專利名稱：共有/祖先免疫原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及免疫原，特別是涉及用于誘導(dǎo)可中和多種多樣HIV原代分離物的抗體的免疫原和/或涉及誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的免疫原。本發(fā)明還涉及使用所述免疫原來誘導(dǎo)抗HIV(人類免疫缺陷病毒)抗體的方法和/或誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼所述免疫原的核酸序列。
背景技術(shù)：
HIV-1的高度遺傳變異性已經(jīng)成為AIDS疫苗開發(fā)的主要障礙。HIV-1的M、N和O組中的遺傳差異很大，在gag和env基因中遺傳差異分別為30％～50％(Gurtler等，J.Virol.681581-1585(1994)，VandenHaesevelde等，J.Virol.681586-1596(1994)，Simon等，Nat.Med.41032-1037(1998)，Kuiken等，Human retroviruses and AIDS 2000acompilation and analysis of nucleic acid and amino acidsequences(Theoretical Biology and Biophysics Group，Los Alamos NationalLaboratory，Los Alamos，新墨西哥))。M組中的病毒進(jìn)一步被分為9個遺傳上獨特的亞型(A-D、F-H、J和K)(Kuiken等，Human retroviruses andAIDS 2000a compilation and analysis of nucleic acid and amino acidsequences(Theoretical Biology and Biophysics Group，Los Alamos NationalLaboratory，Los Alamos，新墨西哥；Robertson等，Science 28855-56(2000)，Robertson等，Human retroviruses and AIDS 1999a compilation andanalysis of nucleic acid and amino acid sequences，Kuiken等編輯(Theoretical Biology and Biophysics Group，Los Alamos NationalLaboratory，Los Alamos，新墨西哥)，第492-505頁(2000))。由于在HIV-1亞型中env基因的遺傳變異高達(dá)30％，因此已經(jīng)難以始終如一地引發(fā)抗所有的HIV-1亞型的交叉亞型T和B細(xì)胞免疫應(yīng)答。HIV-1還經(jīng)常在不同的亞型中進(jìn)行重組以產(chǎn)生流行重組體形式(circulating recombinantform，CRFs)(Robertson等，Science 28855-56(2000)，Robertson等，Humanretroviruses and AIDS 1999a compilation and analysis of nucleic acid andamino acid sequences，Kuiken等編輯(Theoretical Biology and BiophysicsGroup，Los Alamos National Laboratory，Los Alamos，新墨西哥)，第492-505頁(2000)；Carr等，Human retroviruses and AIDS 1998acompilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences，Korber等編輯(Theoretical Biology and Biophysics Group，Los Alamos NationalLaboratory，Los Alamos，新墨西哥)，第III-10～I(xiàn)II-19頁(1998))。在多亞型是常見的地理區(qū)域中，超過20％的HIV-1分離物是重組體(Robertson等，Nature 374124-126(1995)；Cornelissen等，J.virol.708209-8212(1996)；Dowling等，AIDS 161809-1820(2002))，并且重組病毒的高流行率進(jìn)一步使實驗性HIV-1免疫原的設(shè)計復(fù)雜化。
為了克服AIDS疫苗開發(fā)中的這些挑戰(zhàn)，三個計算機(jī)模型(共有型、祖先型和樹的中心型)已經(jīng)用來產(chǎn)生中心化的HIV-1基因(Gaschen等，Science 2962354-2360(2002)；Gao等，Science 2991517-1518(2003)；Nickle等，Science 2991515-1517(2003)；Novitsky等，J.Virol.765435-5451(2002)；Ellenberger等，Virology 302155-163(2002)；Korber等，Science 2881789-1796(2000))。HIV的生物學(xué)引起星狀的種系的產(chǎn)生，并且其結(jié)果是，這三種類型序列相互之間的差異為2％～5％(Gao等，Science 2991517-1518(2003))。3個中心化的基因的策略的任何一個都會減小免疫原和野毒株之間的蛋白距離。通過根據(jù)比對中各位點中最共同的氨基酸來產(chǎn)生人工序列，共有序列使疫苗株與同時期的流行病毒之間的序列差異程度最小化(Gaschen等，Science 2962354-2360(2002))。祖先序列與共有序列類似，但是是使用最大可能性種系發(fā)生分析法來產(chǎn)生的(Gaschen等，Science 2962354-2360(2002)，Nickle等，Science 2991515-1517(2003))。為此，該方法重新形成經(jīng)分析的目前野生型序列的假設(shè)性祖先基因(圖26)。Nickle等提出了產(chǎn)生中心化的HIV-1序列的另外的方法，即樹的中心法(COT)，該方法與祖先序列類似，但是較少受到無關(guān)項的影響(Science 2991515-1517(2003))。
本發(fā)明至少部分地來自于經(jīng)設(shè)計用以確定中心化的免疫原是否能在動物中誘導(dǎo)T和B細(xì)胞免疫應(yīng)答的研究的結(jié)果。這些研究牽涉人工的M組共有env基因(CON6)的產(chǎn)生和DNA質(zhì)粒和重組痘苗病毒的構(gòu)建以表達(dá)可溶性gp120和gp140CF蛋白形式的CON6包膜。結(jié)果證明，CON6Env蛋白具有生物學(xué)功能，具有野生型HIV-1的線性的、構(gòu)象的和聚糖依賴性的表位，而且誘導(dǎo)可識別HIV亞型B和C的T細(xì)胞表位的產(chǎn)生細(xì)胞因子的T細(xì)胞。重要的是，CON6gp120和gp140CF蛋白誘導(dǎo)可中和亞型B和C HIV-1原代分離物的亞類的抗體。
中心化的HIV-1基因手段的研究的迭代性質(zhì)是因為HIV-1序列的快速擴(kuò)張進(jìn)化以及每年HIV序列數(shù)據(jù)庫(即，Los Alamos National Database)所收集的序列不斷地被新的序列所更新的事實。CON6gp120包膜基因來自于1999年的Los Alamos National Database序列，而Con-S來自于2000年的Los Alamos National Database序列。此外，CON6具有中國亞型C V1、V2、V4和V5Env序列，而Con-S具有所有的M組共有Env恒定區(qū)和可變區(qū)，其已經(jīng)被縮短到最小長度的可變環(huán)。由于有相應(yīng)的一系列野生型HIV-1Env基因用于比較，一系列的2003年M組和亞型共有序列的密碼子優(yōu)化基因已被設(shè)計用于誘導(dǎo)對HIV-1原代分離物具有廣泛反應(yīng)性的T和B細(xì)胞應(yīng)答。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)可中和多種多樣的HIV原代分離物的抗體的免疫原和/或涉及誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的免疫原，并且涉及編碼所述免疫原的核酸序列。本發(fā)明還涉及使用所述免疫原來誘導(dǎo)抗HIV抗體的方法和/或涉及誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法。
根據(jù)以下描述，會清楚地了解本發(fā)明的目的和優(yōu)點。


圖1A～1DM組共有env基因(CON6)的產(chǎn)生和表達(dá)。顯示了CON6gp160的完整氨基酸序列。(圖1A)來自野生型CRF08_BC(98CN006)env基因的5個區(qū)域由帶下劃線的字母表示?？勺儏^(qū)由序列上面的中括號指示。潛在的N樣糖基化位點以黑體字突出顯示。(圖1B)CON6gp120和gp140CF的構(gòu)建體。通過分別于gp120切割位點之后或在跨膜結(jié)構(gòu)域之前引入終止密碼子而對CON6gp120和gp140CF質(zhì)粒進(jìn)行遺傳改造。在gp140CF蛋白中刪除了gp120/gp41切割位點和gp41的融合結(jié)構(gòu)域。(圖1C)CON6gp120和gp140CF的表達(dá)。采用雪花蓮(galanthus Nivalis)瓊脂糖凝集素柱從rVV感染的293T細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清液純化出CON6gp120和gp140CF。在10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上對gp120和gp140CF進(jìn)行分離，并用考馬斯蘭染色。(圖1D)基于用于高度表達(dá)人類基因的密碼子選擇進(jìn)行優(yōu)化的CON6env基因。
圖2A～2ECON6gp120gp140CF與可溶性CD4(sCD4)和抗Env單克隆抗體的結(jié)合。(圖2A-2B)所指示的單克隆抗體和sCD4各自被共價固定到CM5傳感器芯片(BIAcore)，注射CON6gp120(圖2A)或gp140CF(圖2B)(分別為100μg/ml和300μg/ml)遍及各個表面。gp120和gp140CF蛋白均與所檢測的除了17b單克隆抗體之外的抗gp120單克隆抗體反應(yīng)，17b單克隆抗體與CON6gp120和gp140CF所顯示出的結(jié)合微不足道。為了測定對17b單克隆抗體與CON6gp120和gp140CF的結(jié)合的誘導(dǎo)，在用sCD4或單克隆抗體A32或T8固定的單個流動細(xì)胞上捕獲(400-580RU)CON6gp120(圖2C)或gp140CF(圖2D)蛋白。在固定各表面后，注射單克隆抗體17b并使其流過經(jīng)固定的各流動細(xì)胞。曲線的重疊表示，單克隆抗體17b與CON6Env蛋白在sCD4和單克隆抗體A32的表面上的結(jié)合都有明顯的增強(qiáng)，但在T8表面上的結(jié)合沒有顯著增強(qiáng)(圖2C-2D)。為了測定ELISA中CON6gp120和gp140CF與人類單克隆抗體的結(jié)合，測定CON6gp120和gp140CF上的20μg/ml的單克隆抗體447、F39F、A32、IgG1b12和2F5的原液的滴度(圖2E)。單克隆抗體447(V3)、F39F(V3)、A32(gp120)、IgG1b12(CD4結(jié)合位點)各自均很好地與CON6gp120和140板孔結(jié)合，而2F5(抗gp41ELDKWAS)只與gp140CF結(jié)合。單克隆抗體447和F39F在gp120上的結(jié)合的終點滴度的濃度分別小于0.003μg/ml和0.006μg/ml；單克隆抗體A32的終點滴度的濃度為小于0.125μg/ml；IgG1b12的終點滴度的濃度為小于0.002μg/ml；2F5的終點滴度的濃度為小于0.016μg/ml。
圖3A和3BCON6包膜的感染性和共受體使用。(圖3A)用HIV-1/SG3Δenv骨架將CON6和env對照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到人類293T細(xì)胞中以產(chǎn)生Env-假病毒體。用等量的各假病毒體(5ng p24)來感染JC53-BL細(xì)胞。在對用于β-gal表達(dá)的受感染細(xì)胞進(jìn)行染色后，通過對每微克p24假病毒體的藍(lán)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計數(shù)(感染單位，IU)來測定感染性(IU/μgp24)。(圖3B)在JC53BL細(xì)胞上對CON6 env基因的共受體使用進(jìn)行測定，所述JC53BL細(xì)胞由AMD3100和/或TAK-799處理1小時(37℃)，然后以等量的各Env-假病毒體的p24(5ng)進(jìn)行感染。將對照組的感染性(沒有阻斷劑)設(shè)定為100％。阻斷效率以來自阻斷實驗的IU相對于來自沒有阻斷劑的對照培養(yǎng)物的IU的百分比表示。所顯示的數(shù)據(jù)為平均值±SD(標(biāo)準(zhǔn)差)。
圖4多亞型Env蛋白對多亞型抗血清的Western印跡分析。在10％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離等量的Env蛋白(100ng)。電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到Hybond ECL硝化纖維素膜上并與來自HIV-1感染患者(1∶1,000)或與用CON6 gp120 DNA進(jìn)行初次免疫、用rVV(1∶1,000)進(jìn)行加強(qiáng)免疫的豚鼠的血清進(jìn)行反應(yīng)。用熒光標(biāo)記的二抗檢測已結(jié)合蛋白的抗體，并在紅外線的成像儀Odyssey(Li-Cor，Lincoln，NE)上掃描和記錄圖像。在Env蛋白和血清ID之后用單字母表示亞型。對于各亞型測試4至6個血清，在來自相同亞型的所有血清中反應(yīng)模式是相似的。顯示了各亞型血清的一個代表性結(jié)果。
圖5CON6Env免疫原在小鼠中誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫應(yīng)答。從單個經(jīng)免疫的小鼠中分離脾細(xì)胞(5只小鼠/組)。用CON6(黑色柱)、亞型B(陰影柱)、亞型C(白色柱)和培養(yǎng)基(沒有肽；灰色柱)的重疊Env肽庫對脾細(xì)胞進(jìn)行體外刺激之后，通過ELISPOT(酶聯(lián)免疫斑點)測定法對INF-γ產(chǎn)生細(xì)胞進(jìn)行測定。將采用CON6gp120或gp140CF誘導(dǎo)的T細(xì)胞的IFN-γ應(yīng)答與采用亞型特異性Env免疫原(JRFL和96ZM651)誘導(dǎo)的T細(xì)胞的IFN-γ應(yīng)答進(jìn)行比較。將各包膜肽庫的總應(yīng)答表示為每100萬個脾細(xì)胞的SFC數(shù)。各柱的值表示為IFN-γ的SFC的平均值±SEM(平均標(biāo)準(zhǔn)誤)(n＝5只小鼠/組)。
圖6A～6E用密碼子選擇進(jìn)行優(yōu)化的亞型C的祖先包膜基因和共有包膜基因(分別在圖6A和6B中)。將祖先和共有氨基酸序列(分別在圖6C和6D中)轉(zhuǎn)錄以反映高度表達(dá)人類基因的密碼子選擇。將重疊20bp的配對寡核苷酸(80個核苷酸(mer))設(shè)計成含有包括限制酶EcoRI、BbsI、BamHI和BsmBI的酶切位點的5′不變序列。BbsI和BsmBI是從它們的識別序列的外面進(jìn)行酶切的II型限制酶。采用PCR和與18bp不變序列互補(bǔ)的引物單獨地對配對寡聚體以分步方式進(jìn)行連接，獲得140bp的PCR產(chǎn)物。將這些產(chǎn)物亞克隆到pGEM-T中并測序，以確定不存在由疏忽所致(inadvertant)的突變/缺失。對4個包含適當(dāng)?shù)牟迦肫蔚膯蝹€pGEM-T亞克隆進(jìn)行消化，并一起連接到pcDNA 3.1中。各組片段中的多片段連接以分步方式從基因的5′到3′端重復(fù)進(jìn)行，直到將整個基因重新構(gòu)建在pcDNA 3.1中(見圖6E中的示意圖)。
圖7JC53-BL細(xì)胞是表達(dá)高水平的CD4和HIV-1共受體CCR5和CXCR4的海拉細(xì)胞的衍生細(xì)胞。它們還包含各表達(dá)自HIV-1LTR的熒光素酶和β-半乳糖苷酶的報道盒子。報道基因的表達(dá)依賴于HIV-1Tat的產(chǎn)生。簡而言之，將細(xì)胞接種到24孔或96孔平板上，在37℃培養(yǎng)24小時，并以DEAE-葡聚糖在37℃處理30分鐘。將病毒在1％的DMEM中連續(xù)稀釋，加到培養(yǎng)在DEAE-葡聚糖中的細(xì)胞中，并在37℃孵育3小時，然后，向各孔中加入另外的細(xì)胞培養(yǎng)基。在37℃進(jìn)行最后孵育48小時之后，將細(xì)胞固定，用X-gal染色使呈現(xiàn)為藍(lán)斑的β-半乳糖苷酶可視化，或凍融3次以測定熒光素酶活性。
圖8亞型C祖先和共有env基因的序列比對。亞型C祖先(底部畫線)和共有(頂部畫線)env序列的比對表現(xiàn)出95.5％序列同源性；顯示出氨基酸序列的差異。一個顯著不同是在C祖先env基因中的V1環(huán)基部增加有糖基化位點?！?”號表示所指位點處氨基酸的組內(nèi)差異；短線表示該組氨基酸的變化。潛在的N-糖基化位點標(biāo)成藍(lán)色。還顯示了gp140基因的截斷位置。
圖9亞型C祖先和共有包膜在293T細(xì)胞中的表達(dá)。將包含密碼子優(yōu)化的gp160、gp140或gp120亞型C祖先和共有基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，通過對細(xì)胞裂解物進(jìn)行Western印跡分析檢測蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后48小時，收集細(xì)胞裂解物，通過BCA蛋白測定法測定總蛋白含量，將總蛋白以2μg/泳道上樣到4％～20％的SDS-PAGE凝膠上。將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上并用來自亞型C感染患者的HIV-1血漿進(jìn)行檢測。
