專(zhuān)利名稱(chēng)：用于治療獲得性免疫缺陷綜合征的重組靶向融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程蛋白質(zhì)藥物領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及靶向性抗HIV/SIV的蛋白質(zhì)及編碼它的融合基因。本發(fā)明還涉及RN-TNFαm1、XE-TNFαm1和XE-TNFαm2融合基因、包含所述融合基因的表達(dá)型重組體、包含所述表達(dá)型重組體的工程菌、由此工程菌表達(dá)和分離純化的靶向融合蛋白R(shí)N-TNFαm1、XE-TNFαm1和XE-TNFαm2以及這些融合蛋白中任意一種的用于治療艾滋病用途。
背景技術(shù)：
獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome AIDS)即艾滋病，是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病。AIDS是由人免疫缺陷性病毒(humanimmunodeficiency virus HIV)感染引起。HIV主要感染表達(dá)CD4分子的T細(xì)胞、單核/巨噬和樹(shù)突狀細(xì)胞，以及中樞神經(jīng)細(xì)胞。據(jù)WHO2003年的數(shù)據(jù)，全球HIV感染者已超過(guò)6000萬(wàn)，其中1/3已死亡。在今后20年內(nèi)，估計(jì)死亡人數(shù)將達(dá)到6800萬(wàn)。目前全球HIV/AIDS人數(shù)已居各種疾病的首位，艾滋病已成為全球的瘟疫.2003年的最新數(shù)據(jù)表明，中國(guó)艾滋病實(shí)際感染者已達(dá)一百余萬(wàn)人，以青壯年為主，其中已經(jīng)死亡的約20萬(wàn)。如果不采取有效的控制措施，到2010年感染者數(shù)量有可能達(dá)到1000萬(wàn)。若防治得力在2010年可將感染者數(shù)量控制在150萬(wàn)以?xún)?nèi)。中國(guó)艾滋病防治形勢(shì)相當(dāng)嚴(yán)峻。
盡管目前高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(High Active Antiretrovirus Therapy，HAART)在發(fā)達(dá)國(guó)家中取得了矚目的成績(jī)，但大多數(shù)HIV感染者都集中在經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)，HAART昂貴的價(jià)格限制了它在這些發(fā)展中國(guó)家的應(yīng)用。全球HIV感染者接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的不足100萬(wàn)。同時(shí)HAART本身存在一些無(wú)法克服的缺點(diǎn)，如HAART的毒副作用大、容易導(dǎo)致病毒的耐藥和病毒的潛伏，而且價(jià)格昂貴。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，此類(lèi)藥物長(zhǎng)期給藥有致癌的危險(xiǎn)性。HAART不能徹底根治艾滋病。艾滋病疫苗雖然一度給人們帶來(lái)了巨大的希望，但實(shí)際上，從疫苗的研發(fā)到真正應(yīng)用于人類(lèi)仍然是困難重重。不僅如此，現(xiàn)有的各種治療手段，包括其它各種藥物治療，基因治療均未取得成功。
靶向性治療技術(shù)又稱(chēng)為“生物導(dǎo)彈”技術(shù)，正越來(lái)越引起人們的關(guān)注。一種生物導(dǎo)彈的設(shè)計(jì)思路是將單克隆抗體與藥物、抗生素或核素偶聯(lián)在一起用于臨床治療，其主要問(wèn)題是靶向性差；另一種生物導(dǎo)彈的設(shè)計(jì)思路是運(yùn)用基因工程技術(shù)將不同的功能區(qū)段拼接所構(gòu)建的融合蛋白作為“分子導(dǎo)向”型導(dǎo)彈，如人工構(gòu)建的融合蛋白CD4178-PE40用于治療艾滋病。臨床研究結(jié)果表明，此類(lèi)融合蛋白雖具有良好的導(dǎo)向作用，但PE40毒素蛋白質(zhì)對(duì)人體而言是異源蛋白，具有很強(qiáng)的免疫原性，可迅速誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生特異針對(duì)PE40的抗體，抗體產(chǎn)生中和效應(yīng)使融合蛋白失效，無(wú)法應(yīng)用于臨床治療。
所以在治療AIDS領(lǐng)域急需低毒高效的靶向性藥物。

發(fā)明內(nèi)容
為了研究高效低毒且無(wú)免疫原性的治療艾滋病的藥物，本發(fā)明提供了運(yùn)用于抗HIV/SIV的三類(lèi)融合蛋白，所述融合蛋白是包含受體多肽與來(lái)源于人體的具有殺細(xì)胞作用的殺傷多肽的靶向性融合蛋白。
在人體內(nèi)，僅有被HIV感染的細(xì)胞才會(huì)表達(dá)gp120蛋白?？膳cgp120特異結(jié)合的靶向分子能將具有殺細(xì)胞作用的TNFαm1和TNFαm2導(dǎo)向被HIV感染的細(xì)胞。被HIV/SIV感染的細(xì)胞有內(nèi)化(Internalization)功能，通過(guò)gp120介導(dǎo)的內(nèi)化作用而將TNFαm1和TNFαm2導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)部引發(fā)細(xì)胞凋亡。正常細(xì)胞由于不表達(dá)gp120，靶向融合蛋白不會(huì)與其結(jié)合，不會(huì)殺傷正常組織細(xì)胞。因此該類(lèi)藥物具有良好的安全性。本發(fā)明由于靶向設(shè)計(jì)，可以既有效降低TNFα的毒性，又可以將TNFα的殺傷作用集中于受HIV/SIV感染的細(xì)胞，更有效發(fā)揮融合蛋白的殺傷作用，同時(shí)兼顧安全和高效。融合蛋白在殺傷受HIV/SIV感染細(xì)胞的同時(shí)，其靶向分子RN、XE還能中和游離的HIV/SIV，實(shí)現(xiàn)對(duì)正常細(xì)胞的保護(hù)。因此這三種融合蛋白都是雙功能的活性多肽。并且，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果的支持。同時(shí)，由于RN、XE和TNFαm均來(lái)自人體，最大限度降低了免疫原性。不僅如此，在RN、XE和TNFαm之間還分別引入了富含柔性氨基酸的氨基酸序列，可以幫助靶向分子RN、XE和效應(yīng)分子TNFαm各自保持獨(dú)立的的三維空間結(jié)構(gòu)來(lái)行使其功能，并各自獨(dú)立作為人體內(nèi)源蛋白被免疫系統(tǒng)識(shí)別而不被免疫系統(tǒng)錯(cuò)誤識(shí)別為異源蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)，避免最終導(dǎo)致藥物失效。本發(fā)明涉及兩種人HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體或輔助受體多肽的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO1，3所示。所述的SEQ ID NO1，3的核苷酸序列用于融合蛋白的導(dǎo)向作用。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及兩種人HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽，它的氨基酸序列如SEQ ID NO2，4所示。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種TNF-α的變異體的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ IDNO5所示。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種TNF-α的變異體，它的氨基酸序列如SEQ ID NO6所不。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種TNF-α的變異體的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ IDNO7所示。
所述的SEQ ID NO5和7的核苷酸序列用于融合蛋白的殺滅作用。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種TNF-α的變異體，它的氨基酸列如SEQ ID NO8所示。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及三種靶向融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白為包含能夠結(jié)合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽和具有殺細(xì)胞作用的殺傷多肽的靶向性融合蛋白。
所述的受體多肽優(yōu)選是RN或XE，或者它們的相關(guān)片斷，類(lèi)似物或突變體；所述的殺傷多肽是包括TNFα、TNFβ、TNFγ或其衍生物或其突變體的TNF家族成員；或TNF超家族成員，如Trail，Light或者是它們的活性功能區(qū)域、突變體或類(lèi)似物；或所述的多肽是來(lái)源于人體的穿孔素、補(bǔ)體成分C9及顆粒溶解素；或者來(lái)源于人體的顆粒酶家族的顆粒酶A，B，C，D，E、絲氨酸酯酶；或蛋白激酶C、蛋白激酶A、天冬氨酸激酶、細(xì)胞色素或DNA核酸內(nèi)切酶；或可以抵御細(xì)菌的多肽和酶，如溶菌酶、防御素；或抗癌基因及其編碼的蛋白質(zhì)，如P53，以及一切來(lái)源于人體的具有致死細(xì)胞功能的基因及其編碼蛋白質(zhì)、或者是它們的活性功能區(qū)域、突變體或類(lèi)似物。
優(yōu)選地，編碼所述的RN的基因序列為SEQ ID NO1所示的序列。
優(yōu)選地，所述的RN基因編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
優(yōu)選地，所述的殺傷多肽是TNFα的突變體TNFαm1，編碼它的cDNA序列為SEQ ID NO5所示的核苷酸序列。
優(yōu)選地，所述的TNFαm1基因編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO6所示的氨基酸序列。
優(yōu)選地，所述的殺傷多肽是TNFα的突變體TNFαm2，編碼它的cDNA序列為SEQ ID NO7所示的核苷酸序列。
優(yōu)選地，所述的殺傷多肽是TNFαm2，它的氨基酸序列為SEQ ID NO8所示的氨基酸序列。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括SEQ D NO1的cDNA和SEQ ID NO5的cDNA的融合基因的重組體p30a-RNTNFαm1；包括SEQ ID NO3的cDNA和SEQ IDNO5的cDNA的融合基因的重組體pCW-XETNFαm1。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括SEQ ID NO2的cDNA和SEQ ID NO7的cDNA的融合基因的重組體pCW-XETNFαm2。
本發(fā)明還涉及含有上述重組體的載體。
本發(fā)明還涉及含有能表達(dá)上述融合蛋白的構(gòu)建質(zhì)粒載體的真核或原核細(xì)胞，優(yōu)選為原核細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及制備上述的融合蛋白的方法，包括用所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，獲得重組的包含能夠結(jié)合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽和具有殺細(xì)胞作用的殺傷多肽的靶向性融合蛋白。
本發(fā)明還涉及一種含有上述融合蛋白的靶向藥物。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及所述的融合蛋白在制備用于治療獲得性免疫缺陷綜合征的藥物中的用途。
優(yōu)選地，其通過(guò)殺滅受HIV/SIV感染的細(xì)胞或中和游離的HIV/SIV來(lái)完成。
本發(fā)明還提供了靶向融合蛋白R(shí)NTNFαm1和XE-TNFαm1、XE-TNFαm2分別對(duì)受HIV/SIV感染細(xì)胞具有特異殺傷作用以及對(duì)血循環(huán)中游離病毒的中和作用的細(xì)胞試驗(yàn)證據(jù)。


圖1為重組體p30RN-TNFαm1的構(gòu)建示意圖。
圖2為重組體pCW XE-TNFαm1的構(gòu)建示意圖。
圖3為重組體pCW XE-TNFαm2的構(gòu)建示意圖。
圖4為重組體p30RN-TNFαm1、pCW XE-TNFαm1的酶切鑒定示意圖。
1.PBR322/BstNI(1875，1060，929，383，121)2.pET-30RNTNFαm1/BamHI+NdeI(5276，587)；3.pCW-XETNFαm1/BamHI+NdeI(4887，587)；4.λDNA/HindIII(23130，9416，6557，4361，2322，2027，564)；圖5為重組體pCW XE-TNFαm2的酶切鑒定示意圖。
1.λDNA/HindIII(23130，9416，6557，4361，2322，2027，567)2.pCW-XETNFαm2(4967bp，549bp)3.DNAladder(800，700，600，500，400，300)圖6為融合蛋白XE-TNFαm1 SDS-PAGE電泳圖。1.低分子量蛋白marker，自上而下分別為97.4KD、66.2KD、43.0KD、31.0KD、20.1KD、14.4KD；2.XE-TNFαm1純化后樣品；3.XE-TNFαm1包涵體樣品；4.XE-TNFαm1誘導(dǎo)樣品；5.XE-TNFαm1未誘導(dǎo)樣品。
圖7為融合蛋白R(shí)N-TNFαm1的SDS-PAGE膠電泳圖。1.低分子量蛋白marker(自上而下分別為97.4KD、66.2KD、43.0KD、31.0KD、20.1KD、14.4KD)；2.RN-TNFαm1切膠回收純化后樣品；3.RN-TNFαm1包涵體樣品；4.RN-TNFαm1誘導(dǎo)樣品；以及5.N-TNFαm1未誘導(dǎo)樣品。
圖8為融合蛋白XE-TNFαm2的SDS-PAGE膠電泳圖。1XETNFαm2未誘導(dǎo)樣品；2XETNFαm2誘導(dǎo)樣品；3XETNFαm2過(guò)柱純化樣品；4低分子量蛋白marker，自上而下(自上而下分別為97.4、66.2、43.0、31.0、20.1、14.4KD)。
圖9融合蛋白XE-TNFαm1SDS-PAGE的激光密度掃描圖。
圖10融合蛋白R(shí)N-TNFαm1SDS-PAGE的激光密度掃描圖。
圖11融合蛋白XE-TNFαm2SDS-PAGE的激光密度掃描圖。
圖12融合蛋白XETNFαm2反向柱梯度洗脫結(jié)果.
