專利名稱：核酸外切酶保護(hù)dna探針雜交dna微陣列芯片檢測dna結(jié)合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
DNA結(jié)合蛋白(DNA-binding protein)是生物蛋白質(zhì)組(proteomics)中一類能夠與DNA發(fā)生結(jié)合從而產(chǎn)生重要功能的蛋白質(zhì)，這類蛋白質(zhì)在基因表達(dá)調(diào)控(gene expression regulation)、DNA重組(DNA recombination)、DNA修復(fù)(DNA reparation)、DNA限制(DNA restriction)等細(xì)胞過程(cellular processes)中發(fā)揮重要作用。這類蛋白質(zhì)中有一部分與DNA相互作用時(shí)，呈現(xiàn)DNA序列特異性結(jié)合功能，如與DNA發(fā)生DNA序列特異性結(jié)合的各類DNA結(jié)合蛋白、各種限制性內(nèi)切酶等。由于這類蛋白質(zhì)在細(xì)胞過程中發(fā)揮的重要作用作用，它們已經(jīng)成為功能基因組(functional genomics)和蛋白質(zhì)組(proteomics)研究的重要對(duì)象。因?yàn)檫@類蛋白質(zhì)參與眾多基因的表達(dá)調(diào)節(jié)，因此與很多疾病存在密切的關(guān)系，成為診斷、治療和藥物研究的重要靶點(diǎn)(drug target)。DNA結(jié)合蛋白表達(dá)及活化程度的檢測分析是研究其功能的主要手段。本專利提出了一種檢測DNA結(jié)合蛋白表達(dá)和活化水平的新方法，該方法將為是分子生物學(xué)(molecular biology)、功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及生物醫(yī)學(xué)(Biomedicine)領(lǐng)域中的DNA結(jié)合蛋白相關(guān)研究提供一種新的檢測分析技術(shù)，可促進(jìn)這些領(lǐng)域中DNA結(jié)合蛋白相關(guān)的科學(xué)研究，以及在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中提供一種疾病相關(guān)DNA結(jié)合蛋白的診斷技術(shù)、以及DNA結(jié)合蛋白為靶點(diǎn)的藥物篩選(drug screening)技術(shù)。
背景技術(shù)：
DNA結(jié)合蛋白是生物蛋白質(zhì)組中一類重要的蛋白質(zhì)，是功能基因組和蛋白質(zhì)組研究的重要對(duì)象；許多疾病都與DNA結(jié)合蛋白的異常表達(dá)及活化存在密切的關(guān)系，成為疾病治療和藥物研究的重要靶點(diǎn)。DNA結(jié)合蛋白表達(dá)及活化程度的檢測分析是研究其功能的主要手段。因此，有關(guān)檢測分析DNA結(jié)合蛋白表達(dá)及活化程度技術(shù)的研究一直受到科學(xué)界的重視。
時(shí)至目前，科學(xué)家們已經(jīng)建立多種基于DNA/蛋白質(zhì)相互作用這一層次的DNA結(jié)合蛋白表達(dá)及活化程度的檢測分析技術(shù)。其中最經(jīng)典的是電泳遷移率變動(dòng)分析(Electrophoresis MobilityShift Assay)，即凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(gel shift assay)。該技術(shù)一般是人工合成含有DNA結(jié)合蛋白結(jié)合序列(consensus，binding sites)的雙鏈(double-stranded)寡核苷酸(oligonucleotides)，并用放射性同位素標(biāo)記寡核苷酸，將標(biāo)記寡核苷酸與含有DNA結(jié)合蛋白的細(xì)胞或組織抽提物混合孵育一段時(shí)間后，進(jìn)行自然聚丙烯酰胺凝膠電泳(native polyacrylamide gel eletrophoresis，PAGE)，分離游離(free DNA)和與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA(retarded DNA)，在通過X-光底片暴光顯現(xiàn)與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA(retarded DNA)，來反映DNA結(jié)合蛋白表達(dá)及活化程度。這一技術(shù)目前仍非常有效地用于DNA結(jié)合蛋白檢測分析。但存在放射性標(biāo)記對(duì)實(shí)驗(yàn)人員及環(huán)境危害的缺陷。因此，對(duì)這一技術(shù)后來進(jìn)行了非放射性標(biāo)記的改進(jìn)。