圖10A和10B圖10A，env缺陷性HIV-1與密碼子優(yōu)化的亞型C祖先和共有g(shù)p160和gp140的反式互補(bǔ)。將包含密碼子優(yōu)化的亞型C祖先和共有g(shù)p160和gp140基因的質(zhì)粒與HIV-1/SG3Δenv原病毒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染后48小時，收獲含有假型病毒的細(xì)胞上清液，通過離心使其澄清，用0.2μM過濾器過濾，通過20％蔗糖墊層進(jìn)行沉淀。采用Coulter HIV-1p24抗原測定法對各病毒沉淀中的p24進(jìn)行定量測定；在4％～20％的SDS-PAGE凝膠上，對于含有密碼子優(yōu)化的包膜的粒子，每個泳道上樣25ng的p24。對于由rev-依賴性的野生型亞型C 96ZAM651env基因產(chǎn)生的粒子，每個泳道上樣250ng的p24。為了確保通過Western印跡使rev-依賴性的包膜可視化，使每個泳道的p24上樣量不同是必要的。將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并用來自HIV-1亞型B和亞型C感染個體的合并血漿進(jìn)行檢測。圖10B，包含亞型C祖先和共有包膜糖蛋白的病毒粒子的感染性。使用JC53-BL測定法測定包含祖先或共有g(shù)p160或gp140包膜的假型病毒的感染性。采用Coulter p24抗原測定法對蔗糖墊層純化的病毒粒子進(jìn)行測定，并將5倍系列稀釋的各沉淀與DEAE-葡聚糖處理的JC53-BL細(xì)胞孵育。48小時的孵育期后，將細(xì)胞固定并染色，以使表達(dá)β-半乳糖苷酶的細(xì)胞可視化。感染性表示為感染單位/ng的p24，從而對加入的假病毒體的濃度差異進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖11亞型C祖先和共有包膜的共受體使用。在AMD3100(CXCR4的特異性抑制劑)、TAK779(CCR5的特異性抑制劑)或AMD3000+TAK779存在時，將包含祖先或共有包膜的假型粒子與DEAE-葡聚糖處理的JC53-BL細(xì)胞孵育，以測定共受體使用。其中包含NL4.3(已知利用CXCR4的分離物)和YU-2(已知使用CCR5的分離物)作為對照。
圖12A～12C亞型C祖先和共有包膜糖蛋白的中和敏感性。將包含祖先、共有或96ZAM651gp160包膜(1,500個感染單位)的等量假病毒體與來自HIV-1亞型C感染患者的一組血漿樣本進(jìn)行預(yù)孵育，然后加到96孔板中的JC53-BL細(xì)胞單層上。培養(yǎng)平板兩天，并檢測熒光素酶活性作為病毒感染性的指標(biāo)。病毒感染性的計算如下用在抗體的各個濃度下產(chǎn)生的熒光素酶單位(LU)除以由對照感染產(chǎn)生的LU。然后對各病毒計算平均50％抑制濃度(IC50)和在各抗體稀釋度時的真實中和％。所有熒光素酶實驗的結(jié)果通過平行感染中的藍(lán)斑的直接計數(shù)進(jìn)行確認(rèn)。
圖13A-13F轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中后共有亞型C Gag(圖13A)和Nef(圖13B)的蛋白表達(dá)。共有亞型C Gag和Nef的氨基酸序列分別表示在圖13C和13D中，而編碼序列分別表示在圖13E和13F中。
圖14A～14C圖14A和14B分別顯示Con-S Env氨基酸序列和編碼序列。圖14C顯示使用體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)的M組共有Con-S Env蛋白的表達(dá)。
圖15A和15BCon-S env基因在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)。(圖15A細(xì)胞裂解物；圖15B上清液)。
圖16A和16BCON6和Con-S env基因的感染性(圖16A)和共受體使用(圖16B)。
圖17A～17C在CON6和Con-S Env-假病毒體中的Env蛋白的整合。(圖17A裂解物；圖17B上清液；圖17C沉淀)。
圖18A～18D圖18A和18B分別顯示亞型A共有Env氨基酸序列和編碼所述氨基酸序列的核酸序列。圖18C和18D分別顯示A.con env基因在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)(圖18C細(xì)胞裂解物；圖18D上清液)。
圖19A～19HM.con.gag(圖19A)、M.con.pol(圖19B)、M.con.nef(圖19C)和C.con.pol(圖19D)核酸序列及其所編碼的相應(yīng)的氨基酸序列(分別在圖19E～19H中)。
圖20A～20D亞型B共有g(shù)ag(圖20A)和env(圖20B)基因。相應(yīng)的氨基酸序列顯示在圖20C和20D中。
圖21將亞型B共有env和gag基因在293T細(xì)胞中的表達(dá)。將包含密碼子優(yōu)化的亞型B共有g(shù)p160、gp140和gag基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，并通過對細(xì)胞裂解物進(jìn)行Western印跡分析來檢測蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染后48小時，收集細(xì)胞裂解物，通過BCA蛋白測定法測定總蛋白含量，并將總蛋白以2μg/泳道上樣到4％～20％的SDS-PAGE凝膠上。將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，并用來自HIV-1亞型B感染個體的血清進(jìn)行檢測。
圖22亞型B共有包膜的共受體使用。在AMD3100(CXCR4的特異性抑制劑)、TAK779(CCR5的特異性抑制劑)和AMD3000+TAK779存在時，將包含亞型B共有g(shù)p160Env的假型粒子與用DEAE-葡聚糖處理的JC53-BL細(xì)胞孵育，以測定共受體使用。其中包括NL4.3(已知利用CXCR4的分離物)和YU-2(已知使用CCR5的分離物)作為對照。
圖23A和23Benv缺陷性HIV-1與密碼子優(yōu)化的亞型B共有g(shù)p160和gp140基因的反式互補(bǔ)。將包含密碼子優(yōu)化的亞型B共有g(shù)p160或gp140基因的質(zhì)粒與HIV-1/SG3Δenv原病毒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染后48小時，收獲含有假型病毒的上清液，采用臺式離心機(jī)使其澄清，用0.2μM過濾器過濾，通過20％蔗糖墊層進(jìn)行沉淀。采用Coulter HIV-1p24抗原測定法對各病毒沉淀中的p24進(jìn)行定量測定；在4％～20％的SDS-PAGE凝膠上，每個泳道上樣25ng的p24。將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并用來自HIV-1亞型B感染患者血清的抗HIV-1抗體進(jìn)行檢測。其中包括與rev-依賴性的NL4.3env的反式互補(bǔ)作為對照。圖23B，包含亞型B共有包膜的病毒粒子的感染性。使用JC53-BL測定法測定包含共有B gp160或gp140的假型病毒的感染性。采用Coulter p24抗原測定法對蔗糖墊層純化的病毒粒子進(jìn)行測定，并將5倍系列稀釋的各沉淀與DEAE-葡聚糖處理的JC53-BL細(xì)胞孵育。48小時的孵育期后，將細(xì)胞固定并染色，以使表達(dá)β-半乳糖苷酶的細(xì)胞可視化。感染性表示為感染單位/ng的p24。
圖24A～24D包含亞型B共有g(shù)p160包膜的病毒體的中和敏感性。將包含亞型B共有或NL4.3Env(gp160)(1,500個感染單位)的等量假病毒體與3種不同的單克隆中和抗體和來自HIV-1亞型B感染個體的一組血漿樣本進(jìn)行預(yù)孵育，然后加到96孔板中的JC53-BL細(xì)胞單層上。培養(yǎng)平板兩天，并檢測熒光素酶活性作為病毒感染性的指標(biāo)。病毒感染性的計算如下用在抗體的各個濃度下產(chǎn)生的熒光素酶單位(LU)除以由對照感染產(chǎn)生的LU。然后對各病毒計算平均50％抑制濃度(IC50)和在各抗體稀釋度時的真實中和％。所有熒光素酶實驗的結(jié)果通過平行感染中的藍(lán)斑的直接計數(shù)進(jìn)行確認(rèn)。圖24A，包含亞型B共有Env(gp160)的假病毒體的中和。圖24B，包含NL4.3Env(gp160)的假病毒體的中和。圖24C，包含亞型B共有Env(gp160)的假病毒體的中和。圖24D，包含NL4.3Env(gp160)的假病毒體的中和。
圖25A和25B圖25A，蔗糖梯度組分的密度和p24分析。從20％～60％蔗糖梯度中收集0.5ml組分。組分1代表從梯度管的底部收集的最大密度組分。用折射計測量密度，并采用Coulter p24抗原測定法對各組分中的p24的量進(jìn)行測定。將組分6～9、10～15、16～21和22～25合并在一起并采用Western印跡進(jìn)行分析。正如所期望的，病毒體在1.16g/ml～1.18g/ml的密度沉淀。圖25B，通過亞型B共有g(shù)ag和env基因的共轉(zhuǎn)染進(jìn)行的VLP制備。用亞型B共有g(shù)ag和env基因共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后48小時，收集細(xì)胞上清液，通過20％蔗糖墊層使其澄清，并通過20％～60％蔗糖梯度進(jìn)行進(jìn)一步純化。將來自該梯度的選擇組分合并，加到20ml的PBS中，并在100,000×g離心過夜。將重懸浮的沉淀上樣到4％～20％SDS-PAGE凝膠，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并用來自HIV-1亞型B感染個體的血漿進(jìn)行檢測。
圖26A和26B圖26A2000Con-S 140CFI.ENV。圖26B密碼子優(yōu)化的2000年的Con-S 140CFI.Seq(序列)。
圖27單個C57BL/6小鼠T細(xì)胞對HIV-1包膜肽的應(yīng)答。在C57BL/C小鼠中的CON6 gp140CFI和Con-S gp140CFI的相對免疫原性。用HIV5305(亞型A)、2801(亞型B)、CON6或Con-S包膜基因采用DNA初次免疫、rVV加強(qiáng)免疫的方式免疫小鼠，每組5只小鼠。使用來自HIV-1UG37(A)、MN(B)、Ch19(C)、89.6(B)、SF162(B)的Env的重疊肽的混合物或沒有肽的陰性對照，在rVV加強(qiáng)免疫后10天對脾細(xì)胞中的IFN-γ斑點形成細(xì)胞進(jìn)行測定。
圖28A～28C圖28A，Con-B 2003Env.pep(841個氨基酸)。帶有下劃線的氨基酸序列是在140CF設(shè)計中被刪除的融合結(jié)構(gòu)域，而帶有下劃線的“W”是C末端的最后一個氨基酸，在140CF設(shè)計中“W”后的所有氨基酸都被刪除。圖28B，Con-B-140CF.pep(632個氨基酸)。黑字體的氨基酸表示被刪除的融合切割位點的接頭。圖28C，密碼子優(yōu)化的Con-B 140CF.Seq(1927個核苷酸)。
圖29A～29C圖29A，CON_OF_CON-2003(829個氨基酸)。帶有下劃線的氨基酸序列是在140CF設(shè)計中被刪除的融合結(jié)構(gòu)域，而帶有下劃線的“W”是C末端的最后一個氨基酸，在140CF設(shè)計中“W”后的所有氨基酸都被刪除。圖29B，ConS-2003-140CF.pep(620個氨基酸)。黑字體的氨基酸表示被刪除的融合切割位點的接頭。圖29C，密碼子優(yōu)化的ConS-2003 140CF.Seq(1891個核苷酸)。
圖30A～30C圖30A，CONSENSUS_A1-2003(845個氨基酸)。帶有下劃線的氨基酸序列是在140CF設(shè)計中被刪除的融合結(jié)構(gòu)域，而帶有下劃線的“W”是C末端的最后一個氨基酸，在140CF設(shè)計中“W”后的所有氨基酸都被刪除。圖30B，Con-A1-2003-140CF.pep(肽)(629個氨基酸)。黑字體的氨基酸表示被刪除的融合切割位點的接頭。圖30C，密碼子優(yōu)化的Con-A1-2003.Seq。
圖31A～31C圖31A，CONSENSUS_C-2003(835個氨基酸)。帶有下劃線的氨基酸序列是在140CF設(shè)計中被刪除的融合結(jié)構(gòu)域，而帶有下劃線的“W”是C末端的最后一個氨基酸，在140CF設(shè)計中“W”后的所有氨基酸都被刪除。圖31B，Con-C 2003 140CF.pep(619個氨基酸)。黑字體的氨基酸表示被刪除的融合切割位點的接頭。圖31C，密碼子優(yōu)化的Con-C-2003 140CF(1,888個核苷酸)。
圖32A～32C圖32A，CONSENSUS_G-2003(842個氨基酸)。帶有下劃線的氨基酸序列是在140CF設(shè)計中被刪除的融合結(jié)構(gòu)域，而帶有下劃線的“W”是C末端的最后一個氨基酸，在140CF設(shè)計中“W”后的所有氨基酸都被刪除。圖32B，Con-G-2003 140CF.pep(626個氨基酸)。黑字體的氨基酸表示被刪除的融合切割位點的接頭。圖32C，密碼子優(yōu)化的Con-G-2003.Seq。
圖33A～33C圖33A，CONSENSUS_01_AE-2003(854個氨基酸)。帶有下劃線的氨基酸序列是在140CF設(shè)計中被刪除的融合結(jié)構(gòu)域，而帶有下劃線的“W”是C末端的最后一個氨基酸，在140CF設(shè)計中“W”后的所有氨基酸都被刪除。圖33B，Con-AE01-2003 140CF.pep(638個氨基酸)。黑字體的氨基酸表示被刪除的融合切割位點的接頭。圖33C，密碼子優(yōu)化的Con-AE01-2003.Seq(1945個核苷酸)。
圖34A～34C圖34A，野生型亞型A Env.00KE_MSA4076-A(亞型A，891個氨基酸)。帶有下劃線的氨基酸序列是在140CF設(shè)計中被刪除的融合結(jié)構(gòu)域，而帶有下劃線的“W”是C末端的最后一個氨基酸，在140CF設(shè)計中“W”后的所有氨基酸都被刪除。圖34B，00KE_MSA4076-A140CF.pep(647個氨基酸)。黑字體的氨基酸表示被刪除的融合切割位點的接頭。圖34C，密碼子優(yōu)化的00KE_MSA4076-A 140CF.Seq(1972個核苷酸)。
圖35A～35C圖35A，野生型亞型B.QH0515.1g gp160(861個氨基酸)。帶有下劃線的氨基酸序列是在140CF設(shè)計中被刪除的融合結(jié)構(gòu)域，而帶有下劃線的“W”是C末端的最后一個氨基酸，在140CF設(shè)計中“W”后的所有氨基酸都被刪除。圖35B，QH0515.1g 140CF(651個氨基酸)。黑字體的氨基酸表示被刪除的融合切割位點的接頭。圖35C，密碼子優(yōu)化的QH0515.1g 140CF.Seq(1984個核苷酸)。
圖36A～36C圖36A，野生型亞型C.DU123.6gp160(854個氨基酸)。帶有下劃線的氨基酸序列是在140CF設(shè)計中被刪除的融合結(jié)構(gòu)域，而帶有下劃線的“W”是C末端的最后一個氨基酸，在140CF設(shè)計中“W”后的所有氨基酸都被刪除。圖36B，DU123.6140CF(638個氨基酸)。黑字體的氨基酸表示被刪除的融合切割位點的接頭。圖36C，密碼子優(yōu)化的DU123.6140CF.Seq(1945個核苷酸)。
圖37A～37C圖37A，野生型亞型CRF01_AE.97CNGX2F-AE(854個氨基酸)。帶有下劃線的氨基酸序列是在140CF設(shè)計中被刪除的融合結(jié)構(gòu)域，而帶有下劃線的“W”是C末端的最后一個氨基酸，在140CF設(shè)計中“W”后的所有氨基酸都被刪除。圖37B，97CNGX2F-AE 140CF.pep(629個氨基酸)。黑字體的氨基酸表示被刪除的融合切割位點的接頭。圖37C，密碼子優(yōu)化的97CNGX2F-AE 140CF.Seq(1921個核苷酸)。
圖38A～38C圖38A，野生型DRCBL-G(854個氨基酸)。帶有下劃線的氨基酸序列是在140CF設(shè)計中被刪除的融合結(jié)構(gòu)域，而帶有下劃線的“W”是C末端的最后一個氨基酸，在140CF設(shè)計中“W”后的所有氨基酸都被刪除。圖38B，DRCBL-G 140CF.pep(630個氨基酸)。黑字體的氨基酸表示被刪除的融合切割位點的接頭。圖38C，密碼子優(yōu)化的DRCBL-G 140CF.Seq(1921個核苷酸)。