圖13融合蛋白XETNFαm2反向柱梯度洗脫后的SDS-PAGE圖。1.收集峰1；2.收集峰2；3.收集峰3；4.包涵體5.收集峰4；6.收集峰5；7.低分子量蛋白marker，自上而下97.4、66.2、43.0、31.0、20.1KD。
圖14融合蛋白R(shí)N-TNFαm1、XE-TNFαm1及TNFα在殺傷試驗(yàn)中對(duì)SIV感染細(xì)胞的殺傷作用。
圖15融合蛋白XE-TNFαm2及TNFα在殺傷試驗(yàn)中對(duì)SIV感染細(xì)胞的殺傷作用。
圖16融合蛋白XE-TNFαm1、RN-TNFαm1在中和試驗(yàn)中對(duì)SIV感染細(xì)胞的保護(hù)作用。
圖17融合蛋白XE-TNFαm2在中和試驗(yàn)中對(duì)SIV感染細(xì)胞的保護(hù)作用。
圖18融合蛋白XE-TNFαm1、RN-TNFαm1在殺傷試驗(yàn)后的病毒滴度。
圖19融合蛋白XE-TNFαm1、RN-TNFαm1在殺傷試驗(yàn)后的病毒滴度。
圖20融合蛋白XE-TNFαm2在中和試驗(yàn)后的病毒滴度。
圖21融合蛋白XE-TNFαm2在中和試驗(yàn)后的病毒滴度。
圖22-1，2顯示殺傷試驗(yàn)前后細(xì)胞的形態(tài)的熒光照片，其中圖20-1為靶向性融合蛋白殺傷試驗(yàn)前細(xì)胞染色照片；圖20-2為靶向性融合蛋白殺傷試驗(yàn)后細(xì)胞染色照片，放大倍數(shù)均為200X。
圖23-1，2顯示中和試驗(yàn)前后細(xì)胞的形態(tài)的熒光照片，其中圖21-1為靶向性融合蛋白中和試驗(yàn)前細(xì)胞染色照片；圖21-2為靶向性融合蛋白中和試驗(yàn)后細(xì)胞染色照片，放大倍數(shù)均為200X。
圖24中和試驗(yàn)對(duì)照組NC+SIV，凋亡率為20.3％。
圖25中和試驗(yàn)XE-TNFαm2，凋亡率為11.3％。
圖26殺傷試驗(yàn)對(duì)照組NC/SIV，凋亡率為21.2％。
圖27殺傷試驗(yàn)對(duì)照組TNFαm2，凋亡率為20.8％。
圖28殺傷試驗(yàn)XE-TNFαm2，凋亡率為47.1％。
圖29重組質(zhì)粒pET30-RNTNFαm1的上游測(cè)序圖。
圖30重組質(zhì)粒pET30-RNTNFαm1的下游測(cè)序圖。
圖31重組質(zhì)粒pCW-XETNFαm1的上游測(cè)序圖。
圖32重組質(zhì)粒pCW-XETNFαm1的下游測(cè)序圖。
圖33重組質(zhì)粒pCW-XETNFαm2的測(cè)序圖。
圖34融合蛋XETNFαm2N端15個(gè)氨基酸序列的測(cè)定。
圖35融合蛋白XETNFαm2的MALDI-TOF MS檢測(cè)鑒定。
具體實(shí)施方案本發(fā)明中融合蛋白是由靶向分子和殺傷分子兩部分組成，這種靶向設(shè)計(jì)的關(guān)鍵是實(shí)現(xiàn)靶向分子的特異性結(jié)合和殺傷分子對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的高效殺傷。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，我們截取了CCR5的N端共30個(gè)氨基酸(N端1-30位)作為融合蛋白的靶向分子，CXCR4的共27個(gè)氨基酸(第二胞外區(qū)1-27位)，分別命名為RN、XE。盡管一些HIV病毒株需要CD4，CCR5和CXCR4的協(xié)同作用才能感染細(xì)胞，但研究表明，許多HIV病毒株僅依賴(lài)CCR5或CXCR4即可獨(dú)立感染細(xì)胞，不需要其它受體的參與。我們分別選用了RN、XE作為融合蛋白的靶向分子。并且，為了在E.coli系統(tǒng)獲得高表達(dá)，通過(guò)DNA合成以及PCR技術(shù)，RN、XE的氨基酸編碼序列均采用E.coli嗜好的密碼子。殺傷分子是腫瘤壞死因子α(TNFα)或其衍生物，其中兩種為T(mén)NFαm1和TNFαm2。靶向分子RN、XE是作為gp120識(shí)別靶細(xì)胞的通用錨定物。因?yàn)橹挥杏坞x的HIV病毒以及被HIV感染的細(xì)胞才會(huì)特異性地表達(dá)病毒的包膜蛋白gp120，因而利用RN、XE或其衍生物作為靶向分子可實(shí)現(xiàn)與被HIV感染細(xì)胞和游離病毒的特異性結(jié)合。而正常的未受病毒感染的細(xì)胞由于不表達(dá)gp120不會(huì)受到融合蛋白的殺傷?？膳cgp120特異結(jié)合的RN、XE能將具有殺細(xì)胞作用的TNFαm1和TNFαm2導(dǎo)向被HIV感染的細(xì)胞。被HIV/SIV感染的細(xì)胞有內(nèi)化(Internalization)功能，通過(guò)gp120介導(dǎo)的內(nèi)化作用而將TNFαm導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)部引發(fā)細(xì)胞凋亡。RN-TNFα、XE-TNFα編碼基因及其突變型可經(jīng)真核或原核系統(tǒng)表達(dá)獲得融合蛋白。
TNFα是一種單核因子，主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。此外，中性粒細(xì)胞、星狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞，也可產(chǎn)TNFα。TNFα發(fā)現(xiàn)于1975年，是一種人源性的細(xì)胞毒性因子，其毒性作用主要是通過(guò)與受體結(jié)合與內(nèi)化，進(jìn)而引發(fā)一系列的信號(hào)傳遞過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。TNFα引起兩種主要的細(xì)胞反應(yīng)，細(xì)胞毒和選擇性的轉(zhuǎn)錄激活。在NK和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒中TNFα的作用是Ca2+非依賴(lài)性的。TNFα三聚體同受體(主要是P55)結(jié)合，聚集成簇，受體復(fù)合物內(nèi)化，內(nèi)化的TNFα受體復(fù)合物可傳遞多種信號(hào)。一個(gè)可能的機(jī)制是通過(guò)G蛋白偶聯(lián)的活化作用激活磷脂酶A2通路，合成前列腺素和白三烯。同時(shí)，花生四烯酸等多不飽和脂肪酸的釋放和代謝在線粒體的電子傳遞系統(tǒng)被擾亂，開(kāi)始產(chǎn)生自由基，最終通過(guò)某些酶、脂的氧化和DNA降解作用殺死細(xì)胞。另一方面信息會(huì)很快導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NF KappaB的激活，活化的NF KappaB進(jìn)入細(xì)胞核，激活一系列基因的轉(zhuǎn)錄。TNFα在已知細(xì)胞因子中的抗腫瘤活性最強(qiáng)。對(duì)包括神經(jīng)纖維瘤、肺癌、乳腺癌、肌肉瘤和淋巴瘤等在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞系都具有明顯的殺傷作用，所以，美國(guó)政府早在1985年就批準(zhǔn)了用TNFα來(lái)治療惡性腫瘤的臨床試驗(yàn)申請(qǐng)。但由于原型TNFα過(guò)強(qiáng)的毒副作用，以致迄今未能成為臨床可用的治療惡性腫瘤的常規(guī)藥物。我們的一個(gè)關(guān)鍵的設(shè)計(jì)思想是認(rèn)為，TNFα的殺細(xì)胞活性是它的基本功能，從其作用機(jī)制看，如能將其準(zhǔn)確導(dǎo)入受HIV/SIV感染的細(xì)胞，同樣可以把被HIV/SIV感染的細(xì)胞殺滅，從而阻止HIV/SIV病毒的復(fù)制和繁殖。因此，運(yùn)用DNA重組技術(shù)將之構(gòu)建成表達(dá)融合蛋白R(shí)NTNFαm1、XE-TNFαm1和XE-TNFαm2的表達(dá)重組體，經(jīng)真核或原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出融合蛋白，然后純化復(fù)性。細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果表明，三種融合蛋白可特異強(qiáng)烈殺滅被HIV/SIV感染的細(xì)胞，與此同時(shí)，該融合蛋白的靶向分子RN、XE還能高效中和游離的HIV/SIV，而使其失活。因此這三種融合蛋白都是雙功能的活性多肽。并且，未被HIV/SIV感染的正常細(xì)胞在加入這兩種融合蛋白以后，其生長(zhǎng)不受影響，證明融合蛋白有良好的安全性。作為對(duì)照，原型TNFα既不能殺傷受HIV/SIV感染的細(xì)胞，也不能中和游離的HIV/SIV病毒，進(jìn)一步驗(yàn)證了我們的設(shè)計(jì)。同時(shí)，由于RN、XE和TNFαm均來(lái)自人體，最大限度降低了免疫原性。因此，本發(fā)明構(gòu)建的三種融合蛋白用于抗HIV/SIV有著良好的特異性和安全性，是一種富有前景的治療艾滋病的潛在藥物。
