專利名稱：香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)啟動(dòng)子及其植物表達(dá)載體的制作方法
專利說(shuō)明
香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)啟動(dòng)子及其植物表達(dá)載體 本發(fā)明涉及香蕉Banlec基因啟動(dòng)子序列的獲得和植物表達(dá)載體的構(gòu)建。香蕉(Musa spp.)屬芭蕉科(Musaceae)芭蕉屬(Musa)。所有的食用香蕉即為芭蕉屬的栽培種，是重要的熱帶、亞熱帶水果。香蕉肉質(zhì)甜糯，芳香味美，且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。除鮮食、煮食外，還可加工成各種各樣營(yíng)養(yǎng)豐富的產(chǎn)品。香蕉是利用轉(zhuǎn)基因方法生產(chǎn)重組藥用蛋白和肽，或者是有價(jià)值的化合物的理想植物，其作為生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)主要有以下幾個(gè)方面1、它的生長(zhǎng)期短，十至十二個(gè)月就可收獲；2、香蕉是鮮食水果消耗量最大的水果，鮮食性可以保證水果中的基因表達(dá)的藥用蛋白不至于變性，是發(fā)展中國(guó)家兒童口服疫苗的理想載體(Richter L，Mason HS，Artzen CJ (1996).Transgenicplants created for oral immunization against diarrheal diseases.J Travel Med352-56.)。3、產(chǎn)業(yè)化程度高。目前香蕉的種植和生產(chǎn)已經(jīng)達(dá)到相當(dāng)規(guī)模，從組培種苗的生產(chǎn)、繁殖、到種植、果園管理、果實(shí)采后的加工處理和儲(chǔ)藏運(yùn)輸，形成了較為成熟的生產(chǎn)和營(yíng)銷體系，一但有了新的品種，將很快實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。正是基于這種目的，近年來(lái)有關(guān)香蕉采后成熟相關(guān)基因克隆和表達(dá)研究逐步深入，試圖尋找果實(shí)特異表達(dá)基因及其啟動(dòng)子，進(jìn)一步發(fā)展和完善香蕉作為生物反應(yīng)器的研究。
外源基因能夠在植物組織中實(shí)現(xiàn)正常乃至高效的表達(dá)，一個(gè)重要的條件是構(gòu)建一個(gè)能高水平表達(dá)異源蛋白質(zhì)的表達(dá)載體，而對(duì)一個(gè)高效表達(dá)的載體而言，啟動(dòng)子則是其最重要元件之一。因此，選擇合適的植物啟動(dòng)子和改進(jìn)其活性是增強(qiáng)外源基因表達(dá)首先要考慮的問(wèn)題。目前在植物表達(dá)載體中廣泛應(yīng)用的啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，例如，絕大多數(shù)雙子葉轉(zhuǎn)基因植物均使用CaMV35S啟動(dòng)子，單子葉轉(zhuǎn)基因植物主要使用來(lái)自玉米的Ubiquitin啟動(dòng)子和來(lái)自水稻的Actinl啟動(dòng)子。在這些組成型表達(dá)啟動(dòng)子的控制下，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的所有部位和所有的發(fā)育階段都會(huì)表達(dá)。然而，外源基因在受體植物內(nèi)持續(xù)、高效的表達(dá)不但造成浪費(fèi)，往往還會(huì)引起植物的形態(tài)發(fā)生改變，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。為了使外源基因在植物體內(nèi)有效發(fā)揮作用，同時(shí)又可減少對(duì)植物的不利影響，目前人們對(duì)特異表達(dá)啟動(dòng)子的研究和應(yīng)用越來(lái)越重視。已發(fā)現(xiàn)的特異性啟動(dòng)子主要包括器官特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子。例如，種子特異性啟動(dòng)子、果實(shí)特異性啟動(dòng)子、葉肉細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、根特異性啟動(dòng)子、損傷誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子、化學(xué)誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子、光誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子、熱激誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子等。這些特異性啟動(dòng)子的克隆和應(yīng)用為在植物中特異性地表達(dá)外源基因奠定了基礎(chǔ)。果實(shí)成熟特異性啟動(dòng)子的研究在番茄上進(jìn)展較大，番茄E8基因的啟動(dòng)子被證明是果實(shí)成熟啟動(dòng)子且對(duì)乙烯做出反應(yīng)，Penarrubia(Penarrubia L，Kim R，Giovannoni J，et al.Productionof the sweet protein monellin in transgenic plants.Bio/Technol.1992，10561-564)等用該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)移的指導(dǎo)甜蛋白基因在番茄果實(shí)成熟中表達(dá)，結(jié)果獲得較高的表達(dá)量，且甜蛋白受乙烯誘導(dǎo)而增加。