專利名稱：化合物西替歐醛的醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物化學(xué)和藥物治療學(xué)領(lǐng)域，具體涉及二倍半萜類化合物西替歐醛(hyrtiosal)的制備方法及HIV-1整合酶抑制活性研究。
背景技術(shù)：
自1981年在美國發(fā)現(xiàn)首例艾滋病AIDS(acquired immunodeficiency syndrome，獲得性免疫缺陷病癥)患者以來，艾滋病已在全球的180多個國家和地區(qū)快速蔓延。目前全球艾滋病患者和病毒攜帶者總數(shù)已達到4,200多萬，這其中中國有近100萬，在亞洲居第2位，在全球居第14位。而且近年來中國艾滋病病例數(shù)在以平均每年30-40％的速度快速增長，已經(jīng)成為一個日益嚴(yán)峻的公共安全問題。
HIV病毒作為AIDS的病原體，其感染人體后在體內(nèi)的復(fù)制過程需要整合酶(integrase，IN)的參與才能完成。IN能完成HIV雙鏈DNA分子整合進入宿主染色體的過程。IN在體內(nèi)具有3’切割的內(nèi)切酶活性和鏈轉(zhuǎn)移活性。IN先在HIV線形平端DNA的雙鏈兩端按3’-5’方向切割兩個堿基，形成CA-OH-3’的凹端，在宿主細胞的DNA雙鏈上切開一個5bp的缺口；然后HIV DNA雙鏈的CA-OH-3’的凹端在IN的作用下與宿主細胞DNA鏈切口的5bp以磷酸二酯鍵的形式結(jié)合形成整合中間體；再在細胞內(nèi)某些酶的作用機制下去掉病毒DNA5’末端未配對的兩個堿基，修復(fù)病毒及宿主細胞DNA鏈的缺口。
IN是由288個氨基酸組成的分子量32kD的蛋白質(zhì)，它在結(jié)構(gòu)上分為三個部分N端區(qū)、核心區(qū)和C端區(qū)。N端區(qū)由1-50位氨基酸組成，是一個保守的HHCC鋅指結(jié)構(gòu)域，具有病毒DNA識別功能，此外還有促進IN四聚化和增強催化活性的功能。核心區(qū)由52-210位氨基酸組成，是IN催化最重要的部位。它包含三個酸性氨基酸殘基(Asp64、Asp116和Glu152)，排列成DD35E型，是非常保守的結(jié)構(gòu)，是內(nèi)核酶和核苷轉(zhuǎn)移酶的位點。該部位和一個或兩個二價陽離子(Mg2+或Mn2+)結(jié)合對催化活性是必需的。C端區(qū)是IN中保守性最小的區(qū)域，由213-288位氨基酸組成。它包含核定位信號，能非特異性的結(jié)合DNA，還參與IN的多聚化。IN三個區(qū)的晶體結(jié)構(gòu)及與各種抑制劑的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)都已得到，但是IN全長的晶體結(jié)構(gòu)仍然沒有解決。
由于IN在HIV病毒復(fù)制過程中起著不可缺少的重要作用，而且IN在人體細胞內(nèi)沒有IN的功能類似物，因而IN是AIDS治療的理想靶標(biāo)。尋找新的IN抑制劑，結(jié)合HIV逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶抑制劑聯(lián)合用藥，可以提高抗病毒活性、降低毒副作用和減少耐藥性，是很有意義的治療方案。
到目前為止發(fā)現(xiàn)的IN的抑制劑包括DNA結(jié)合劑、寡核苷酸及核苷類似物、硫酸酯類似物、多肽和羥基取代的芳香化合物等。根據(jù)這些抑制劑跟IN的結(jié)合位點可以分為四類。
1核苷結(jié)合位點最早用做IN抑制劑研究的核苷化合物是AZT及其衍生物AZTMP。AZT單磷酸、雙磷酸和三磷酸均具有抗IN鏈轉(zhuǎn)移活性。它們對IN的抑制是通過干擾IN與DNA的結(jié)合實現(xiàn)的。IN的K156、K159和K160是單核苷的結(jié)合位點，其中高度保守的K159是IN與DNA結(jié)合的關(guān)鍵。隨后發(fā)現(xiàn)二核苷及異二核苷，還有寡核苷酸類化合物也有抑制IN的活性。
2金屬離子結(jié)合位點多羥基芳香化合物與IN的二價金屬離子(Mg2+或Mn2+)鰲合從而抑制IN的活性。這是具有IN抑制作用的化合物中被報道最多的，有木脂內(nèi)酯類、香豆素單體或二聚體類、苯乙烯喹啉類和含鄰苯二酚的螺環(huán)類蒽醌類等。這類化合物在體外測定中對IN有很好的抑制作用，但在細胞培養(yǎng)中毒性太大。
3LTR(長末端重復(fù))DNA序列結(jié)合位點這類抑制劑目前已經(jīng)報道的有DNA雙螺旋小溝結(jié)合劑(如紡錘霉素和偏端霉素)、DNA嵌入劑(如多柔比星)和拓撲異構(gòu)酶抑制劑(如米多蒽醌)。