另外，關(guān)于該融合蛋白是否具有免疫原性，RN、XE與TNFα均為人源蛋白，原則上說(shuō)，已經(jīng)盡可能地減小了免疫原性。盡管E.coli系統(tǒng)研制的多數(shù)活性多肽藥物均有一定的免疫原性，但并不影響其臨床應(yīng)用。本發(fā)明選取密碼子為E.coli.嗜好的編碼CCR5的N末端(RN)的30個(gè)氨基酸(N末端第1位至30位)的編碼序列作為靶向分子，與利用PCR技術(shù)得到的強(qiáng)效腫瘤壞死因子alpha(TNFα)的衍生物TNFαm1構(gòu)建表達(dá)重組體p30a-RNTNFαm1。選取人工合成的密碼子為E.coli.嗜好的編碼CXCR4的第二胞外環(huán)區(qū)(XE)的27個(gè)氨基酸(第二胞外環(huán)區(qū)第1位至27位)基因編碼序列作為靶向分子，與利用PCR技術(shù)得到的強(qiáng)效腫瘤壞死因子α(TNFα)的衍生物TNFαm1和TNFαm2的基因片段重組，構(gòu)建表達(dá)重組體pCW-XETNFαm1和pCW-XETNFαm2。
將以下描述的表達(dá)型重組體pCW-XETNFαm1、pCW-XETNFαm2和p30a-RNTNFαm1分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α和BL21，經(jīng)篩選獲高表達(dá)工程菌pCW-XETNFαm1/DH5α、pCW-XETNFαm2/DH5α和p30a-RNTNFαm1/BL21。行SDS-PAGE膠分析，重組融合蛋白XETNFαm1、RNTNFαm1和XETNFαm2分別約占菌體總蛋白的27.4％、15.6％、38.6％。對(duì)pCW-XETNFαm1/DH5α、p30a-RNTNFαm1/BL21高表達(dá)株進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)誘導(dǎo)，提取包涵體，8M尿素溶解，經(jīng)SDS-PAGE凝膠切割后電洗脫回收蛋白。經(jīng)冰凍酸性丙酮除去SDS，經(jīng)過(guò)透析、復(fù)性。融合蛋白XETNFαm2經(jīng)反相高效液相色譜柱純化，目的蛋白主要在30％RB處被洗脫(層析條件為起始緩沖液RA10％乙睛，0.05％TFA；洗脫緩沖液RB90％乙睛，0.05％TFA)。
蛋白定量后，殺傷試驗(yàn)中，融合蛋白R(shí)NTNFαm1和XE-TNFαm1藥物終濃度分別為8、16、32、64、128μg/ml；XE-TNFαm2的藥物終濃度分別為1、2、4、8、16μg/ml，于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中分別處理2.0×105/ml被SIV感染的CEMx-174細(xì)胞及未被病毒感染的正常細(xì)胞。設(shè)立正常的CEMx-174細(xì)胞對(duì)照組和1640培養(yǎng)基的調(diào)零孔。在殺傷試驗(yàn)中，以蛋白處理過(guò)的感染SIV的CEMx-174細(xì)胞為試驗(yàn)組，以未加蛋白的感染SIV的CEMx-174細(xì)胞為對(duì)照組。同時(shí)為評(píng)價(jià)融合蛋白的安全性和證實(shí)融合蛋白作用的靶向性，設(shè)立融合蛋白作用于正常細(xì)胞的對(duì)照組；為證實(shí)融合蛋白作用的機(jī)制，設(shè)立了野生型TNFα作用于SIV感染細(xì)胞的對(duì)照組。殺傷試驗(yàn)的結(jié)果顯示，三種種融合蛋白在各自的劑量范圍內(nèi)對(duì)SIV感染細(xì)胞有明顯的殺傷作用，并且呈良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，三種融合蛋白對(duì)正常的未感染SIV的CEMx-174細(xì)胞無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的殺傷作用，融合蛋白的安全性得以保障，并證實(shí)了靶向性融合蛋白的特異性殺傷作用，符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求。同時(shí)，在中和試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組OD值均顯著高于對(duì)照組，在各自的劑量范圍內(nèi)對(duì)SIV感染細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用，并且呈良好的劑量-效應(yīng)依賴(lài)關(guān)系。同時(shí)還有滴度試驗(yàn)支持以上結(jié)果。而對(duì)于經(jīng)液相色譜純化的融合蛋白XE-TNFαm2，還通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定各試驗(yàn)組的凋亡率進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)設(shè)計(jì)。
細(xì)胞試驗(yàn)的結(jié)果表明，本發(fā)明中的三種融合蛋白R(shí)NTNFαm1、XE-TNFαm1和XE-TNFαm2，用于抗HIV/SIV，有著良好的特異性和安全性，是一種富有前景的治療艾滋病的潛在藥物。
本發(fā)明提供了包含所述融合蛋白基因以及含該基因的表達(dá)型重組體。
優(yōu)選地，所述融合蛋白中的受體多肽是能夠與gp120和/或gp41特異性結(jié)合的RN、XE，或者它們的相關(guān)片斷，類(lèi)似物或突變體。
優(yōu)選地，由于CCR5N端30個(gè)氨基酸(RN)對(duì)于CCR5結(jié)合gp120分子是足夠的，截取了CCR5N端30個(gè)氨基酸(RN)作為受體多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。優(yōu)選地，由于CXCR4第二胞外環(huán)區(qū)27個(gè)氨基酸(XE)對(duì)于CXCR4結(jié)合gp120分子是足夠的，截取了CXCR4全長(zhǎng)中的第二胞外環(huán)區(qū)27個(gè)氨基酸(XE)作為受體多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。
更優(yōu)選地，為了實(shí)現(xiàn)融合蛋白在E.coli.系統(tǒng)中的高效表達(dá)，RN基因片段系人工合成的突變的E.coli.嗜好的DNA序列，其DNA序列如SEQ ID NO1所示。XE基因片段系人工合成的突變的E.coli.嗜好的DNA序列，其DNA序列如SEQ IDNO2所示。
優(yōu)選地，所述的功能多肽是TNF家族成員，如TNFα，TNFβ(又名淋巴毒素，lymphotoxin，LT)，TNFγ，或其衍生物或其突變體，或TNF超家族成員，如Trail(Tumor related Apoptosis induced ligand)，Light(for homologous tolymphotoxins，exhibitsInducible expression，and competes with HSVGlycoprotein DforHVEM，a receptor expressed byTlymphocytes，Light；，又稱(chēng)為HEVMLherpesvirus entry mediator ligand)以及是它們的活性功能區(qū)域、突變體或類(lèi)似物?；蛘呤蔷哂辛呀饧?xì)胞作用來(lái)源于人體的穿孔素(human perforin，HP；pore formingprotein，PFP)，可形成補(bǔ)體攻擊復(fù)合物的補(bǔ)體成分C9，顆粒溶解素(granulysin)；或者可引起凋亡的來(lái)源于人體的顆粒酶家族的顆粒酶A，B，C，D，E(GranzymeA，B，C，D，E)，絲氨酸酯酶(serine esterases)；直接參與細(xì)胞凋亡的的蛋白激酶C(PKC)，蛋白激酶A(APK)，天冬氨酸激酶(caspases)，細(xì)胞色素，DNA核酸內(nèi)切酶；可以抵御細(xì)菌的多肽和酶，如溶菌酶(Lysosome)，防御素(defensin)；具有抑制腫瘤作用的P53以及是它們的活性功能區(qū)域、突變體或類(lèi)似物。
更優(yōu)選地，其中所述功能多肽是TNFα的突變體TNFαm1和TNFαm2。本發(fā)明依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)導(dǎo)，采用兩種方式改造TNFα的結(jié)構(gòu)，其一是在TNFαN端第一位氨基酸Val前增加兩個(gè)氨基酸Gly，Thr在其后增加三個(gè)氨基酸Arg，Gly，Pro成為采用TNFαm1；其二是將原型TNFα的N端前7個(gè)氨基酸缺失突變，并將Pro8，Ser9，Asp10突變?yōu)锳rg8，Lys9，Arg10，獲得減毒增效的TNFαm2，以降低其毒副作用使之可以更適用于臨床，同時(shí)提高其抗腫瘤活性。
本發(fā)明提供了三種編碼抗愛(ài)滋病的新型靶向融合蛋白R(shí)NTNFαm1、XE-TNFαm1和XE-TNFαm2，分別具有SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ IDNO13的核苷酸序列。