圖39A和39B圖39A，2003 Con-S Env；圖39B，2003 Con-SEnv.seq.opt.(Seq.opt.＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖40A和40B圖40A，2003M組Anc Env；圖40B，2003M.組anc.Env.seq.opt.(Seq.opt.＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖41A和41B圖41A，2003 CON_A1_Env；圖41B，2003 CON_A1Env.seq.opt.(Seq.opt.＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖42A和42B圖42A，2003 A1.Anc Env；圖42B，2003 A1.anc Env.seq.opt.(Seq.opt.＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖43A和43B圖43A，2003 CON_A2Env；圖43B，2003 CON_A2Env.seq.opt.(Seq.opt.＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖44A和44B圖44A，2003 CON_B Env；圖44B，2003 CON_BEnv.seq.opt.(Seq.opt.＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖45A和45B圖45A，2003 B.anc Env；圖45B，2003 B.ancEnv.seq.opt.(Seq.opt.＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖46A和46B圖46A，2003 CON_C Env；圖46B，2003 CON_CEnv.seq.opt.(Seq.opt.＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖47A和47B圖47A，2003 C.anc Env；圖47B，2003 C.ancEnv.seq.opt.(Seq.opt.＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖48A和48B圖48A，2003 CON_D Env；圖48B，2003 CON_DEnv.seq.opt.(Seq.opt.＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖49A和49B圖49A，2003 CON_F1 Env；圖49B，2003 CON_F1Env.seq.opt.(Seq.opt.＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖50A和50B圖50A，2003CON_F2 Env；圖50B，2003 CON_F2Env.seq.opt.(Seq.opt.＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖51A和51B圖51A，2003 CON_G Env；圖51B，2003 CON_GEnv.seq.opt.(Seq.opt.＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖52A和52B圖52A，2003 CON_H Env；圖52B，2003 CON_HEnv.seq.opt.(Seq.opt.＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖53A和53B圖53A，2003 CON_01_AE Env；圖53B，2003CON_01_AE Env.seq.opt.(Seq.opt.＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖54A和54B圖54A，2003 CON_02_AG Env；圖54B，2003CON_02_AG Env.seq.opt.(Seq.opt.＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖55A和55B圖55A，2003 CON_03_AB Env；圖55B，2003CON_03_AB Env.seq.opt.(Seq.opt.＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖56A和56B圖56A，2003 CON_04_CPX Env；圖56B，2003CON_04_CPX Env.seq.opt.(Seq.opt.＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖57A和57B圖57A，2003 CON_06_CPX Env；圖57B，2003CON_06_CPX Env.seq.opt.(Seq.opt.＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖58A和58B圖58A，2003 CON_08_BC_Env；圖58B，2003CON_08_BC Env.seq.opt.(Seq.opt.＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖59A和59B圖59A，2003 CON_10_CD Env；圖59B，2003CON_10_CD Env.seq.opt.(Seq.opt.＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖60A和60B圖60A，2003 CON_11_CPX Env；圖60B，2003CON_11_CPX Env.seq.opt.(Seq.opt.＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖61A和61B圖61A，2003 CON_12_BF Env；圖61B，2003CON_12_BF Env.seq.opt.(Seq.opt.＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖62A和62B圖62A，2003 CON_14_BG Env；圖62B，2003CON_14_BG Env.seq.opt.(Seq.opt.＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖63A和63B圖63A，2003_CON_S gag.PEP；圖63B，2003_CON_Sgag.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖64A和64B圖64A，2003_M.GROUP.anc gag.PEP；圖64B，2003_M.GROUP.anc gag.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖65A～65D圖65A，2003_CON_A1 gag.PEP；圖65B，2003_CON_A1 gag.OPT；圖65C，2003_A1.anc gag.PEP；圖65D，2003_A1.anc gag.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖66A和66B圖66A，2003_CON_A2 gag.PEP；圖66B，2003_CON_A2 gag.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖67A～67D圖67A，2003_CON_B gag.PEP；圖67B，2003_CON_Bgag.OPT；圖67C，2003_B.anc gag.PEP；圖67D，2003_B.anc gag.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖68A～68D圖68A，2003_CON_C gag.PEP；圖68B，2003_CON_Cgag.OPT；圖68C，2003_C.anc.gag.PEP；圖68D，2003_C.anc.gag.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖69A和69B圖69A，2003_CON_D gag.PEP；圖69B，2003_CON_Dgag.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖70A和70B圖70A，2003_CON_F gag.PEP；圖70B，2003_CON_Fgag.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖71A和71B圖71A，2003_CON_G gag.PEP；圖71B，2003_CON_Ggag.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖72A和72B圖72A，2003_CON_H gag.PEP；圖72B，2003_CON_Hgag.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖73A和73B圖73A，2003_CON_K gag.PEP；圖73B，2003_CON_Kgag.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖74A和74B圖74A，2003_CON_01_AE gag.PEP；圖7B，2003_CON_01_AE gag.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖75A和75B圖75A，2003_CON_02_AG gag.PEP；圖75B，2003_CON_02_AG gag.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖76A和76B圖76A，2003_CON_03_ABG gag.PEP；圖76B，2003_CON_03_ABG gag.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖77A和77B圖77A，2003_CON_04_CFX gag.PEP；圖77B，2003CON_04_CFX gag.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖78A和78B圖78A，2003_CON_06_CPX gag.PEP；圖78B，2003_CON_06_CPX gag.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖79A和79B圖79A，2003_CON_07_BC gag.PEP；圖79B，2003_CON_07_BC gag.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖80A和80B圖80A，2003_CON_08_BC gag.PEP；圖80B，2003_CON_08_BC gag.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖81A和81B圖81A，2003_CON_10_CD gag.PEP；圖81B，2003_CON_10_CD gag.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖82A和82B圖82A，2003_CON_11_CPX gag.PEP；圖82B，2003_CON_11_CPX gag.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖83A和83B圖83A，2003_CON_12_BF.gag.PEP；圖83B，2003_CON_12_BF.gag.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖84A和84B圖84A，2003_CON_14_BG gag.PEP；圖84B，2003_CON_14_BG gag.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖85A和85B圖85A，2003_CONS_nef.PEP；圖85B，2003_CONSnef.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖86A和86B圖86A.2003_M GROUP.anc nef.PEP；圖86B，2003_M GROUP.anc.nef.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖87A和87B圖87A，2003_CON_A nef.PEP；圖87B，2003_CON_Anef.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖88A～88D圖88A，2003_CON_A1 nef.PEP；圖88B，2003_CON_A1 nef.OPT；圖88C，2003_A1.anc nef.PEP；圖88D，2003_A1.anc nef.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖89A和89B圖89A，2003_CON_A2 nef.PEP；圖89B，2003_CON_A2 nef.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖90A～90D；圖90A，2003_CON_B nef.PEP；圖90B，2003_CON-Bnef.OPT；圖90C，2003_B.anc nef.PEP；圖90D，2003_B.anc nef.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖91A和91B圖91A，2003_CON_02_AG nef.PEP；圖91B，2003_CON_02_AG nef.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖92A～92D圖92A，2003_CON_C nef.PEP；圖92B，2003_CON_Cnef.OPT；圖92C，2003_C.anc nef.PEP；圖92D，2003_C.anc nef.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖93A和93B圖93A，2003_CON_D nef.PEP；圖93B，2003_CON_Dnef.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖94A和94B圖94A，2003_CON_F1 nef.PEP；圖94B，2003_CON_F1 nef.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖95A和95B圖95A，2003_CON_F2 nef.PEP；圖95B，2003_CON_F2 nef.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖96A和96B圖96A，2003_CON_G nef.PEP；圖96B，2003_CON_Gnef.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖97A和97B圖97A，2003_CON_H nef.PEP；圖97B，2003_CON_Hnef.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖98A和98B圖98A，2003_CON_01_AE nef.PEP；圖98B，2003_CON_01 AE nef.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖99A和99B圖99A，2003_CON_03_AE nef.PEP；圖99B，2003_CON_03_AE nef.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖100A和100B圖100A，2003_CON_04_CFX nef.PEP；圖100B，2003_CON_04_CFX nef.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖101A和101B圖101A，2003_CON_06_CFX nef.PEP；圖101B，2003_CON_06_CFX nef.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖102A和102B圖102A，2003_CON_08_BC nef.PEP；圖102B，2003_CON_08_BC nef.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖103A和103B圖103A，2003_CON_10_CD nef.PEP；圖103B，2003_CON_10_CD nef.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖104A和104B圖104A，2003_CON_11_CFX nef.PEP；圖104B，2003_CON_11_CFX nef.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖105A和105B圖105A，2003_CON_12_BF nef.PEP；圖105B，2003_CON_12_BF nef.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖106A和106B圖106A，2003_CON_14_BG nef.PEP；圖106B，2003_CON_14_BG nef.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖107A和107B圖107A，2003_CON_S pol.PEP；圖107B，2003_CON_S pol.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖108A和108B圖108A，2003_M GROUP anc pol.PEP；圖108B，2003_M.GROUP anc pol.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖109A～109D圖109A，2003_CON_A1 pol.PEP；圖109B，2003_CON_A1 pol.OPT；圖109C，2003_A1.anc pol.PEP；圖109D，2003_Al.anc pol.OPT (OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖110A和110B圖110A，2003_CON_A2 pol.PEP；圖110B，2003_CON_A2 pol.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖111A～111D圖111A，2003_CON_B pol.PEP；圖111B，2003_CON_B pol.OPT；圖111C，2003_B.anc pol.PEP；圖111D，2003_B.anc pol.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖112A～112D圖112A，2003_CON_C pol.PEP；圖112B，2003_CON_C pol.OPT；圖112C，2003_C.anc pol.PEP；圖112D，2003_C.anc pol.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖113A和113B圖113A，2003_CON_D pol.PEP；圖113B，2003_CON_D pol.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖114A和114B圖114A，2003_CON_F1pol.PEP；圖114B，2003_CON_F1 pol.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖115A和115B圖115A，2003_CON_F2 pol.PEP；圖115B，2003_CON_F2 pol.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖116A和116B圖116A，2003_CON_G pol.PEP；圖116B，2003_CON_G pol.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖117A和117B圖117A，2003_CON_H pol.PEP；圖117B，2003_CON_H pol.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖118A和118B圖118A，2003_CON_01_AE pol.PEP；圖118B，2003_CON_01_AE pol.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖119A和119B圖119A，2003_CON_02_AG pol.PEP；圖119B，2003_CON_02_AG pol.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖120A和120B圖120A，2003_CON_03_AB pol.PEP；圖120B，2003_CON_03_AB pol.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖121A和121B圖121A，2003_CON_04_CPX pol.PEP；圖12lB，2003_CON_04_CPX pol.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖122A和122B圖122A，2003_CON_06_CPX pol.PEP；圖122B，2003_CON_06_CPX pol.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖123A和123B圖123A，2003_CON_08_BC pol.PEP；圖123B，2003_CON_08_BC pol.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖124A和124B圖124A，2003_CON_10_CD pol.PEP；圖124B，2003_CON_10_CD pol.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖125A和125B圖125A，2003_CON_11_CPX pol.PEP；圖125B，2003_CON_11_CPX pol.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖126A和126B圖126A，2003_CON_12_BF pol.PEP；圖126B，2003_CON_12_BF pol.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