番茄PG基因(BirdC R，Smith C J S，Ray J A et al.The tomato polygalacturonase gene andripening-specific expression in transgenic plants.Plant Mol.Biol.1998，11651-662)和2A11基因亦被證實(shí)為果實(shí)成熟特異表達(dá)，Chengappa等(Chengappa S，Guilleroux M，Phillips W，et al.Transgenic tomato plantswith decreased sucrose synthase are unaltered in starh and sugar accumulationin the fruit，Plant Mol.Biol.1990，40213-221)用2A11基因啟動(dòng)子在番茄果實(shí)中特異表達(dá)反義蔗糖合成酶基因，證實(shí)為果實(shí)特異表達(dá)。Atkinson(AtkinsonR G，Bolitho K M，Wright M，et al.Apple ACCoxidase and polygalacturonaseripening-specific gene expression and promoter analysis in transgenic tomato.Plant Mol.Biol.1995，28423-435)和Wang(Wang Z Y，MacRac E A，WrightM A，et al.polygalacturonase gene expression in Kiwifruitrelationship to fruitsoftening and ethylene production.Plant Mol.Biol.2000，42，317-328)分別研究了蘋果ACC合成酶、PG基因和獼猴桃PG基因的表達(dá)，它們均為果實(shí)特異表達(dá)，分離三個(gè)基因的啟動(dòng)子，分別與報(bào)告基因GUS構(gòu)建表達(dá)載體且轉(zhuǎn)化番茄，在轉(zhuǎn)基因番茄中GUS表達(dá)表明呈現(xiàn)果實(shí)成熟特異性。毛自朝等(果實(shí)專一性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)ipt基因在番茄中的表達(dá)及其對(duì)番茄果實(shí)發(fā)育的影響。毛自朝，于秋菊等。科學(xué)通報(bào)，2002，47(6)444-447)用番茄果實(shí)專一性啟動(dòng)子2A12驅(qū)動(dòng)ipt基因在番茄中表達(dá)，結(jié)果表明在果實(shí)中專一表達(dá)。香蕉的啟動(dòng)子研究獲得一些進(jìn)展，王新立等(香蕉果實(shí)成熟相關(guān)基因AC01啟動(dòng)子區(qū)的克隆及其功能初探.王新力，彭學(xué)賢*.生物工程學(xué)報(bào)，2001，17(4)428-431；香蕉果實(shí)特異性ACC合酶基因啟動(dòng)子區(qū)的克隆及其功能初探.王新力，彭學(xué)賢*.生物工程學(xué)報(bào)，2001，17(3)293-296.)2001年克隆了香蕉ACC合成酶和氧化酶基因的啟動(dòng)子，通過(guò)GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)研究證實(shí)為果實(shí)特異性，但未見(jiàn)更深入的研究報(bào)道。亦未見(jiàn)有果實(shí)特異啟動(dòng)子在香蕉轉(zhuǎn)基因中應(yīng)用的報(bào)道。因此，利用轉(zhuǎn)基因香蕉作為生物反應(yīng)器存在一個(gè)重要難題是需要使用組織特異性啟動(dòng)子，尤其是在果實(shí)中特異高效表達(dá)的啟動(dòng)子。
香蕉凝集素(Banana lectin，BanLec)是在成熟香蕉果實(shí)中的一種主要蛋白，我們采用競(jìng)爭(zhēng)性PCR的方法，對(duì)凝集素基因在香蕉不同器官中的表達(dá)進(jìn)行了定量研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明香蕉凝集素基因只在果肉中表達(dá)，而且隨著采后成熟過(guò)程而表現(xiàn)出發(fā)育特異性，在成熟度IV的果肉中，表達(dá)量最高，每微克總RNA中包含有68ngBanLec基因的轉(zhuǎn)錄本(香蕉成熟相關(guān)基因的克隆及表達(dá)的定量分析。張德有，碩士論文，2002；Jin Zhi-Qiang，Zhang De-You，XuBi-Yu.Cloning and Developmental and Tissue-Specific Expression of Banana(Musa AAA subgroup)Lectin Gene。Acta Genetica Sinica，May 2004，31(5)508-512)。根據(jù)前期的研究，BanLec基因的啟動(dòng)子很可能是果實(shí)特異高效表達(dá)啟動(dòng)子。為了解決香蕉作為生物反應(yīng)器的需要，同時(shí)亦為在香蕉果實(shí)特異表達(dá)氨基酸合成基因、抗衰老基因、藥用蛋白質(zhì)基因等有用基因)，培育具有較高商業(yè)價(jià)值及保健價(jià)值的香蕉新品種，本發(fā)明的目的是提供一個(gè)在香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)的啟動(dòng)子及其植物表達(dá)載體。
本發(fā)明的技術(shù)方案為一種香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)啟動(dòng)子，具有序列表中<400>項(xiàng)下的序列。
