專利名稱：一種植物啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
啟動(dòng)子是基因表達(dá)所必需的，決定了外源基因表達(dá)的空間、時(shí)間和表達(dá)的強(qiáng)度等，是人們定向改造生物的重要限制因素。最常用的啟動(dòng)子是35s基因啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能夠在植物組織中高水平表達(dá)，因此35s啟動(dòng)子已經(jīng)被引入許多轉(zhuǎn)基因植物中。35s啟動(dòng)子來(lái)源于CaMV，該病毒能夠侵染多種十字花科植物，在其復(fù)制周期中經(jīng)歷DNA和RNA階段，與人類免疫缺陷病毒(HIV)和乙型肝炎病毒以及反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的繁殖過(guò)程相似。與乙型肝炎病毒不同的是，CaMV DNA并不整合到宿主基因組上。35s啟動(dòng)子是CaMV DNA上控制基因組的RNA形式(即35S RNA)合成的區(qū)域。
由于35s啟動(dòng)子在植物基因工程中被廣泛應(yīng)用，在談?wù)撧D(zhuǎn)基因植物的安全性時(shí)，人們自然要關(guān)心該啟動(dòng)子是否存在著潛在風(fēng)險(xiǎn)。有關(guān)35s啟動(dòng)子的潛在風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題最初是源于Kohli等(Kohli，etal.，Plant J.1999，17(6)591-601)的文章。Kohli等使用霰彈法進(jìn)行水稻的遺傳轉(zhuǎn)化，他們的重組DNA分子包括分別由35s啟動(dòng)子控制的3個(gè)基因。對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，在水稻基因組中存在著多拷貝的緊密相連的外源DNA，在精確定位這些DNA之間的毗連區(qū)后，發(fā)現(xiàn)確實(shí)存在著DNA重組位點(diǎn)。其中，11個(gè)重組位點(diǎn)中有4個(gè)是35s啟動(dòng)子內(nèi)的同一位點(diǎn)，該位點(diǎn)是一個(gè)長(zhǎng)19bp、包括TATA box在內(nèi)的回文序列。他們認(rèn)為這一位點(diǎn)就是35S啟動(dòng)子中的重組熱點(diǎn)(hot-spot)。Cummins等根據(jù)這一工作推論這一熱點(diǎn)會(huì)使轉(zhuǎn)基因不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致35s啟動(dòng)子較大的移動(dòng)性，插入到植物基因組的不同位置。在此假說(shuō)的基礎(chǔ)上，Cummins等進(jìn)一步列出了一系列35s啟動(dòng)子的潛在風(fēng)險(xiǎn)(1)如果35s啟動(dòng)子插入到原來(lái)整合到植物基因組中的隱性病毒基因組旁，可能會(huì)重新活化病毒；(2)與此相似，如果該啟動(dòng)子插入到某一編碼毒素蛋白的基因上游，可能會(huì)增強(qiáng)該毒素的合成；(3)當(dāng)轉(zhuǎn)基因植物被動(dòng)物或人類食用時(shí)，35S啟動(dòng)子可能會(huì)通過(guò)基因的水平轉(zhuǎn)移插入到某一致癌基因上游、活化并且導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。上述任何一種情況使人們有足夠的理由關(guān)心35s啟動(dòng)子的安全性。
轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性問(wèn)題是當(dāng)前轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展的難題。實(shí)現(xiàn)外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的定向、安全、高效表達(dá)是解決轉(zhuǎn)基因植物安全性問(wèn)題的關(guān)鍵之一。解決這個(gè)問(wèn)題的一個(gè)重要途徑是克隆到調(diào)控外源基因在特定器官或特定發(fā)育時(shí)期表達(dá)的啟動(dòng)子，構(gòu)建高效表達(dá)遺傳轉(zhuǎn)化載體，實(shí)現(xiàn)可控的遺傳轉(zhuǎn)化。1，5一二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubisco)是植物光合作用中重要的質(zhì)體蛋白；由核基因編碼的小亞基的基因rbcS具有葉片組織特異性和光誘導(dǎo)特性，葉片組織特異性為實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的定向表達(dá)創(chuàng)造了條件，光誘導(dǎo)特性為轉(zhuǎn)基因的定時(shí)表達(dá)帶來(lái)了希望。