4其他位點2000年默克公司發(fā)現(xiàn)了兩種能遏制IN的二酮酸類抑制劑，這是目前為止唯一一類選擇性作用于IN的抑制劑。這類化合物對整合反應(yīng)的第二步有選擇性抑制作用。除此之外其他的抑制劑都可能同時有多個作用位點。
盡管對IN的抑制劑已有十余年的研究，但是IN抑制劑目前沒有藥物上市，僅有少數(shù)進入臨床。究其原因，主要有兩方面的限制一是活性測定方法的限制基于細胞培養(yǎng)的測定無法確定化合物是否直接作用于IN，而分子水平的篩選又有太多假陽性；二是結(jié)構(gòu)生物學(xué)方面的限制IN的晶體結(jié)構(gòu)及其DNA底物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)都沒有確定，而且整合這個復(fù)雜的生化過程中還有許多機理沒弄清楚。
目前對AIDS病的治療主要采用聯(lián)合用藥的策略，即采用HIV逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶抑制劑聯(lián)合用藥，但是治療過程中HIV病毒突變導(dǎo)致的耐藥性以及逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶抑制劑的毒副作用情況嚴(yán)重。因此，尋找和發(fā)現(xiàn)HIV-1整合酶抑制劑成為AIDS治療的新的重要主題。從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)HIV-1整合酶的新型抑制劑，對于進一步設(shè)計合成新型有效的HIV-1整合酶抑制劑及AIDS的治療具有重大的開拓性的意義。
本發(fā)明揭示了來源于中國南海海綿的二倍半萜類化合物西替歐醛與HIV-1整合酶具有很高結(jié)合活性(KD＝0.197μM)，并且在底物競爭測試中能夠有效的抑制整合酶對底物的結(jié)合(IC50＝9.6μM)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供對HIV-1整合酶有抑制作用的化合物西替歐醛。
本發(fā)明的另一個目的是提供該化合物的制備方法。
本發(fā)明的再一個目的是運用生物傳感器，利用表面等離子共振原理，篩選了化合物西替歐醛對HIV-1整合酶的抑制活性，從而確定了對艾滋病的治療用途。
本發(fā)明提供具有如下結(jié)構(gòu)式的化合物西替歐醛 西替歐醛本發(fā)明提供了化合物西替歐醛的制備方法。
化合物西替歐醛從南海海綿(Hyrtios erectus)中提取分離得到將冰凍的新鮮海綿切碎，用分析純丙酮超聲提取至無色，減壓濃縮丙酮提取液(溫度低于50℃)，濃縮物用蒸餾水懸浮，分別用乙醚和正丁醇萃取，乙醚萃取液經(jīng)減壓濃縮后得到棕色浸膏，該浸膏先后通過硅膠(200-300目)柱層析(以石油醚(60-90℃)/丙酮梯度洗脫)，凝膠Sephadex LH-20(氯仿洗脫)柱層析，隨后用高效液相色譜制備(采用甲醇/水＝85∶15洗脫，210nm檢測，流速為2.6ml/min)，分離得到化合物西替歐醛。
本發(fā)明利用生物傳感器技術(shù)對西替歐醛進行了HIV-1整合酶抑制劑活性的實驗由下列步驟組成。
1.用生物傳感器測定西替歐醛與HIV-1整合酶的結(jié)合活性。
(1)GST標(biāo)記的HIV-1整合酶(IN，integrase)的克隆本步驟采用基因工程上游方法，選用pGEX-4T-1載體構(gòu)建IN融合蛋白的質(zhì)粒(pGEX-4T-1-IN)。
a.用PCR技術(shù)從pUC18-IN質(zhì)粒獲得IN的DNA片段(基因序列依據(jù)AF040373(GENEBANK))。
引物FW5′-ata tgg atc ctt ttta gat gga ata gat-3′RV5′-ata tct cga gct aat cct cat cct g-3′94℃變性5min，然后開始循環(huán)94℃45s，55℃45s，72℃1min30s，重復(fù)29次循環(huán)，然后72℃10min。
采用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物并回收PCR片段。
b.將IN PCR片段克隆到載體pGEX-4T-1上IN PCR產(chǎn)物和pGEX-4T-1分別用BamHI和XhoI進行酶切反應(yīng)；用膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物；用T4DNA連接酶做連接反應(yīng)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞；通過酶切和測序鑒定出正確的克隆。
