酸，其中所述取代選自2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180，186和+191。3.如權(quán)利要求2所述的核酸，其中所述木聚糖酶具有至少一個取代，取代選自H22K，S65C，N92C，F(xiàn)93W，N97R，V108H，H144C，H144K，F(xiàn)180Q和S186C。4.如權(quán)利要求3所述的核酸，變F93W，N97R和H144K。5.如權(quán)利要求3所述的核酸，變H144C和N92K。6.如權(quán)利要求3所述的核酸，變F180Q，H144C和N92C。7.如權(quán)利要求3所述的核酸，變H22K和F180Q。8.如權(quán)利要求3所述的核酸，變V108H。9.如權(quán)利要求3所述的核酸，變S65C和S186C。10.如權(quán)利要求3所述的核酸，其中所述木聚糖酶具有下面的突其中所述木聚糖酶具有下面的突其中所述木聚糖酶具有下面的突其中所述木聚糖酶具有下面的突其中所述木聚糖酶具有下面的突其中所述木聚糖酶具有下面的突其中所述木聚糖酶具有下面的突變H22K，F(xiàn)180Q，H144C和N92C。11.修飾的木聚糖酶，其包含具有如SEQIDNO:l所示的氨基酸序列的多肽，其中所述序列在選自下面的位置上具有至少一個取代的氨基酸殘基2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，亂110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。12.如權(quán)利要求il所述的木聚糖酶，其中所述取代選自2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180，186和+191。13.如權(quán)利要求12所述的木聚糖酶，其中有至少l木聚糖酶具V108H一個取代，取代選自H22K，S65C，N92C，F(xiàn)93W，N97R，，H144C，H144K，F(xiàn)180Q和S186C。14.如權(quán)利要求13所述的木聚糖酶，其中所述木聚糖酶具有下面的突變F93W，N97R和H144K。15.如權(quán)利要求13所述的木聚糖酶，其中所述木聚糖酶具有下面的突變H144C和N92K。16.如權(quán)利要求13所述的木聚糖酶，其中所述木聚糖酶具有下面的突變F180Q，H144C和N92C。17.如權(quán)利要求13的突變H22K和F180Q。:聚糖酶，其中所述木聚糖酶具有下面18.如權(quán)利要求13所述的木聚糖酶，其中所述木聚糖酶具有下面的突變V108H。19.如權(quán)利要求13所述的木聚糖酶，其中所述木聚糖酶具有下面的突變S65C和S186C。20.如權(quán)利要求13所述的木聚糖酶，其中所述木聚糖酶具有下面的突變H22K，F(xiàn)180Q，H144C和N92C。21.修飾酶，所述修飾酶包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:l所示的序列同源，所述氨基酸序列在與選自下面的位置等價的位置上具有至少一個取代的氨基酸殘基2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190禾口+191。22.如權(quán)利要求21所述的酶，其中與SEQIDNO:l中所示的序列的同源性為至少20%。23.如權(quán)利要求22所述的酶，其中所述氨基酸序列在與選自下面的位置等價的位置上具有至少一個取代的氨基酸殘基2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180，186和+191。24.部族C的糖基水解酶，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:l中所示的序列同源，所述氨基酸序列在與選自下面位置等價的位置上具有至少一個取代的氨基酸殘基2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。25.如權(quán)利要求24所述的糖基水解酶，其與SEQIDNO:l中所示的序列的同源性為至少20%。.26.如權(quán)利要求25所述的糖基水解酶，其中所述氨基酸序列在與選自下面的位置等價的位置上具有至少一個取代氨基酸殘基2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180，186禾口+191。27.修飾的家族ll木聚糖酶，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:l中所示的序列同源，所述氨基酸序列在與選自下面的位置等價的位置上具有至少一個取代氨基酸殘基2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147，(149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。28.如權(quán)利要求27所述的木聚糖酶，其與SEQIDNO:l所示的序列的同源性為至少20%。29.如權(quán)利要求28所述的木聚糖酶，其中所述氨基酸序列在與選自下面的位置等價的位置上具有至少一個取代的氨基酸殘基2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180，186禾口+191。30.家族12纖維素酶，其包含氨基酸序列，其中所述氨基酸序列與SEQIDNO:l中所示的序列同源，所述氨基酸序列在與選自下面的位置等價的位置上具有至少一個取代氨基酸殘基2，5，7，10，11，16，19，22，26，28，29，30，34，36，38，57，58，61，63，65，67，92，93，97，105，108，110，111，113，132，143，144，147,149，151，153，157，160，162，165，169，180，184，186，188，190和+191。31.如權(quán)利要求30所述的纖維素，其與SEQIDNO:1中提出的序列的同源性為至少20%。32.如權(quán)利要求31所述的纖維素，其中所述氨基酸序列在與選自下面的位置等價的位置上具有至少一個取代的氨基酸殘基2，22，28，58，65，92，93，97，105，108，144，162，180，186和+191。全文摘要本發(fā)明涉及經(jīng)過修飾的木聚糖酶，其在苛刻的工業(yè)環(huán)境下，諸如增加的pH值和/或溫度下，具有增加的穩(wěn)定性。文檔編號C12N9/42GK101415823SQ200480026503公開日2009年4月22日申請日期2004年9月10日優(yōu)先權(quán)日2003年9月15日發(fā)明者F·費內(nèi)爾,K·A·克拉克森申請人:金克克國際有限公司