上述啟動(dòng)子是包括從香蕉總DNA克隆的香蕉BanLec基因啟動(dòng)子，經(jīng)測(cè)序其長(zhǎng)度為745bp，通過(guò)Promoter predictions等軟件進(jìn)行基礎(chǔ)啟動(dòng)子的分析，結(jié)果表明在89-138bp，221-270bp和499-548bp存在三處基礎(chǔ)啟動(dòng)子區(qū)。利用該啟動(dòng)子序列與植物表達(dá)載體PBI121構(gòu)建成一個(gè)含有BanLec基因啟動(dòng)子<p>對(duì)比實(shí)施例2在對(duì)比實(shí)施例2中，除了使用2-吡咯烷酮代替1，3-丁二醇之外，與對(duì)比實(shí)施例1同樣制備油墨。
對(duì)比實(shí)施例3在對(duì)比實(shí)施例3中，除了使用Nippon Kayaku Co.，Ltd生產(chǎn)的S-1代替C.I.直接藍(lán)199作為染色劑之外，與對(duì)比實(shí)施例1同樣制備油墨。
對(duì)于在實(shí)施例和對(duì)比實(shí)施例中制備的油墨，采用與根據(jù)JIS-K3362的測(cè)試方法相同的方法測(cè)量其發(fā)泡能力和泡沫穩(wěn)定性。測(cè)量在25℃的空氣中完成。
下表1中示出了各個(gè)實(shí)施例和對(duì)比實(shí)施例的發(fā)泡能力和泡沫穩(wěn)定性的測(cè)量結(jié)果。
表1
如在表1中示出的結(jié)果表明的，相對(duì)于對(duì)比實(shí)施例1～3的油墨來(lái)說(shuō)，實(shí)施例1～4的油墨具有較低的發(fā)泡能力，即50mm或更低，因此較難產(chǎn)生泡沫。
此后，使用一種方法對(duì)于各個(gè)實(shí)施例和對(duì)比實(shí)施例油墨的頻率響應(yīng)性進(jìn)行評(píng)價(jià)，使用的方法中采用帶有打印頭芯片的噴墨打印機(jī)，所述打印頭芯片包括單個(gè)面積為20×20微米2的加熱電阻和24個(gè)尺寸為20微米的噴嘴，該打印頭芯片由8.5V電壓驅(qū)動(dòng)并且從噴嘴噴射每個(gè)的體積為10pl的墨滴以打印字母字符和實(shí)施實(shí)心打印，即在Xerox Corp生產(chǎn)的PPC紙上用油墨填充<p>
2.果實(shí)特異表達(dá)載體PBIL2構(gòu)建根據(jù)已測(cè)序的BanLec基因啟動(dòng)子序列，在其兩端加上HindIII和BamH I酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)5’和3’端引物。通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增啟動(dòng)子目的片段，回收PCR產(chǎn)物，用HindIII和BamH I雙酶切該產(chǎn)物和植物表達(dá)載體pBl121，將酶切獲得的含有兩個(gè)酶切位點(diǎn)的啟動(dòng)子片段和pBl121載體大片段連接獲得含有凝聚素啟動(dòng)子表達(dá)載體pBIL2。(
圖1)。
二、BanLec基因啟動(dòng)子的功能鑒定
1.基因槍法對(duì)香蕉不同器官轉(zhuǎn)化pBIL2及GUS基因的組織化學(xué)染色定位將香蕉果實(shí)用1‰氯化汞溶液消毒10min，用滅菌蒸餾水沖洗數(shù)次再將其徒手切成薄片；縱剖香蕉組培苗的根并將葉切為1～2cm小塊。置上述材料于1/2MS培養(yǎng)基上，室溫放置3h.。參照王關(guān)林的方法以pBIL2、pBI121和H2O三種表達(dá)載體的DNA包被金粉制備微彈，按廠商提供的使用手冊(cè)用基因槍轟擊香蕉材料。轟擊后的香蕉材料于26℃暗培養(yǎng)。然后進(jìn)行組織化學(xué)染色(圖2、3、4)。
2.轉(zhuǎn)化材料的GUS酶活性檢測(cè)(1)GUS提取液的制備分別取基因槍轟擊后24h和36h的轉(zhuǎn)化材料，用無(wú)菌蒸餾水清洗樣品表面的培養(yǎng)基，多余的蒸餾水用無(wú)菌濾紙吸干；置液氮中研磨成粉。按質(zhì)量體積比加入3倍Gus提取緩沖液(配方50mmol/L磷酸鈉沖液，10mmol/LDTT，1mmol/L EDTA，0.1％十二烷基肌氨酸鈉，0.1％Triton X-100)研成勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)入1.5ml無(wú)菌離心管中，4℃，12,000rpm離心2min.轉(zhuǎn)移上清至1.5ml無(wú)菌離心管中。
(2)Gus提取液GUS含量測(cè)定1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備配制25μg/ml BSA母液稱取2.5mg BSA，加入0.5ml提取緩沖液，用H2O定容100ml，按表2制作BSA梯度液；從中吸取400μl加入100μl考馬斯亮藍(lán)G-250溶液(配方0.01％考馬斯亮藍(lán)，4.7％(W/V)乙醇，8.5％(W/V)磷酸)，混勻，室溫下放置2min，用光徑1cm的比色杯測(cè)定595nm的吸收值；吸收值對(duì)蛋白濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)。
表2 BSA梯度液濃度BSA母液(ml)H2O(ml) BSA濃度(μl/ml)0.25 4.75 1.250.54.52.51.04.05.01.53.57.52.03.010.02.52.512.55.00 25.0
2)分光光度計(jì)法測(cè)定GUS含量分別取Gus提取液20μl，加H2O至400μl，加入100μl考馬斯亮藍(lán)溶液，混勻，室溫放置2min，測(cè)定595nm的光吸收值；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品GUS含量。