利用rbcS啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因植物中調(diào)控外源蛋白基因使其在葉片中高效表達(dá)，而在種子中不表達(dá)將是解決轉(zhuǎn)基因安全性的重要技術(shù)策略。從而希望能夠解決外源毒蛋白對(duì)人類健康帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。另外，外源基因表達(dá)量不足往往是得不到理想的轉(zhuǎn)基因植物的重要原因。由于啟動(dòng)子在決定基因表達(dá)方面起關(guān)鍵作用，因此，選擇合適的植物啟動(dòng)子和通過(guò)改造增強(qiáng)其活性是增強(qiáng)外源基因表達(dá)首先要考慮的問(wèn)題。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種具有葉片組織特異性、表達(dá)強(qiáng)度高的植物啟動(dòng)子。
本發(fā)明所提供的植物啟動(dòng)子名稱為rbcSc，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有99％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由655個(gè)堿基組成。
含有rbcSc啟動(dòng)子的表達(dá)載體和細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，利用現(xiàn)有分子生物學(xué)的方法可以得到不同的表達(dá)載體，如植物表達(dá)載體pB2(圖譜如圖1B所示)。
本發(fā)明的rbcSc啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性是35S啟動(dòng)子的1.3倍；而且是由rbcS基因啟動(dòng)子進(jìn)行結(jié)構(gòu)上的改造而得到，除了具有較強(qiáng)的表達(dá)活性外，還具有葉片組織特異性和光誘導(dǎo)特性，rbcS啟動(dòng)子可在轉(zhuǎn)基因植物中調(diào)控外源蛋白基因使其在葉片中高效表達(dá)，而在種子中不表達(dá)，保證種子等目標(biāo)器官中不含有外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)等，解決種子等目標(biāo)器官中含有外源蛋白(如Bt毒蛋白)等生物安全性問(wèn)題。本發(fā)明的rbcSc啟動(dòng)子可代替35S啟動(dòng)子作為植物轉(zhuǎn)基因的工具啟動(dòng)子，廣泛用于培育具有較高生物安全性的單子葉和雙子葉轉(zhuǎn)基因植物。


圖1A為植物表達(dá)載體pB9物理圖譜圖1B為植物表達(dá)載體pB2物理圖譜圖1C為植物表達(dá)載體pB8物理圖譜圖2為TaKaRa Mutan BEST Kit原理示意3為幾種啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性比較示意4為不同載體在苜蓿植株中的瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果照片圖5為不同載體在水稻愈傷組織中的瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果照片圖6為不同載體在玉米愈傷組織中的瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果照片圖7為不同載體在小麥愈傷組織中的瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果照片具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、rbcSZm1啟動(dòng)子的克隆根據(jù)報(bào)道序列(GeneBankS42508)設(shè)計(jì)引物，且5’端加上HindIII酶切位點(diǎn)，3’端加上XbaI酶切位點(diǎn)，由生工生物技術(shù)公司合成引物，序列如下引物0AAAAAG CTTGAT ATT AGT TCA GCC CAA；引物1TTTTCT AGACGA CGA GGC CAT CAT CAC。以玉米基因組DNA為模板，按常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得654bp的目的片段，電泳回收純化，連接到pGEM-T載體上，篩選鑒定后進(jìn)行測(cè)序，序列如序列表中SEQ ID №2所示，表明在rbcS基因啟動(dòng)子的-118處堿基T突變成C。