c.將HIV-1整合酶185位的苯丙氨酸突變成賴氨酸本步驟采用Invitrogen公司的點突變試劑盒。
突變引物FW5’-ggcagtattcatccacaataagaaaagaaaaggggggattgg-3’RV5’-ccaatccccccttttcttttcttattgtggatgaatactgcc-3’通過測序確定發(fā)生正確突變的克隆質(zhì)粒pGEX-4T-1-IN(F185K)。
(2)HIV-1整合酶的表達純化本步驟采用了基因工程中的下游技術(shù)a.將質(zhì)粒pGEX-4T-1-IN(F185K)轉(zhuǎn)入表達菌株BL21(DE3)中，挑選正確的克隆在37℃過夜振蕩培養(yǎng)于10ml氨芐LB培養(yǎng)基(酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L和NaCl10g/L，氨芐青霉素濃度為100mg/L)中，按1∶100轉(zhuǎn)接到新鮮的氨芐LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)到OD600值處于0.6-0.8之間時，加入IPTG至終濃度為0.2mM并將培養(yǎng)溫度降低至25℃誘導(dǎo)蛋白表達5-7小時。5,000rpm離心10min收集細菌，用PBS緩沖液懸洗細菌后再次離心，并將收集的細菌置于-70℃冰箱保存待用。
b.超聲破碎細菌，采用親和層析的方法用GST樹脂純化蛋白，然后再用分子篩的方法進一步得到純度大于95％的蛋白。
(3)西替歐醛與HIV-1整合酶結(jié)合活性檢測本步驟采用生物傳感器Biacore 3000及其相關(guān)技術(shù)(表面等離子共振生物傳感技術(shù))。
a.將純化好的HIV-1整合酶用氨基偶聯(lián)的方法偶聯(lián)到CM5芯片上(偶聯(lián)方法按照Biacore 3000使用手冊)。
b.將不同濃度的西替歐醛配成含0.1％DMSO的HBS-EP緩沖液(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA和0.01％P20，pH7.4)作動力學(xué)分析，用Biacore evaluation 3.2軟件分析得出該化合物和HIV-1整合酶的平衡解離常數(shù)KD。
2.用生物傳感器測定西替歐醛對HIV-1整合酶的IC50值。
(1)將HIV-1整合酶的底物類似物偶聯(lián)到生物傳感器SA芯片上本步驟采用生物傳感器Biacore 3000及其相關(guān)技術(shù)(底物類似物是雙鏈DNA，序列為5’-GTGTGGAAAATCTCTAGGTGT-3’。
根據(jù)HIV-1整合酶的病毒DNA末端底物序列設(shè)計合成底物類似DNA，并在5’端加上生物素(biotin)標(biāo)記。序列biotin-5’-GTGTGGAAAATCTCTAGGTGT-3’。將合成的帶生物素標(biāo)記的DNA利用生物素和鏈霉素結(jié)合的原理偶聯(lián)到SA芯片。
(2)用生物傳感器測定西替歐醛對HIV-1整合酶的IC50值本步驟采用生物傳感器Biacore3000及其相關(guān)技術(shù)。
將純化好的HIV-1整合酶和不同濃度的西替歐醛在冰上孵育1小時后作動力學(xué)分析，因為化合物競爭結(jié)合HIV-1整合酶，使得HIV-1整合酶對芯片上底物DNA類似物的結(jié)合能力下降，表現(xiàn)為RU值的下降。根據(jù)化合物的不同濃度對應(yīng)的RU值與濃度作圖，用Origin分析得出化合物的IC50值。


圖1是表示GST標(biāo)記的HIV-1整合酶的純度。
圖2是西替歐醛與HIV-1整合酶動力學(xué)分析。
圖3是西替歐醛IC50值的測定。
具體實施例方式
下面進一步用實施例說明式(I)化合物的制備，但這些實施例絕不是對本發(fā)明的任何限制。
NMR用Bruker-DRX500核磁共振儀測定。柱層析硅膠、薄層硅膠板均為青島海洋化工有限公司生產(chǎn)。所使用的Sephadex LH-20為E.Merk公司生產(chǎn)，試劑均為上海振興化工一廠產(chǎn)品。
