專利名稱：一種新的有機磷農(nóng)藥降解酶及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株對有機磷農(nóng)藥具有高效廣譜降解能力的細菌菌株——C2-1的分離，并涉及此菌株分泌的有機磷農(nóng)藥降解酶及其酶學性質(zhì)研究，以及編碼這種酶的基因的克隆。
背景技術(shù)：
有機磷農(nóng)藥是農(nóng)藥中的主要類別，占世界農(nóng)藥總量的80％[1]，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)必不可少的。但有機磷農(nóng)藥具有抑制人體乙酰膽堿酯酶的功能，對人存在著程度不同的毒性。隨著人們生活質(zhì)量的提高和環(huán)保意識的加強，有機磷農(nóng)藥的殘留毒性問題越來越受到人們的關(guān)注。
自1973年Sethunarhan和Yoshida[2]從接觸過有機磷農(nóng)藥的土壤中分離出第一株有二嗪農(nóng)和對硫磷降解活性的黃桿菌以來，人們不斷發(fā)現(xiàn)一些土壤微生物(細菌、真菌)能夠降解有機磷農(nóng)藥，這主要是由于它能夠分泌一種酶降解有機磷，同時降解后的產(chǎn)物可作為微生物生長的碳、氮、磷源，為其生長提供營養(yǎng)[3，4，5]。
有機磷通常含有三個磷酯鍵，所以常被稱為磷酸三酯。一般有機磷被分為兩種類型，一是磷通過雙鍵與氧結(jié)合(P＝O)，如甲胺磷、氧化樂果、敵敵畏等；另一種是磷通過雙鍵與硫結(jié)合(P＝S)，如對硫磷、甲基對硫磷、辛硫磷、水胺硫磷、毒死蜱(樂斯本)等[6]。有研究表明，如果有機磷中的一個磷酸酯鍵被水解將大大降低其毒性，以對硫磷為例，將使其毒性降低100倍[7，8]。因此，破壞有機磷的磷酯鍵是降低有機磷農(nóng)藥毒性行之有效的方法。
有機磷農(nóng)藥降解酶(Organophosphorus acid hydrolase，EC 3.1.8.2)可降解有機磷農(nóng)藥分子，破壞有機磷的磷酯鍵而使其脫毒。由于各種有機磷農(nóng)藥都有類似的結(jié)構(gòu)，只是取代基不同，所以一種有機磷農(nóng)藥降解酶往往可降解多種有機磷農(nóng)藥。有機磷農(nóng)藥降解酶目前已被公認為是消除農(nóng)藥殘留的最有潛力的新方法[9]。
近年來對于有機磷農(nóng)藥降解酶的分子生物學研究隨著人們對農(nóng)藥殘留的認識而不斷深入。DiSioudi等人[10，11]研究了其編碼基因的結(jié)構(gòu)，并進行了分子改造，使其改變了底物特異性，從而能對多種有機磷農(nóng)藥具有高效的降解效率。同時，人們還將農(nóng)藥降解酶基因克隆到大腸桿菌中，并使其在細胞表面表達，增加其降解效率[12，13]。
本發(fā)明的目的是為了進一步研究這個具有優(yōu)良酶學性質(zhì)的有機磷農(nóng)藥降解酶，并利用基因工程的手段克隆其有機磷農(nóng)藥降解酶基因，最終將其高效表達，廉價生產(chǎn)有機磷農(nóng)藥降解酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種能有效降解多種有機磷農(nóng)藥的菌株，并提供該菌株分泌的一種新的有機磷農(nóng)藥降解酶，以及一種編碼本發(fā)明的農(nóng)藥降解酶的基因。
1.本發(fā)明提供一種可降解多種有機磷農(nóng)藥的菌株C2-1本發(fā)明中菌C2-1是采用農(nóng)藥富集的方法分離得到。主要步驟如下取農(nóng)藥廠經(jīng)農(nóng)藥長期污染的土樣，在100mL液體Burk無機鹽培養(yǎng)基中，32℃振蕩培養(yǎng)過夜。菌液用無菌水梯度稀釋后分別涂布于加有敵敵畏和甲基對硫磷的Burk無機鹽培養(yǎng)基上，置于32℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，挑取單菌落，經(jīng)平板劃線純化。將分離到的單菌落菌株分別接種于分別含有不同有機磷農(nóng)藥的Burk無機鹽平板上，32℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，進行降解試驗，培養(yǎng)兩天后開始觀察是否有消解圈以及消解圈的大小。對分離出的在農(nóng)藥平板上有消解圈的菌株所分泌的有機磷農(nóng)藥降解酶進行酶活性測定，篩選出具有高活性且有廣譜降解農(nóng)藥特性的菌株。
其中，編號為C2-1的菌在幾種農(nóng)藥平板上均有消解圈，并且酶活性高，說明其有機磷農(nóng)藥降解特性最為優(yōu)良。將篩選到的菌株C2-1轉(zhuǎn)接于斜面編號保存，送交中國科學院微生物研究所國家菌種保藏檢測中心進行菌種鑒定。經(jīng)鑒定該菌株屬于假產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)。并于2004年2月8日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京，中關(guān)村，北一條13號)，保藏號為CGMCC1150。