用XbaI+HindIII雙酶切rbcSZm1，然后電泳回收純化。同時(shí)，也將pBI121質(zhì)粒(GENBANKAF485783)用XbaI+HindIII雙酶切，37℃，充分酶切直至過(guò)夜，之后1.0％瓊脂糖凝膠電泳回收純化。酶切體系總共20ulXbaI，2ul；HindIII，2ul；10×buffer，2ul；BSA，2ul；載體DNA；12ul。然后將二者的回收產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，連接體系共10ulT4DNA連接酶，1ul；10×連接buffer，1ul；pBI121，4ul；目的片段，4ul。然后按CaCl2法轉(zhuǎn)化DH5α，進(jìn)行卡那抗生素篩選，提取重組陽(yáng)性質(zhì)粒，以提取的重組陽(yáng)性質(zhì)粒為模板按常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，引物序列(0和1)如上，結(jié)果表明重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)正確，得到植物表達(dá)載體pB9(圖1A)。
實(shí)施例2、rbcSc啟動(dòng)子的克隆利用Megaprimer PCR的方法，以rbcSZm1作為模板，以引物1GAT ATT AGT TCAGCC CAA和引物2(突變)5’-CCGGGCGCGGCCACG-3’為引物。第一輪擴(kuò)出了241bp大小的目的片段，回收此片段作為下一輪擴(kuò)增中的megaprimer。以5’-CGCGCGCGCGCGTG-3’為另一端引物，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)第二輪擴(kuò)增，擴(kuò)增出654bp大小的目的片段，回收純化，連接到T載體上，篩選出陽(yáng)性克隆，鑒定后送申友生物技術(shù)公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示在rbcS基因啟動(dòng)子的GC富含區(qū)-118定點(diǎn)將T突變成C，其它的堿基序列與rbcSZm1基因啟動(dòng)子完全一致，命名為rbcSc，其序列如序列表中SEQ ID №1所示。
用XbaI+HindIII雙酶切rbcSc，然后電泳回收純化。同時(shí)，也將pBI121質(zhì)粒用XbaI+HindIII雙酶切之后電泳回收純化，然后將二者的回收產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化到DH5α，卡那抗生素篩選，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，用XbaI和HindIII雙酶切重組質(zhì)粒，結(jié)果表明重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)正確，得到植物表達(dá)載體pB2(圖1B)，具體步驟參照實(shí)例1。
Megaprimer PCR的具體步驟如下第一步反應(yīng)體系為10×pfu Buffer 5uldNTP 4ul引物1 2ul引物2(突變)2ul模板 1-10ngpfu(5U/ul) 0.5ul滅菌蒸餾水 直到50ul反應(yīng)程序?yàn)?25個(gè)循環(huán)反應(yīng)結(jié)束之后，1.0％瓊脂糖電泳，回收純化241bp片段為megaprimer。
第二步在PCR小管中加入質(zhì)粒 1uldNTP 1ul10×buffer5ulTaq plus酶2.5Umegaprimer2ul引物1 8ul突變 16ul補(bǔ)水至48ul進(jìn)行如下反應(yīng) 5個(gè)循環(huán)結(jié)束后，72℃取出加入2ul另一端引物，繼續(xù)進(jìn)行如下反應(yīng) 30個(gè)循環(huán)反應(yīng)結(jié)束之后，1.0％瓊脂糖電泳，回收純化654bp片段。然后把回收的片段連接到T載體上，測(cè)序。
實(shí)施例3、rbcSo啟動(dòng)子的克隆利用插入突變?cè)趓bcSZm1基因啟動(dòng)子的-31位置、TATA框上游插入八核苷酸序列(八聚體ATTTGCAT)。根據(jù)寶生物公司TaKaRa Mutan BEST Kit突變?cè)噭┖?原理如圖2)的說(shuō)明合成引物插入序列引物5’端ATT TGCATC ATG GAC ATG GCT CTAT；插入序列引物3’端TCG CTG GAT CCG CGT CCG CC；以rbcSZm1基因啟動(dòng)子為模板，按常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化，連接到T載體上，篩選出陽(yáng)性克隆，鑒定后送申友生物技術(shù)公司測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)八核苷酸序列插入到了啟動(dòng)子當(dāng)中，且位于TATA框上游14bp處。命名為rbcSo，其序列如序列表中SEQ ID №3所示，自5’端155位-162位堿基為插入的八核苷酸序列ATGCAAAT。