圖127A和127B圖127A，2003_CON_14 BG pol.PEP；圖127B，2003_CON_14_BG pol.OPT(OPT＝密碼子優(yōu)化的編碼序列)。
具體實施例方式
本發(fā)明涉及誘導(dǎo)可中和多種多樣人類免疫缺陷病毒(HIV)原代分離物的抗體的免疫原和/或誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的免疫原。所述免疫原包含至少一個共有或祖先免疫原(例如，Env、Gag、Nef或Pol)或其部分或變體。本發(fā)明還涉及編碼所述共有或祖先免疫原或其部分或變體的核酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用所述免疫原和編碼序列的方法。雖然本發(fā)明就特定的共有和祖先免疫原(例如，M組共有Env)進(jìn)行了詳細(xì)描述，但是應(yīng)理解，可以采用本文所描述的方法來產(chǎn)生多種共有或祖先免疫原(例如其他HIV-1組(例如，N和O)的包膜)。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，可以例如由Los Alamos HIV序列數(shù)據(jù)庫中的序列(使用例如MASE(Multiple Aligned Sequence Editor，多比對序列編輯器))，通過產(chǎn)生針對特定HIV-1組的各亞型(M組分為亞型A-D、F-H、J、K)的env基因的共有序列，構(gòu)建共有env基因。然后可以產(chǎn)生所有的亞型共有序列的共有序列，以避免對亞型進(jìn)行大量測序(Gaschen等，Science 2962354-2360(2002)；Korber等，Science 2881789-1796(2000))。在實施例1所描述的M組共有env基因(稱為CON6)的情況中，將來自CRF08BC重組株(98CN006)的5個高度可變區(qū)(V1、V2、V4、V5和gp41的胞質(zhì)域中的一個區(qū)域)用來填充序列中所缺失的區(qū)域(然而，參見Con-S的相應(yīng)區(qū)域)。為了進(jìn)行高水平表達(dá)，可以基于用于高水平表達(dá)人類基因的密碼子選擇來優(yōu)化共有或祖先基因的密碼子(Haas等，Curr.Biol.6315-324(2000)，Andre等，J.Virol.721497-1503(1998))。
通過1999年共有M組env基因，即CON6，根據(jù)ELISPOT γ-干擾素的斑點形成細(xì)胞的數(shù)目和在兩個品系小鼠(表1和2顯示的BALB/c小鼠中的數(shù)據(jù))中所識別的表位的數(shù)目，說明相對于野生型B和C的envCON6誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的優(yōu)越性已成為可能。已經(jīng)比較了CON6 Env蛋白和數(shù)種亞型B Env對HIV-1原代分離物的中和抗體的誘導(dǎo)能力。由CON6誘導(dǎo)的中和抗體的靶包括數(shù)種非B HIV-1株。
表1BALB/c小鼠中CON6、JRFL和96ZM651的Env免疫原的T細(xì)胞表位圖

表2 C57BL/6小鼠中CON6gp120免疫原的T細(xì)胞表位圖

對于2000年共有M組env基因，即Con-S，已經(jīng)證明在兩個品系的小鼠(C57BL/6的數(shù)據(jù)顯示在圖27)中進(jìn)行的T細(xì)胞γ-干擾素ELISPOT測定法中Con-S包膜具有與CON6包膜基因一樣的免疫原性。此外，在CON6和Con-S的gp140 Envs在豚鼠(表3)中作為抗體的蛋白免疫原的比較中，發(fā)現(xiàn)兩種gp140 Envs均誘導(dǎo)可中和亞型B原代分離物的抗體。然而，Con-S gp140還誘導(dǎo)亞型C分離物TV-1和DU 123以及一種亞型AHIV-1原代分離物的顯著中和，而CON6則不能。
表D-2總結(jié)了按照受試者年齡和TetraMenD血清群的滴度幾何均數(shù)(GMT)。
表D-2按照受試者年齡和TetraMenD血清群的GMT總結(jié)

由于共有免疫原的下一個迭代和具有實用性的HIV-1免疫原可以是數(shù)種亞型共有基因的多價混合物、亞型和共有基因的混合物或中心化的基因和野生型基因的混合物的事實，已經(jīng)由亞型A、B、C、CRF AE01和G以及來自2003年Los Alamos National Database數(shù)據(jù)庫序列的M組共有基因設(shè)計出了一系列的11個亞型共有和野生型基因。選擇野生型序列的原因是因為已知它們來自早期傳播的HIV-1株(所述株最有可能是需要用疫苗進(jìn)行防護(hù)的)或者因為它們是最近提交到該亞型的數(shù)據(jù)庫中的株系。這些核苷酸和氨基酸序列顯示在圖28～38中。(對于所顯示的所有經(jīng)設(shè)計的140CF，140CF基因的側(cè)翼可以具有包含Kozak序列(GCCACCATGG/A)和SalI位點的5′序列″TTCAGTCGACGGCCACC″和包含終止密碼子和BglII位點的3′序列TAAAGATCTTACAA)。在圖39～62中顯示的是2003中心化的(共有和祖先)HIV-1包膜蛋白和密碼子優(yōu)化的基因序列。
CON6 gp140(其不中和非進(jìn)化枝B HIV株)和Con-S gp140(其確實誘導(dǎo)可中和非進(jìn)化枝B HIV株的抗體)之間的主要差異在于Con-S V1、V2、V4和V5區(qū)域。對于進(jìn)化枝B株，V3區(qū)的肽能誘導(dǎo)中和抗體(Haynes等，J.Immunol.1511646-1653(1993))。因此，Th-V1、Th-V2、Th-V4、Th-V5肽的構(gòu)建預(yù)計可以產(chǎn)生具有所需要的廣泛反應(yīng)性的抗非進(jìn)化枝B中和抗體。因此，考慮將在表4中所提供的Th-V肽用作獲自Con-S gp140的一種或多種肽免疫原。其他HIV株中的gag Th決定簇(GTH，表4)或任何的同源GTH序列可以用來促進(jìn)免疫原性，也可以使用HIV gp120的C4區(qū)(KQIINMWQVVGKAMYA)或來自其他HIV株的任何的同源C4序列(Haynes等，J.Immunol.1511646-1653(1993))。當(dāng)在適當(dāng)?shù)淖魟├鏑orixa的RC529(Baldridge等，J.Endotoxin Res.8453-458(2002))中配制時，可以單獨或一起使用帶有N末端輔助決定簇的Con-S V1、V2、V4和V5肽來誘導(dǎo)針對非進(jìn)化枝B分離物具有廣泛的交叉反應(yīng)性的中和抗體。

可以理解，本發(fā)明包括本文具體公開的序列的部分和變體。例如，密碼子優(yōu)化的共有編碼序列形式可以構(gòu)建成gp120/41已被刪除或未被刪除的gp140CF、gp140CFI、gp120或gp160形式。例如，關(guān)于共有和祖先包膜序列，本發(fā)明包含缺乏V3的包膜序列。或者，V3序列可以選自優(yōu)選序列例如美國申請10/431,596和美國臨時申請60/471,327所公開的序列。此外，用于廣泛應(yīng)答的最佳免疫原可以包括M組共有g(shù)ag、pol、nef和env編碼序列的混合物，以及由gag、pol、nef和env HIV基因的亞型共有或祖先編碼序列的混合物構(gòu)成。為了解決病毒株中的區(qū)域差異，有效的混合物可以包括共有/祖先和野生型編碼序列的混合物。
本發(fā)明的共有或祖先包膜可以被“激活”以暴露通常只是在HIV病毒體表面上暫性地暴露或幾乎不暴露的中和表位的中間構(gòu)象。免疫原可能是使呈遞到B淋巴細(xì)胞的特定表位能夠得以獲得的共有或祖先包膜的“冷凍的”觸發(fā)形式。所述表位呈遞的結(jié)果是產(chǎn)生廣泛中和HIV的抗體(可以直接參考WO 02/024149和其中所述的激活的/觸發(fā)的包膜)。
融合中間免疫原的概念與gp41 HR-2區(qū)域肽DP178可以捕獲gp41的未卷曲構(gòu)象(Furata等，Nature Struct.Biol.5276(1998))和福爾馬林固定的HIV感染細(xì)胞能廣泛產(chǎn)生中和抗體(LaCasse等，Science 283357(1997))的觀測結(jié)果一致。最近，抗卷曲螺旋區(qū)的單克隆抗體結(jié)合到卷曲螺旋gp41結(jié)構(gòu)的HR1和HR2區(qū)中的gp41的構(gòu)象決定簇，但是并不中和HIV(Jiang等，J.Virol.10213(1998))。然而，后一研究證明，如果產(chǎn)生正確的抗體，抗體可以利用用于結(jié)合的卷曲螺旋區(qū)。
一方面，本發(fā)明的免疫原例如，在細(xì)胞小泡或包含跨脂質(zhì)雙層包膜的脂質(zhì)體中包含可溶性形式或者錨定形式的共有或祖先包膜。為了制造更接近天然的包膜，可以將gp140或gp160共有或者祖先序列構(gòu)建在用以形成天然三聚包膜的脂雙層中?；蛘?，可以將aldrithio 1-2滅活的HIV-1病毒體中的觸發(fā)的gp160用作免疫原。gp160還可以作為gp160或gp140(gp140是跨膜區(qū)以及可能其它gp41區(qū)域被刪除的gp160)以重組體蛋白存在。與gp160或gp140結(jié)合的可以是重組體CCR5或者CXCR4共受體蛋白(或它們的胞外域肽或蛋白片段)，或結(jié)合gp120上的CXCR4或CCR5的結(jié)合位點的抗體或其它配體，和/或可溶性CD4，或模擬CD4的結(jié)合作用的抗體或其它配體。或者，包含CD4、CCR5(或CXCR4)的泡囊或脂質(zhì)體，或可溶性CD4和反映CCR5或CXCR4 gp120結(jié)合位點的肽?；蛘撸罴训腃CR5肽配體可以是來自CCR5的N末端的肽，其中特異性的酪氨酸被硫酸化(Bormier等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 975762(2001))。觸發(fā)的免疫原不一定要結(jié)合到膜上，但是其可以在溶液存在和被觸發(fā)?；蛘?，可溶性CD4(sCD4)可以被由CD4肽模擬表位(mimetope)觸發(fā)的包膜(gp140或gp160)所代替(Vitra等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 961301(1999))。還可以用“觸發(fā)”gp160或gp140以經(jīng)受與誘導(dǎo)細(xì)胞融合的gp160的結(jié)構(gòu)有關(guān)的變化的其它HIV共受體分子。可溶性HIV gp140原代分離物HIV 89.6包膜與可溶性CD4(sCD4)的連接會誘導(dǎo)gp41中的構(gòu)象變化。
在一個實施方式中，本發(fā)明涉及具有與受體(CD4)連接的共有或祖先包膜特征的免疫原，其中CCR5結(jié)合區(qū)是暴露的但是不同于CD4結(jié)合位點阻斷了的與CD4連接的蛋白，所述免疫原具有暴露(開放)的CD4結(jié)合位點。而且，該免疫原可以沒有寄主CD4，這避免在施用于宿主后產(chǎn)生可能有害的抗CD4抗體。
所述免疫原可以包含與被A32單克隆抗體(mab)所識別的gp120上的位點的配體結(jié)合的共有或祖先包膜(Wyatt等，J.Virol.695723(1995)；Boots等，AIDS Res.Hum.Retro.131549(1997)；Moore等，J.Virol.688350(1994)，Sullivan等，J.Virol.724694(1998)；Fouts等，J.Virol.712779(1997)；Ye等，J.Virol.7411955(2000))。已經(jīng)展示了一個A32單克隆抗體以模擬CD4并當(dāng)與gp120結(jié)合時，上調(diào)(暴露)CCR5結(jié)合位點(Wyatt等，J.Virol.695723(1995))。gp120與所述配體的結(jié)合也上調(diào)CD4結(jié)合位點而不阻斷CD4與gp120的結(jié)合。有利的是，所述配體還上調(diào)結(jié)合到切除的gp120、未切除的gp140和切除的gp41上的gp41的HR-2結(jié)合位點，由此進(jìn)一步暴露這些蛋白上的HR-2結(jié)合位點-其各自為抗HIV中和抗體的潛在靶。
在該實施方式的具體方面，所述免疫原包含與完整A32單克隆抗體、A32單克隆抗體的Fab2片段或A32單克隆抗體的Fab片段連接的可溶性HIV共有或祖先gp120包膜，其結(jié)果是暴露/上調(diào)了共有或祖先包膜上的CD4結(jié)合位點、CCR5結(jié)合位點和HR-2結(jié)合位點。所述免疫原可以包含結(jié)合有A32單克隆抗體(或其片段)的共有或祖先包膜或可以包含結(jié)合有A32單克隆抗體(或其片段)并與交聯(lián)劑(例如0.3％甲醛)或異雙官能交聯(lián)劑(例如DTSSP(Pierce Chemical Company)連接的共有或祖先包膜。所述免疫原還可以包含未切除的共有或祖先gp140或未切除gp140、切除的gp41和切除的gp120的混合物。結(jié)合到共有或祖先gp140和/或gp120或結(jié)合到與gp41非共價結(jié)合的gp120的A32單克隆抗體(或其片段)導(dǎo)致gp41、gp120和未切除gp140中的HR-2結(jié)合位點的上調(diào)(暴露)。A32單克隆抗體(或其片段)與gp120或gp140的結(jié)合還導(dǎo)致CD4結(jié)合位點和CCR5結(jié)合位點的上調(diào)。對于包含復(fù)合物的gp120，包含未切除的gp140和A32單克隆抗體(或其片段)的復(fù)合物可以用作未交聯(lián)或與諸如0.3％甲醛或DTSSP等交聯(lián)劑交聯(lián)的免疫原。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及包含可溶性的未切除的共有或祖先gp140的免疫原，該免疫原與Fab片段或整個A32單克隆抗體結(jié)合和交聯(lián)，選擇性地與HR-2結(jié)合蛋白結(jié)合和交聯(lián)。
用結(jié)合到gp120上的A32單克隆抗體結(jié)合位點的配體觸發(fā)的共有或祖先包膜蛋白可以與至少第二免疫原組合施用，所述第二免疫原包含與A32單克隆抗體結(jié)合位點明顯不同的位點(例如被單克隆抗體17b所識別的CCR5結(jié)合位點)結(jié)合的配體所觸發(fā)的第二包膜。所述17b單克隆抗體(Kwong等，Nature 393648(1998)可得自AIDS Reference Repository，NIAID，NIH)，其促進(jìn)sCD4結(jié)合到gp120上。所述第二免疫原(也可以單獨使用或與除以上所述的免疫原之外的觸發(fā)的免疫原組合使用)可以例如包含可溶性HIV共有或祖先包膜，所述包膜連接有整個的17b單克隆抗體、17b單克隆抗體的Fab2片段或17b單克隆抗體的Fab片段。應(yīng)理解，導(dǎo)致CD4結(jié)合位點暴露的其它CCR5配體，包括其它抗體(或其片段)可用以代替17b單克隆抗體。這一另外的免疫原可以包含結(jié)合有17b單克隆抗體或其片段(或上述的其它CCR5配體)的gp120，或者可以包含具有17b單克隆抗體或其片段(或上述的CCR5其它配體)的gp120，所述17b單克隆抗體或其片段與試劑例如0.3％甲醛或異雙官能交聯(lián)劑(例如DTSSP(Pierce Chemical Company)結(jié)合和交聯(lián)?；蛘?，所述另外的免疫原可以包含未切除的gp140，該gp140獨立存在或在切除的gp41和切除的gp120的混合物中存在。單克隆抗體17b或其片段(或上述的其它CCR5配體)結(jié)合到所述混合物中的gp140和/或gp120上，導(dǎo)致CD4結(jié)合區(qū)的暴露。17b單克隆抗體或其片段(或上述的CCR5其它配體)、gp140復(fù)合物可以以不交聯(lián)或與諸如0.3％甲醛或DTSSP等試劑交聯(lián)的形式存在。