該菌株是一株革蘭氏染色反應(yīng)陰性菌，菌體呈短桿狀，大小為0.8×1.5-3.0微米，一般有1-3根鞭毛及極毛，無芽孢，氧化酶和接觸酶測定為陽性，其生長嚴格好氧，菌落一般是光滑的。此菌能夠在加有有機磷農(nóng)藥的無機鹽培養(yǎng)基上生長，降解農(nóng)藥為其生長提供碳源。
2.本發(fā)明提供一種新的有機磷農(nóng)藥降解酶OPHC2的分離純化及其酶學性質(zhì)的研究用LB完全培養(yǎng)基大量培養(yǎng)菌體，超聲波破碎細胞，離心，上清用硫酸銨沉淀收集蛋白。將沉淀的蛋白重懸于緩沖液中，經(jīng)透析濃縮得到粗酶液。通過聚丙烯酰胺(PAGE)非變性膠電泳將粗酶液中的蛋白各組分分離開，在電洗脫儀(Phamasia)上將各蛋白分別洗脫下來，經(jīng)酶活性測定確定所需蛋白。將確定為農(nóng)藥降解酶的蛋白洗脫液過夜透析，濃縮，走SDS-PAGE電泳，得到一條單一的蛋白條帶，并初步確定OPHC2的分子量約為35KD。
以純化的農(nóng)藥降解酶OPHC2為材料，測得其最適反應(yīng)溫度為65℃。60℃和70℃下此酶相對較穩(wěn)定，說明此酶有很好的耐熱性；其最適反應(yīng)pH為9，且在pH6-11的范圍內(nèi)酶的相對活力均在60％以上，說明其有很寬的pH酶解范圍；在研究不同金屬離子及化學試劑對酶反應(yīng)的影響時，發(fā)現(xiàn)只有SDS影響最大，其他金屬離子及化學試劑對酶的活性影響不大。
3.本發(fā)明有機磷農(nóng)藥降解酶OPHC2的氨基酸序列及其編碼基因的核苷酸序列的獲得委托奧科生物技術(shù)公司對OPHC2酶蛋白進行了N端肽段測序，同時委托軍事醫(yī)學科學院儀器測試分析中心對OPHC2蛋白進行了酶解后的內(nèi)肽測序，得到了4個內(nèi)肽段的N端序列。根據(jù)N端及內(nèi)肽段的序列設(shè)計合成了簡并性引物，通過PCR反應(yīng)得到了部分編碼基因(786bp)的核苷酸序列，根據(jù)得到的序列設(shè)計合成了兩對特異性的引物。大量培養(yǎng)C2-1菌，提取質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶消化后連接，以此DNA為模板，進行PCR反應(yīng)，擴增得到特異DNA條帶，回收后克隆，測序，得到編碼基因全長核苷酸序列(SEQ ID NO1)，同時推出有機磷農(nóng)藥降解酶OPHC2的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。


圖1C2-1菌在含有0.05％(v/v)甲基對硫磷的Burk無機鹽平板上生長5天所產(chǎn)生的消解圈。
圖2OPHC2純化過程SDS-PAGE電泳圖。
圖3對硝基酚含量測定標準曲線。
圖4溫度對OPHC2酶反應(yīng)的影響。
圖5OPHC2酶的溫度穩(wěn)定性。
圖6pH對OPHC2酶反應(yīng)的影響。
圖7OPHC2酶的pH穩(wěn)定性。
圖8有機磷農(nóng)藥降解酶OPHC2氨基酸序列。
圖9有機磷農(nóng)藥降解酶結(jié)構(gòu)基因ophc2核苷酸序列。
本發(fā)明的可降解多種有機磷農(nóng)藥的菌株C2-1于2004年2月8日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京，中關(guān)村，北一條13號)，保藏號為CGMCC 1150。
具體實施例方式
下述實施例是為了更詳細地解釋本發(fā)明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明局限于此。
一.生化試劑、酶及試劑盒限制性內(nèi)切酶為寶生物及BioLabs公司產(chǎn)品、連接酶為Promega公司產(chǎn)品、Taq酶為上海生工生物工程公司產(chǎn)品；DNA回收試劑盒購于寶生物工程公司、T載體連接試劑盒購于Promega公司；其他生化試劑均購于Sigma、Promega及北京化學試劑公司。
二、培養(yǎng)基1.Burk無機鹽培養(yǎng)基(g/L)K2HPO4，0.2；KH2PO4，0.8；MgSO4.7H2O，0.2；CaSO4.H2O，0.1；NaMoO4.2H2O，0.003；FeSO4.7H2O，0.005；(NH4)2SO4，1.0；酵母粉0.5；pH7.2，121℃滅菌20分鐘，固體培養(yǎng)基加入1.5％瓊脂。2.LB完全培養(yǎng)基(g/L)NaCl，10；蛋白胨；10；酵母粉，5。
三.蛋白及DNA測序、引物合成委托北京奧科生物技術(shù)公司對OPHC2進行了蛋白N端測序；委托軍事醫(yī)學科學院儀器測試分析中心進行蛋白酶解后的內(nèi)肽測序；委托上?；瞪锛夹g(shù)有限公司進行DNA測序；委托北京奧科生物技術(shù)公司合成所有實驗用的引物。