用XbaI+HindIII雙酶切rbcSo，然后電泳回收純化。同時(shí)，也將pBI121質(zhì)粒用XbaI+HindIII雙酶切之后電泳回收純化，然后將二者的回收產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化到DH5α，卡那抗生素篩選，提取陽(yáng)性質(zhì)粒，用XbaI和HindIII雙酶切重組質(zhì)粒，結(jié)果表明重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)正確，得到植物表達(dá)載體pB8(圖1C)，具體步驟參照實(shí)例1。
實(shí)施例4、rbcSc、rbcSo啟動(dòng)子的瞬時(shí)表達(dá)的檢測(cè)本實(shí)施例所用主要溶液的成分(1)W5清洗液(pH5.8高壓滅菌)NaCl154mmoll/lCaCl2125mmol/lKCl 5mmol/l葡萄糖 5mmol/l(2)酶溶液纖維素酶R-101.2％離析酶R-10 0.4％用K3AS培養(yǎng)基配制，攪拌30-60分鐘溶解之后，3000g，離心5分鐘，過(guò)濾滅菌，現(xiàn)用現(xiàn)配。
(3)GUS酶提取緩沖液Na3PO4(pH7.0)50mmol/lEDTA10mmol/lNaCl100mmol/lSodium Lauroy Sarcosine 0.1％
Triton X-1000.1％β-巰基乙醇 10mol/lPMSF2mmol/lBSA 0.01％(4)MaMg溶液MgCl215mmol/lMES 5mmol/l甘露醇 0.5mmol/lpH5.8，高壓滅菌。
(5)終止緩沖液Na2CO30.2mol/l(6)MUG溶液用GUS酶提取緩沖液配制成2mmol/l。
(7)4-MU溶液用終止緩沖液配成100umol/l，再稀釋成工作濃度。
rbcSc、rbcSo啟動(dòng)子的瞬時(shí)表達(dá)的檢測(cè)的具體步驟如下1、原生質(zhì)體的制備(1)采集生長(zhǎng)6周的無(wú)菌煙草植株上中等大小的葉片。
(2)用8個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿中含有10ml用K3AS調(diào)制的酶解液，放4片葉片。
(3)將葉片疊成兩層，垂直于中肋切成2mm寬的小條。
(4)用封口膜將培養(yǎng)皿密封，26℃保溫16小時(shí)。
(5)檢查酶解進(jìn)行的程度，輕輕的攪動(dòng)，使已分離的細(xì)胞釋放進(jìn)酶解液，如果需要，繼續(xù)將葉片酶解1-3小時(shí)。
(6)為了促進(jìn)原生質(zhì)體的釋放，可用大口徑移液管緩慢的將酶解液上下吹吸2-3次。
(7)用100目和200目不銹鋼篩的濾器過(guò)濾酶解混合液。
(8)將濾得的原生質(zhì)體置于5ml離心管中，2000rpm離心20分鐘，使原生質(zhì)體漂浮上層。
(9)用大口徑移液管將上層原生質(zhì)體以最小體積轉(zhuǎn)移到新的5ml離心管中。
(10)用4倍體積的W5溶液稀釋原生質(zhì)體懸浮液，溫和混勻，以2000rpm，5分鐘離心沉淀原生質(zhì)體。
(11)用W5溶液洗滌并以2000rpm，5分鐘離心沉淀原生質(zhì)體。
2、聚乙二醇介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(1)將煙草原生質(zhì)體懸浮于5ml MaMg溶液中，用血紅細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定原生質(zhì)體的濃度，使每個(gè)轉(zhuǎn)化樣品大約有1×106-2×106個(gè)細(xì)胞。
(2)2000rpm，5分鐘離心沉淀原生質(zhì)體，除去上清，再將沉淀懸浮于0.5ml的MaMg溶液中。
(3)對(duì)原生質(zhì)體在45℃水浴中進(jìn)行熱激處理5分鐘，取出樣品后室溫放置10分鐘。
(4)向樣品中加入用于轉(zhuǎn)化的DNA，通常每個(gè)樣品(約106個(gè)原生質(zhì)體)大約加10ugDNA。DNA用TE溶解，體積小于30ul。
(5)緩慢加入0.5ml PEG1450，溫和混勻，以誘導(dǎo)細(xì)胞攝取DNA。
(6)室溫下轉(zhuǎn)化25分鐘。
(7)用5ml W5溶液稀釋樣品，溫和攪勻后，用2000rpm離心5分鐘沉淀原生質(zhì)體。