即用地高辛(digoxigenin，DIG)標(biāo)記寡核苷酸，進(jìn)行自然聚丙烯酰胺凝膠電泳，再將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印(blotting)到尼龍膜(nylonmembrane)等介質(zhì)上，依靠堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶耦聯(lián)的DIG抗體和相應(yīng)酶的生色(colorimetric)或發(fā)光(chemiluminescent)底物(substrate)，進(jìn)行化學(xué)生色或發(fā)光檢測，來反映DNA結(jié)合蛋白表達(dá)及活化程度。也有采用熒光(fluorescent)標(biāo)記寡核苷酸進(jìn)行電泳遷移率變動(dòng)分析的改進(jìn)技術(shù)。這些技術(shù)也能夠很好地用于DNA結(jié)合蛋白檢測分析。但這些技術(shù)仍然存在自身的缺點(diǎn)，即它們雖然避免了經(jīng)典放射性標(biāo)記探針凝膠遷移實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)，但同時(shí)帶來實(shí)驗(yàn)流程的復(fù)雜化和更多的影響因素，如尼龍膜實(shí)驗(yàn)的高背景、轉(zhuǎn)引設(shè)備需求及實(shí)驗(yàn)成本提高等問題。同時(shí)，這些改進(jìn)技術(shù)從根本上未擺脫種凝膠遷移實(shí)驗(yàn)的技術(shù)思想，無法克服凝膠遷移實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品數(shù)量需求大、實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長、分析效率低等缺陷。
鑒于這些技術(shù)目前仍然存在的缺點(diǎn)，建立從技術(shù)思想角度上完全不同于凝膠遷移實(shí)驗(yàn)的DNA結(jié)合蛋白表達(dá)及活化檢測及分析技術(shù)是非常必要的。因此我們多年來一直從事DNA結(jié)合蛋白檢測新技術(shù)的研究，并且已經(jīng)建立了多種雙鏈DNA微陣列芯片技術(shù)(中國專利ZL02112780.8、02137945.9、03152881.3、03132206.9)。在我們已經(jīng)發(fā)明的專利技術(shù)中，對(duì)DNA結(jié)合蛋白的檢測是在芯片上直接制備雙鏈DNA，將DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)嵌合固定在芯片上雙鏈DNA上，通過待檢蛋白溶液與雙鏈DNA芯片的反應(yīng)，使蛋白質(zhì)結(jié)合在芯片DNA上，進(jìn)行DNA結(jié)合蛋白的檢測。這種方法在檢測中需要用熒光素標(biāo)記蛋白質(zhì)，或準(zhǔn)備蛋白質(zhì)的抗體并用熒光素進(jìn)行標(biāo)記才能實(shí)現(xiàn)芯片檢測，這不僅要求標(biāo)記蛋白、制備抗體等實(shí)驗(yàn)，而且標(biāo)記對(duì)蛋白可能造成DNA結(jié)合功能的影響。這種方法在檢測一種蛋白質(zhì)與芯片上眾多的DNA間的相互作用時(shí)，非常有效；但在檢測多種蛋白時(shí)，面臨一定的困難。特別重要的是，在實(shí)踐中需要檢測的對(duì)象常常是組織(tissue)、細(xì)胞(cell)等的核抽提物(nuclearextract)，要對(duì)這樣的復(fù)雜混合物進(jìn)行熒光標(biāo)記是很困難的，特別是對(duì)那些低豐度的DNA結(jié)合蛋白，要在核抽提物中標(biāo)記它們是非常困難的。另外如果采用抗體，則需要制備所需要檢測的所有蛋白質(zhì)的抗體，并用熒光標(biāo)記它們，才能用于高通量檢測多種DNA結(jié)合蛋白，這一途徑顯然更加困難。由此，我們著力改進(jìn)現(xiàn)有的DNA結(jié)合蛋白檢測技術(shù)，希望建立一些更加有效的技術(shù)，推動(dòng)相關(guān)技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化和應(yīng)用。本發(fā)明中，我們將核酸外切酶保護(hù)分析(Exonuclease Protection Assay)技術(shù)、PCR(Polymerase Chain Reaction)技術(shù)及DNA微陣列芯片(DNA microarray chip)技術(shù)有效地結(jié)合在一起，建立了“核酸外切酶保護(hù)DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結(jié)合蛋白”技術(shù)，用于在不標(biāo)記蛋白的情況下，同步(simultaneous)檢測多種DNA結(jié)合蛋白，即實(shí)現(xiàn)DNA結(jié)合蛋白的高通量(high throughput)分析檢測。