實施例1冰凍的新鮮海綿(干重138克)切碎，用分析純丙酮超聲提取至無色，減壓濃縮丙酮提取液(溫度低于50℃)，濃縮物以500毫升的蒸餾水懸浮，分別用乙醚和正丁醇萃取，乙醚萃取液經(jīng)減壓濃縮后得到棕色浸膏5.4克，該浸膏依次通過硅膠(200-300目)柱層析[石油醚(60-90℃)/丙酮梯度洗脫]，凝膠LH-20(氯仿洗脫)柱層析分離得到無色晶體11.2毫克。1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)如下1H NMR(CDCl3)δ9.47(s，1H，H-12)，7.36(brs，2H，H-19和H-25)，6.37(t，1H，H-18)，4.42(m，1H，H-16)，0.86(s，3H，Me)，0.85(s，3H，Me)，0.84(s，3H，Me)，0.82(s，3H，Me)；13C NMR(CDCl3)δ40.2(C-1)，18.8(C-2)，42.4(C-3)，33.1(C-4)，57.4(C-5)，18.3(C-6)，40.1(C-7)，44.5(C-8)，60.3(C-9)，36.7(C-10)，33.6(C-11)，205.8(C-12)，52.9(C-13)，48.0(C-14)，33.6(C-15)，64.2(C-16)，129.2(C-17)，108.5(C-18)，143.2(C-19)，33.5(C-20)，21.2(C-21)，15.7(C-22)，16.5(C-23)，19.1(C-24)，138.8(C-25)；經(jīng)與文獻波譜數(shù)據(jù)(Iguchi，K.；Shimada，Y.；Yamada，Y.J.Org.Chem.1992，57，522-524)確定采用上述提取、分離流程最終得到的無色晶體為二倍半萜類化合物西替歐醛(hyrtiosal)。
下述實施例中，所用的實驗材料及其來源包括(1)Glutathione SepharoseTM4B親和樹脂和Hiload 16/60 Superdex75分子篩預(yù)裝柱均購自Amersham Biosciences公司；(2)Biacore3000專用CM5芯片和SA芯片購自Amersham Biosciences公司；(3)HIV-1整合酶基因由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成部合成，依據(jù)序列AF040373(GENEBANK)，克隆到質(zhì)粒pUC18構(gòu)建成pUC18-IN；(4)載體pGEX-4T-1和菌株BL21購自Novagen公司；(5)快速點突變試劑盒購自Invitrogen公司；(6)限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、連接酶、dNTP等均購自Ferment(晶美)公司；(7)10×buffer隨pyrobestTMDNA聚合酶一起購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；(8)小量質(zhì)粒抽提試劑盒購自華舜公司；(9)PCR產(chǎn)物回收試劑盒和膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；(10)DNAmarker購自鼎國生物技術(shù)公司；(11)蛋白質(zhì)低分子量marker購自Amersham Biosciences公司；(12)引物合成和DNA生物素修飾由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成；(13)DNA測序由上海博亞公司完成；(14)氨芐青霉素、卡那霉素、DMSO和IPTG均購自Sigma公司；(15)細菌培養(yǎng)所需LB培養(yǎng)基(酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L和NaCl 10g/L)其中酵母提取物、胰蛋白胨和NaCl均購自中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W(xué)試劑公司；(16)還原型谷胱甘肽購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；(17)緩沖液1×PBS(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.4)；HBS-EP(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA和0.01％P20，pH7.4)其中NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、HEPES均購自中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W(xué)試劑公司，P20購自Amersham