(8)按大約每毫升105個(gè)原生質(zhì)體的密度將原生質(zhì)體再懸浮于K3AM培養(yǎng)液中。
(9)在26℃，將5ml離心管中的原生質(zhì)體遮光培養(yǎng)20小時(shí)，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。
(10)首先用W5溶液將原生質(zhì)體稀釋3倍，然后2000rpm，7分鐘離心收集原生質(zhì)體。
(11)將沉淀再懸浮于500ul的GUS酶提取緩沖液中并轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中。交替地將樣品在液氮和37℃水浴中進(jìn)行3次各3分鐘左右的反復(fù)凍融后，4℃條件下8000rpm離心5分鐘沉淀細(xì)胞碎片，再分析上清液中酶活性。提取液可在-80℃條件下保存若干星期而不會(huì)喪失活性。
(12)用微量Bradford法測(cè)定上清部分的蛋白質(zhì)濃度。在測(cè)定蛋白質(zhì)濃度時(shí)，加入到染色試劑中的上清液需20ul。
3、GUS的熒光測(cè)定(1)對(duì)各樣品進(jìn)行測(cè)定時(shí)，預(yù)先準(zhǔn)備200ul，2mmol/l的MUG溶液于微量離心管中，在37℃下水浴5分鐘。加入200ul細(xì)胞提取液，攪動(dòng)均勻后，再進(jìn)行水浴。
(2)15分鐘后，從每支待測(cè)管中取出200ul轉(zhuǎn)移到預(yù)先加有1.8ml終止緩沖液的試管中，搖動(dòng)均勻。
(3)用熒光計(jì)在激發(fā)光波長(zhǎng)為362nm，發(fā)射波長(zhǎng)為450nm下所產(chǎn)生的MU濃度作定量分析。用終止緩沖液將MU貯液稀釋來(lái)配成濃度范圍在0-10umpl/l的一系列MU標(biāo)準(zhǔn)液，通過(guò)測(cè)定它們的熒光強(qiáng)度作出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(4)根據(jù)各稀釋樣品的熒光強(qiáng)度可計(jì)算出初始反應(yīng)中未稀釋產(chǎn)物的濃度。對(duì)每一個(gè)樣品，空白對(duì)照(未用DNA做電擊轉(zhuǎn)化的樣品)值被扣除。
本實(shí)施例用煙草原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，把載體pB2、pB8、pB9和pBI121分別導(dǎo)入到煙草原生質(zhì)體中，24小時(shí)之后，破碎細(xì)胞，離心取上清液，用MUG作為底物測(cè)GUS酶的活性。分解生成的4-MU在激發(fā)波長(zhǎng)362nm，產(chǎn)生發(fā)射波長(zhǎng)450nm的熒光，由熒光分光光度計(jì)可測(cè)得相對(duì)熒光數(shù)值，利用公式相對(duì)熒光強(qiáng)度×1.5×10-3umol/l÷蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)計(jì)算GUS活性。結(jié)果如圖3所示，表明rbcSc啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性是rbcSZm1的3.5倍，是35S啟動(dòng)子的1.3倍；rbcSo啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性是rbcSZm1的1.6倍，是35S啟動(dòng)子的0.6倍。
實(shí)施例5、rbcSc啟動(dòng)子在玉米愈傷組織、水稻愈傷組織、小麥愈傷組織、苜蓿植株中的活性將植物表達(dá)載體pB2、pBI121和pB9用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法在玉米愈傷組織、水稻愈傷組織、小麥愈傷組織、苜蓿植株上進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以檢測(cè)啟動(dòng)子rbcSc在不同物種中的活性。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)具體步驟如下1、農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化(1)挑取LBA4404單菌落于3mlYEB(Sm100ug/ml)中，28℃，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
(2)取過(guò)夜培養(yǎng)菌液500ul，接種于50mlYEB(Sm100ug/ml)中，28℃，振蕩培養(yǎng)至OD600＝0.5。
(3)5000rpm離心5分鐘。
(4)加10ml 0.15M NaCl懸浮農(nóng)桿菌細(xì)胞，5000rpm離心5分鐘。