另一方面，本發(fā)明提供了包含所述基因RNTNFαm1、XE-TNFαm1和XE-TNFαm2的表達(dá)型重組體pET30RNTNFαm1、pCWXE-TNFαm1、pCWXE-TNFαm2以及工程菌p30a-RNTNFαm1/BL21、pCW-XETNFαm1/DH5α和pCW-XETNFαm2/DH5α。以及大量制備、純化和復(fù)性蛋白的技術(shù)路線。
以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
實(shí)施例1.溫控型表達(dá)型重組體pET30a-RNTNFαm1的獲得1.1PCR引物及其序列1.1.1博亞公司合成TNFαm1引物Forward primer 25bp含KpnI位點(diǎn)Reverse primer 25bp含BamHI位點(diǎn)1.1.2博亞公司合成pCW111的測(cè)序引物Forward primer 5’-AAAAAGGGCATCAAATTAAACC-3’Reverse primer 5’-TCGGCGATATAGGCGCCAGC-3’1.1.3博亞公司合成RN引物上游引物1 27bp含NdeI位點(diǎn)下游引物 27bp含KpnI位點(diǎn)
1.2突變型TNFαm1的獲得PCR反應(yīng)條件為94℃變性3分鐘后開(kāi)始循環(huán)94℃變性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒。經(jīng)25個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10分鐘。使用的擴(kuò)增酶高保真Pfu。以1.0％瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物中的目的片段，得到514bp左右的DNA片段。
利用TNFαm1 PCR引物對(duì)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的TNFαcDNA。進(jìn)行特異擴(kuò)增，其結(jié)果是在TNFαcDNA的5’端引入1個(gè)KpnI位點(diǎn)(GGT ACC)和幾個(gè)額外的編碼氨基酸的密碼子GGT ACCGTAAGA GGT CCA(其中帶下劃線的為較原型比多出來(lái)的密碼子)，這段DNA序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為Gly ThrValArg Gly Pro(帶下劃線的為較原型比多出來(lái)的氨基酸).同時(shí)，還在其3’端引入1個(gè)BamHI位點(diǎn)(GGATCC)和2個(gè)終止密碼子(UAA UGA)。
1.3RN片斷的獲得PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3分鐘開(kāi)始循環(huán)94℃變性30秒，58℃退火35秒，72℃延伸30秒。經(jīng)過(guò)25個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10分鐘。使用高保真的pfu酶，以2.5％瓊脂糖凝膠回收，得到約90bp的PCR產(chǎn)物。
利用TNFαm1 RN引物對(duì)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的CCR5cDNA為模板經(jīng)PCR得到含CCR5N端前30個(gè)氨基酸的編碼序列，即RN，同時(shí)在上游引入NdeI位點(diǎn)、下游引入KpnI位點(diǎn)。
1.4.重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-RNTNFαm1的構(gòu)建用BamH I及Nde I雙酶切處理pCW111質(zhì)粒，回收4887bp的酶切產(chǎn)物，與經(jīng)NdeI、KpnI雙酶切處理的RNPCR產(chǎn)物，經(jīng)BamHI、KpnI雙酶切處理的TNFαm1 PCR產(chǎn)物連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布在含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB瓊脂平板上，利用藍(lán)白板篩選陽(yáng)性克隆。按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第二版)(J.薩姆布魯克，等.主編，金冬雁等譯，科學(xué)出版社，1992)的堿裂解法小量制備抗性克隆的質(zhì)粒DNA，限制性分析證實(shí)質(zhì)粒插入片段大小與目的基因相符，獲得重組質(zhì)粒pCW-RNTNFαm1。由于RNTNFαm1融合基因在pCW111中不表達(dá)，將重組質(zhì)粒pCW-RNTNFαm1和載體pET30a(+)分別用BamH I及Nde I雙酶切處理，將片斷RNTNFαm1平移至pET30a(+)獲得表達(dá)重組質(zhì)粒pET30a-RNTNFαm1。重組體構(gòu)建示意圖見(jiàn)圖1，酶切鑒定見(jiàn)圖4，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖29，30。
實(shí)施例2.表達(dá)型重組體pCW-XETNFαm1的構(gòu)建對(duì)用pfu酶擴(kuò)增獲得的TNFαm1的平端PCR產(chǎn)物與經(jīng)EcoRV酶切處理的pBSks質(zhì)粒片段平端連接。轉(zhuǎn)化前取約0.1μlEcoRV處理酶連產(chǎn)物，置37℃水浴一小時(shí)。將因通過(guò)EcoRV酶切位點(diǎn)自連而形成的pBSks空質(zhì)粒線性化，有效降低載體的自連。因插入方向不同，得到兩種產(chǎn)物，通過(guò)BamHI單酶切，舍去無(wú)法切出約500bp的片段反向插入產(chǎn)物，用ApaI、KpnI雙酶切處理定向的pBS-TNFαm1正向連接產(chǎn)物，回收534bp的片段。人工合成的質(zhì)粒pGEM-XE含大腸桿菌嗜好的編碼CXCR4N端的前27個(gè)氨基酸(即XE)的編碼序列。將質(zhì)粒pGEM-XE和用ApaI、KpnI雙酶切處理后回收大片段，與同樣經(jīng)過(guò)ApaI和KpnI雙酶切處理后回收的pBS-TNFαm1酶切產(chǎn)物小片段連接，獲得質(zhì)粒pGEM-XETNFαm1。用BamHI、NdeI雙酶切處理質(zhì)粒pGEM-XETNFαm1及載體pCW111，將融合基因XETNFαm1平移至載體pCW111，獲得表達(dá)重組體pCW-XETNFαm1。重組體構(gòu)建示意圖見(jiàn)圖2，酶切鑒定見(jiàn)圖4，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖31，32。
實(shí)施例3.表達(dá)型重組質(zhì)粒pCW-XETNFαm2的構(gòu)建3.1TNFαm2片段的獲得以pCW-XETNFαm1為模板，博亞公司合成引物上游引物 30bp含PstI和KpnI位點(diǎn)下游引物 25bp含BamHI位點(diǎn)PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3分鐘開(kāi)始循環(huán)94℃變性30秒，56℃退火35秒，72℃延伸50秒。經(jīng)過(guò)25個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10分鐘。使用高保真的pfu酶，以1.5％瓊脂糖凝膠回收，得到約477bp的PCR產(chǎn)物。利用TNFαm2PCR引物對(duì)對(duì)質(zhì)粒pCW-CD4V1TNFαm1進(jìn)行特異擴(kuò)增，其結(jié)果是獲得將原型TNFα的N端前7個(gè)氨基酸缺失突變，并將Pro8，Ser9，Asp10突變?yōu)閍rg8，Lys9，Arg10，獲得的減毒強(qiáng)效突變的TNFαm2。同時(shí)，還在其3’端引入1個(gè)BamHI位點(diǎn)(GGA TCC)和2個(gè)終止密碼子(UAA UGA)。將pfu酶擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切，玻璃奶回收酶切產(chǎn)物后，與經(jīng)過(guò)BamHI和XhoI雙酶切處理的PBSSK粘端連接，獲得重組質(zhì)粒pBS-TNFαm2。
3.2重組質(zhì)粒pCW-XETNFαm2的構(gòu)建將pBS-TNFαm2經(jīng)KpnI和BamHI雙酶切處理，回收477bp的酶切產(chǎn)物，與經(jīng)過(guò)同樣雙酶切處理的pCW-XETNFαm1回收得到的載體連接，獲得表達(dá)型重組質(zhì)粒pCW-XETNFαm2。其重組質(zhì)粒構(gòu)建見(jiàn)圖3，酶切鑒定見(jiàn)圖5，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖33。