3)GUS活性測(cè)定將Gus反應(yīng)緩沖液于37℃預(yù)熱，分別取Gus提取液100μl轉(zhuǎn)入1.5ml無(wú)菌離心管中，加入890μl新鮮的Gus反應(yīng)緩沖液和10μl 100mM PNPG(0.03g/PNPG溶于1ml水)貯存液，混勻。另取一1.5ml無(wú)菌離心管，加入990μl新鮮的Gus反應(yīng)緩沖液和10μl 100mM PNPG貯存液，混合均勻作為空白對(duì)照。反應(yīng)于37℃水浴中進(jìn)行，記錄反應(yīng)開(kāi)始時(shí)間。在反應(yīng)時(shí)間分別為15、30、60、90、120、150min時(shí)，將100ul反應(yīng)液轉(zhuǎn)入1.5ml無(wú)菌離心管中(預(yù)先裝有400ul 0.4M Na2CO3)，迅速混勻以終止反應(yīng)。將樣品置分光光度計(jì)中，用光徑1cm的比色杯測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間的樣品及標(biāo)品(1uM對(duì)硝基苯酚)415nm的光吸收值；以每毫克蛋白的GUS酶單位時(shí)間內(nèi)水解PNPG生成對(duì)硝基苯酚的量表示GUS表達(dá)活性。
4)pBI121與pBIL2載體GUS活性測(cè)得各轉(zhuǎn)化材料Gus提取液的A595，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白含量如下(表3)。
表3轉(zhuǎn)化24小時(shí)各器官Gus提取液中蛋白含量質(zhì)粒 葉 根果pBI121 2.5 2.5 3.125PBIL2 0.03 0.10 3.531根據(jù)表1可以看出，pBIL2轉(zhuǎn)化的果實(shí)中GUS蛋白明顯高于pBI121。pBI121轉(zhuǎn)化的各器官中GUS含量差別不大，而pBIL2轉(zhuǎn)化的各香蕉果實(shí)高出其他器官100-300倍。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明，BanLec基因啟動(dòng)子的活性很高，在香蕉果實(shí)中甚至高于目前常用的組成型強(qiáng)啟動(dòng)子35S，而且是果實(shí)特異性的。
5)轉(zhuǎn)化24小時(shí)后一定時(shí)間內(nèi)GUS酶活力變化與時(shí)間的對(duì)應(yīng)關(guān)系基因槍轉(zhuǎn)化后數(shù)十小時(shí)取相同重量的基因槍轟擊的果實(shí)薄片制備GUS提取液，酶反應(yīng)后測(cè)得415nm處兩種果實(shí)轉(zhuǎn)化材料Gus提取液不同反應(yīng)時(shí)間的光吸收值(表4)，按0.0170標(biāo)樣OD為1nmol產(chǎn)物/ml的標(biāo)準(zhǔn)將其換算成消光產(chǎn)物量后對(duì)時(shí)間作圖(圖6)。
表4Gus提取液不同反應(yīng)時(shí)間的光吸收值 Gus酶活力曲線圖表明，pBIL1質(zhì)粒轟擊的果片在15-90minGus活性高于pBI121質(zhì)粒轟擊的果片，120-150min兩個(gè)質(zhì)粒轟擊樣品的Gus活性基本一致。說(shuō)明BanLec基因啟動(dòng)子在果實(shí)中的啟動(dòng)活性高于35S啟動(dòng)子，而且持續(xù)的時(shí)間較長(zhǎng)，證明了BanLec基因啟動(dòng)子是一個(gè)果實(shí)特異性的高效啟動(dòng)子，本研究從BanLec基因啟動(dòng)子的分離、測(cè)序、植物表達(dá)載體的構(gòu)建、基因槍法轉(zhuǎn)化香蕉各組織(根、莖、葉)、GUS基因染色定位、GUS基因活性測(cè)定等作了系統(tǒng)研究，獲得了一個(gè)香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)啟動(dòng)子，以此啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化香蕉及番茄等果用型植物是可行的。此項(xiàng)技術(shù)補(bǔ)充了香蕉果實(shí)特異啟動(dòng)子的數(shù)量，通過(guò)查新在國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道。圖1為載體構(gòu)建圖。
圖2為pBI121質(zhì)粒GUS表達(dá)圖。
圖3為pBIL2質(zhì)粒GUS表達(dá)圖。
圖4為對(duì)照GUS表達(dá)圖。
圖5為BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
圖6為GUS酶活性變化圖。
圖7為香蕉抗性試驗(yàn)圖。
圖8為載體PBIL2導(dǎo)入農(nóng)桿菌圖。
圖9為香蕉外植體培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化生根圖。
圖1中，構(gòu)建的含有BanLec基因啟動(dòng)子和GUS基因的植物表達(dá)載體。上圖為凝膠電泳圖，箭頭所指為酶切下的啟動(dòng)子目的條帶，M為大連寶生物公司生產(chǎn)的DNAmarkerDL2000-15000，從上至下大小分別為15kb，10kb，7.5kb，5kb，2.5kb，2kb，1.0kb，0.75kb，0.5kb，0.25kb，0.1kb；下圖為一含有GUS基因的植物表達(dá)載體構(gòu)建示意圖，LB和RB分別表示載體的左臂和右臂；nos pro表示胭脂堿基因啟動(dòng)子；nptII表示新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；nos表示胭脂堿基因終止子；Lct pro2表示BanLec基因啟動(dòng)子；gus表示β-葡萄糖苷酸酶基因。
圖2為含有CaMV35S啟動(dòng)子的載體PBI121包裹的金粉轟擊香蕉根、果、葉的染色圖，結(jié)果顯示香蕉的根、果、葉均有染色。箭頭所指為GUS染色部位。
圖3為含有BanLec基因啟動(dòng)子的載體PBIL2包裹的金粉轟擊香蕉根、果、葉的染色圖，結(jié)果顯示只有香蕉果實(shí)的薄片染色，根、葉均未染色。箭頭所指為GUS染色部位。
圖4為用水包裹的金粉轟擊香蕉根、果、葉的染色圖。結(jié)果顯示香蕉的根、果、葉均未染色。