可以將諸如T649Q26L和DP178等可溶性HR-2肽加到上述復(fù)合物中，以使共有g(shù)p120和gp 41以及未切除的共有g(shù)p140分子上的表位穩(wěn)定化，而且可以與所述復(fù)合物交聯(lián)或不交聯(lián)施用。
除了上述17b單克隆抗體之外，已經(jīng)制造了一系列中和許多HIV原代分離物的單克隆抗體(mab)，這些單克隆抗體包括結(jié)合到gp120上的CD4結(jié)合位點的單克隆抗體IgG1b12(Roben等，J.Virol.68482(1994)；Mo等，J.Virol.716869(1997))、結(jié)合到gp120上的構(gòu)象決定簇的單克隆抗體2G12(Trkola等，J.Virol.701100(1996))以及結(jié)合到gp41的膜鄰近區(qū)的單克隆抗體2F5(Muster等，J.Virol.684031(1994))。
如上所述，可以采用各種方法來“冷凍”根據(jù)本發(fā)明的融合表位。例如，可以通過以下方法來實施“冷凍”添加呈現(xiàn)卷曲螺旋區(qū)的部分和當(dāng)添加到CD4觸發(fā)的共有或祖先包膜會導(dǎo)致防止融合的DP-178或T-649Q26L肽(Rimsky等，J.Virol.72986-993(1998))。結(jié)合有HR-2肽的共有或祖先gp120、gp140、gp41或gp160可用作免疫原或用試劑例如DTSSP或DSP(Pierce Co.)、甲醛或者其它具有類似作用的交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)。
也可以通過以下方法實施“冷凍”將0.1％～3％甲醛或多聚甲醛(兩者均為蛋白交聯(lián)劑)添加到所述復(fù)合物中，以穩(wěn)定CD4、CCR5或CXCR4、HR-2肽gp160復(fù)合物，或穩(wěn)定“觸發(fā)的”gp41分子，或同時使兩者穩(wěn)定化(LaCasse等，Science 283357-362(1999))。
另外，共有或者祖先gp41或gp120融合中間體的“冷凍”可以通過以下方法實施添加采用兩個與氨基反應(yīng)的NHS酯的異雙官能試劑(例如DSP(dithiobis[succimidylproprionate])或水溶性DTSSP(Pierce Co.)來交聯(lián)和穩(wěn)定CD4、CCR5或CXCR4、HR-2肽gp160復(fù)合物，或穩(wěn)定“觸發(fā)的”gp41分子，或同時使兩者穩(wěn)定。
經(jīng)免疫或接種的動物和人中的T細(xì)胞免疫應(yīng)答分析表明，雖然包膜蛋白是誘導(dǎo)中和抗體的唯一的基因，但是它通常不是T細(xì)胞免疫應(yīng)答的主要靶。HIV-1Gag、Pol和Nef蛋白誘導(dǎo)有效的T細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明包括可以誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的共有或祖先免疫原的所有組成成分。共有或祖先序列的亞基可以用作T或B細(xì)胞免疫原(參見實施例6和7及其所參考的附圖以及圖63～127)。
可以采用本領(lǐng)域公知的技術(shù)將本發(fā)明的免疫原與藥學(xué)可接受的載體和/或佐劑(例如明礬)一起配制。本免疫原的適當(dāng)施用途徑包括全身性(例如肌肉內(nèi)的或皮下的)途徑。當(dāng)在黏膜免疫系統(tǒng)(例如鼻內(nèi)的)中尋求免疫反答時，可以采用其它的途徑。
本發(fā)明的免疫原可以采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行化學(xué)合成和純化。所述免疫原還可以通過公知的重組DNA技術(shù)來合成。編碼本發(fā)明的免疫原的核酸可以用作例如DNA疫苗的組分，其中以裸DNA形式施用編碼序列或例如編碼免疫原的小基因可以存在于病毒載體中。所述編碼序列可以存在于以下載體中例如復(fù)制型或非復(fù)制型腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、減毒的結(jié)核分枝桿菌載體、卡介菌(BCG)載體、痘苗或經(jīng)修飾的痘苗安卡拉(MVA)載體、另外的痘病毒載體、重組脊髓灰質(zhì)炎和其它腸病毒載體、沙門氏菌種細(xì)菌載體、志賀氏菌屬種細(xì)菌載體、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEE)載體、生里基森林病毒載體或煙草花葉病毒載體。編碼序列例如還可以表示為帶有活性啟動子例如CMV啟動子的DNA質(zhì)粒。其它活載體也可以用來表達(dá)本發(fā)明的序列。本發(fā)明的免疫原的表達(dá)可以通過將編碼所述免疫原的核酸導(dǎo)入患者本身的細(xì)胞而在所述細(xì)胞中加以誘導(dǎo)，所述核酸優(yōu)選采用使在人類細(xì)胞中的表達(dá)優(yōu)化的密碼子和啟動子。制造和使用DNA疫苗的方法的例子描述在美國專利5,580,859、5,589,466和5,703,055中。
本發(fā)明的組合物包含在藥學(xué)可接受的遞送系統(tǒng)中免疫學(xué)上有效量的本發(fā)明的免疫原或編碼所述免疫原的核酸序列。所述組合物可以用于預(yù)防和/或治療免疫缺陷病毒感染。本發(fā)明的組合物可以采用佐劑、乳化劑、藥學(xué)可接受的載體或通常在疫苗組合物中提供的其它成分來配制。最適當(dāng)?shù)闹苿┛梢院苋菀椎赜杀绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員進(jìn)行設(shè)計，并且可以包括用于立即釋放和/或持續(xù)釋放的制劑，以及用于誘導(dǎo)全身免疫和/或局部黏膜免疫(例如，所述制劑可以被設(shè)計用于鼻內(nèi)施用)的制劑。本發(fā)明的組合物可以通過以下任意的適當(dāng)途徑施用包括皮下途徑、鼻內(nèi)途徑、口服、肌肉內(nèi)途徑或其它腸胃外途徑或腸途徑。所述免疫原可以作為單劑量或多劑量施用。最適當(dāng)?shù)拿庖叻桨缚梢院苋菀椎赜善胀夹g(shù)人員進(jìn)行確定，并可以因患者、組合物和所希望的效果的改變而改變。
本發(fā)明考慮直接應(yīng)用本發(fā)明的免疫原和/或編碼所述免疫原的核酸和/或在上述載體中表達(dá)為小基因的免疫原。例如，編碼免疫原的小基因可以用作初次免疫物和/或加強(qiáng)免疫物。
本發(fā)明包括本文所公開的任意的和所有的氨基酸序列及其(適用時的)CF和CFI形式，以及編碼所述氨基酸序列的核酸序列(以及與所述編碼序列互補(bǔ)的核酸)。
本發(fā)明的某些方面可以在以下非限制性實施例中進(jìn)行更為詳細(xì)的描述。
實施例1人工HIV-1M組共有包膜實驗細(xì)節(jié)CON6gp120和gp140蛋白在重組痘苗病毒(VV)中的表達(dá)。為了表達(dá)和純化HIV-1CON6包膜蛋白的分泌形式，分別在gp120切割位點(REKR)之后和跨膜結(jié)構(gòu)域(YIKIFIMIVGGLIGLRIVFAVLSIVN)之前導(dǎo)入終止密碼子而構(gòu)建CON6 gp120和gp140CF質(zhì)粒。在gp140CF蛋白中刪除了gp120/gp41切割位點和gp41的融合結(jié)構(gòu)域。將CON6 gp120和gp140CFDNA構(gòu)建體克隆到pSC65載體(來自Bernard Moss，NIH，Bethesda，MD)的SalI和KpnI限制酶位點中。所述載體包含由p7.5啟動子控制的lacZ基因。使用背靠背的P E/L啟動子來表達(dá)CON6 env基因。將BSC-1細(xì)胞以2×105/孔接種到6孔平板上，采用野生型痘苗病毒(WR)以0.1pfu/細(xì)胞的MOI進(jìn)行感染，感染后2小時，將包含CON6 env基因的pSC65來源的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到VV感染細(xì)胞中和如所述(Moss和Earl，Current Protocolsin Molecular Biology，Ausubel等編輯(John Wiley & Sons，Inc.Indianapolis，IN)pp.16.15.1-16.19.9(1998))選擇重組(r)VV。通過PCR和測序分析證實包含CON6 env基因的重組VV。通過SDS-PAGE和Western印跡分析證實CON6包膜蛋白的表達(dá)。用瓊脂糖雪花蓮凝集素珠子(Vector Labs，Burlingame，CA)純化重組CON6 gp120和gp140CF，并貯藏在-70℃直到使用。表達(dá)JRFL(vCB-28)或96ZM651(vT241R)gp160的重組VV則從NIH AIDS Research and Reference Reagent Program(Bethesda，MD)獲得。
單克隆抗體和gp120野生型包膜?？筭p120(A32)、gp120 V3環(huán)(F39F)和CCR5結(jié)合位點(17b)上的構(gòu)象決定簇的人類單克隆抗體為JamesRobinson(Tulane Medical School，New Orleans，LA)所惠贈(Wyatt等，Nature 393；705-711(1998)；Wyatt等，J.Virol.695723-5733(1995))。單克隆抗體2F5、447、b12、2G12和可溶性CD4獲自NIH AIDS Research andReference Reagent Program(Bethesda，MD)(Gomy等，J.Immunol.1595114-5122(1997)；Nyambi等，J.Virol.706235-6243(1996)；Purtscher等，AIDS Res.Hum.Retroviruses 101651-1658(1994)；Trkola等，J.Virol 701100-1108(1996))。T8是定位到gp120 C1區(qū)的鼠單克隆抗體(由P.Earl，NIH，Bethesda，MD惠贈)。BaL(亞型B)、96ZM651(亞型C)和93TH975(亞型E)gp120由QBI，Inc.和AIDS，NIH的分部提供。表達(dá)92U037(亞型A)和93BR029(亞型F)gp140(分泌的和未切除的)的CHO細(xì)胞系由NICBS(英國)獲得。
表面等離子共振生物傳感器(SPR)測定和ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)。在BIAcore 3000儀器(BIAcore Inc.，Uppsala，瑞典)上進(jìn)行SPR生物傳感器測定，并采用BIAevaluation 3.0軟件(BIAcore Inc.，Upsaala，瑞典)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。通過用于蛋白固定的標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)程序，將pH為4.5的10mM醋酸鈉緩沖液中的抗gp120單克隆抗體(T8、A32、17b、2G12)或sCD4直接固定到CM5傳感器芯片上。分別以100μg/ml和300μg/ml的濃度將經(jīng)FPLC純化的CON6 gp120單體或gp140CF寡聚體重組蛋白流過CM5傳感器。用空白線內(nèi)參比表面(為進(jìn)行胺偶聯(lián)經(jīng)激活的和去激活的)或不結(jié)合的單克隆抗體對照來減去非特性或本體應(yīng)答(bulkresponse)。分別以可溶性89.6 gp120和不相關(guān)的IgG作為陽性對照和陰性對照，以確保在注射CON6 Env蛋白之前的各單克隆抗體表面的活性。在25℃，用pH為7.4的PBS(150mM的NaCl、0.005％的表面活性劑P20)的10μl/min～30μl/min(微升/分鐘)進(jìn)行連續(xù)流動來對CON6包膜蛋白的結(jié)合進(jìn)行實時監(jiān)測。在各結(jié)合循環(huán)后，除去結(jié)合的蛋白，并用5μl～10μl再生溶液(10mM甘氨酸-HCl，pH 2.9)進(jìn)行單或雙脈沖來使傳感器表面再生。進(jìn)行ELISA以測定各種單克隆抗體與所述CON6 gp120和gp140CF蛋白的反應(yīng)性(Haynes等，AIDS Res.Hum.Retroviruses 11211-221(1995))。對于人類單克隆抗體與rgp120或gp140蛋白結(jié)合的測定，滴定終點定義為單克隆抗體(從20μg/ml開始)的最高滴度，此時結(jié)合CON6 gp120和gp140CF Env蛋白的單克隆抗體大于或等于背景對照(不結(jié)合的人類單克隆抗體)的3倍。
感染性和共受體使用的測定。將HIV-1/SG3 Δenv和CON6或?qū)φ誩nv質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到人類293T細(xì)胞中。收獲假型病毒、過濾并對p24濃度進(jìn)行定量(DuPont/NEN Life Sciences，Boston，MA)。對于各假病毒體，以等量的p24(5ng)感染JC53-BL細(xì)胞以測定感染性(Derdeyn等，J.Virol.748358-8367(2000)；Wei等，Antimicrob Agents Chemother.461896-1905(2002))。JC53-BL細(xì)胞表達(dá)CD4、CCR5和CXCR4受體并包含在HIV-1長末端重復(fù)(LTR)的轉(zhuǎn)錄控制下穩(wěn)定整合的β-半乳糖苷酶(β-gal)基因?？梢酝ㄟ^用于β-gal表達(dá)的染色和對假病毒體的每微克p24(IU/μg p24)的藍(lán)色細(xì)胞數(shù)目(感染單位)計數(shù)，采用這些細(xì)胞對假病毒體貯存物的感染滴度進(jìn)行定量(Derdeyn等，J.Virol.748358-8367(2000)；Wei等，AntimicrobAgents Chemother.461896-1905(2002))。為了測定CON6 env基因的共受體使用，在37℃，用1.2μM的AMD3100和4μM的TAK-799處理JC53BL細(xì)胞1小時，然后用各Env假型病毒的等量p24(5ng)進(jìn)行感染。阻斷效率表示為來自阻斷實驗的感染單位相對于來自沒有阻斷劑的對照培養(yǎng)物的感染單位的百分比。將來自對照組(沒有阻斷劑)的感染性人為地設(shè)定為100％。
免疫。所有的動物均以杜克大學(xué)動物使用和照料委員會(DukeUniversity Animal Use and Care Committee)批準(zhǔn)的動物使用規(guī)程在AALAC指導(dǎo)方針下收養(yǎng)在杜克大學(xué)動物系(Duke University AnimalFacility)。根據(jù)生產(chǎn)廠家(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)提供的規(guī)程用RIBI-CWS佐劑將重組CON6 gp120和gp140CF糖蛋白配制在穩(wěn)定乳劑中。為了誘導(dǎo)抗包膜抗體，每3個星期對4只遠(yuǎn)交系的豚鼠(Harlan Sprague，Inc.，Chicago，IL)各皮下給予100μg的經(jīng)純化的CON6 gp120或gp140CF(總共免疫5次)。對血清樣本進(jìn)行熱滅活(56℃，1小時)，并貯藏在-20℃直到使用。
為了誘導(dǎo)抗包膜的T細(xì)胞應(yīng)答，用50μg質(zhì)粒DNA對6～8周齡的雌性BALB/c小鼠(Frederick Cancer Research and Developmental Center，NCI，F(xiàn)rederick，MD)在四頭肌以3周為間隔進(jìn)行3次肌肉內(nèi)注射(i.m.)免疫。在最后的DNA免疫后3周，用表達(dá)Env蛋白的107PFU的rVV對小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。在加強(qiáng)免疫后2周，對所有小鼠實施安樂死，并取出脾臟以分離脾細(xì)胞。
中和測定。采用以下測定法進(jìn)行中和測定Bures等(AIDS Res.Hum.Retroviruses 162019-2035(2000))所描述MT-2測定法；使用一組HIV-1原代分離物在5.25.GFP.Luc.M7細(xì)胞中進(jìn)行的基于熒光素酶的多復(fù)制周期HIV-1感染性測定法(Bures等，AIDS Res.Hum.Retroviruses 162019-2035(2000)；Bures等，J.Virol.762233-2244(2002)；或使用滅活的HIV-1病毒體的合胞體(外源性融合)抑制測定法(Rossio等，J.Virol.727992-8001(1998))。在基于熒光素酶的測定法中，所測定的中和抗體為5.25.EGFP.Luc.M7細(xì)胞中熒光素酶活性的降低的函數(shù)，所述細(xì)胞由Nathaniel R.Landau，Salk Institute，La Jolla，CA(Brandt等，J.Biol.Chem.27717291-17299(2002))提供。在96孔平底培養(yǎng)板中，將500組織培養(yǎng)感染劑量50(TCID50)的無細(xì)胞的病毒與150μl的所示血清稀釋液一起孵育(1小時，37℃)，3次重復(fù)。將5.25.EGFP.Luc.M7細(xì)胞以5×105/ml密度懸浮在包含DEAE-葡聚糖(10μg/ml)的培養(yǎng)基中。添加細(xì)胞(100μl)，直到通過熒光顯微檢測在對照孔(沒有測試血清樣本)中10％的細(xì)胞的GFP表達(dá)呈陽性。此時，通過去除一半體積的培養(yǎng)基使細(xì)胞濃縮2倍。將50μl的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到96孔白色固體板(Costar，Cambridge，MA)中，以在Wallac 1420 Multilabel Counter(PerkinElmer Life Sciences，Boston，MA)上采用Bright-GloTM底物(Promega，Madison，WI)進(jìn)行熒光素酶活性測定。在MT-2和熒光素酶測定中的中和滴度是其中大于或等于50％的病毒感染受到抑制的滴度。只有所滴定的值超過1∶20(即大于1∶30)才被認(rèn)為是顯著陽性。合胞體抑制“外源性融合”測定利用加到SupT1細(xì)胞中的來自HIV-1亞型B株ADA和AD8(由Larry Arthur和Jeffrey Lifson，F(xiàn)rederickResearch Cancer Facility，F(xiàn)rederick，MD惠贈)的HIV-1 aldrithiol-2(AT-2)滅活病毒體，合胞體抑制滴度被確定為相對于預(yù)放血的血清，大于或等于90％的合胞體受到抑制的滴度。