Biosciences公司；下述實施例中常規(guī)的基因操作參照有關(guān)文獻，其中限制性酶切方法參照分子克隆第二版P259-262；用T4DNA連接酶連接方法參照分子克隆第二版P282-283；感受態(tài)細胞的制備參照分子克隆第二版P55-56；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞DH5α和BL21方法參照分子克隆第二版P55-56；用酶切鑒定方法參照分子克隆第二版P259-262；此外瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物方法參照分子克隆第二版P680-682；膠回收按照上海生工的試劑盒說明書；點突變參照Invitrogen的試劑盒說明書；蛋白純化方法參照GST gene fusion systemhandbook及<Gel filtration，principles and methods>(Amersham Biosciences)；蛋白偶連到CM5芯片方法和生物素修飾的DNA偶聯(lián)到SA芯片的方法按照Biacore3000自帶軟件進行；質(zhì)粒提取方法參照華舜公司試劑盒說明書；LB培養(yǎng)基的配制方法參照分子克隆第二版P908；IPTG和PBS緩沖液的配制參照分子克隆第二版P926-927；HBS-EP溶液的配制參照Biacore3000說明書。
實施例2 GST標(biāo)記的HIV-1整合酶(IN，integrase)的融合蛋白質(zhì)粒pGEX-4T-1-IN(F185K)的構(gòu)建(一)實驗方法1)用PCR技術(shù)從pUC18-IN質(zhì)粒獲得IN的DNA片段(基因序列依據(jù)AF040373(GENEBANK))。
引物FW5′-ata tgg atc ctt ttta gat gga ata gat-3′RV5′-ata tct cga gct aat cct cat cct g-3′94℃變性5min，然后開始循環(huán)94℃45s，55℃45s，72℃1min30s，重復(fù)29次循環(huán)，然后72℃10min。
采用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物并回收PCR片段。
2)將IN PCR片段克隆到載體pGEX-4T-1上IN PCR產(chǎn)物和pGEX-4T-1分別用BamHI和XhoI進行酶切反應(yīng)；用膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物；用T4DNA連接酶做連接反應(yīng)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞涂布在含氨芐青霉素(100mg/l)的平板上；通過酶切和測序鑒定出正確的克隆。
3)將HIV-1整合酶185位的苯丙氨酸突變成賴氨酸本步驟采用Invitrogen公司的點突變試劑盒。
突變引物FW5’-ggcagtattcatccacaataagaaaagaaaaggggggattgg-3’RV5’-ccaatccccccttttcttttcttattgtggatgaatactgcc-3’通過測序確定發(fā)生正確突變的克隆質(zhì)粒pGEX-4T-1-IN(F185K)。
(二)實驗結(jié)果1)瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結(jié)果pGEX-4T-1載體的多克隆位點上有BamHI和XhoI兩個酶切位點，IN通過這兩個位點克隆到pGEX-4T-1上，正確的酶切結(jié)果切出IN本身的片段約900bp和載體的片段約4900bp；2)測序結(jié)果顯示克隆的序列與AF040373(GENEBANK)相同，僅在序列的553-555位由原有的”ttt”突變?yōu)椤盿aa”，對應(yīng)為185位的氨基酸由苯丙氨酸突變成賴氨酸。
實施例3 GST標(biāo)記的HIV-1整合酶(GST-IN)的表達純化(一)實驗方法1)將質(zhì)粒pGEX-4T-1-IN(F185K)轉(zhuǎn)入表達菌株BL21(DE3)中，挑選正確的克隆在37℃過夜振蕩培養(yǎng)于10ml氨芐LB培養(yǎng)基(酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L和NaCl10g/L，氨芐青霉素濃度為100mg/L)中，按1∶100轉(zhuǎn)接到新鮮的氨芐LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)到OD600值處于0.6-0.8之間時，加入IPTG至終濃度為0.2mM并將培養(yǎng)溫度降低至25℃誘導(dǎo)蛋白表達5-7小時。5,000rpm離心10min收集細菌，用PBS緩沖液懸洗細菌后再次離心，并將收集的細菌置于-70℃冰箱保存待用。