圖5進(jìn)行BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，方法是配制25μg/ml BSA母液稱取2.5mg BSA，加入0.5ml提取緩沖液，用H2O定容100ml，按表2制作BSA梯度液；從中吸取400μl加入100μl考馬斯亮藍(lán)G-250溶液(配方0.01％考馬斯亮藍(lán)，4.7％(W/V)乙醇，8.5％(W/V)磷酸)，混勻，室溫下放置2min，用光徑1cm的比色杯測(cè)定595nm的吸收值；吸收值對(duì)蛋白濃度作圖。
圖6是基因槍轉(zhuǎn)化后數(shù)十小時(shí)取相同重量的基因搶轟擊的果實(shí)薄片制備GUS提取液，酶反應(yīng)后測(cè)得415nm處兩種果實(shí)轉(zhuǎn)化材料Gus提取液不同反應(yīng)時(shí)間的光吸收值，按0.0170標(biāo)樣OD為1nmol產(chǎn)物/ml的標(biāo)準(zhǔn)將其換算成消光產(chǎn)物量后對(duì)時(shí)間作圖，Gus酶活力曲線圖表明，pBIL1質(zhì)粒轟擊的果片在15-90minGus活性高于pBI121質(zhì)粒轟擊的果片，120-150min兩個(gè)質(zhì)粒轟擊樣品的Gus活性基本一致。
圖7中，香蕉芽的薄片分別接種于含有PPT(膦絲菌素)0.25mg/L、0.50mg/L、0.75mg/L、1.00mg/L的MS附加6-BA(6-芐基氨基嘌呤)2.0mg/L、NAA(奈乙酸)0.2mg/L培養(yǎng)基上，進(jìn)行誘芽培養(yǎng)，最適濃度為1.00mg/L。
圖8中，用三親交配法將載體PBIL2導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，①為pBIL2導(dǎo)入農(nóng)桿菌長(zhǎng)出菌苔及菌落，說(shuō)明PBIL2已導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105；②、③、④為三個(gè)對(duì)照pBIL2、EHA105、pRK 2013都未長(zhǎng)出菌苔或菌落。
圖9中，上左為將巴西香蕉和紅香蕉的芽接種于MS附加6-BA(6-芐基氨基嘌呤)2.0mg/L、NAA(奈乙酸)0.2mg/L的培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大繁殖培養(yǎng)。其余為用香蕉莖薄片進(jìn)行的轉(zhuǎn)化及其生根圖。以下結(jié)合實(shí)例應(yīng)用(用該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化芪合酶基因)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
1.啟動(dòng)子序列的克隆根據(jù)BanLec基因啟動(dòng)子測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)5’、3’引物，并分別加上HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)5’Primer5’-gcAAGCTTGGTATCTATTTATGAAATC--3’ 目的片段PCR擴(kuò)增在PCR管中依次加入滅菌水18.9ul香蕉基因組1.0ul緩沖液2.5uldNTP 0.0ulTapDNA聚合酶 0.5ul5’Premer 1.5ul3’Premer 1.5ul總體積25ul。
輕輕混勻，瞬時(shí)離心，將Eppendorf管置PCR擴(kuò)增儀中，蓋上加熱帽。反應(yīng)程序94℃ 2S、72℃ 3min 7個(gè)循環(huán)；94℃ 2s；67℃ 3min. 37個(gè)循環(huán)67℃ 4min.
取5.0μlPCR擴(kuò)增反應(yīng)液進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，5V/cm恒電壓條件下電泳30min后，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。
2.目的片段的回收用QIAQUICK Gel Extraction Kit(QAGEN)回收，方法如下1)在紫外光下切下含有目的片段的膠置于1。5ml無(wú)菌離心管中，加入3倍體積的QG緩沖液，50溫育10min，每隔2-3min搖動(dòng)一次。
2)加入1倍體積的異丙醇并混勻，將其轉(zhuǎn)到QIAGUICK柱中，12000rpm，離心4min。
3)加入0.5mlQG緩沖液到柱中，12000rpm，離心1min。
4)加入0.75mlPE緩沖液到柱中，12000rpm，離心1min，13000rpm重復(fù)離心1min。
5)將柱放到1.5ml無(wú)菌離心管上，加入20ulEB緩沖液，13000rpm，離心2min，收集的溶液點(diǎn)2ul，紫外光下觀察。
3.回收PCR產(chǎn)物和pBI121植物表達(dá)載體用BamH1，Hind111雙酶切。
回收PCR產(chǎn)物 10ulBuffer E 5ulBamH1 5ulHind111 5ulBSA(100x) 0.5ulH2O 24.5ul總體積50ulpBI121質(zhì)粒DNA 5ulBuffer E 5ulBamH1 5ul
Hind111 5ulBSA(100x)0.5ulH2O 29.5ul總體積 50ul37℃水浴，3.5hr。
3.回收啟動(dòng)子BL2片段和PBI121雙酶切載體片段用QlAquick Gel Extraction Kit(50)回收兩個(gè)目的片段(方法同2)，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收結(jié)果。
4.啟動(dòng)子雙酶切片斷與PBI121雙酶切載體連接反應(yīng)700bp目的片段DNA 7.0ulpBI121雙酶切載體 1.0ul10x連接酶buffer 2ulT4DNA連接酶1ul總體積 10ul16℃，16hr。