酶聯(lián)免疫斑點(ELISPOT)測定。通過切碎并施加壓力使其通過70μm尼龍細(xì)胞過濾器(BD Labware，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)，制備來自單個免疫小鼠的脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液。CON6 gp140的重疊Env肽(159個肽，15個氨基酸中(mer)重疊11個)購自Boston Bioscence，Inc(Royal Oak，MI)。MN gp140的重疊Env肽(亞型B；170個肽，15個氨基酸中重疊11個)和Chn19 gp140(亞型C；69個肽，20個氨基酸重疊10個)得自NIH AIDSResearch and Reference Reagent Program(Bethesda，MD)。用來自CON6、亞型B和亞型C的Env蛋白的重疊Env肽庫對來自各小鼠的脾細(xì)胞(5只小鼠/組)進(jìn)行體外刺激。用抗IFN-γ單克隆抗體(5μg/ml，AN18；Mabtech，Stockholm，瑞典)包被96孔的PVDF平板(MultiScreen-IP，Millipore，Billerica，MA)。采用Hepes緩沖的完全RPMI培養(yǎng)基在37℃對平板封閉2小時后，將各50μl合并的重疊包膜肽(13個CON6和MN庫，在每個庫中有13～14個肽；9 Chn19庫，在每個庫中有7～8個肽)以5μg/ml的終濃度加到平板上。然后將50μl濃度為1.0×107/ml的脾細(xì)胞加到各個孔中(兩次重復(fù))，并在37℃用5％CO2孵育16小時。將平板與100μl的1∶1000稀釋的鏈霉抗生物素蛋白堿性磷酸酶(Mabtech，Stockholm，Sweden)進(jìn)行孵育，并用100μl BCIP/NBT(和)堿性磷酸酶底物(Moss，Pasadena，MD)顯現(xiàn)紫斑點。使用Immunospot計數(shù)系統(tǒng)(CTL Analyzers，Cleveland，OH)測定斑點形成細(xì)胞(SFC)。各包膜肽庫的總應(yīng)答表示為SFC/106脾細(xì)胞。
結(jié)果CON6包膜基因設(shè)計、構(gòu)建和表達(dá)。通過以下方法構(gòu)建人工M組共有env基因(CON6)產(chǎn)生來自Los Alamos HIV序列數(shù)據(jù)庫中的序列的各HIV-1亞型的env基因的共有序列，然后產(chǎn)生所有的亞型共有序列的共有序列以避免對亞型進(jìn)行大量測序(Gaschen等，Science 2962354-2360(2002)；Korber等，Science 2881789-1796(2000))。然后使用來自CRF08_BC重組株(98CN006)(V1、V2、V4、V5和gp41的胞質(zhì)域中的區(qū)域)的5個高度可變區(qū)來填充CON6序列的缺失區(qū)域。CON6V3區(qū)是M組共有序列(圖1A)。為高水平表達(dá)，基于用于高水平表達(dá)人類基因的密碼子對CON6 env基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化(Haas等，Curr.Biol.6315-324(2000)；Andre等J.Virol.721497-1503(1998))(見圖1D)。構(gòu)建密碼子優(yōu)化的CON6 env基因，并將其亞克隆到pcDNA 3.1DNA的EcoR I和BamHI位點(Gao等，AIDS Res.Hum.Retroviruses，19817-823(2003))。轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中后，采用Western印跡測定確認(rèn)高水平的蛋白表達(dá)。為獲得進(jìn)行表征和用作免疫原的重組CON6 Env蛋白，產(chǎn)生rVV以表達(dá)分泌的gp120和未切割的gp140CF(圖1B)。根據(jù)減壓條件下采用考馬斯藍(lán)凝膠所進(jìn)行的測定，各蛋白的純度大于或等于90％(圖1C)。
在CON6蛋白上保留有CD4結(jié)合結(jié)構(gòu)域和其它野生型HIV-1表位。為了測定CON6蛋白是否可以結(jié)合到CD4上并表達(dá)其它野生型HIV-1表位，測定了CON6 gp120和gp140CF結(jié)合一種或多種可溶性CD4、結(jié)合數(shù)種特征公知的抗gp120單克隆抗體以及經(jīng)受CD4誘導(dǎo)的構(gòu)象變化的能力。首先，用sCD4或單克隆抗體包被BIAcore CM5傳感器芯片以監(jiān)測它們與CON6 Env蛋白的結(jié)合活性。已發(fā)現(xiàn)單體CON6 gp120和寡聚體gp140CF有效地結(jié)合到sCD4和抗gp120單克隆抗體T8、2G12和A32，但是沒有組成型地結(jié)合單克隆抗體17b，單克隆抗體17b識別gp120的CCR5結(jié)合位點中的CD4可引誘型表位(圖2A和2B)。sCD4和A32在結(jié)合到野生型gp120之后可以暴露17b結(jié)合表位(Wyatt等，Nature 393；705-711(1998)；Wyatt等，J.Virol.695723-5733(1995))。為了確定17b表位是否可以在CON6 Envs上受到sCD4或A32的誘導(dǎo)，將sCD4、A32和T8包被在傳感器芯片上，然后捕獲CON6 gp120或gp140CF，并監(jiān)測單克隆抗體17b結(jié)合活性。在與sCD4或單克隆抗體A32結(jié)合之后，CON6gp120和gp140CF均被觸發(fā)而經(jīng)受構(gòu)象變化并結(jié)合單克隆抗體17b(圖2C和2D)。相反地，在與單克隆抗體T8結(jié)合之后，17b表位并沒有暴露(圖2C和2D)。接著采用ELISA來確定一組抗gp120 V3環(huán)(447，F(xiàn)39F)、CD4結(jié)合位點(b12)和gp14中和決定簇(2F5)的人類單克隆抗體與CON6 gp120和gp140CF的反應(yīng)性(圖2E)。CON6 rgp120和rgp140CF蛋白很好地結(jié)合到中和V3單克隆抗體447和F39F以及有效的中和CD4結(jié)合位點單克隆抗體b12。通過結(jié)合到C末端gp41表位而中和HIV-1原代分離物的單克隆抗體2F5也很好地結(jié)合到CON6 gp140CF上(圖2E)。
CON6 env基因具有生物學(xué)功能并使用CCR5作為其共受體。為了確定CON6包膜基因是否具有生物學(xué)功能，將該基因與env缺陷性SG3前病毒克隆共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。收獲假型病毒并感染JC53BL細(xì)胞。通過對感染CON6 Env假病毒體的JC53-BL細(xì)胞中的藍(lán)色細(xì)胞所進(jìn)行的檢測，表明CON6 Env蛋白具有生物學(xué)功能(圖3A)。然而，該感染滴度比具有YU2或NL4-3野生型HIV-1包膜的假病毒體的滴度低1～2對數(shù)(log)。
接著測定了CON6 env基因的共受體的使用。當(dāng)用CXCR4阻斷劑AMD3100處理時，NL4-3 Env假病毒體的感染性受到阻斷，但YU2或CON6 Env-假病毒體的感染性沒有受到抑制(圖3B)。相反地，當(dāng)用CCR5阻斷劑TAK-779處理時，NL4-3 Env-假病毒體的感染性沒有受到影響，但YU2或CON6 Env假病毒體的感染性受到抑制。當(dāng)用兩種阻斷劑處理時，所有假病毒體的感染性都受到抑制?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，CON6包膜使用了CCR5共受體來使其進(jìn)入靶細(xì)胞。
CON6 gp120與不同亞型血清的反應(yīng)。為了確定多亞型線性表位是否保留在CON6 gp120上，產(chǎn)生重組Env蛋白組(gp120和gp140)。將等量的各Env蛋白(100ng)上樣到SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，轉(zhuǎn)移到硝化纖維素上，并在Western印跡測定中使其與亞型A至G患者血清以及抗CON6gp120豚鼠血清(1∶1,000稀釋)反應(yīng)。對于各HIV-1亞型，檢測4至6個患者的血清。各亞型的一個代表性血清顯示在圖4中。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，雖然所測試的所有亞型血清在上述的組的Envs中顯示出不同的反應(yīng)性，但是所有M組亞型患者血清與CON6 gp120 Env蛋白的反應(yīng)同樣好，證明被患者血清識別的野生型HIV-1 Env表位被很好地保留在CON6 Env蛋白上。接著測試在豚鼠中產(chǎn)生的CON6 gp120抗血清是否可以與不同亞型的Env蛋白反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)CON6血清與其本身和除了亞型A Env蛋白之外的其它亞型Env蛋白的反應(yīng)同樣好(圖4)。
針對CON6、亞型B和亞型C包膜重疊肽的T細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)。為了比較CON6 Env免疫原所誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫應(yīng)答與亞型特異性免疫原所誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫應(yīng)答，用亞型B或亞型C DNA和表達(dá)亞型B或C包膜蛋白的相應(yīng)的rVV來免疫另外兩組小鼠。用亞型B(JRFL)或亞型C(96ZM651)Env免疫原所免疫的小鼠主要具有亞型特異性的T細(xì)胞免疫應(yīng)答(圖5)。在用亞型B(MN)肽庫但不用亞型C(Chn19)或CON6肽庫刺激之后，對來自用JRFL(亞型B)免疫原免疫的小鼠的IFN-γSFC進(jìn)行檢測。在用亞型C(Chn19)和CON6肽庫但是不用亞型B(MN)肽庫刺激之后，對來自用96ZM651(亞型C)免疫原免疫的小鼠的IFN-γSFC進(jìn)行檢測。相反地，當(dāng)用CON6肽庫和用亞型B或C肽庫刺激之后，從用CON6 Env免疫原免疫的小鼠中鑒定出了IFN-γSFC(圖5)。CON6 gp140所誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫應(yīng)答比CON6 gp120所誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫應(yīng)答顯得更強(qiáng)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，CON6 gp120和gp140CF免疫原能夠誘導(dǎo)可識別野生型亞型B和C包膜的T細(xì)胞表位的T細(xì)胞應(yīng)答。
中和HIV-1亞型B和C原代分離物的重組CON6 gp120和gp140CF包膜對抗體的誘導(dǎo)。為了確定CON6包膜免疫原是否可以誘導(dǎo)可中和HIV-1原代分離物的抗體，用CON6 gp120或gp140CF蛋白對豚鼠進(jìn)行免疫。使用經(jīng)4或5次免疫后所收集的血清來進(jìn)行中和測定并與相應(yīng)的預(yù)放血血清進(jìn)行比較。在合胞體抑制測定中對兩個經(jīng)AT-2滅活的HIV-1分離物(ADA和AD8)進(jìn)行檢測(表5A)。在MT-2或基于熒光素酶的測定中檢測兩個亞型B SHIV分離物、8個亞型B原代分離物、4個亞型C和亞型A、D和E各1個的原代分離物(表5B)。在合胞體抑制測定中，發(fā)現(xiàn)同時由CON6 gp120和gp140CF蛋白誘導(dǎo)的抗體強(qiáng)烈地抑制了經(jīng)AT-2滅活的ADA和AD8所誘導(dǎo)的合胞體(表5A)。在MT-2測定中，發(fā)現(xiàn)2個SHIV分離物中的1個(SHIV SF162P3)受到兩個gp120和一個gp140CF血清的弱中和作用(表5B)。在基于熒光素酶的測定中，發(fā)現(xiàn)8個亞型B原代分離物中的4個(BXO8、SF162、SS1196和BAL)受到所有g(shù)p120和gp140CF血清的強(qiáng)中和作用，還發(fā)現(xiàn)8個亞型B分離物中的2個(6101，0692)受到大多數(shù)gp120和gp140CF血清的弱中和作用。沒有發(fā)現(xiàn)抗HIV-1 PAVO的中和作用(表5B)。接著，針對4個亞型C HIV-1分離物而對CON6抗gp120和gp140CF血清進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)4個分離物中的3個(DU179、DU368和S080)主要受到抗CON6 gp120血清的弱中和作用。一個gp140CF血清即No.653強(qiáng)烈地中和DU179而較弱地中和S080(表5B)。最后，抗CON6 Env血清強(qiáng)烈地中和亞型D分離物(93ZR001)，較弱地中和亞型E(CM244)分離物，但是不中和亞型A(92RW020)分離物。
表5AHIV-1M組共有包膜CON6蛋白誘導(dǎo)融合抑制抗體的能力

1相對于預(yù)免疫血清，Sup T1細(xì)胞的HIV誘導(dǎo)的合胞體所受到的抑制大于90％時的血清稀釋度的倒數(shù)。所有預(yù)放血血清均為陰性(滴度小于10)。
表5BM組共有HIV-1包膜CON6 gp120和gp140CF蛋白誘導(dǎo)可中和HIV原代分離物的抗體的能力

*MT-2測定；所有其他HIV分離物均在M7熒光素酶測定中進(jìn)行測試。
HIV-1分離物QH0692、SS1196、SF162、6101、BX08、BG1168、BAL用5次注射后的血清進(jìn)行測試；其它HIV-1分離物用4次注射后的血清進(jìn)行測試。ND＝未進(jìn)行測試。
HIV+血清是HIV-1+人類血清(LEH3)或具有已知的HIV-1分離物SS1196中和活性的抗gp120豚鼠血清(#)。GMT＝每組4只動物的幾何平均滴度。所報道的中和滴度均是減去預(yù)放血血清中的任意背景中和后的滴度。
≠TriMab2＝人類單克隆抗體2F5、b12和2G12的混合物。
結(jié)論已描述了人工HIV-1 M組共有env基因(編碼序列)(CON6和Con-S)的制備，所述基因編碼能夠利用CCR5共受體來介導(dǎo)病毒的進(jìn)入的功能性Env蛋白。重要的是，這些M組共有包膜基因可以誘導(dǎo)可識別亞型B和C HIV-1原代分離物的表位的T和B細(xì)胞應(yīng)答。此外，Con-S誘導(dǎo)強(qiáng)烈中和亞型C和HIV-1株的抗體(見表3)。
對HIV-1的防護(hù)關(guān)系還未被最終確知。來自動物模型的大量數(shù)據(jù)和對HIV-1感染患者的研究表明，HIV-1疫苗研究的目標(biāo)應(yīng)該是具有廣泛反應(yīng)性CD4+和CD8+抗HIV-1T細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)(Letvin等，Annu.Rev.Immunol.2073-99(2002))和中和多亞型的HIV-1原代分離物的高水平抗體的誘導(dǎo)(Mascola等，J.Virol.734009-4018(1999)；Mascola等，Nat.Med.6270-210(2000))。
HIV-1的高度遺傳變異性使得難以設(shè)計出能夠誘導(dǎo)足夠廣泛的免疫應(yīng)答以用于臨床的免疫原。已經(jīng)提出了用于T和B細(xì)胞應(yīng)答的基于表位的疫苗(McMichael等，Vaccine 201918-1921(2002)；Sbai等，Curr.DrugTargets Infect.Disord.1303-313(2001)；Haynes，Lancet 348933-937(1996))、反映融合中間體的受限制性包膜(Fouts等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9911842-22847(2002))，以及用于誘導(dǎo)抗HIV-1中和抗體的保守性高階結(jié)構(gòu)的暴露來克服HIV-1變異性(Roben等，J.Virol.684821-4828(1994)；Saphire等，Science 2931155-1159(2001))。然而，由于HIV-1的多樣性一直增加并且迅速進(jìn)化，病毒是快速移動的復(fù)雜靶，而且HIV-1變異的復(fù)雜程度使所有這些方法均難以解決。目前HIV-1免疫原設(shè)計的最常見手段是對野生型野HIV-1分離物進(jìn)行選擇，所述分離物可以是或不是來自將進(jìn)行疫苗測試的區(qū)域。已設(shè)計了加入了多個包膜免疫原的多價包膜免疫原(Bartlett等，AIDS 121291-1300(1998)；Cho等，J.Virol.752224-2234(2001))。
上述研究通過產(chǎn)生M組共有env基因(CON6)而對HIV-1免疫原設(shè)計新策略進(jìn)行了測試，該M組共有env基因縮短了該候選免疫原和野生型野毒株之間的遺傳距離。通過選擇位于大多數(shù)的位置的最常見的氨基酸而產(chǎn)生所有亞型的CON6 env基因(Gaschen等，Science 2962354-2360(2002)，Korber等，Science 2881789-1796(2000))。因為只使用最常見的氨基酸，大多數(shù)的抗體和T細(xì)胞表位得到了很好的保留。重要的是，M組共有env序列和任何亞型env序列之間的遺傳距離大約為15％，該遺傳距離只是野生型亞型之間的遺傳距離(30％)的一半(Gaschen等，Science 2962354-2360(2002))。這一距離基本等同于相同亞型中的病毒間的遺傳距離。另外，由于CRF不增加亞型間的總遺傳差異，M組共有env基因與任何重組的病毒env基因同樣也有約15％的差異。
使用單循環(huán)感染系統(tǒng)確認(rèn)了CON6-Env假病毒體的感染性，雖然感染性受到影響，表明人工包膜不在“最佳的”功能構(gòu)象中，但是仍然能夠介導(dǎo)病毒的進(jìn)入。由于大多數(shù)HIV-1感染患者最初是受到R5病毒的感染，因此CON6包膜利用CCR5(R5)作為它的共受體是非常重要的。