實(shí)施例4.融合蛋白XE-TNFαm1、RNTNFαm1和XE-TNFαm2在大腸桿菌中的表達(dá)4.1目的蛋白的表達(dá)與鑒定將表達(dá)重組體pCW-XETNFαm1、pCW-XETNFαm2轉(zhuǎn)化DH5α，然后接種于5ml LB培養(yǎng)基，同時(shí)加入終濃度為100mg/ml的氨芐青霉素，32℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜。按2％接種量重新接種兩管5ml LB/Amp+培養(yǎng)液。在32℃下振搖培養(yǎng)至OD600約為0.6時(shí)。然后分出一管置于42℃搖床，振搖培養(yǎng)誘導(dǎo)5h；另一管繼續(xù)在32℃振蕩培養(yǎng)5h，作為對(duì)照。將p30a-RNTNFαm1轉(zhuǎn)化BL21，然后然后接種于5ml LB培養(yǎng)基，同時(shí)加入終濃度為100mg/ml的卡那霉素，37℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜。在37℃下振搖培養(yǎng)至OD600約為0.6時(shí)。然后分出一管加入1mMIPTG，置于37℃搖床，振搖培養(yǎng)誘導(dǎo)5h；另一管繼續(xù)在37℃振蕩培養(yǎng)5h，作為對(duì)照。4000g離心收集菌體，加入上樣緩沖液(50mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，100mmol/L DTT，2％SDS，0.1％溴酚藍(lán)，10％甘油)，混勻，置于100℃沸水浴保持5min。10000g離心1min，取上清進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。目的蛋白質(zhì)表達(dá)量通過(guò)Chromscan3快速凝膠掃描儀于626nm波長(zhǎng)處掃描，并計(jì)算表達(dá)量。詳細(xì)方法參見(jiàn)參見(jiàn)盧圣棟主編的《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》第二版，365-387頁(yè)。
4.2結(jié)果經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，pCW-XETNFαm1/DH5α、p30a-RNTNFαm1/BL21表達(dá)的目的蛋白分別在約21kD、21kD處有明顯的蛋白帶出現(xiàn)，而未誘導(dǎo)樣品在相應(yīng)位置上沒(méi)有該條帶，蛋白大小與預(yù)期一致，初步斷定為目的蛋白，見(jiàn)圖6，圖7。經(jīng)SDS-PAGE凝膠激光掃描分析，XETNFαm1、RNTNFαm1目的蛋白分別占細(xì)胞總蛋白的27.4％、15.6％，見(jiàn)圖9、10。pCW-XETNFαm2/DH5α在大約20kD處有特異的蛋白表達(dá)條帶，見(jiàn)圖8，與預(yù)期分子量一致。經(jīng)激光密度掃描，其表達(dá)蛋白在總蛋白中的含量分別為38.6％，見(jiàn)圖11。
實(shí)施例5.融合蛋白XE-TNFαm1、RNTNFαm1和XE-TNFαm2的大量制備與純化、復(fù)性。
5.1大體積培養(yǎng)工程菌pCW-XETNFαm1/DH5α、pCW-XETNFαm2/DH5α接種于50m1 LB培養(yǎng)基，同時(shí)加入終濃度為100mg/ml的氨芐青霉素，32℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜。按2％接種量重新接種于兩瓶分別含有500ml LB/Amp+培養(yǎng)液的2L三角瓶中。在32℃下振搖培養(yǎng)至OD600約為0.6時(shí)。然后置于42℃繼續(xù)振搖培養(yǎng)誘導(dǎo)5h。工程菌p30a-RNTNFαm1/BL21接種于50ml LB培養(yǎng)基，同時(shí)加入終濃度為100mg/ml的卡那霉素，37℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜。按2％接種量重新接種于兩瓶分別含有500ml LB/Ka+培養(yǎng)液的2L三角瓶中。在37℃下振搖培養(yǎng)至OD600約為0.6時(shí)，加入IPTG1mM，繼續(xù)振搖培養(yǎng)誘導(dǎo)5h。4000g離心、收集菌體，置于-20℃反復(fù)凍融。
5.2包涵體的制備5.2.1洗滌細(xì)胞
6000g×15分鐘離心收集細(xì)菌，稱(chēng)重濕菌體。
用3％Triton X-100洗滌菌體，攪拌器上攪勻30分鐘，6000g×15分鐘離心收集用量為10ml-50ml緩沖液/1g濕菌體(包括下列各種洗滌緩沖液)。
5.2.2破細(xì)胞用緩沖液將細(xì)胞懸浮，緩沖液配制50mmol/L Tris.Cl(pH8.5-9.0)，2mmol/LEDTA，100mmol/L NaCl，0.5％Triton X-100，溶菌酶1mg/ml)。用攪拌器在室溫下攪拌，使得懸浮液因溶菌酶的作用而粘稠。
5.2.3超聲處理每次超打10秒，間隔15秒，20-50次作用(視菌體濃度而定)，至菌體不再粘稠為止。然后離心收集，6000g×15分鐘。上述操作應(yīng)在冰水中進(jìn)行，為防止炭化，超聲功率不宜過(guò)大，在玻璃燒杯中進(jìn)行較好，超聲波探頭深入液面大于3厘米，距杯底2厘米位好。
5.2.45％Triton X-100洗滌用緩沖液徹底懸浮沉淀，攪拌并超聲波處理30次，參見(jiàn)上述步驟2.3。緩沖液為50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，2mmol/L EDTA，5％TritonX-100。離心收集沉淀，6000g×15分鐘。
5.2.5包涵體的保存與溶解用少量8M尿素逐漸溶解包涵體，取20μl溶液加入2X上樣緩沖液，混勻，沸水中煮3-5分鐘。取20ul進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。其余包涵體可凍存于-70℃。
5.3.目的蛋白的純化取上述的包涵體溶液，加入等體積2x上樣緩沖液中，進(jìn)行15％的SDS-PAGE電泳。
5.3.1.融合蛋白XE-TNFαm1、RNTNFαm1和XE-TNFαm2的純化5.3.1.1凝膠切割切下蛋白Marker泳道所在的膠條和少部分樣品膠條，將其放入快速染色液中速染15分鐘，剩余凝膠用保鮮膜包好置于4℃冰箱。速染的膠條脫色顯出條帶后，將膠條與剩余的凝膠對(duì)比，切下含目的帶部分的凝膠條。
5.3.1.2.電洗脫將切下的凝膠條及凝膠浸泡液裝入透析袋中并置于水平電泳槽中，加入蛋白電泳洗脫進(jìn)行恒壓100v電泳。電泳10～12h后將洗脫液還位透析液再電泳10～12h。將透析袋中的浸泡液倒入50ml離心管中，如溶液較多可先用適量PEG10000濃縮。
5.3.1.3.痕量SDS的去除在離心管中加入5倍體積以上的冰凍酸性丙酮-甲醇蛋白沉淀液，20℃沉淀過(guò)夜。10,000r/m離心10分鐘，去掉上清收集沉淀。將收集的沉淀用蛋白沉淀液洗滌1次。
5.3.2.融合蛋白XE-TNFαm2的純化在反向柱純化過(guò)程中，通過(guò)梯度洗脫發(fā)現(xiàn)該蛋白的洗脫峰在30％左右，見(jiàn)圖12，13。因此收集該峰并進(jìn)行凍干。將凍干樣品溶解于生理鹽水中，0.22μm過(guò)濾膜后電泳以觀察該重組蛋白的溶解情況，電泳發(fā)現(xiàn)該當(dāng)?shù)鞍椎募兌容^高時(shí)，能夠較好地溶解于生理鹽水中，當(dāng)含有雜蛋白時(shí)，會(huì)出現(xiàn)乳白色沉淀。將收集到的樣品溶解于生理鹽水后過(guò)0.22μm濾膜，凍干，完全去除乙腈后保存至-80℃冰箱。層析條件層析注Waters AP-1空柱自填6mlSource15RPC樹(shù)脂；起始緩沖液RA10％乙睛，0.05％TFA；洗脫緩沖液RB90％乙睛，0.05％TFA；樣品每次上樣2ml；流速2ml；梯度0-100％，15min收集目的蛋白主要在30％RB處被洗脫。
5.4融合蛋白的復(fù)性5.4.1融合蛋白XE-TNFαm1和RNTNFαm1的復(fù)性將洗滌后的蛋白沉淀用變性緩沖液(6mol/L鹽酸胍，0.1mol/Ltris-HCl，PH 8.6，1mmol/L EDTA，0.05mmol/L NaCl，10mmol/L DDT)在冰浴中溶解后轉(zhuǎn)入透析袋內(nèi)，同時(shí)在透析袋內(nèi)加入蛋白復(fù)性液(50mmol/L Tris-HCl，PH8.0，1mmol/LEDTA，0.25mol/L NaCl，0.25mol/L左旋精氨酸，5mmol/L DDT)中，于蒸餾水中4℃透析48小時(shí)以使蛋白復(fù)性。
5.4.2融合蛋白XE-TNFαm2的復(fù)性反相柱收集到的蛋白含有乙腈這樣的有機(jī)溶劑，盡管冷凍抽干已經(jīng)將有機(jī)溶劑完全去除，但為了更好地使蛋白復(fù)性，在細(xì)胞試驗(yàn)前一天，用細(xì)胞培養(yǎng)基溶解蛋白干粉，在蛋白透析復(fù)性緩沖液中透析24小時(shí)，然后將復(fù)性好的蛋白溶液過(guò)濾除菌，同時(shí)定量。
蛋白復(fù)性緩沖液的配制Tris-HCI 20mM(pH7.2).