發(fā)明內(nèi)容
(1)、發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種不需要對(duì)DNA結(jié)合蛋白進(jìn)行任何標(biāo)記就可以高靈敏高通量檢測DNA結(jié)合蛋白的新技術(shù)，便于依靠基因芯片技術(shù)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)DNA結(jié)合蛋白的高效分析。為分子生物學(xué)(molecular biology)、功能基因組學(xué)(functional genomics)、蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)及生物醫(yī)學(xué)(biomedicine)等領(lǐng)域中的DNA結(jié)合蛋白(DNA-binding protein)的相關(guān)研究提供一種新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，促進(jìn)這些領(lǐng)域中DNA結(jié)合蛋白相關(guān)的科學(xué)研究，以及針對(duì)DNA結(jié)合蛋白的臨床檢測和藥物篩選研究。
(2)、技術(shù)方案本專利提出了一種檢測DNA結(jié)合蛋白表達(dá)和活化水平的新技術(shù)，即“核酸外切酶保護(hù)DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結(jié)合蛋白”，運(yùn)用該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA結(jié)合蛋白表達(dá)(expression)和活化(activation)水平的檢測分析。該技術(shù)的核心是將鑒定DNA結(jié)合蛋白DNA結(jié)合位點(diǎn)的核酸外切酶保護(hù)分析(Exonuclease Protection Assay)技術(shù)、核酸擴(kuò)增的PCR(Polymerase Chain Reaction)技術(shù)及高通量檢測生物信息的DNA微陣列芯片(DNAmicroarray chip)技術(shù)巧妙地結(jié)合在一起，達(dá)到對(duì)DNA結(jié)合蛋白表達(dá)和活化水平的非標(biāo)記(label-free)高通量(High throughput)分析。
運(yùn)用該技術(shù)分析DNA結(jié)合蛋白表達(dá)及活化水平時(shí)，首先依據(jù)要檢測的DNA結(jié)合蛋白的DNA結(jié)合位點(diǎn)的核苷酸序列，如一般的共同基序(consensus)，以及本技術(shù)中運(yùn)用核酸外切酶保護(hù)分析對(duì)PB-Probe結(jié)構(gòu)的要求，設(shè)計(jì)并合成具有“旁側(cè)序列——DNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)——PCR引物結(jié)合位點(diǎn)——標(biāo)簽序列——PCR引物結(jié)合位點(diǎn)——DNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)——旁側(cè)序列”結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)結(jié)合DNA探針(簡稱“PB-Probe”)；對(duì)DNA結(jié)合蛋白進(jìn)行檢測時(shí)，首先將多個(gè)PB-Probe等摩爾混合，成為PB-Probe溶液，再將待檢測的DNA結(jié)合蛋白溶液與PB-Probe溶液在有利與DNA/蛋白質(zhì)結(jié)合的結(jié)合緩沖液中混合，在適宜反應(yīng)溫度下進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)適當(dāng)時(shí)間；向DNA/蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)體系中加入核酸外切酶(exonuclease)反應(yīng)液，在適宜溫度下酶切(digestion)適當(dāng)時(shí)間，再加入終止液徹底終止核酸外切酶酶切活性；酶切反應(yīng)終止后，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行DNA純化，將純化后的DNA作為模板(template)，用PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在DNA/蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)中，若待檢溶液中存在相應(yīng)PB-Probe的DNA結(jié)合蛋白，則DNA結(jié)合蛋白就會(huì)與溶液中的PB-Probe發(fā)生序列特異性結(jié)合反應(yīng)(sequence-specific