5.連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化用無(wú)菌吸頭取100μl感受態(tài)細(xì)胞置1.5ml預(yù)冷的無(wú)菌Eppendorf管中，加入5μl連接反應(yīng)液，輕輕混勻(用手彈管壁3、4下)，立即置冰上30分鐘；將管置42℃恒溫水浴中熱激90秒鐘；放回冰上3-5分鐘；加入400μl無(wú)附加抗生素的LB液體培養(yǎng)基，混勻，37℃預(yù)表達(dá)培養(yǎng)45-60分鐘；制備LB附加100ug/ml氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)的固體平板；取200μl菌液與4μlIPTG及16μlX-gal混勻；用無(wú)菌吸頭蔣混合液移至LB平板上，再用無(wú)菌三角頭玻棒蔣菌液均勻涂滿整個(gè)平板表面；平板于37℃正向放置至液體被吸收，然后倒置平皿，于37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)。
6.重組質(zhì)粒微量提取及酶切鑒定1)重組質(zhì)粒微量提取用無(wú)菌牙簽從LB平板上挑取白色單菌落并分別接種到盛有附加100ug/ml氨芐青霉素(Ampicillin)的2-3ml LB液體培養(yǎng)基中；37℃、300rpm/min條件下連續(xù)培養(yǎng)8-10小時(shí)；分別轉(zhuǎn)移1.4ml培養(yǎng)物至1.5ml離心管中；12 000rpm/min離心30sec收集1.5ml培養(yǎng)物中的菌體，盡量棄盡上清，倒置片刻；加入100μl溶液I，在渦旋器上使菌體充分重懸；加入200μl溶液II，立即將離心管緩緩顛倒數(shù)次直到溶液變清亮，冰浴2min；加入150μl溶液III，緩緩顛倒離心管數(shù)次直至白色沉淀充分形成，冰浴2min；12000rpm/min離心3min，取400μl上清轉(zhuǎn)入另一微量離心管中，加入800μl95％乙醇，混勻后于室溫放置3min，12 000rpm/min離心3min，使質(zhì)粒DNA沉淀；棄盡上清，用200μl的TE溶解沉淀，之后加入200μl冰預(yù)冷的LiCl溶液，冰浴5min后12 000rpm/min離心3min；轉(zhuǎn)移上清到另一離心管中，加入0.8ml95％乙醇，混勻后于室溫靜置3min，12 000rpm/min離心3min使質(zhì)粒沉淀，棄去上清后用1ml70％乙醇洗滌沉淀，棄盡液體，用100μl含RNA酶A(20ug/ml)的TE溶解DNA沉淀，37℃水浴15min后于-20℃保存?zhèn)溆?)酶切鑒定依次加入以下試劑，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行EcoR和PstI雙酶切鑒定。
10xBuffer H2ulEcoRI 0.5ulPstI 0.5ulddH2O 5.5ul重組質(zhì)粒 2.0ul總體積 10ul37溫育3hr，反應(yīng)液進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳。
7.凝集素基因啟動(dòng)子連接芪合酶基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建1)芪合酶基因PCR擴(kuò)增根據(jù)已發(fā)表的芪合酶基因序列設(shè)計(jì)兩個(gè)引物5’Primer CCGGATCCGCTTCAATTTCATTACGT3’Primer CCGAGCTCCTCCTATTTGATACATTA利用葡萄的總DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)滅菌水18.9ul葡萄基因組DNA 1.0ul緩沖液2.5uldNTP 0.0ulTaqDNA聚合酶 0.5ul
5’Premer 1.5ul3’Premer 1.5ul總體積 25ul。
輕輕混勻，瞬時(shí)離心，將Eppendorf管置PCR擴(kuò)增儀中，蓋上加熱帽。反應(yīng)程序95℃變性1分鐘94℃變性30秒55℃退火30秒72℃延伸2分鐘35個(gè)循環(huán)72℃延伸10分鐘取5.0μl PCR擴(kuò)增反應(yīng)液進(jìn)行1.0％瓊脂糖凝膠電泳，5V/cm恒電壓條件下電泳30min后，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。獲得一條長(zhǎng)約1500bp的條帶，測(cè)序證明是葡萄芪合酶基因。
2)芪合酶基因PCR產(chǎn)物回收同步驟2。
3)回收的PCR產(chǎn)物及凝集素基因啟動(dòng)子表達(dá)載體用BamH1、Sac1雙酶切LAB DNA 3.0ulBuffer K 2.5ulBamH1 5.0ulSac1 5.0ulBSA 5.0ulH2O 29.5ul總體積50.0ulPBIL1(PBIL2、PBIL3) 10ulBuffer K 2.5ulBamH1 5.0ul
Sac1 5.0ulBSA 5.0ulH2O22.5ul總體積 50.0ul37℃水浴，3.5h。
4)回收芪合酶雙酶切及凝集素基因啟動(dòng)子表達(dá)載體(pBIL2)雙酶切目的片段，方法同2。
5)芪合酶基因片段與PBIL2載體雙酶切片段連接構(gòu)建載體pBIB2pBIL1 2.0ul芪合酶基因2.0ulT4DNA ligase 1.0ulligase buffer 1.0ulH2O 4.0ul總體積10.0ul16℃水浴，16h。
6)pBIB2載體酶切鑒定pBIB1(B2，B3)DNA 2.0ulMULT1-10buffer1.0ulBamH1 0.5ulSac1 0.5ulBSA 0.1ulH2O 5.9ul總體積10.0ul37℃水浴，3h。
經(jīng)酶切鑒定，含有凝集素基因啟動(dòng)子及葡萄芪合酶基因的植物表達(dá)載體已構(gòu)建成功。
8.轉(zhuǎn)化香蕉
1)材料與試劑巴西香蕉組培芽和紅香蕉組培芽均由我研究室培育。
卡那霉素(Kanamycin)，利福平(Rifampicin)、鏈霉素(Streptomycin)、噻孢霉素(Cefotaxime)、膦絲菌素(Phophinothricin PPT)均購(gòu)自北京經(jīng)科公司?；驑孠it購(gòu)自Bio-RAD公司。
2)香蕉材料的準(zhǔn)備及抗性梯度實(shí)驗(yàn)①香蕉材料的準(zhǔn)備將巴西香蕉和紅香蕉的芽接種于MS附加6-BA 2.0mg/L、NAA0.2mg/L的培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大繁殖培養(yǎng)。