GSH/GSSG 4mM/1mM精氨酸0.1M透析液的配制Tris-HCI 20mM(pH7.2)實(shí)施例6.融合蛋白XE-TNFαm2理化指標(biāo)的測(cè)定6.1融合蛋XETNFαm2氨基酸序列的測(cè)定將凍干的蛋白樣品由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室利用ABI Procise491型測(cè)序儀，進(jìn)行N端氨基酸測(cè)序。結(jié)果表明其序列為MNVSEADDRYIXDRF。與理論值完全符合。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)“氨基酸序列分析鑒定書(shū)”(見(jiàn)附錄1)。
6.2融合蛋白XETNFαm2的MALDI-TOF MS檢測(cè)鑒定
6.2.1考馬斯亮藍(lán)染色凝膠膠內(nèi)酶切肽譜的樣品制備6.2.1.1脫色1)將蛋白帶切下，用刀片將膠帶切成小塊，水洗數(shù)次。
2)用約5倍體積的含50％乙氰的25mM碳酸氫銨溶液浸泡片(50-100μl)，振蕩20min，放在室溫1hr.，使膠塊完全脫水(直至無(wú)藍(lán)色為好)。
3)棄上清，旋轉(zhuǎn)真空干燥后，加入25-30μl酶液(25μg/m含25mM碳酸氫銨)，4℃冰箱中放置20-30min，使酶液完全被吸收(如酶液不夠，可補(bǔ)充5-10μl)。
4)37℃保溫反應(yīng)12小時(shí)以上或過(guò)夜。
6.2.1.2.肽提取1)加5％TFA-50％ACN 100μl，于37℃保溫1小時(shí)。
2)吸出上清液，置于另一個(gè)Eppendrof管中，再向膠塊管加入2.5％TFA-50％ACN溶液100μl，于37℃保溫1小時(shí)，吸出上清。
3)合并上清液，旋轉(zhuǎn)真空干燥。
6.2.1.3.質(zhì)譜樣品的制備1)樣品含量較高時(shí)，用3-6μl 0.5％TFA溶液溶解樣品，取1μl樣品與1μl Matrix混勻，測(cè)MALDI-TOF-MS串連質(zhì)譜分析鑒定出相關(guān)蛋白為人屬的腫瘤壞死因子alpha，并測(cè)定其分子量為17.4KD，等電點(diǎn)為8.6(見(jiàn)附錄2)。
實(shí)施例7重組靶向融合蛋白對(duì)SIV感染的CEMX-174的殺傷作用7.1模式細(xì)胞的制備由于HIV不感染其它動(dòng)物的CD4陽(yáng)性細(xì)胞，因而迄今尚無(wú)一種人的艾滋病動(dòng)物模型。猩猩感染HIV-1后僅僅表現(xiàn)為暫時(shí)性的T細(xì)胞數(shù)量的改變以及產(chǎn)生抗體，并不發(fā)展成艾滋病臨床癥狀。研究發(fā)現(xiàn)HIV-2和SIVMAC9亞洲短尾猴種分離的免疫缺陷病毒的核苷酸序列有大約75％甚至更高的同源性，與HIV-1僅有45％的同源性。但由于SIV和HIV-1在感染、復(fù)制、和調(diào)控方面基本相似，可通過(guò)研究SIV引起的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物艾滋病作為研究人類(lèi)艾滋病的基礎(chǔ)。因此本實(shí)驗(yàn)采用SIV進(jìn)行初步的體外實(shí)驗(yàn)來(lái)反應(yīng)靶向融合蛋白地抗HIV/SIV作用。
本試驗(yàn)所使用的模式細(xì)胞為CEMX-174細(xì)胞株(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物研究所病毒室)。具體地，首先將液氮保存的CEMX-174細(xì)胞復(fù)蘇，轉(zhuǎn)接于含10％胎牛血清(天津三得利公司)的1640培養(yǎng)基(Gibco-BRL公司，洛克維爾，馬里蘭州，美國(guó))的100ml的培養(yǎng)瓶中，37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48小時(shí)后換液，隨后在培養(yǎng)液中加入病毒滴度大于5120的SIV，來(lái)感染CEMX-174細(xì)胞。由于該細(xì)胞易于被感染且效率高，所以每隔6-8小時(shí)在顯微鏡下觀察細(xì)胞被感染情況，包括被感染細(xì)胞的百分率以及細(xì)胞的形態(tài)改變等。經(jīng)過(guò)4-5天的培養(yǎng)和反復(fù)感染，用免疫熒光檢測(cè)感染效率，平均感染率約47％。
7.2實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果7.2.1MTT法測(cè)定細(xì)胞活性以往細(xì)胞試驗(yàn)都是通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)估計(jì)細(xì)胞活性的，這樣因其主觀因素和自身許多缺陷使得結(jié)果可信度不高。本發(fā)明采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性。MTT的商品名為噻唑藍(lán)，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源的MTT還原成難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶，并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的藍(lán)紫色結(jié)晶。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其OD值，可間接反映活性細(xì)胞的數(shù)量。在一定范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成量與細(xì)胞數(shù)量成正比。所以本發(fā)明采用MTT測(cè)定細(xì)胞活性，提高結(jié)果的客觀性、可信度。
7.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果及說(shuō)明本試驗(yàn)采用5個(gè)劑量組，使融合蛋白XE-TNFαm1、RNTNFαm1藥物終濃度為8、16、32、64、128μg/ml，融合蛋白XE-TNFαm2藥物終濃度為1，2，4，8，16μg/ml。于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中分別處理2.0×105/ml被SIV感染的CEMx-174細(xì)胞及未被病毒感染的正常細(xì)胞。設(shè)立正常的CEMx-174細(xì)胞對(duì)照組和1640培養(yǎng)基的調(diào)零孔。在殺傷試驗(yàn)中，以蛋白處理過(guò)的感染SIV的CEMx-174細(xì)胞為試驗(yàn)組，以未加蛋白的感染SIV的CEMx-174細(xì)胞為對(duì)照組。同時(shí)為評(píng)價(jià)融合蛋白的安全性和證實(shí)融合蛋白作用的靶向性，設(shè)立融合蛋白作用于正常細(xì)胞的對(duì)照組；為證實(shí)融合蛋白作用的機(jī)制，設(shè)立了野生型TNFα作用于SIV感染細(xì)胞的對(duì)照組。48小時(shí)后通過(guò)熒光染色和計(jì)數(shù)得出試驗(yàn)組和各種對(duì)照組的SIV感染的熒光百分比(每500個(gè)細(xì)胞中，計(jì)數(shù)SIV感染細(xì)胞的合胞體形成率)，同時(shí)用MTT法測(cè)定細(xì)胞OD值，算出融合蛋白的殺傷率。對(duì)相對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)組和對(duì)照組的存活細(xì)胞的OD值進(jìn)行方差分析(analysis of variance)和配對(duì)T檢驗(yàn)，結(jié)果顯示(見(jiàn)表1-1，1-2，2-1，2-2)。殺傷試驗(yàn)的結(jié)果顯示，在8、16、32、64、128μg/ml的劑量范圍下，融合蛋白XE-TNFαm1對(duì)感染SIV的CEMx-174細(xì)胞的殺傷率分別為17.3％，32.9％，38.7％，45.4％，54.9％；融合蛋白R(shí)NTNFαm1對(duì)感染SIV的CEMx-174細(xì)胞的殺傷率分別為16.2％，20.3％，28.2％，31.7％，33.7％。在1，2，4，8，16μg/ml的劑量范圍內(nèi)，融合蛋白XE-TNFαm2對(duì)感染SIV的CEMx-174細(xì)胞的殺傷率分別為21.0％，30.0％，37.6％，49.8％，65.3％。由此可見(jiàn)，三種融合蛋白實(shí)驗(yàn)組OD值均顯著低于對(duì)照組，在各自的劑量范圍內(nèi)對(duì)SIV感染細(xì)胞有明顯的殺傷作用，并且呈良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系(見(jiàn)圖14，15)。同時(shí)，單獨(dú)用TNFα蛋白分別在8、16、32、64、128μg/ml和1、2、4、8、16μg/ml劑量下對(duì)感染SIV的CEMx-174細(xì)胞后，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，MTT法顯示對(duì)照組和用藥組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(**P＞0.20)，可認(rèn)為T(mén)NFα對(duì)SIV感染細(xì)胞無(wú)殺傷作用。說(shuō)明了單獨(dú)的TNFα蛋白由于沒(méi)有靶向分子的介導(dǎo)，對(duì)感染SIV的CEMx-174細(xì)胞不具備殺傷作用。驗(yàn)證了三種融合蛋白對(duì)感染SIV的CEMx-174細(xì)胞的殺傷作用必須通過(guò)靶向性分子的介導(dǎo)，符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求。表四的數(shù)據(jù)顯示，三種融合蛋白在各自的劑量下作用于未感染SIV的CEMx-174正常細(xì)胞，其細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和正常細(xì)胞的生長(zhǎng)情況無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異，**P＞0.20。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，三種融合蛋白對(duì)正常的未感染SIV的CEMx-174細(xì)胞無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的殺傷作用，融合蛋白的安全性得以保障，并證實(shí)了靶向性融合蛋白的特異性殺傷作用，符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求。
殺傷率＝1-(對(duì)照組OD值-調(diào)零組OD值)×對(duì)照組感染率÷(試驗(yàn)組OD值-調(diào)零組OD值)×試驗(yàn)組感染率表1-1.殺傷試驗(yàn)結(jié)果

說(shuō)明1每組劑量有3個(gè)平行孔，每個(gè)孔用MTT法測(cè)定3次
2NC代表正常的CEMx-174細(xì)胞，NC/SIV代表感染了SIV的CEMx-174細(xì)胞，熒光計(jì)數(shù)百分比即為感染率3各融合蛋白作用組測(cè)定的OD值與對(duì)照組(NC/SIV)相比較，均有顯著性差異*P＜0.054TNFα作用組與對(duì)照組(NC/SIV)相比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(**P＞0.20)5數(shù)值的計(jì)算方法見(jiàn)正文說(shuō)明表1-2.殺傷試驗(yàn)結(jié)果

說(shuō)明1每組劑量有3個(gè)平行孔，每個(gè)孔用MTT法測(cè)定3次2NC代表正常的CEMx-174細(xì)胞，NC/SIV代表感染了SIV的CEMx-174細(xì)胞，熒光計(jì)數(shù)百分比即為感染率3各融合蛋白作用組測(cè)定的OD值與對(duì)照組(NC/SIV)相比較，均有顯著性差異*P＜0.054TNFα作用組與對(duì)照組(NC/SIV)相比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(**P＞0.20)5數(shù)值的計(jì)算方法見(jiàn)正文說(shuō)明表2-1.融合蛋白對(duì)正常CEMx-174細(xì)胞的作用


說(shuō)明1每組劑量有3個(gè)平行孔，每個(gè)孔用MTT法測(cè)定3次2NC代表正常的CEMx-174細(xì)胞3各融合蛋白作用組與對(duì)照組(NC/SIV)相比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(**P＞0.20)表2-2.融合蛋白對(duì)正常CEMx-174細(xì)胞的作用

說(shuō)明1每組劑量有3個(gè)平行孔，每個(gè)孔用MTT法測(cè)定3次2NC代表正常的CEMx-174細(xì)胞3各融合蛋白作用組與對(duì)照組(NC/SIV)相比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異(**P＞0.20)實(shí)施例8重組靶向融合蛋白XETNFαm1、RNTNFαm1和XETNFαm2對(duì)SIV感染的CEMX-174的保護(hù)作用8.1模式細(xì)胞的制備同7.18.2實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果8.2.1MTT法測(cè)定細(xì)胞活性同7.2.18.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果及說(shuō)明用正常培養(yǎng)的CEMx-174細(xì)胞作為正常組，以1640培養(yǎng)基為調(diào)零組，以蛋白處理過(guò)的CEMx-174細(xì)胞和SIV病毒顆粒混合物為試驗(yàn)組，以未加蛋白的CEMx-174細(xì)胞和SIV病毒顆粒混合物為對(duì)照組，共測(cè)試三個(gè)加樣組，每組又分5個(gè)劑量組，融合蛋白XE-TNFαm1、RNTNFαm1的劑量范圍為2、4、8、16、32μg/ml，融合蛋白XE-TNFαm2的劑量范圍為1、2、4、8、16μg/ml。在2、4、8、16、32μg/ml的劑量范圍內(nèi)，融合蛋白XE-TNFαm1對(duì)CEMx-174細(xì)胞的保護(hù)率分別為12.7％，15.7％，26.6％，33.5％，40.2％；RNTNFαm1對(duì)CEMx-174細(xì)胞的保護(hù)率分別為13.3％，18.6％，19.5％，24.3％，31.8％。在1、2、4、8、16μg/ml的劑量范圍內(nèi)，融合蛋白XE-TNFαm2對(duì)CEMx-174細(xì)胞的保護(hù)率分別為13.6％，18.9％，29.1％，38.0％，50.4％。中和試驗(yàn)的結(jié)果表明(見(jiàn)表3-1，3-2))，三種融合蛋白實(shí)驗(yàn)組OD值均顯著高于對(duì)照組，在各自的劑量范圍內(nèi)對(duì)SIV感染細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用，并且呈良好的劑量-效應(yīng)依賴(lài)關(guān)系(見(jiàn)圖16，17)。
保護(hù)率＝(試驗(yàn)組OD值-調(diào)零組OD值)-(對(duì)照組OD值-調(diào)零組OD值)÷(試驗(yàn)組OD值-調(diào)零組OD值)表3-1.中和試驗(yàn)結(jié)果

表3-2.中和試驗(yàn)結(jié)果