(5)1ml預(yù)冷的20mM CaCl2懸浮細(xì)胞，冰浴，24小時(shí)內(nèi)使用或分裝成200ul，液氮中速凍1分鐘，-70℃保存。
(6)取200ul感受態(tài)細(xì)胞，加入1ug構(gòu)建好的質(zhì)粒DNA，液氮中速凍1分鐘，37℃，5分鐘。
(7)加入1mlYEB，28℃慢速培養(yǎng)4小時(shí)。
(8)1000rpm離心30秒，棄上清，加入0.1mlYEB培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，涂布于含有100ug/ml卡那和100ug/ml Sm的YEB平板上，28℃培養(yǎng)48小時(shí)。
2、轉(zhuǎn)化、染色及檢測(cè)挑取步驟(8)中的單菌落于卡那和Sm抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中28℃振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，取50ul菌液加入到3ml新鮮培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)，10小時(shí)。轉(zhuǎn)化時(shí)取1ml菌液，加入9ml培養(yǎng)基稀釋。將植物組織材料浸入提前準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌菌液中5分鐘后取出，用無(wú)菌濾紙將愈傷上面的菌液吸干，然后放在MS分化培養(yǎng)基(MS+2mg/lBA+0.2mg/l IAA)上，培養(yǎng)三天后放入GUS染色緩沖液(50mmol/l磷酸鈉(pH7.0)；1mmol/l EDTA；1mmol/l鐵氰化鉀；1mmol/l亞鐵氰化鉀；0.5mg/ml X-gluc(X-gluc溶液；10mg X-gluc溶于1ml N-N-二甲基甲酰胺中)；0.05％ Triton-100)中，37℃染色過(guò)夜，觀察并照相。結(jié)果如圖4、圖5、圖6和圖7所示，表明rbcSc啟動(dòng)子在苜蓿、水稻、玉米、小麥中均具有轉(zhuǎn)錄活性。圖4、圖5、圖6和圖7中，左側(cè)部分為pB9，中間部分為pB2，右側(cè)部分為pBI121。
序列表<160>3<210>1<211>655<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1ccgggcgcgg ccacgggaga acggtggcca ctcgtcccac atccgcttcg tcacgcccca 60acgagaggcg gacgcggatc cagcgacatg gacatggctc tatatatgcc gtcggtgggg120gagcccctac aggacgaccc aagcaagcaa gctcgatcta ctactactac tagctggtac180accaagaagt gttttgtcct tgcctagttt ccattgtcgt acgttcttaa taaaccgcga240gctgaactgc ttgtgttcga gagagacagc ggattgagat tgcaggatgc caggaagggg300acgaccgact cgaccgtata gtccatccgt ggcgtggctc catgtggcgc ggacggacga360taaggcgaca agtggtggcg gacgcgcgcg tgcgatcagg ataggccagg ctggccgggt420gcggccacgg gagaacggtg gccactcgtc ccacatccgc ttcgtcacgc cccaacgaga480ggcggacgcg gatccagcga catggacatg gctctatata tgccgtcggt gggggagccc540ctacaggacg acccaagcaa gcaagctcga tctactacta ctactagctg gtacacatac600tagccagcct gccagccagc ttgccatggc gcccaccgtg atgatggcct cgtcg 655<210>2<211>654<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2