實施例1本實施例說明篩選可降解多種有機磷農(nóng)藥的天然菌株C2-1的篩選過程，其主要步驟如下1.取土樣0.5g在100mL Burk無機鹽液體培養(yǎng)基中，32℃振蕩培養(yǎng)過夜。
2.菌液用無菌水梯度稀釋，稀釋倍數(shù)為10、102、103、104、105、106，分別涂布于加有0.2mg/mL敵敵畏(純品)和0.2mg/mL甲基對硫磷(純品)的Burk無機鹽固體培養(yǎng)基平板上，置于32℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，挑取單菌落，經(jīng)平板劃線純化。
3.將分離到的單菌落菌株分別接種于分別含有有機磷農(nóng)藥甲基對硫磷(0.05％)、對硫磷(0.05％)、甲胺磷(0.05％)、氧化樂果(0.05％)、辛硫磷(0.05％)(均為v/v)(上述農(nóng)藥均購自中國國家農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心)的Burk無機鹽五種平板上，32℃溫箱培養(yǎng)，進行消解試驗，培養(yǎng)兩天后開始觀察是否有消解圈以及消解圈的大小。
4.選取在5種農(nóng)藥平板上均有消解圈的菌株，接種于5mL LB完全液體培養(yǎng)基上，32℃振蕩培養(yǎng)過夜，收集菌體，懸于50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH9.0)中，超聲波破碎菌體，15,000rpm離心5分鐘去細胞殘渣，上清液用來進行酶活性測定。酶活性測定方法取100μL待測酶液加入含有5μL 10mg/mL甲基對硫磷和900μL 50mmol/L Tris-Cl(pH9.0)緩沖液的體系中，37℃保溫10分鐘，加入1mL 10％三氯乙酸終止反應(yīng)，再加入1mL 10％Na2CO3溶液顯色，410nm測定OD值，計算水解產(chǎn)物對硝基酚的含量和酶的活性。一個酶的活性單位(U)定義為在37℃，每分鐘釋放出1μmol對硝基酚所需酶量為一個酶活性單位。其中C2-1菌所產(chǎn)生的農(nóng)藥降解酶活性最高，將其保存，送交中國科學院微生物研究所進行菌種鑒定，并于2004年2月8日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京，中關(guān)村，北一條13號)，保藏號為CGMCC1150。圖1為C2-1菌在含有0.05％(v/v)甲基對硫磷的Burk無機鹽平板上生長5天所產(chǎn)生的消解圈。
實施例2本實驗說明有機磷農(nóng)藥降解酶OPHC2的純化過程，其主要步驟如下1.農(nóng)藥降解酶(OPHC2)粗酶液的提取用1000mL LB完全培養(yǎng)基大量培養(yǎng)C2-1菌體細胞，32℃振蕩培養(yǎng)過夜，5000rpm離心10分鐘，棄上清，并將菌體重懸浮于100mL含有0.1mmol/L蛋白酶抑制劑PMSF的50mmol/L Tris-Cl(pH8.0)緩沖液中，用超聲波破碎儀(美國Branson公司)破碎細胞，12,000rpm離心20分鐘，收集上清，用飽和度為20％-90％的硫酸銨沉淀蛋白。沉淀重新懸浮于20mL 50mmol/L，pH8.0 Tris-HCl緩沖液中，并透析脫鹽、濃縮，得到OPHC2粗酶液。
2.OPHC2的分離和純化通過聚丙烯酰胺(PAGE)非變性膠電泳(凝膠的濃度15％)，將粗酶液中的蛋白各組分分離開，取邊上的一條電泳道的膠染色，以此作為對照切下對應(yīng)的未染色蛋白帶，在電洗脫儀(Phamasia)上將各蛋白分別洗脫下來，經(jīng)酶活性測定確定所需蛋白。PAGE電泳后，有三條較明顯的蛋白帶，將它們分別切下來，在電洗脫儀上洗脫下來，經(jīng)酶活性測定位于中間的條帶的蛋白是我們所需要的目的蛋白。將含有目的蛋白的洗脫液透析，濃縮，走SDS-PAGE電泳，得到一條單一的蛋白條帶，并初步確定OPHC2的分子量約為35KD。圖2所示OPHC2純化過程SDS-PAGE電泳圖。
實施例3本實施例說明有關(guān)農(nóng)藥降解酶OPHC2酶學性質(zhì)的研究，其主要步驟如下1.有機磷降解酶酶活性測定方法有機磷降解酶可將甲基對硫磷等摩爾的分解為二乙基硫代磷酸酯和黃色的對硝基酚，通過測定產(chǎn)物對硝基酚的量即可測定酶的活性。
對硝基酚的含量測定及標準曲線制作步驟如下秤取0.08346g對硝基酚，先用少量95％乙醇溶解，然后用水定容至100mL，濃度為6mmol/L。按下表分別加入不同量的對硝基酚溶液和50mmol/L Tris-Cl(pH8.0)緩沖液，總體積為1mL，然后每管加入1mL10％三氯乙酸，再加入1mL 10％Na2CO3溶液，總體積為3mL，410nm測定光吸收值。同時，繪制對硝基酚含量測定標準曲線(圖3)。
表1標準曲線的繪制

根據(jù)有機磷降解酶酶活性標準曲線，得出有機磷降解酶酶活單位計算公式 其中3×10-3反應(yīng)總體積(L)；N酶液的稀釋倍數(shù)；10①將100μL稀釋酶液中的酶活性折算為1mL的酶活性；10②反應(yīng)時間。