說(shuō)明1每組劑量有3個(gè)平行孔，每個(gè)孔用MTT法測(cè)定3次2NC代表正常的CEMx-174細(xì)胞，NC+SIV代表混合有SIV顆粒的正常的CEMx-174細(xì)胞3試驗(yàn)組測(cè)定的OD值與對(duì)照組(NC+SIV)相比較，均有顯著性差異*P＜0.05實(shí)施例9殺傷試驗(yàn)及中和試驗(yàn)的病毒滴度試驗(yàn)將融合蛋白殺傷處理后培養(yǎng)48h的細(xì)胞培養(yǎng)液混勻，(中和試驗(yàn)要處理7天)，按照10、20、40、80、160、320、640、1280、2560倍以培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。分別取各稀釋液100μl于新的無(wú)菌96孔板中，加等量的1.0×105/mlCEMx-174細(xì)胞，置37℃ CO2培養(yǎng)箱(95％空氣，5％CO2)中孵育，每48小時(shí)更換一半新鮮培養(yǎng)基。7天后觀察結(jié)果，以細(xì)胞融合形成的多核大細(xì)胞為指標(biāo)確定滴度。(結(jié)果見(jiàn)表1-1，1-2，3-1，3-2)細(xì)胞培養(yǎng)物上清中的病毒完全是由于受病毒感染的細(xì)胞在病毒繁殖后裂解而釋放到上清中的。上清中的病毒數(shù)量可通過(guò)病毒滴度試驗(yàn)來(lái)確定。在一定的稀釋度下，上清中的病毒被稀釋到滴度實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)靈敏度范圍以下，這樣的稀釋物加入正常細(xì)胞培養(yǎng)物中不導(dǎo)致合胞體的產(chǎn)生。我們采用2n梯度稀釋上清以感染細(xì)胞的方法，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)，以培養(yǎng)細(xì)胞中合胞體的產(chǎn)生與否為標(biāo)準(zhǔn)確定病毒感染細(xì)胞的情況，可以直接得出在何稀釋度下病毒濃度低于滴度試驗(yàn)的檢測(cè)靈敏度范圍的結(jié)果。以此為根據(jù)可推斷上清中原來(lái)含有的病毒的相對(duì)濃度，該指標(biāo)可作為病毒學(xué)檢驗(yàn)的客觀指標(biāo)。從病毒滴度示意圖(圖18-21)中可看出實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組之間在殺傷試驗(yàn)和中和試驗(yàn)后病毒滴度結(jié)果上均曾現(xiàn)明顯差異，并呈明顯的劑量關(guān)系，從圖中可以看出隨著藥物劑量的增加，殺傷組和中和組病毒滴度逐漸下降。
實(shí)施例10感染細(xì)胞的熒光計(jì)數(shù)及顯微照相將殺傷試驗(yàn)和中和試驗(yàn)中各培養(yǎng)孔的細(xì)胞充分混懸，取1ml細(xì)胞培養(yǎng)液，3000rpm離心3分鐘，棄上清。再用1ml的PBS洗一次，棄上清，在逐漸加入PBS，混懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml。取15μl混懸液滴加在載玻片上的環(huán)內(nèi)，自然晾干，在丙酮中4℃固定20分鐘，取出晾干，加入gp120的抗體(猴抗SIV抗體，來(lái)自感染SIV猴的血清)，37℃、水浴30分鐘。然后用pH7.2的PBS沖洗，并置于其中浸泡10分鐘，其間不斷振搖。取出片子后，再加入用萬(wàn)分之二的Evens蘭配制的兔抗猴抗體(即二抗)，37℃水浴30分鐘，用PBS沖洗，晾干后在熒光顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞數(shù)并拍照。在熒光顯微鏡下觀察被SIV/HIV感染的細(xì)胞在藍(lán)色光的激發(fā)下發(fā)黃綠色熒光，可以看到細(xì)胞周邊呈黃綠色，而未被感染的細(xì)胞則不呈黃色，呈暗紅色。殺傷試驗(yàn)和保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果中的熒光感染率見(jiàn)表1-1，1-2，2-1，2-2。殺傷試驗(yàn)前后的熒光照片見(jiàn)圖22-1和圖22-2。圖22-1中可見(jiàn)被SIV/HIV感染的細(xì)胞，而圖22-2中可見(jiàn)許多細(xì)胞碎片，為被融合蛋白殺傷的SIV/HIV感染的細(xì)胞。保護(hù)試驗(yàn)前后的熒光照片見(jiàn)圖23-1和圖23-2。圖23-1中可見(jiàn)被SIV/HIV感染的細(xì)胞，而圖23-2中多見(jiàn)未受SIV/HIV感染的正常細(xì)胞，說(shuō)明細(xì)胞受到了融合蛋白的有效保護(hù)。
實(shí)施例11流式細(xì)胞儀檢測(cè)融合蛋白XETNFαm2作用組的細(xì)胞凋亡11.1流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡-Annexin-V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的基本特征之一，它在機(jī)體的胚胎發(fā)育，組織修復(fù)及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等方面起著重要的作用。細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的失控可導(dǎo)致臨床各種疾病的發(fā)生。細(xì)胞凋亡有別與細(xì)胞死亡，它有一系列的細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生化的改變，包括出現(xiàn)染色體濃縮，DNA降解，凋亡小體形成等。在正常的活細(xì)胞，磷脂酰絲氨酸(phosphotidylserine，PS)位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在凋亡的細(xì)胞，PS從細(xì)胞膜得內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為35-36KD的Ca++依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。因此將Annexin-V進(jìn)行熒光素(如FITC，PE)或BIOTIN標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。這是目前公認(rèn)的靈敏、高效的凋亡細(xì)胞的監(jiān)測(cè)方法。
Propidum iodide(PI)是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡晚期的細(xì)胞和死亡細(xì)胞，PI能夠透過(guò)而使其染紅因而將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早期的細(xì)胞和晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。
試劑盒組成(50/25TESTS)Annexin V-FITC 500/250ul @20ug/mlBinding buffer 40/20mlPBS60/30mlPropidium Iodine(PI)250ul/125ul @50ug/ml操作步驟1.調(diào)整待測(cè)細(xì)胞的濃度為5×105-1×106個(gè)/ml2.取1ml細(xì)胞，1000rpm4度離心10分鐘，棄上清。
3.加入1ml冷的PBS，輕輕振蕩使細(xì)胞懸浮。
4.1000rpm4度離心10分鐘，棄上清5.重復(fù)步驟3、4兩次。
6.對(duì)于貼壁細(xì)胞，先用胰酶消化，再用PBS洗滌。
7.將細(xì)胞重懸于200ul的binding buffer8.加入10ulAnnexin V-FITC和5ul的PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15分鐘或4度反應(yīng)30分鐘9.加入300ulbinding bufer，立即上機(jī)檢測(cè)10.若用熒光顯微鏡檢測(cè)，將細(xì)胞混勻液離心，取細(xì)胞沉淀涂片，再進(jìn)行觀察。
11.2試驗(yàn)結(jié)果如表4所示，在殺傷試驗(yàn)中，細(xì)胞凋亡率如下對(duì)照組21.2％；16μg/ml的劑量下，XETNFαm2作用組為47.1％，TNFαm2作用組為20.8％。中和試驗(yàn)中，對(duì)照組20.3％，XETNFαm2作用組為11.3％。初步證實(shí)XETNFαm2可特異性地引發(fā)HIV/SIV感染細(xì)胞的凋亡，同時(shí)保護(hù)正常細(xì)胞。
表4


盡管根據(jù)上面的實(shí)施例結(jié)合附圖已經(jīng)很好的描述了本發(fā)明，但應(yīng)當(dāng)理解的是，多種修飾和變化都包含在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。而限制本發(fā)明的僅僅是所附的權(quán)利要求。
序列表<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所；以及中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所<120>三種用于治療獲得性免疫缺陷綜合征的重組靶向融合蛋白<130>
<160>14<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>96<212>DNA<213>人<400>1catatggact accaggtttc cagcccgatc tacgacatca actactacac ttccgaaccg60tgccagaaaa tcaacgttaa acagatcgct gctcgt 96<210>2<211>32<212>PRT<213>人
<400>2His Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr1 5 10 15Thr Ser Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg20 25 30<210>3<211>87<212>DNA<213>人<400>3catatgaacg tttccgaagc tgacgaccgt tacatctgcg accgtttcta cccgaacgac60ctgtgggttg tggttttcca gttccag87<210>4<211>29<212>PRT<213>人<400>4His Met Asn Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys Asp Arg Phe1 5 10 15Tyr Pro Asn Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln20 25<210>5<211>492
<212>DNA<213>人<400>5ggtaccgtaa gaggtccaag atcatcttct aaaaccccga gtgacaagcc tgtagcccat60gttgtagcaa accctcaagc tgaggggcag ctccagtggc tgaaccgccg ggccaatgcc120ctcctggcca atggcgtgga gctgagagat aaccagctgg tggtgccatc agagggcctg180tacctcatct actcccaggt cctcttcaag ggccaaggct gcccctccac ccatgtgctc240ctcacccaca ccatcagccg catcgccgtc tcctaccaga ccaaggtcaa cctcctctct300gccatcaaga gcccctgcca gagggagacc ccagaggggg ctgaggccaa gccctggtat360gagcccatct atctgggagg ggtcttccag ctggagaagg gtgaccgact cagcgctgag420atcaatcggc ccgactatct cgactttgcc gagtctgggc aggtctactt tgggatcatt480gccctgtgat aa492<210>6<211>162<212>PRT<213>人<400>6Gly Thr Val Arg Gly Pro Arg Ser Ser Ser Lys Thr Pro Ser Asp Lys1 5 10 15Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln20 25 30Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu35 40 45
Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr50 55 60Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu65 70 75 80Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val85 90 95Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu100 105 110Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val115 120 125Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro130 135 140Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile145 150 155 160Ala Leu<210>7<211>463<212>DNA<213>人<400>7ggtacccgta aacgcaagcc tgtagcccat gttgtagcaa accctcaagc tgaggggcag60ctccagtggc tgaaccgccg ggccaatgcc ctcctggcca atggcgtgga gctgagagat120aaccagctgg tggtgccatc agagggcctg tacctcatct actcccaggt cctcttcaag180ggccaaggct gcccctccac ccatgtgctc ctcacccaca ccatcagccg catcgccgtc240
tcctaccaga ccaaggtcaa cctcctctct gccatcaaga gcccctgcca gagggagacc300ccagaggggg ctgaggccaa gccctggtat gagcccatct atctgggagg ggtcttccag360ctggagaagg gtgaccgact cagcgctgag atcaatcggc ccgactatct cgactttgcc420gagtctgggc aggtctactt tgggatcatt gccctgtgat aaa 463<210>8<211>152<212>PRT<213>人<400>8Gly Thr Arg Lys Arg Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln1 5 10 15Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu20 25 30Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu35 40 45Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys50 55 60Pro Ser Thr His ValLeu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val65 70 75 80Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys85 90 95Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro100 105 110Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser
115 120 125Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln130 135 140Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu145 150<210>9<211>594<212>DNA<213>人<400>9catatggact accaggtttc cagcccgatc tacgacatca actactacac ttccgaaccg60tgccagaaaa tcaacgttaa acagatcgct gctcgtggta ccgtaagagg tccaagatca120tcttctaaaa ccccgagtga caagcctgta gcccatgttg tagcaaaccc tcaagctgag180gggcagctcc agtggctgaa ccgccgggcc aatgccctcc tggccaatgg cgtggagctg240agagataacc agctggtggt gccatcagag ggcctgtacc tcatctactc ccaggtcctc300ttcaagggcc aaggctgccc ctccacccat gtgctcctca cccacaccat cagccgcatc360gccgtctcct accagaccaa ggtcaacctc ctctctgcca tcaagagccc ctgccagagg420gagaccccag agggggctga ggccaagccc tggtatgagc ccatctatct gggaggggtc480ttccagctgg agaagggtga ccgactcagc gctgagatca atcggcccga ctatctcgac540tttgccgagt ctgggcaggt ctactttggg atcattgccc tgtgataagg atcc 594<210>10<211>193<212>PRT<213>人
<400>10Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr1 5 10 15Ser Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg Gly20 25 30Thr Val Arg Gly Pro Arg Ser Ser Ser Lys Thr Pro Ser Asp Lys Pro35 40 45Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp50 55 60Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg65 70 75 80Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser85 90 95Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu100 105 110Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn115 120 125Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly130 135 140Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe145 150 155 160Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp165 170 175Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala180 185 190
Leu<210>11<211>585<212>DNA<213>人<400>11catatgaacg tttccgaagc tgacgaccgt tacatctgcg accgtttcta cccgaacgac60ctgtgggttg tggttttcca gttccagggt accgtaagag gtccaagatc atcttctaaa120accccgagtg acaagcctgt agcccatgtt gtagcaaacc ctcaagctga ggggcagctc180cagtggctga accgccgggc caatgccctc ctggccaatg gcgtggagct gagagataac240cagctggtgg tgccatcaga gggcctgtac ctcatctact cccaggtcct cttcaagggc300caaggctgcc cctccaccca tgtgctcctc acccacacca tcagccgcat cgccgtctcc360taccagacca aggtcaacct cctctctgcc atcaagagcc cctgccagag ggagacccca420gagggggctg aggccaagcc ctggtatgag cccatctatc tgggaggggt cttccagctg480gagaagggtg accgactcag cgctgagatc aatcggcccg actatctcga ctttgccgag540tctgggcagg tctactttgg gatcattgcc ctgtgataag gatcc585<210>12<211>190<212>PRT<213>人<400>12Met Asn Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys Asp Arg Phe Tyr1 5 10 15
Pro Asn Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln Gly Thr Val Arg20 25 30Gly Pro Arg Ser Ser Ser Lys Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His35 40 45Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg50 55 60Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln65 70 75 80Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu85 90 95Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr100 105 110Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser115 120 125Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala130 135 140Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu145 150 155 160Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp165 170 175Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu180 185 190<210>13<211>550<212>DNA
<213>人<400>13catatgaacg tttccgaagc tgacgaccgt tacatctgcg accgtttcta cccgaacgac60ctgtgggttg tggttttcca gttccagggt acccgtaaac gcaagcctgt agcccatgtt120gtagcaaacc ctcaagctga ggggcagctc cagtggctga accgccgggc caatgccctc180ctggccaatg gcgtggagct gagagataac cagctggtgg tgccatcaga gggcctgtac240ctcatctact cccaggtcct cttcaagggc caaggctgcc cctccaccca tgtgctcctc300acccacacca tcagccgcat cgccgtctcc taccagacca aggtcaacct cctctctgcc360atcaagagcc cctgccagag ggagacccca gagggggctg aggccaagcc ctggtatgag420cccatctatc tgggaggggt cttccagctg gagaagggtg accgactcag cgctgagatc480aatcggcccg actatctcga ctttgccgag tctgggcagg tctactttgg gatcattgcc540ctgtgataaa 550<210>14<211>180<212>PRT<213>人<400>14Met Asn Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys Asp Arg Phe Tyr1 5 10 15Pro Asn Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln Gly Thr Arg Lys20 25 30Arg Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln35 40 45
Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val50 55 60Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu65 70 75 80Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His85 90 95Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr100 105 110Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr115 120 125Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly130 135 140Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn145 150 155 160Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly165 170 175Ile Ile Ala Leu180
權(quán)利要求
1.一種編碼靶向融合蛋白的基因，其特征在于其包含編碼能夠結(jié)合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽的基因和編碼具有殺細(xì)胞作用的殺傷多肽的基因。
2.如權(quán)利要求1所述的靶向融合蛋白基因，其特征在于所述的編碼能夠結(jié)合HIV/SIV的gp120和/或gp41的輔助受體多肽的基因選自SEQ ID NO1和SEQ IDNO3所示的核苷酸序列，所述的編碼具有殺細(xì)胞作用的殺傷多肽的基因選自SEQID NO5和SEQ ID NO7的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的靶向融合蛋白基因，其特征在于所述的基因具有如SEQ ID NO9、11或13所示的核苷酸序列。
4.一種靶向融合蛋白，其特征在于其包含能夠結(jié)合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽和具有殺細(xì)胞作用的殺傷多肽。
5.如權(quán)利要求4所述的靶向融合蛋白，其特征在于其中所述的能夠結(jié)合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽包括RN或XE，或者它們的相關(guān)片斷、類(lèi)似物或突變體，所述的殺傷多肽是包括TNFα、TNFβ、TNFγ或其衍生物或其突變體的TNF家族成員；或TNF超家族成員；或所述的多肽是來(lái)源于人體的穿孔素、補(bǔ)體成分C9及顆粒溶解素；或者來(lái)源于人體的顆粒酶家族的顆粒酶A，B，C，D，E、絲氨酸酯酶；或蛋白激酶C、蛋白激酶A、天冬氨酸激酶、細(xì)胞色素或DNA核酸內(nèi)切酶；或可以抵御細(xì)菌的多肽和酶，如溶菌酶、防御素；或抗癌基因及其編碼的蛋白質(zhì)；以及一切來(lái)源于人體的具有致死細(xì)胞功能的基因及其編碼蛋白質(zhì)、或者是它們的活性功能區(qū)域、突變體或類(lèi)似物。
6.如權(quán)利要求5所述的靶向融合蛋白，其特征在于其中所述的能夠結(jié)合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽選自XE和RN，以及所述的殺傷多肽TNFα變異體。
7.如權(quán)利要求6所述的靶向融合蛋白，其特征在于其中所述的能夠結(jié)合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽選自SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，以及所述的殺傷多肽選自SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所示的氨基酸序列。
8.如權(quán)利要求7所述的靶向融合蛋白，其特征在于所述的靶向融合蛋白具有如SEQ ID NO10、12或14所示的氨基酸序列。
9.含有SEQ ID NO9或SEQ ID NO11或SEQ ID NO13所示的核苷酸序列的融合基因的重組體p30aRN-TNFαm1、pCW-XETNFαm1和pCW-XETNFαm2。
10.含有權(quán)利要求9所述的重組體的表達(dá)載體。
11.含有權(quán)利要求10所述的載體的真核或原核細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求11所述的真核或原核細(xì)胞，其是大腸桿菌。
13.一種制備權(quán)利要求4所述的融合蛋白的方法，包括用權(quán)利要求10所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，獲得重組的包含能夠結(jié)合HIV/SIV的gp120和/或gp41的受體多肽和具有殺細(xì)胞作用的殺傷多肽的靶向性融合蛋白。
14.如權(quán)利要求4所述的融合蛋白在制備用于治療艾滋病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程蛋白質(zhì)藥物領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及靶向性抗HIV/SIV的蛋白質(zhì)及編碼它的融合基因。本發(fā)明還涉及XE－TNFαm1、RN－TNFαm1和XE－TNFαm2的融合基因、包含所述融合基因的表達(dá)型重組體、包含所述表達(dá)型重組體的工程菌、由此工程菌表達(dá)和分離純化的靶向融合蛋白XE－TNFαm1、RNTNFαm1和XE－TNFαm2以及這些融合蛋白中任意一種用于治療艾滋病的用途。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1752211SQ20041008000
公開(kāi)日2006年3月29日 申請(qǐng)日期2004年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月23日
發(fā)明者盧圣棟, 楊晶, 王憬惺, 李濤, 李兆忠, 申景平, 叢哲, 涂新明, 蔣虹, 陳偉京, 路金芝, 佟巍, 魏強(qiáng), 秦川, 張兵林 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所, 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所