gatattagtt cagcccaact ctatacgtac atacatccaa acacgccctc agtacgtgcc 60tcaggtggtg cggaccagcc gggtagaatg tggtagaacg gccaacaggt gagtgagaga120gagaccaggg ccatcagcag cagaggcaat gagcaaacag acgcagagac gaggtcgaaa180accaagaagt gttttgtcct tgcctagttt ccattgtcgt acgttcttaa taaaccgcga240gctgaactgc ttgtgttcga gagagacagc ggattgagat tgcaggatgc caggaagggg300acgaccgact cgaccgtata gtccatccgt ggcgtggctc catgtggcgc ggacggacga360taaggcgaca agtggtggcg gacgcgcgcg tgcgatcagg ataggccagg ctggccgggt420gcggccacgg gagaacggtg gccactcgtc ccacatccgc ttcgtcacgc cccaacgaga480ggcggacgcg gatccagcga catggacatg gctctatata tgccgtcggt gggggagccc540ctacaggacg acccaagcaa gcaagctcga tctactacta ctactagctg gtacacatac600tagccagcct gccagccagc ttgccatggc gcccaccgtg atgatggcct cgtc 654<210>3<211>655<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3gacgaggcca tcatcacggt gggcgccatg gcaagctggc tggcaggctg gctagtatgt 60gtaccagcta gtagtagtag tagatcgagc ttgcttgctt gggtcgtcct gtaggggctc120ccccaccgac ggcatatata gagccatgtc catgatgcaa atgctggatc cgcgtccgcc180tctcgttggg gcgtgacgaa gcggatgtgg gacgagtggc caccgttctc ccgtggccgc240acccggccag cctggcctat cctgatcgca cgcgcgcgtc cgccaccact tgtcgcctta300tcgtccgtcc gcgccacatg gagccacgcc acggatggac tatacggtcg agtcggtcgt360taaggcgaca agtggtggcg gacgcgcgcg tgcgatcagg ataggccagg ctggccgggt420gcggccacgg gagaacggtg gccactcgtc ccacatccgc ttcgtcacgc cccaacgaga480ggcggacgcg gatccagcga catggacatg gctctatata tgccgtcggt gggggagccc540ctacaggacg acccaagcaa gcaagctcga tctactacta ctactagctg gtacacatac600tagccagcct gccagccagc ttgccatggc gcccaccgtg atgatggcct cgtcg 65權(quán)利要求
1.一種植物啟動(dòng)子，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有99％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物啟動(dòng)子，其特征在于它的編碼序列是序列表中的SEQ ID №1。
3.含有權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子的細(xì)胞系。
4.含有權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子的表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體為植物表達(dá)載體pB2。
6.權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物啟動(dòng)子及其應(yīng)用，本發(fā)明所提供的植物啟動(dòng)子rbcSc，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)與序列表中SEQ ID№1限定的DNA序列具有99％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列。rbcSc啟動(dòng)子可代替35S啟動(dòng)子作為植物轉(zhuǎn)基因的工具啟動(dòng)子，可廣泛用于培育具有較高生物安全性的單子葉和雙子葉轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1603409SQ03134800
公開日2005年4月6日 申請(qǐng)日期2003年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月30日
發(fā)明者王濤, 劉禮兵, 袁媛 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)