2)待用的菌體用20ml PBS懸起，超聲破碎細菌，15,000rpm離心30min后取上清和已經(jīng)用PBS平衡好的Glutathione SepharoseTM4B親和樹脂在4℃混勻4hrs，穿過柱子后，用100-150ml PBS洗去雜蛋白，最后用50mM GSH洗脫GST標(biāo)記的IN。
3)洗脫的蛋白溶液按照Amersham Biosciences公司提供的說明書利用Hiload 16/60Superdex75分子篩預(yù)裝柱進一步分離純化，所用溶液為10mM HEPES和150mMNaCl，收集蛋白用SDS-PAGE檢測純度。
(二)實驗結(jié)果8％SDS-PAGE并用考馬斯亮藍染色檢測純化的蛋白HIV-1整合酶全長282個氨基酸，加上大小為27kD的GST標(biāo)記，整個融合蛋白大小約為60kD。如圖1所示，左邊泳道為marker，右邊則為純化好的蛋白HIV-1整合酶，染色后的SDS-PAGE膠上可以清楚的看到約60kD處的條帶，判斷純度大于95％。
實施例4 利用生物傳感器Biacore 3000檢測西替歐醛與HIV-1整合酶的結(jié)合活性(一)實驗方法1)將純化好的HIV-1整合酶用氨基偶聯(lián)的方法利用Biacore 3000自帶的程序偶聯(lián)到CM5芯片上。Biacore3000系統(tǒng)運行環(huán)境為HBS-EP緩沖液(10mM HEPES，150mMNaCl，3mM EDTA和0.01％P20，pH7.4)。
2)將不同濃度的西替歐醛配成含0.1％DMSO的HBS-EP緩沖液(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA和0.01％P20，pH7.4)作動力學(xué)分析，用Biacore evaluation 3.2軟件分析得出該化合物和HIV-1整合酶的平衡解離常數(shù)KD。
(二)實驗結(jié)果化合物西替歐醛表現(xiàn)出對HIV-1整合酶很高的結(jié)合活性，KD＝0.197μM(圖2)。
實施例5 用生物傳感器測定西替歐醛對HIV-1整合酶的IC50值。
(一)實驗方法1)將HIV-1整合酶的底物類似物偶聯(lián)到生物傳感器SA芯片上根據(jù)HIV-1整合酶的病毒DNA末端底物序列設(shè)計合成底物類似DNA，并在5’端加上生物素(biotin)標(biāo)記。序列biotin-5’-GTGTGGAAAATCTCTAGGTGT-3’。將合成的帶生物素標(biāo)記的DNA利用生物素和鏈霉素結(jié)合的原理偶聯(lián)到SA芯片。
2)生物傳感器測定西替歐醛對HIV-1整合酶的IC50值將純化好的HIV-1整合酶和不同濃度的西替歐醛在冰上孵育1小時后作動力學(xué)分析，因為化合物競爭結(jié)合HIV-1整合酶，使得HIV-1整合酶對芯片上底物DNA類似物的結(jié)合能力下降，表現(xiàn)為RU值的下降。根據(jù)化合物的不同濃度對應(yīng)的RU值與濃度作圖，用軟件Origin分析得出化合物的IC50值。
(二)實驗結(jié)果由圖3可以看到隨著化合物濃度的增加，HIV-1整合酶對SA芯片的RU值下降。根據(jù)化合物的不同濃度對應(yīng)的RU值與濃度作圖，用Origin分析得出化合物西替歐醛的IC50值為9.6μM。
權(quán)利要求
1.具有如下結(jié)構(gòu)式的化合物西替歐醛的用途，在它對HIV-1整合酶具有高結(jié)合活性
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物西替歐醛的用途，其特征在于化合物具有抑制HIV-1整合酶與底物的結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物西替歐醛的用途，其特征在于在制備預(yù)防或治療艾滋病藥物中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供具有如圖所示結(jié)構(gòu)式的化合物西替歐醛(I)。化合物西替歐醛與HIV－1整合酶具有很高的結(jié)合活性(K
文檔編號A61P31/18GK1864674SQ200510026028
公開日2006年11月22日 申請日期2005年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月20日
發(fā)明者郭躍偉, 沈旭, 蔣華良, 于志國, 杜麗 申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所