取生長(zhǎng)良好的香蕉植株及芽的頂端分生組織和球莖切成0.5-1.0mm的薄片，接種于上述培養(yǎng)基中，觀察薄片上吸芽的生長(zhǎng)情況，確定最佳的取材時(shí)間及取材部位。
②抗性梯度實(shí)驗(yàn)將取自香蕉芽的薄片分別接種于含有PPT 0.25mg/L、0.50mg/L、0.75mg/L、1.00mg/L的MS附加6-BA 2.0mg/L、NAA 0.2mg/L培養(yǎng)基上，進(jìn)行誘芽培養(yǎng)，測(cè)定外植體對(duì)PPT的敏感性及最適選擇濃度。
接種在未加除草劑PPT的培養(yǎng)基上的香蕉芽葉片呈綠色，生長(zhǎng)良好；而接種在加有PPT的培養(yǎng)基上的香蕉芽，生長(zhǎng)三天后葉片明顯開(kāi)始枯黃，尤以幼葉為甚，當(dāng)PPT濃度達(dá)到1.00mg/L時(shí)，兩周后，所有的芽全部枯死(如圖7)。所以PPT能夠作為香蕉的有效選標(biāo)記，且最適濃度為1.00mg/L。
3)質(zhì)粒PBIL2導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105三親交配法將載體PBIL2導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105①接種受體農(nóng)桿菌EHA105在含有Rif50mg/L、str 100mg/L的YEP固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，長(zhǎng)出單菌落后，挑選一個(gè)單菌落接種在液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)。
②接種帶有“協(xié)助”質(zhì)粒pRK2013的大腸桿菌在含有Kan 50mg/L的固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌落后挑選一個(gè)單菌落接種在相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)。
③挑帶有中間質(zhì)粒載體PBIL2的大腸桿菌的單菌落在含有Kan 50mg/L的液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)。
④三種菌生長(zhǎng)到OD600為0.5左右時(shí)，等體積混勻，涂布于不含抗生素的YEP固體培養(yǎng)基上，28℃過(guò)夜培養(yǎng)。
⑤用接種針將長(zhǎng)出的菌苔轉(zhuǎn)接至含有Rif 50mg/L、Str 100mg/L、Kan 50mg/L的固體YEP培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2-3天，長(zhǎng)出單菌落。同時(shí)設(shè)三個(gè)對(duì)照EHA105、pRK2013、pBIL2。
⑥將長(zhǎng)出的單菌落再次轉(zhuǎn)接到含有上述三種抗生素的YEP固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)。
YEP培養(yǎng)基 蛋白胨 10g/LpH7.0酵母提取物 5g/L氯化鈉 10g/LLB培養(yǎng)基 蛋白胨 10g/LpH7.0酵母提取物 10g/L氯化鈉 5g/L(配制固體培養(yǎng)基時(shí)，需加入15g/L瓊脂粉)挑菌苔涂三抗平板后，三個(gè)對(duì)照pBIL2、EHA105、pRK 2013都未長(zhǎng)出菌苔或菌落，只有三親交配產(chǎn)物長(zhǎng)出菌苔及菌落，說(shuō)pBIL2已導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105(圖8)。
4農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化香蕉芽頂端分生組織及球莖薄片1)無(wú)菌受體材料的準(zhǔn)備取經(jīng)過(guò)擴(kuò)大繁殖的香蕉芽，將外層葉片剝?nèi)?，將芽頂端分生組織及球莖橫切成2-3片0.5-1mm的薄片。
2)農(nóng)桿菌培養(yǎng)①?gòu)钠桨迳咸羧尉?，接種于三抗YEP液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24小時(shí)以上，至OD600為0.6-0.8。
②將菌液分裝于10mL離心管中，4℃，4000rpm，離心10min，棄上清。
③將菌體重懸于2倍體積，附加500uM乙酰丁香酮(Acetosyringone AS)的MS液體培養(yǎng)基中。
3)侵染將菌液倒入無(wú)菌小燒杯內(nèi)，將受體材料放入菌液中，分別浸泡10min、20min、30min，取出薄片放于無(wú)菌濾紙上吸去多余菌液。
4)共培養(yǎng)將侵染過(guò)的薄片接種于MS附加6-BA 2.0mg/L、NAA 0.2mg/L的培養(yǎng)基上，在28℃暗培養(yǎng)4-6天。
5)選擇培養(yǎng)將經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)移到加有1.00mg/L PPT及300mg/L Cef的脫菌分化培養(yǎng)基上，在光照為5000LX，25.28℃條件下進(jìn)行誘芽選擇培養(yǎng)。
6)生根培養(yǎng)待吸芽長(zhǎng)到0.5cm以上時(shí)，從 片上切下來(lái)轉(zhuǎn)入含有1.00mg/L PPT的生根培養(yǎng)基(MS+0.5mg/L KT+1.0mg/L NAA)上進(jìn)行生根培養(yǎng)。