取100μL待測酶液加入含有5μL 10mg/mL甲基對硫磷和900μL50mmol/L Tris-Cl(pH9.0)緩沖液的體系中，37℃保溫10分鐘，加入1mL10％三氯乙酸終止反應(yīng)，再加入1mL 10％Na2CO3溶液顯色，410nm測定OD值，計算水解產(chǎn)物對硝基酚的含量和酶的活性。一個酶的活性單位(U)定義為在37℃，每分鐘釋放出1μmol對硝基酚所需酶量。
2.OPHC2酶反應(yīng)最適溫度及熱穩(wěn)定性研究以純化的農(nóng)藥降解酶OPHC2為材料，在不同溫度下進行酶促反應(yīng)后，如上所述測定其酶活性，得到其最適反應(yīng)溫度；在60℃和70℃下分別處理酶液，處理時間為2分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘，處理后在37℃下測酶活性，以確定其熱穩(wěn)定性。結(jié)果表明，其最適反應(yīng)溫度為65℃。溫度在低于65℃時，隨著溫度升高酶活性逐步上升，但在20℃時相對酶活仍有25.87％。高于65℃酶活力迅速下降，到80℃只有最大活力的7.7％(見圖4)。圖5為OPHC2的熱穩(wěn)定性曲線，60℃此酶很穩(wěn)定，保溫30分鐘后，其相對酶活有85.6％；70℃下保溫30分鐘，其酶活性有所下降，但相對酶活仍有近40％，說明此酶有很好的耐熱性。
3.OPHC2酶反應(yīng)的最適pH及pH穩(wěn)定性以純化的農(nóng)藥降解酶OPHC2為材料，在不同的pH下如上所述進行酶促反應(yīng)，測定了其最適pH；將酶液在不同pH的緩沖液中于37℃保溫30分鐘后，測酶活性以確定其pH穩(wěn)定性；測定結(jié)果表明，其最適反應(yīng)pH為9，但在pH6-11的范圍內(nèi)，酶的相對活力均在60％以上，說明其有很寬的pH酶解范圍，見圖6。在不同pH下保溫30分鐘后，酶的相對活力影響不大，即使是pH5其相對酶活也達到72.53％，且在堿性條件下更加穩(wěn)定，見圖7。
4.不同金屬離子及化學試劑對OPHC2酶反應(yīng)的影響以純化的農(nóng)藥降解酶OPHC2為材料，在酶促反應(yīng)體系中分別加入不同金屬離子及化學試劑，各種化合物的終濃度為1mmol/L，如上所述測酶活性，以研究不同金屬離子及化學試劑對酶反應(yīng)的影響。表2所示不同金屬離子及化學試劑對OPHC2酶反應(yīng)的影響。其中SDS影響最大，為OPHC2酶的強烈變性劑；Cu2+、Mn2+、Zn2+、Pb2+對OPHC2酶活性有輕微的影響，其他的金屬離子及化學試劑對其影響不大或有的有促進作用。
表2不同金屬離子及化學試劑對OPHC2酶解反應(yīng)的影響

實施例4本實施例說明有機磷農(nóng)藥降解酶OPHC2的部分氨基酸序列測定。
將純化的蛋白走SDS-PAGE電泳，通過電轉(zhuǎn)儀(Phamacia公司)將膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜(購于美國Millipore公司)上，委托北京奧科生物技術(shù)公司對OPHC2進行成熟蛋白N端測序。同時，將純化的OPHC2酶蛋白走SDS-PAGE電泳，電泳后按常規(guī)固定、染色，電泳膠交給軍事醫(yī)學科學院儀器測試分析中心進行酶解后的內(nèi)肽測序。奧科生物技術(shù)公司測試分析得出的成熟蛋白N端氨基酸序列為AAPAQQKTQVPGYYR(SEQ ID NO3)。軍事醫(yī)學科學院儀器測試分析中心對OPHC2蛋白進行了膠內(nèi)酶解，得到了4個內(nèi)肽段的N端氨基酸序列，分別為APEGMQGMFK(SEQ ID NO4)；GIDDKDLQSLLAR(SEQ ID NO5)；ILAEAATDK(SEQ ID NO6)；MAQQAVAPYAK(SEQ ID NO7)。
實施例5本實施例說明農(nóng)藥降解酶OPHC2編碼基因ophc2全序列的獲得，其主要步驟如下1.首先進行質(zhì)粒消除實驗，以確定有機磷農(nóng)藥降解酶基因是在C2-1菌的染色體上還是在質(zhì)粒上。將菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，32℃振蕩培養(yǎng)過夜，按10％接種量轉(zhuǎn)接于含有1.5μg/mL絲裂霉素C的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)36小時，用LB培養(yǎng)基稀釋菌液，稀釋倍數(shù)為10、102、103、104、105，分別涂布于LB平板上，32℃溫箱培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)。挑取單菌落培養(yǎng)后進行農(nóng)藥降解酶酶活性測定。結(jié)果表明，質(zhì)粒消除后檢測不到酶活性，說明有機磷農(nóng)藥降解酶基因是位于質(zhì)粒上。