BIAcore分析表明，CON6 gp120和gp140CF均結(jié)合sCD4和與野生型HIV-1 Env蛋白結(jié)合的很多單克隆抗體?？乖耘c野生型HIV-1包膜類似的CON6 gp120和140CF蛋白的表達(dá)是HIV-1免疫原開發(fā)中的重要步驟。然而，許多野生型包膜蛋白表達(dá)有效的中和性人類單克隆抗體所結(jié)合的表位，但是當(dāng)所述野生型包膜蛋白本身被用作免疫原時，其并沒誘導(dǎo)具有中和性人類單克隆抗體的特異性的廣泛中和性抗HIV-1抗體。
中和抗體研究是振奮人心的，原因在于CON6 gp120、CON6 gp140CF和Con-S gp140CFI誘導(dǎo)抗體，該抗體中和選擇的亞型B、C和D HIV-1原代分離物，其中Con-S gp140CFI誘導(dǎo)對非亞型B原代HIV分離物的最強(qiáng)中和。然而明顯地，最難以中和的原代分離物(PAVO、6101、BG1168、92RW020、CM244)只是被抗CON6 gp120或gp140血清微弱地中和或不中和(表4b)。盡管如此，考慮到用Con-S亞基gp140CFI包膜蛋白產(chǎn)生的應(yīng)答對非亞型B HIV分離物的廣泛性，用于誘導(dǎo)中和抗體的Con-S包膜的免疫原性還是很有希望的。以前用表達(dá)gp120和gp160的痘病毒構(gòu)建體進(jìn)行的研究未產(chǎn)生高水平的中和抗體(Evans等，J.Infect.Dis.180290-298(1999)；Polacino等，J.Virol.73618-630(1999)；Ourmanov等，J.Virol.742960-2965(2000)；Pal等，J.Virol 76292-302(2002)；Excler和Plotkin，AIDS 11(增刊A)S127-137(1997))。已構(gòu)建了表達(dá)分泌型CON6 gp120和gp140的rVV，而且也已誘導(dǎo)了中和HIV-1原代分離物的的抗體。HIV中和抗體免疫原可以是Con-S gp140 CFI或其亞基與中和大多數(shù)亞型B分離物的免疫原的組合。
當(dāng)評價蛋白的免疫原性時，寡聚gp140蛋白的結(jié)構(gòu)是非常重要的。在這一方面，對用快速液相色譜(FPLC)和分析超速離心所純化的CON6gp140CF蛋白進(jìn)行的研究表明，所純化的gp140主要包含帶有二聚體小組分的三聚體。
因此，中心化包膜例如本文所述的CON6、Con-S或2003M組或亞型共有或祖先編碼序列是用以制備各種不同有效“增強(qiáng)的”包膜免疫原的吸引人的候選者，所述免疫原包括CD4-Env復(fù)合物、受限制性包膜結(jié)構(gòu)和三聚體寡聚形式。CON6誘導(dǎo)的T和B細(xì)胞應(yīng)答在SHIV攻擊模型中防止HIV-1感染和/或疾病的能力將在非人類的靈長類動物中進(jìn)行研究。
上述研究已經(jīng)證明，人工的中心化HIV-1基因例如M組共有env基因(CON6)和Con-S也可以誘導(dǎo)針對野生型亞型B和C Env蛋白中和對M組共有Env蛋白上的T細(xì)胞表位的T細(xì)胞應(yīng)答(圖5)。而采用CON6gp140CF免疫原所進(jìn)行的DNA初次免疫和rVV加強(qiáng)免疫策略明顯地誘導(dǎo)了產(chǎn)生IFN-γ的T細(xì)胞，該T細(xì)胞識別亞型B和C表位，為了測定中心化序列例如在CON6包膜中發(fā)現(xiàn)的序列在誘導(dǎo)交叉分化體T細(xì)胞應(yīng)答方面是否明顯優(yōu)于野生型HIV-1基因，還需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究(Ferrari等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 941396-1401(1997)；Ferrari等，AIDS Res.Hum.Retroviruses 161433-1443(2000))。然而，CON6(和Con-S env編碼序列)初次免疫(prime)和加強(qiáng)免疫的脾細(xì)胞T細(xì)胞識別HIV-1亞型B和CT細(xì)胞表位這一事實是證明CON6(和Con-S)能夠誘導(dǎo)可能在臨床上有用的T細(xì)胞應(yīng)答中的重要步驟。
已經(jīng)提出了三種計算機(jī)模型(共有、祖先和樹的中心(COT))來產(chǎn)生中心化的HIV-1基因(Gaschen等，Science 2962354-2360(2002)；Gao等，Science 2991517-1518(2003)，Nickle等，Science 2991515-1517(2003)；Korber等，Science 2881789-1796(2000))。對于亞型之內(nèi)或之間的大多數(shù)HIV-1序列，所述中心化的HIV-1基因全部傾向位于在星狀種系發(fā)生樹的根部。作為實驗性疫苗，它們都可以縮短免疫原和野毒株之間的遺傳距離。然而，共有、祖先和COT序列各自具有優(yōu)點和缺點(Gaschen等，Science 2962354-2360(2002)；Gao等，Science 2991517-1518(2003)；Nickle等，Science 2991515-1517(2003))。共有和COT代表作為抽樣的當(dāng)前野生型病毒中的序列或者表位，并且?guī)缀醪皇艿綗o關(guān)HIV-1序列的影響，而祖先則代表可受無關(guān)序列顯著影響的祖先序列。然而，目前不知道哪一個中心化序列可以用作最好的免疫原來引發(fā)抗不同HIV-1株的廣泛免疫應(yīng)答，而且測試這些不同策略的研究還在進(jìn)行中。
總之，所述數(shù)據(jù)已經(jīng)顯示，HIV-1人工CON6和Con-S包膜可以誘導(dǎo)針對野生型HIV-1表位的T細(xì)胞應(yīng)答，并且可以誘導(dǎo)可中和HIV-1原代分離物的抗體，因而證明在HIV-1疫苗設(shè)計中使用人工的中心化HIV-1序列的可行性和希望。
實施例2HIV-1亞型C祖先和共有包膜糖蛋白實驗細(xì)節(jié)HIV-1亞型C祖先和共有env基因從Los Alamos HIV MolecularImmunology數(shù)據(jù)庫(http://hiv-web.lanl.gov/immunology)獲得，對其進(jìn)行密碼子選擇優(yōu)化以用于哺乳動物細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)并進(jìn)行合成(圖6)。為了確保最佳的表達(dá)，在緊接于起始密碼子上游插入Kozak序列(GCCGCCGCC)。除了全長基因之外，通過在緊接于gp41跨膜結(jié)構(gòu)域(IVNR)和gp120/gp41切割位點(REKR)之后導(dǎo)入終止密碼子，產(chǎn)生了兩個截斷的env基因，分別產(chǎn)生了gp140和gp120形式的糖蛋白(圖8)。
在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中對基因的完整性進(jìn)行測試，并在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。為了測定祖先和共有亞型C包膜是否能夠介導(dǎo)融合和進(jìn)入，將gp160和gp140基因與HIV-1/SG3Δenv原病毒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，并使用JC53-BL細(xì)胞測定法對所得的假病毒體的感染性進(jìn)行測試(圖7)。還使用稍有改變的JC53-BL測定法對共受體使用和包膜中和敏感性進(jìn)行測定。將密碼子選擇優(yōu)化的和rev依賴性的96ZAM651 env基因用作當(dāng)代的亞型C對照。
結(jié)果密碼子優(yōu)化的亞型C祖先和共有包膜基因(gp160、gp140、gp120)在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)高水平的env糖蛋白(圖9)。
密碼子優(yōu)化的亞型C gp160和gp140糖蛋白被有效地整合到病毒粒子中。經(jīng)蔗糖純化的假病毒體的Western印跡分析顯示，密碼子優(yōu)化的包膜的病毒體整合水平比rev依賴性的當(dāng)代包膜對照的病毒體整合水平高10倍(圖10A)。
用亞型C共有g(shù)p160或gp140包膜進(jìn)行假型化的病毒體比包含相應(yīng)gp160和gp140祖先包膜的假病毒體更具有感染性。另外，gp160包膜也一致地比它們的各自gp140對應(yīng)體更具有感染性(圖10B)。
亞型C祖先和共有包膜均利用CCR5作為共受體來介導(dǎo)病毒的進(jìn)入(圖11)。
包含亞型C祖先和共有g(shù)p160的假病毒體的感染性被來自亞型C感染患者的血漿所中和。這表明這些人工包膜具有類似于天然HIV-1 env糖蛋白的結(jié)構(gòu)，而且保留了共同的中和表位。注意到亞型C祖先和共有env糖蛋白(gp160)之間的中和潛力沒有顯著的差異(圖12)。
結(jié)論HIV-1亞型C病毒屬于最普遍的流行分離物，占全世界新感染的約50％。全球流行的HIV-1株中的遺傳多樣性為疫苗設(shè)計帶來了挑戰(zhàn)。雖然HIV-1 Env蛋白高度可變，但是它在受感染宿主中可以誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫反應(yīng)。通過分析70個HIV-1完整亞型C env序列，產(chǎn)生了共有和祖先亞型C env基因。兩者的序列與當(dāng)代的亞型C株大致等距，因此期望誘導(dǎo)較好的交叉保護(hù)性免疫。獲自重新構(gòu)建的祖先或共有序列的免疫原使候選疫苗與當(dāng)代分離物之間的遺傳差異最小化。然而，共有和祖先亞型C env基因具有5％的氨基酸序列差異。已合成了用于分析的共有和祖先序列。已構(gòu)建了密碼子優(yōu)化的亞型C祖先和共有包膜基因，而且已測定了所表達(dá)的糖蛋白的體外生物學(xué)性質(zhì)。合成的亞型C共有和祖先env基因表達(dá)具有與當(dāng)代的亞型C野生型包膜糖蛋白類似的結(jié)構(gòu)、功能和抗原性的糖蛋白。
實施例3亞型C gag和nef基因的共有序列(C.con.gag和C.con.nef)的密碼子選擇優(yōu)化M組病毒的所有亞型之中的亞型C病毒已經(jīng)變成全球最普遍的病毒。超過50％的HIV-1感染者目前正攜帶著HIV-1亞型C病毒。此外，有相當(dāng)大的亞型C內(nèi)變異性不同亞型C病毒的Gag、Pol、Env和Nef蛋白可以分別具有多達(dá)10％、6％、17％和16％的差異。最重要的是，來自一個國家的亞型C病毒間的差異可以象世界的其他地方所分離的病毒那樣大。唯一例外的是來自的印度/中國、巴西和埃塞俄比亞/吉布提的HIV-1株，其中亞型C似乎是更新近引入的。甚至在一個國家中，由于亞型C病毒的高遺傳變異性，基于單個病毒分離物的免疫原可能不引發(fā)抗在同一地區(qū)流行的其它分離物的保護(hù)性免疫。
于是，收集亞型C病毒的gag和nef基因序列，以通過使用50％共有閾值來產(chǎn)生兩個基因的共有序列。為了避免潛在的對起始病毒的偏好，分別只使用一個來自印度/中國、巴西和埃塞俄比亞/吉布提的序列來產(chǎn)生亞型C共有序列(C.con.gag和C.con.nef)?；诟叨缺磉_(dá)人類基因的密碼子選擇對C.con.gag和C.con.nef基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化。轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中之后的蛋白表達(dá)顯示在圖13中。如所見到的，共有亞型C Gag和Nef蛋白得到有效的表達(dá)并被Gag特異性抗體和Nef特異性抗體所識別。C.con.gag和C.con.nef基因的蛋白表達(dá)水平與天然亞型env基因(96ZM651)的蛋白表達(dá)水平相當(dāng)。
實施例4全長的“帶有共有可變區(qū)的共有序列的共有env基因”(Con-S)的合成在合成的“共有序列的共有(consensus of the consensus)”env基因(CON6)中，用來自當(dāng)代的亞型C病毒(98CN006)的相應(yīng)區(qū)域來代替可變區(qū)。另外的con/con基因也已設(shè)計成具有共有可變區(qū)(CON-s)?；诟叨缺磉_(dá)人類基因的密碼子使用對Con-S env基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化。(分別見圖14A和14B中的氨基酸序列和核酸序列)。
設(shè)計配對的寡聚核苷酸(80個核苷酸)，該核苷酸在它們的3′端重疊20bp，在它們的5′和3′端包含不變序列，所述不變序列分別包括限制酶位點EcoRI和BbsI以及BsmBI和BamHI。BbsI和BamHI是在它們的識別序列的外部進(jìn)行切割的II型限制酶。已將它們以以下方式定位在寡聚體中它們切除與18bp不變區(qū)域鄰近的前4個殘基，在各片段的末端留下4個堿基的5′突出部分，以用于隨后連接步驟。采用PCR和與18bp不變序列互補(bǔ)的引物單獨對26條配對的寡聚體進(jìn)行連接。使用T/A克隆方法將各對克隆到pGEM-T(Promega)中并進(jìn)行測序以確定不存在疏忽所造成的突變/缺失。然后對包含正確插入片段的pGEM-T亞克隆進(jìn)行消化，在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，并進(jìn)行凝膠(Qiagen)純化。在多片段連接反應(yīng)中將4個108個核苷酸(mer)的單獨片段連接到pcDNA3.1(Invitrogen)中。以分步方式從基因的5′到3′末端在片段組中進(jìn)行四步連接。重復(fù)這一過程直到完整基因被重新構(gòu)建到pcDNA 3.1載體中。
通過將密碼子選擇優(yōu)化的寡聚對連接在一起而構(gòu)建完整的Con-S基因。為了確定該基因的開放閱讀框，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和翻譯測定。在翻譯步驟中用S35-甲硫氨酸對蛋白產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記。在10％SDS-PAGE上分離，并采用放射自顯影法進(jìn)行檢測。在7個克隆中鑒定到4個具有預(yù)期大小的經(jīng)表達(dá)的Con-S gp160(圖14C)。
在轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中之后，使用Western印跡測定CONs Env蛋白在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)(圖15)。Con-S Env蛋白的表達(dá)水平與早先在CON6 env克隆中所觀察的非常相似，所述CON6 env克隆包含來自98CN006病毒分離物的共有保守區(qū)和可變環(huán)。
通過將Con-S env克隆和env缺失性SG3原病毒克隆共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中而制備假病毒體。在轉(zhuǎn)染后兩天，收獲假病毒體，并感染到JC53BL-13細(xì)胞中。在三個獨立實驗中，用X-gal染色后通過藍(lán)細(xì)胞計數(shù)而對感染單位(IU)進(jìn)行測定。當(dāng)與CON6 env克隆比較時，Con-S env克隆在JC53BL-13細(xì)胞中生產(chǎn)相似的IU數(shù)(圖16)。兩者的IU滴度比SG3骨架克隆對照(沒有Env)高大約3個對數(shù)。然而，所述滴度也比陽性對照(天然HIV-1 env基因，NL4-3或YU2)低大約2個對數(shù)。這些數(shù)據(jù)表明，兩個共有M組env克隆均具有生物學(xué)功能。然而，它們的功能性已經(jīng)受到影響。功能性共有env基因表明這些Env蛋白正確地折疊，保留了天然Env蛋白的基本構(gòu)象，并能夠被開發(fā)為通用的Env免疫原。
接著測定Con-S Env使用什么共受體來使其進(jìn)入JC53-BL細(xì)胞中。當(dāng)用CXCR4阻斷劑AMD3100處理時，NL4-3 Env-假病毒體的感染性受到阻斷，而YU2、Con-S或CON6 Env-假病毒體的感染性則沒有受到抑制。相反地，當(dāng)用CCR5阻斷劑TAK779處理時，NL4-3 Env-假病毒體的感染性沒有受到影響，而YU2、Con-S或CON6 Env-假病毒體的感染性則受到抑制。當(dāng)用兩種阻斷劑處理時，所有假病毒體的感染性都受到抑制。總之，這些數(shù)據(jù)表明，Con-S和CON6包膜使用CCR5而不是CXCR4共受體來使其進(jìn)入靶細(xì)胞中。
接著測定CON6或Con-S Env蛋白是否可能同等有效地整合到假病毒體中。為了能夠精確地比較有多少Env蛋白被整合到假病毒體中，各假病毒體以相同的濃度上樣到SDS-PAGE上對于細(xì)胞裂解物，上樣5μg總蛋白；對于細(xì)胞培養(yǎng)物懸液，上樣25ng p24；對于純化的病毒貯存物(超速離心沉淀后濃縮的假病毒體)，上樣150ng的p24。整合到CON6或Con-S Env-假病毒體內(nèi)的任何制備物(細(xì)胞裂解物、細(xì)胞培養(yǎng)物懸液或純化的病毒貯存物)中的Env蛋白的量沒有差異(圖17)。
實施例5共有亞型A全長env(A.con.env)基因的合成亞型A病毒在非洲大陸中是第二大普遍的HIV-1，已記載超過70％的HIV-1感染為亞型A病毒感染。亞型C病毒是非洲和世界范圍內(nèi)最普遍的病毒，該病毒的共有g(shù)ag、env和nef基因先前已經(jīng)產(chǎn)生。由于亞型A和C病毒在env基因之間的遺傳距離高達(dá)30％，兩亞型間的交叉反應(yīng)性或防護(hù)并不是最佳的。所有亞型的兩個M組共有env基因也已產(chǎn)生。然而，為靶向任何特定的亞型病毒，亞型特異性共有基因會更有效，這是因為亞型共有基因和來自相同亞型的野毒之間的遺傳距離會比M組共有基因和所述相同病毒之間的遺傳距離小。因此，為了開發(fā)亞型A特異性免疫原需要產(chǎn)生共有基因?；诟叨缺磉_(dá)人類基因的密碼子選擇來對A.con.env基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化(分別見圖18A和18B中的氨基酸和核酸序列)。