農(nóng)桿菌侵染10min、20min后的受體材料，共培養(yǎng)時(shí)一直觀察不到農(nóng)桿菌復(fù)出，接種到選擇培養(yǎng)基上時(shí)無(wú)抗性芽長(zhǎng)出。侵染30min的受體材料，共培養(yǎng)6天后，在材料周圍可以觀察到有農(nóng)桿菌復(fù)出；在選擇培養(yǎng)基上，受體材料正面有呈弧形排列的白色突起狀抗性小芽長(zhǎng)出。說(shuō)明只要侵染時(shí)間及共培養(yǎng)時(shí)間合適，單子葉植物香蕉也可由農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行外源基因的導(dǎo)入。共處理了巴西香蕉和紅香蕉76片/皿×15皿＝1140片受體材料，經(jīng)6天共培養(yǎng)，45天誘芽選擇培養(yǎng)，60天生根選擇培養(yǎng)后共得到64株在抗性培養(yǎng)基上生根的紅香蕉植株(如圖9)。
序 列 表<110>中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室<120>香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)啟動(dòng)子及其植物表達(dá)載體<160>1<210>1<211>748<212>DNA<213>香蕉(Musa spp)<400>1gggcccgacg tcgcatgctc ccggccgcca tggcggccgc gggaattcga ttactatagg60gcacgcgtgg tcgacggccc gggctggtat ctatttatga aatcttgagt ttaatgtttc120tattaattta ttttttataa attcttaaaa gatcctagaa cgttaatccc tttggatcaa180tatataaaag tgacatacga cttagaaaaa atcaaataaa attaaatata aatatatatt240tatgaagaat aaattaaaat tttgtattac ttaatcatat cctacatatc tacgatctgc300accatcaaac caaaaaaaaa gggggttatc tctccaacgt agccgaagta ttgaactctc360aagtcccccc aacacgtttc catgtgtcga ccgccacgcc atatccttat ccgctcctct420ttaattattg accacaccac catccgtgat cgtcgccagt cacgtcttcg tcgtcgagag480gctctacacg accctcgtca cgtgatacac gctttcctcg aggaagccac gggcgagggg540gtgagcggta cacctccatt ccaccccgac atcagagcca tggcgatccg ctataggtag600cctctctccc tcttccccaa cattatcttc tgcagaagaa agggaggagt ttggtacaca660caacacgatg gtgagaggct ctctatacac acatagtttt ctgtctgtgg aacagtttgg720ttacctccgt gcgtcgtgtg tcgacgtc748
權(quán)利要求
1.一種香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)啟動(dòng)子，其特征在于具有序列表中<400>1項(xiàng)下的序列。
2.一種香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)載體，其特征在于轉(zhuǎn)入了權(quán)利要求1所述的香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)啟動(dòng)子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)載體，其特征在于用權(quán)利要求1所述的香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)啟動(dòng)子置換植物表達(dá)載體PBI121上的CaMV35S啟動(dòng)子，構(gòu)建成在啟動(dòng)子下游含有GUS基因的香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及香蕉果實(shí)特異高效表達(dá)啟動(dòng)子及其植物表達(dá)載體，該啟動(dòng)子長(zhǎng)748bp，以其取代植物表達(dá)載體pBI121上的組成型35S啟動(dòng)子，構(gòu)建成為一個(gè)新的植物表達(dá)載體，命名為pBSP1。用GUS基因瞬時(shí)表達(dá)方法檢測(cè)了含有該段啟動(dòng)子及pBI121啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性，GUS組織染色顯示該啟動(dòng)子具有表達(dá)組織特異性，即只在果實(shí)表達(dá)。GUS活性測(cè)定其啟動(dòng)活性轉(zhuǎn)化的各香蕉果實(shí)高出其他器官100－300倍，且略高于35S啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子的獲得，為香蕉的轉(zhuǎn)基因及對(duì)香蕉果實(shí)的分子生物學(xué)研究提供了一個(gè)有力的工具，特別是為利用香蕉作為生物反應(yīng)器的研究和開(kāi)發(fā)創(chuàng)造了條件。因此，該啟動(dòng)子的獲得，具有重要理論和實(shí)踐意義。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1644694SQ200410092468
公開(kāi)日2005年7月27日 申請(qǐng)日期2004年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月20日
發(fā)明者徐碧玉, 金志強(qiáng), 劉歌, 劉菊華 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所, 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室