2.根據(jù)成熟蛋白N端氨基酸序列設(shè)計合成了5’端簡并性引物5’CA(A/G)GT(A/G/C/T)CC(A/G/C/T)GG(A/G/C/T)TA(T/C)TA(T/C)(C/A)G3’(SEQ ID NO8)；并根據(jù)內(nèi)肽段的N端氨基酸序列設(shè)計合成4個3’端簡并性引物，分別是722-3’5’(T/C)TG(A/G/C/T)A(A/G)(A/G)TC(C/T)TG(A/G)TC(A/G)TC 3’(SEQ IDNO9)548-3’5’AACAT(A/G/C/T)CC(T/C)TGCAT(A/G/C/T)CC(T/C)TC 3’(SEQ ID NO10)589-3’5’GC(A/G/C/T)AC(A/G/C/T)GC(T/C)TG(T/C)TT(A/G/T/C)GCCAT3’(SEQID NO11)466-3’5’TT(G/A)TC(A/G/C/T)GT(A/G/C/T)GC(A/G/C/T)GC(T/C)TC(A/G/C/T)GC3’(SEQ ID NO12)3.攜帶有機磷農(nóng)藥降解酶基因的質(zhì)粒的提取用LB液體培養(yǎng)基5mL培養(yǎng)C2-1菌，離心收集菌體，將細菌沉淀懸于350μL STET(NaCl0.1mol/L，Tris HCl 10mmol/L(pH8.0)，EDTA 1mmol/L(pH8.0)，Triton X-1005％)溶液中，加入25μL新配制的溶菌酶溶液(10mg/mL，用pH8.010mmol/L Tris HCl配制)，振蕩混均。將離心管放到沸水浴中煮沸45秒，15,000rpm離心10分鐘后，挑出沉淀，上清中加入40μL 5mol/L乙酸鈉(pH5.2)和420μL異丙醇，振蕩混均后，室溫放置5分鐘。15000rpm離心5分鐘，棄上清，沉淀抽干水分后，溶于400μL TE緩沖液中，依次用酚、酚-氯仿、氯仿抽提，去雜蛋白，乙醇沉淀后溶于雙蒸水備用。
4.以5’端簡并性引物和4個3’端簡并性引物分別配對，以質(zhì)粒DNA為模板，分別PCR，PCR反應(yīng)條件為94℃5分鐘；94℃45sec，55℃45sec，72℃1分鐘，30個循環(huán)；72℃10分鐘。分別得到4條特異性的條帶，一條為100bp左右，兩條為500bp左右，一條為750bp左右?？寺〉絋載體上后，測序。測序結(jié)果顯示，由5’端簡并性引物和466-3’端引物擴增出來的片段為762bp，其他片段均為其中的一部分。在這762bp的片段中，發(fā)現(xiàn)位于412bp處有一個單一EcoRI酶切位點，位于455bp處有一個單一SphI酶切位點。根據(jù)EcoRI酶切位點前已測定序列合成一對分別向兩端擴增的引物Q15’CCGAGTGCCATACGGTAGTA 3’(SEQ ID NO13)Q25’AACGCGACCGTGGAGGTG 3’(SEQ ID NO14)
同樣，根據(jù)SphI酶切位點后已測定序列合成一對分別向兩端擴增的引物H15’TTGCGCCATCTTGAACATGC 3’(SEQ ID NO15)H25’CAGGCAGTCGCACCCTATGC 3’(SEQ ID NO16)用EcoRI、SphI分別酶切質(zhì)粒DNA，酶切后連接使其環(huán)化，以這兩個DNA分別為模板，分別用以上兩對引物進行PCR擴增(PCR反應(yīng)條件同上)。其中以SphI酶切的為模板，Q1和Q2為引物擴增出600bp左右的片段，得到的是酶的前段編碼基因；其中以EcoRI酶切的為模板，H1和H2為引物擴增出500bp左右的片段，得到的是酶的后段編碼基因。將這兩段克隆到T載體上后，測序后，即可拼接出完整的基因序列。再根據(jù)此完整序列設(shè)計基因兩端引物ophc2-5’5’ATGCGTCTTTTCTCGCTGAGC 3’(SEQ ID NO17)ophc2-3’5’TCAGCGGTCGCTACGGATCGG 3’(SEQ ID NO18)以質(zhì)粒DNA為模板，進行PCR擴增反應(yīng)(反應(yīng)條件同上)，得到了完整的有機磷農(nóng)藥降解酶基因ophc2。經(jīng)測序驗證，與拼接出的完整基因序列完全一樣。
得到的有機磷農(nóng)藥降解酶結(jié)構(gòu)基因ophc2全長975個核苷酸，編碼324個氨基酸。有機磷農(nóng)藥降解酶的氨基酸序列見圖8，其編碼基因的核苷酸序列見圖9。根據(jù)信號肽序列的結(jié)構(gòu)規(guī)則及成熟N端氨基酸序列測定結(jié)果，N端24個氨基酸為信號肽。信號肽的切割位點在+24位的Ala之后。此基因與到目前為止報道過的6個有機磷農(nóng)藥降解酶基因的最高同源性僅有46％，見表3。
表3 ophc2與已報道的有機磷農(nóng)藥降解酶的同源性比較