各對寡聚體已經(jīng)得到擴(kuò)增、克隆、連接和測序。在通過體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)確認(rèn)A.con.env基因的開放閱讀框之后，將A.con.env基因轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，并通過Western印跡測定而對蛋白表達(dá)和特異性加以確認(rèn)(圖18)。然后確定A.con.包膜是否具有生物學(xué)功能。將A.con.env包膜與env缺陷性SG3原病毒克隆共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。收獲假型病毒，并將其用來感染JC53BL細(xì)胞。檢測出被A.con.env-假病毒體感染的JC53-BL細(xì)胞中的藍(lán)細(xì)胞，表明A.con.Env蛋白具有生物學(xué)功能(表6)。然而，A.con.Env-假病毒體的感染滴度比具有野生型亞型C包膜的假病毒體的感染滴度大約低7倍(表6)?？傊?，具有生物學(xué)功能的A.con.Env蛋白表明其正確地折疊，并且如果用作Env免疫原，其可誘導(dǎo)線性的和構(gòu)象的T和B細(xì)胞表位。
表6帶有A.con.env基因的假病毒體的感染性JC53BL13(IU/μl)

實施例6全長“共有序列的共有g(shù)ag、pol和nef基因”(M.con.gag、M.con.pol和M.con.nef)和亞型C共有pol基因(C.con.pol)的設(shè)計對于M組共有基因，構(gòu)建兩個不同的env基因，一個帶有病毒特異性可變區(qū)(CON6)和另一個帶有共有可變區(qū)(Con-S)。然而，對經(jīng)免疫或接種的動物和人類中的T細(xì)胞免疫應(yīng)答進(jìn)行分析表明，雖然env基因是誘導(dǎo)中和抗體的唯一基因，但是它通常不是T細(xì)胞免疫應(yīng)答的主要靶。相反地，發(fā)現(xiàn)HIV-1 Gag、Pol和Nef蛋白對于誘導(dǎo)有效的T細(xì)胞免疫應(yīng)答是重要的。為了產(chǎn)生可誘導(dǎo)更為廣泛的針對所有亞型的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答的免疫原的所有組成部分，需要構(gòu)建除了單獨的env基因之外的其它M組共有基因。已設(shè)計了“共有序列的共有”gag、pol和nef基因(M.con.gag、M.con.pol和M.con.nef)。為了產(chǎn)生亞型共有pol基因，還設(shè)計了亞型C共有pol基因(C.con.pol)?；诟叨缺磉_(dá)人類基因的密碼子選擇，對M.con.gag、M.con.pol、M.con.nef和C.con.pol基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化(見圖19中的核酸和氨基酸序列)。
實施例7合成的亞型B共有g(shù)ag和env基因?qū)嶒灱?xì)節(jié)亞型B共有g(shù)ag和env序列分別來自于37和137個當(dāng)代HIV-1株，進(jìn)行密碼子優(yōu)化以用于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)，并進(jìn)行合成(圖20A和20B)。為了確保最佳的表達(dá)，在緊接于起始密碼子的上游插入Kozak序列(GCCGCCGCC)。除了全長的env基因外，還通過在緊接于gp41跨膜結(jié)構(gòu)域(IVNR)之后導(dǎo)入終止密碼子來產(chǎn)生截斷的env基因，以形成gp145基因。在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中測試基因的完整性，在哺乳動物的細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。(亞型B共有Gag和Env序列分別顯示在20C和20D中)。
為了確定亞型B共有包膜是否能夠介導(dǎo)融合和進(jìn)入，將gp160和gp145基因與HIV-1/SG3Δenv原病毒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，并用JC53-BL細(xì)胞測定法對所得的假病毒體的感染性進(jìn)行測試。JC53-BL細(xì)胞是表達(dá)高水平CD4和HIV-1共受體CCR5和CXCR4的海拉細(xì)胞的衍生細(xì)胞。它們還包含各自由HIV-1 LTR表達(dá)的熒光素酶和β-半乳糖苷酶的報道盒子。報道基因的表達(dá)依賴于HIV-1 Tat的產(chǎn)生。簡而言之，將細(xì)胞接種到24孔平板上，在37℃培養(yǎng)24小時，并在37℃用DEAE-葡聚糖處理30分鐘。將病毒系列稀釋在1％DMEM中，加到在DEAE-葡聚糖中孵育的細(xì)胞中，并在37℃孵育3小時，此后，將另外的500μL的細(xì)胞培養(yǎng)基加到各孔中。然后在37℃最終孵育48小時之后，將細(xì)胞固定，使用X-Gal染色，并用PBS覆蓋以對藍(lán)斑進(jìn)行顯微計數(shù)。從樣本孔中的計數(shù)中減去用來測定背景的模擬感染孔中的計數(shù)。還用稍有改變的JC53-BL測定法對共受體使用和包膜中和敏感性進(jìn)行測定。
為了測定亞型B共有Gag蛋白是否能夠產(chǎn)生整合Env糖蛋白的病毒樣粒子(VLP)，用亞型B共有g(shù)ag和env基因?qū)?93T細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48小時，收集包含VLP的細(xì)胞的上清液，用臺式離心機(jī)使其澄清，通過0.2mM過濾器過濾，并通過20％蔗糖墊層進(jìn)行沉淀。將VLP沉淀重新懸浮在PBS中，并轉(zhuǎn)移到20％～60％連續(xù)蔗糖梯度上。然后在100,000×g離心過夜，收集0.5ml組分并測定其p24的含量。還測定了每個組分的折射率。合并具有正確VLP密度并包含最高水平的p24的組分，將其進(jìn)行最后沉淀。將包含VLP的沉淀重新懸浮在PBS中，并上樣到4％～20％SDS-PAGE凝膠上。將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上并用來自亞型B HIV-1感染個體的血清進(jìn)行檢測。
結(jié)果經(jīng)密碼子選擇優(yōu)化的、亞型B共有包膜(gp160、gp145)和gag基因在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)高水平的糖蛋白(圖21)。
亞型B gp160和gp145糖蛋白有效地整合到病毒粒子中。對蔗糖純化的假病毒體進(jìn)行的Western印跡分析表明，共有B包膜的整合水平比rev依賴性的當(dāng)代包膜的整合水平至少高5倍(圖23A)。用亞型B共有g(shù)p160或gp145包膜假型化的病毒體比含有rev依賴性的當(dāng)代包膜的假病毒體更具有感染性(圖23B)。
亞型B共有包膜利用CCR5作為共受體來進(jìn)入攜帶有CD4的靶細(xì)胞(圖22)。
包含亞型B共有g(shù)p160包膜的假病毒體的感染性被來自HIV-1亞型B的感染患者的血漿(圖24C)及中和性單克隆抗體(圖24A)中和。這表明亞型B的合成的共有B包膜的總體結(jié)構(gòu)與天然HIV-1 Env糖蛋白類似，而且共同的中和表位保持完整。圖24B和24D顯示亞型B對照包膜(NL4.3 Env)的中和概況。
亞型B共有Gag蛋白能夠從細(xì)胞膜出芽并形成病毒樣粒子(圖25A)。密碼子優(yōu)化的亞型B共有g(shù)ag和gp160基因的共轉(zhuǎn)染產(chǎn)生帶有整合的包膜的VLP(圖25B)。
結(jié)論合成的亞型B共有env和gag基因表達(dá)與當(dāng)代亞型B Env和Gag蛋白在結(jié)構(gòu)、功能和抗原性方面類似的病毒蛋白?？紤]到基于亞型B共有基因的免疫原會誘發(fā)CTL(細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞)和中和免疫應(yīng)答，所述CTL(細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞)和中和免疫應(yīng)答對廣泛系列的HIV-1分離物具有防護(hù)作用。
***在此通過參考的方式引入以上引用的所有文件和其它信息來源。還通過參考的方式引入Liao等的J.Virol.785270(2004)。
權(quán)利要求
1.含有圖1A所示的氨基酸序列的分離的蛋白。
2.包含編碼CON6HIV gp160蛋白的核苷酸序列的核酸，其中，所述的核苷酸序列包含為了在人類細(xì)胞中表達(dá)而進(jìn)行了優(yōu)化的密碼子。
3.如權(quán)利要求2所述的核酸，其中，所述的核酸包含圖1D所示的核苷酸序列。
4.包含編碼亞型C祖先HIV包膜蛋白的核苷酸序列的核酸，其中，所述的核苷酸序列包含為了在人類細(xì)胞中表達(dá)而進(jìn)行了優(yōu)化的密碼子。
5.如權(quán)利要求4所述的核酸，其中，所述的核酸包含圖6A所示的核苷酸序列。
6.包含編碼亞型C共有HIV包膜蛋白的核苷酸序列的核酸，其中，所述的核苷酸序列包含為了在人類細(xì)胞中表達(dá)而進(jìn)行了優(yōu)化的密碼子。
7.如權(quán)利要求6所述的核酸，其中，所述的核酸包含圖6B所示的核苷酸序列。
8.包含圖6C或6D所示的氨基酸序列的分離的蛋白。
9.包含編碼亞型C共有HIV gag蛋白的核苷酸序列的核酸，其中，所述的核苷酸序列包含為了在人類細(xì)胞中表達(dá)而進(jìn)行了優(yōu)化的密碼子。
10.如權(quán)利要求9所述的核酸，其中，所述的核酸包含圖13E所示的核苷酸序列。
11.包含編碼亞型C共有HIV nef蛋白的核苷酸序列的核酸，其中，所述的核苷酸序列包含為了在人類細(xì)胞中表達(dá)而進(jìn)行了優(yōu)化的密碼子。
12.如權(quán)利要求11所述的核酸，其中，所述的核酸包含圖13F所示的核苷酸序列。
13.包含編碼M組共有HIV包膜蛋白的核苷酸序列的核酸，其中，所述的核苷酸序列包含為了在人類細(xì)胞中表達(dá)而進(jìn)行了優(yōu)化的密碼子。
14.如權(quán)利要求13所述的核酸，其中，所述的核酸包含圖14B所示的核苷酸序列。
15.包含編碼亞型A共有HIV包膜蛋白的核苷酸序列的核酸，其中，所述的核苷酸序列包含為了在人類細(xì)胞中表達(dá)而進(jìn)行了優(yōu)化的密碼子。
16.如權(quán)利要求15所述的核酸，其中，所述的核酸包含圖18B所示的核苷酸序列。
17.包含編碼M組共有HIV gag蛋白的核苷酸序列的核酸，其中，所述的核苷酸序列包含為了在人類細(xì)胞中表達(dá)而進(jìn)行了優(yōu)化的密碼子。
18.如權(quán)利要求17所述的核酸，其中，所述的核酸包含圖19A所示的核苷酸序列。
19.包含編碼M組共有HIV pol蛋白的核苷酸序列的核酸，其中，所述的核苷酸序列包含為了在人類細(xì)胞中表達(dá)而進(jìn)行了優(yōu)化的密碼子。
20.如權(quán)利要求19所述的核酸，其中，所述的核酸包含圖19B所示的核苷酸序列。
21.包含編碼M組共有HIV nef蛋白的核苷酸序列的核酸，其中，所述的核苷酸序列包含為了在人類細(xì)胞中表達(dá)而進(jìn)行了優(yōu)化的密碼子。
22.如權(quán)利要求21所述的核酸，其中，所述的核酸包含圖19C所示的核苷酸序列。
23.包含編碼亞型C共有HIV pol蛋白的核苷酸序列的核酸，其中，所述的核苷酸序列包含為了在人類細(xì)胞中表達(dá)而進(jìn)行了優(yōu)化的密碼子。
24.如權(quán)利要求23所述的核酸，其中，所述的核酸包含圖19D所示的核苷酸序列。
25.包含編碼亞型B共有HIV gag蛋白的核苷酸序列的核酸，其中，所述的核苷酸序列包含為了在人類細(xì)胞中表達(dá)而進(jìn)行了優(yōu)化的密碼子。
26.如權(quán)利要求25所述的核酸，其中，所述的核酸包含圖20A所示的核苷酸序列。
27.包含編碼亞型B共有HIV包膜蛋白的核苷酸序列的核酸，其中，所述的核苷酸序列包含為了在人類細(xì)胞中表達(dá)而進(jìn)行了優(yōu)化的密碼子。
28.如權(quán)利要求27所述的核酸，其中，所述的核酸包含圖20B所示的核苷酸序列。
29.包含圖20C或20D所示的氨基酸序列的分離的蛋白。
30.包含圖26A所示的氨基酸序列的分離的蛋白。
31.包含編碼權(quán)利要求30所述蛋白的核苷酸序列的核酸。
32.如權(quán)利要求31所述的核酸，其中，所述的核酸包含圖26B所示的核苷酸序列。
33.包含圖28B所示的氨基酸序列的分離的蛋白。
34.包含編碼權(quán)利要求33所述蛋白的核苷酸序列的核酸。
35.如權(quán)利要求34所述的核酸序列，其中，所述的核酸包含圖28C所示的核苷酸序列。
36.包含圖29B所示的氨基酸序列的分離的蛋白。
37.包含編碼權(quán)利要求36所述蛋白的核苷酸序列的核酸。
38.如權(quán)利要求37所述的核酸序列，其中，所述的核酸包含圖29C所示的核苷酸序列。
39.包含圖30B所示的氨基酸序列的分離的蛋白。
40.包含編碼權(quán)利要求39所述蛋白的核苷酸序列的核酸。
41.如權(quán)利要求40所述的核酸序列，其中，所述的核酸包含圖30C所示的核苷酸序列。
42.包含圖31B所示的氨基酸序列的分離的蛋白。
43.包含編碼權(quán)利要求42所述蛋白的核苷酸序列的核酸。
44.如權(quán)利要求43所述的核酸序列，其中，所述的核酸包含圖31C所示的核苷酸序列。
45.包含圖32B所示的氨基酸序列的分離的蛋白。
46.包含編碼權(quán)利要求45所述蛋白的核苷酸序列的核酸。
47.如權(quán)利要求46所述的核酸序列，其中，所述的核酸包含圖32C所示的核苷酸序列。
48.包含圖33B所示的氨基酸序列的分離的蛋白。
49.包含編碼權(quán)利要求48所述蛋白的核苷酸序列的核酸。
50.如權(quán)利要求49所述的核酸序列，其中，所述的核酸包含圖33C所示的核苷酸序列。
51.包含圖34B所示的氨基酸序列的分離的蛋白。
52.包含編碼權(quán)利要求51所述蛋白的核苷酸序列的核酸。
53.如權(quán)利要求52所述的核酸序列，其中，所述的核酸包含圖34C所示的核苷酸序列。
54.包含圖35B所示的氨基酸序列的分離的蛋白。
55.包含編碼權(quán)利要求54所述蛋白的核苷酸序列的核酸。
56.如權(quán)利要求55所述的核酸序列，其中，所述的核酸包含圖35C所示的核苷酸序列。
57.包含圖36B所示的氨基酸序列的分離的蛋白。
58.包含編碼權(quán)利要求57所述蛋白的核苷酸序列的核酸。
59.如權(quán)利要求58所述的核酸序列，其中，所述的核酸包含圖36C所示的核苷酸序列。
60.包含圖37B所示的氨基酸序列的分離的蛋白。
61.包含編碼權(quán)利要求60所述蛋白的核苷酸序列的核酸。
62.如權(quán)利要求61所述的核酸序列，其中，所述的核酸包含圖37C所示的核苷酸序列。
63.包含圖38B所示的氨基酸序列的分離的蛋白。
64.包含編碼權(quán)利要求63所述蛋白的核苷酸序列的核酸。
65.如權(quán)利要求64所述的核酸序列，其中，所述的核酸包含圖38C所示的核苷酸序列。
66.包含圖39A～圖127A中任一圖所示的CF或CFI形式的氨基酸序列的分離的蛋白。
67.包含圖39B所示的核苷酸序列的核酸。
68.包含圖40B所示的核苷酸序列的核酸。
69.包含圖41B所示的核苷酸序列的核酸。
70.包含圖42B所示的核苷酸序列的核酸。
71.包含圖43B所示的核苷酸序列的核酸。
72.包含圖44B所示的核苷酸序列的核酸。
73.包含圖45B所示的核苷酸序列的核酸。
74.包含圖46B所示的核苷酸序列的核酸。
75.包含圖47B所示的核苷酸序列的核酸。
76.包含圖48B所示的核苷酸序列的核酸。
77.包含圖49B所示的核苷酸序列的核酸。
78.包含圖50B所示的核苷酸序列的核酸。
79.包含圖51B所示的核苷酸序列的核酸。
80.包含圖52B所示的核苷酸序列的核酸。
81.包含圖53B所示的核苷酸序列的核酸。
82.包含圖54B所示的核苷酸序列的核酸。
83.包含圖55B所示的核苷酸序列的核酸。
84.包含圖56B所示的核苷酸序列的核酸。
85.包含圖57B所示的核苷酸序列的核酸。
86.包含圖58B所示的核苷酸序列的核酸。
87.包含圖59B所示的核苷酸序列的核酸。
88.包含圖60B所示的核苷酸序列的核酸。
89.包含圖61B所示的核苷酸序列的核酸。
90.包含圖62B所示的核苷酸序列的核酸。
91.包含圖63B～圖84B、圖65D、圖67D和圖68D中任一圖所示的核苷酸序列的核酸。
92.包含圖85B～圖106B、圖88D、圖90D和圖92D中任一圖所示的核苷酸序列的核酸。
93.包含圖107B～圖127B、圖109D、圖111D和圖112D中任一圖所示的核苷酸序列的核酸。
94.包含權(quán)利要求2～7、9～28、31、32、34、35、37、38、40、41、43、44、46、47、49、50、52、53、55、56、58、59、61、62、64、65和67～93任一項所述的核酸的載體。
95.包含至少一個如權(quán)利要求1～93任一項所述的蛋白或核酸以及載體的組合物。
96.在哺乳動物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括對所述哺乳動物施用至少一個如權(quán)利要求1～93任一項所述的蛋白和/或核酸，該蛋白和/或核酸的施用量足以實現(xiàn)所述誘導(dǎo)。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及免疫原，特別是涉及用于誘導(dǎo)可中和多種多樣HIV原代分離物的抗體的免疫原和/或涉及誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的免疫原。本發(fā)明還涉及使用所述免疫原來誘導(dǎo)抗HIV抗體的方法和/或誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼所述免疫原的核酸序列。
文檔編號C12NGK1852734SQ200480026658
公開日2006年10月25日 申請日期2004年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月17日
發(fā)明者貝特·T·科貝爾, 比阿特麗斯·H·哈恩, 喬治·M·肖, 丹尼斯·科特, 李盈盈, 朱莉·德克爾, 巴頓·F·海恩斯, 高峰, 廖化新 申請人:杜克大學(xué), 阿拉巴馬州立大學(xué)伯明翰研究基金會, 加利福尼亞大學(xué)董事會