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SEQUENCE LISTING<110>中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所<120>一種新的有機磷農(nóng)藥降解酶及其編碼基因<130>I040310<160>18<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>975<212>DNA<213>假產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)<400>1atgcgtcttt tctcgctgag caccgcattg tcgtccgcca tgatcgccct ggtcagcctg 60ccgctgcagg cggccgcacc ggcacaacag aagacccagg taccgggcta ctaccgtatg120gcactcggtg acttcgaagt caccgctctg tatgacggct acgtcgacct gcctgccagc180ctgctcaagg gcatcgatga caaggacctg caatcgctgc tggctcgcat gttcgtggcg240
tcggagaaag gcgtgcagac tgcggtcaac gcctacctga tcaacactgg cgacaacctg300gtgctgatcg ataccggcgc cgcccagtgc ttcggcccga ctctcggcgt ggtgcagacc360aacctcaagg catccggcta ccagccggag caggttgata ccgtgctgct cacccacctg420cacccagacc atgcctgcgg cctggtcaac gccgacggca gcccggccta ccccaacgcg480accgtggagg tgccgcaggc ggaggctgaa ttctggctcg acgaggcgac catggccaag540gcccccgaag gcatgcaagg catgttcaag atggcgcaac aggcagtcgc accctatgcc600aagatgaaca agctcaagcc ctacaagaca gaaggcgaat tgttgcctgg cgtcagcctg660gtagcgagcc cgggacacac gcccggacat acctcttacc tgttcaaatc gggtggacag720agcctgctgg tatggggcga cattctgctt aaccacgccg tgcagttcgc caagcctgaa780gtggtcttcg agttcgatgt cgacagcgac caggccaggc aatcccgcca acgcatcctg840gccgaagcgg ccacagacaa gctgtgggtc gctggtgcgc acctgccctt ccccggcctg900ggccacgtac gcaaggaagc ccaaggctac gcctgggtac ccgtcgagtt cagcccgatc960cgtagcgacc gctga 975<210>2<211>324<212>PRT<213>假產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)<400>2Met Arg Leu Phe Ser Leu Ser Thr Ala Leu Ser Ser Ala Met Ile Ala1 5 10 15
Leu Val Ser Leu Pro Leu Gln Ala Ala Ala Pro Ala Gln Gln Lys Thr20 25 30Gln Val Pro Gly Tyr Tyr Arg Met Ala Leu Gly Asp Phe Glu Val Thr35 40 45Ala Leu Tyr Asp Gly Tyr Val Asp Leu Pro Ala Ser Leu Leu Lys Gly50 55 60Ile Asp Asp Lys Asp Leu Gln Ser Leu Leu Ala Arg Met Phe Val Ala65 70 75 80Ser Glu Lys Gly Val Gln Thr Ala Val Asn Ala Tyr Leu Ile Asn Thr85 90 95Gly Asp Asn Leu Val Leu Ile Asp Thr Gly Ala Ala Gln Cys Phe Gly100 105 110Pro Thr Leu Gly Val Val Gln Thr Asn Leu Lys Ala Ser Gly Tyr Gln115 120 125Pro Glu Gln Val Asp Thr Val Leu Leu Thr His Leu His Pro Asp His130 135 140Ala Cys Gly Leu Val Asn Ala Asp Gly Ser Pro Ala Tyr Pro Asn Ala145 150 155 160Thr Val Glu Val Pro Gln Ala Glu Ala Glu Phe Trp Leu Asp Glu Ala165 170 175Thr Met Ala Lys Ala Pro Glu Gly Met Gln Gly Met Phe Lys Met Ala180 185 190
Gln Gln Ala Val Ala Pro Tyr Ala Lys Met Asn Lys Leu Lys Pro Tyr195 200 205Lys Thr Glu Gly Glu Leu Leu Pro Gly Val Ser Leu Val Ala Ser Pro210 215 220Gly His Thr Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Phe Lys Ser Gly Gly Gln225 230 235 240Ser Leu Leu Val Trp Gly Asp Ile Leu Leu Asn His Ala Val Gln Phe245 250 255Ala Lys Pro Glu Val Val Phe Glu Phe Asp Val Asp Ser Asp Gln Ala260 265 270Arg Gln Ser Arg Gln Arg Ile Leu Ala Glu Ala Ala Thr Asp Lys Leu275 280 285Trp Val Ala Gly Ala His Leu Pro Phe Pro Gly Leu Gly His Val Arg290 295 300Lys Glu Ala Gln Gly Tyr Ala Trp Val Pro Val Glu Phe Ser Pro Ile305 310 315 320Arg Ser Asp Arg<210>3<211>15<212>PRT<213>假產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)
<400>3Ala Ala Pro Ala Gln Gln Lys Thr Gln Val Pro Gly Tyr Tyr Arg1 5 10 15<210>4<211>10<212>PRT<213>假產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)<400>4Ala Pro Glu Gly Met Gln Gly Met Phe Lys1 5 10<210>5<211>13<212>PRT<213>假產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)<400>5Gly Ile Asp Asp Lys Asp Leu Gln Ser Leu Leu Ala Arg1 5 10<210>6<211>9
<212>PRT<213>假產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)<400>6Ile Leu Ala Glu Ala Ala Thr Asp Lys1 5<210>7<211>11<212>PRT<213>假產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)<400>7Met Ala Gln Gln Ala Val Ala Pro Tyr Ala Lys1 5 10<210>8<211>20<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(3)
<223>r＝g或a<220>
<221>misc_feature<222>(6，9，12)<223>n＝a或g或c或t<220>
<221>misc_feature<222>(15，18)<223>y＝t或c<220>
<221>misc_feature<222>(19)<223>m＝c或a<400>8cargtnccng gntaytaymg 20<210>9<211>18<212>DNA
<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(1，10)<223>y＝t或c<220>
<221>misc_feature<222>(4)<223>n＝a或g或c或t<220>
<221>misc_feature<222>(6，7，13，16)<223>r＝a或g<400>9ytgnarrtcy tgrtcrtc18<210>10<211>20<212>DNA
<213>人工合成<220>
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<221>misc_feature<222>(9，18)<223>y＝t或c<400>10aacatnccyt gcatnccytc 20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工合成<220>
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<223>n＝a或g或c或t<220>
<221>misc_feature<222>(15)<223>y＝t或c<400>12ttrtcngtng cngcytcngc 20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>13ccgagtgcca tacggtagta 20<210>14<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>14aacgcgaccg tggaggtg18
<210>15<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>15ttgcgccatc ttgaacatgc 20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>16caggcagtcg caccctatgc 20<210>17<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>17atgcgtcttt tctcgctgag c21
<210>18<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>18tcagcggtcg ctacggatcg g21151權(quán)利要求
1.一種有機磷農(nóng)藥降解酶，其特征在于，具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述有機磷農(nóng)藥降解酶的基因，其特征在于，具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.權(quán)利要求1所述的有機磷農(nóng)藥降解酶在制備用于消除有機磷農(nóng)藥殘留的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
4.一種篩選具有有機磷農(nóng)藥降解酶特性的菌株的方法，其包括1)取經(jīng)農(nóng)藥長期污染的土樣，并于液體培養(yǎng)基中過夜預(yù)培養(yǎng)；2)稀釋預(yù)培養(yǎng)的菌液，并在含敵敵畏和甲基對硫磷的固體培養(yǎng)基上分離單菌落；3)將分離的單菌落在分別含甲基對硫磷，對硫磷，甲胺磷，氧化樂果，辛硫磷的5種固體培養(yǎng)基上進行消解試驗；4)測定在上述5種固體培養(yǎng)基上均有消解圈的菌株的酶活性；5)對具有最高農(nóng)藥降解酶活性的菌株進行菌種鑒定。
5.權(quán)利要求4的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基是Burk無機鹽培養(yǎng)基，其基本組分為0.2g/L K2HPO4；0.8g/L KH2PO4；0.2g/LMgSO4.7H2O；0.1g/L CaSO4.H2O；0.003g/L NaMoO4.2H2O；0.005g/LFeSO4.7H2O；1.0g/L(NH4)2SO4和0.5g/L酵母粉；pH7.2。
6.權(quán)利要求4的方法，其特征在于，所述菌株的培養(yǎng)溫度是32℃。
7.權(quán)利要求4的方法，其特征在于所述酶活性的測定是在含甲基對硫磷的Tris-HCl緩沖體系中在37℃的溫度下進行。
8.權(quán)利要求4的方法，其特征在于，所述敵敵畏和甲基對硫磷的含量為0.2mg/mL。
9.權(quán)利要求4的方法，其特征在于，所述甲基對硫磷，對硫磷，甲胺磷，氧化樂果，辛硫磷的含量為0.05％(v/v)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株對有機磷農(nóng)藥具有高效廣譜降解能力的細菌菌株，此菌株屬于假產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)，我們將其命名為C2－1，還提供了該菌株的分離過程、培養(yǎng)條件和降解特性，它可利用農(nóng)藥在無機鹽培養(yǎng)基上生長。同時提供了該菌株分泌的有機磷農(nóng)藥降解酶的分離和純化及其酶學性質(zhì)的研究，以及編碼它的基因的分離和克隆。它將為我們利用基因工程手段克隆有機磷農(nóng)藥降解酶基因提供很好的基因源，最終達到廉價生產(chǎn)有機磷農(nóng)藥降解酶的目的。
文檔編號C12N9/00GK1644687SQ20041008015
公開日2005年7月27日 申請日期2004年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月3日
發(fā)明者伍寧豐, 姚斌, 史秀云, 范云六, 鄧敏捷 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所, 中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所