binding)，形成“PB-Probe/DNA結(jié)合蛋白”復(fù)合物(complex)，在這種復(fù)合物中，DNA結(jié)合蛋白結(jié)合在PB-Probe兩端的DNA結(jié)合位點(diǎn)上，形成了一種物理障礙(physicalhindrance)，當(dāng)核酸外切酶消化時(shí)，則結(jié)合的DNA結(jié)合蛋白阻擋了核酸外切酶沿著PB-Probe的外切反應(yīng)，使核酸外切酶不能降解PB-Probe上DNA結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)側(cè)的PCR引物結(jié)合位點(diǎn)(PCR primer-binding site)及標(biāo)簽序列(Tag sequence)，因此在PCR反應(yīng)中，被DNA結(jié)合蛋白保護(hù)的PB-Probe的PCR引物結(jié)合位點(diǎn)及標(biāo)簽序列就可以實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增；而當(dāng)待檢溶液中不存在相應(yīng)PB-Probe的DNA結(jié)合蛋白時(shí)，裸露(naked)的PB-Probe就會(huì)受到核酸外切酶的攻擊，核酸外切酶對(duì)PB-Probe發(fā)生徹底降解，因此在PCR反應(yīng)中，因無PCR引物結(jié)合位點(diǎn)及標(biāo)簽序列，PCR就擴(kuò)增不出產(chǎn)物。因此，PCR產(chǎn)物的有無及多少代表了待檢蛋白質(zhì)溶液中DNA結(jié)合蛋白的有無及多少。為便于檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在PCR擴(kuò)增中可運(yùn)用熒光標(biāo)記的單核苷酸(Mononuleotide)或引物(primer)，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記，再將熒光標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與Tag-DNA微陣列芯片雜交，依據(jù)芯片應(yīng)該光掃描圖像獲得PCR產(chǎn)物中各種PB-Probe的數(shù)量信息，從而高通量判定待檢蛋白質(zhì)溶液中DNA結(jié)合蛋白的有無及多少。此處所使用的Tag-DNA微陣列芯片是一種普通的單鏈DNA(single-stranded DNA，ssDNA)微陣列芯片(microarray chip)，但芯片上固定的DNA探針是專門針對(duì)PB-Probe上的標(biāo)簽序列(Tagsequence)設(shè)計(jì)的，因此這些芯片DNA探針(CD-Probe)可檢測PCR產(chǎn)物中各種PB-Probe的數(shù)量信息。
運(yùn)用該技術(shù)檢測DNA結(jié)合蛋白包括如下五個(gè)步驟
①制備PB-Probe、CD-Probe和Tag-DNA微陣列芯片；②PB-Probe與DNA結(jié)合蛋白結(jié)合；③核酸外切酶酶切；④PCR擴(kuò)增及標(biāo)記；⑤PCR產(chǎn)物與DNA微陣列芯片雜交檢測。
制備PB-Probe是運(yùn)用該技術(shù)檢測DNA結(jié)合蛋白的第一步，也是很重要的一步。為實(shí)現(xiàn)本技術(shù)檢測DNA結(jié)合蛋白的功用，PB-Probe的設(shè)計(jì)和制備具有下列結(jié)構(gòu)①PB-Probe為雙鏈DNA(double-stranded DNA，dsDNA)分子；②PB-Probe的兩端各含有一個(gè)以上的相同DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)；③PB-Probe的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)側(cè)有PCR引物結(jié)合位點(diǎn)；④PB-Probe的兩PCR引物結(jié)合位點(diǎn)之間存在特定的標(biāo)簽(Tag)序列。因此本發(fā)明中使用的PB-Probe具有這樣的結(jié)構(gòu)，即“旁側(cè)序列——DNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)——PCR引物結(jié)合位點(diǎn)——標(biāo)簽序列——PCR引物結(jié)合位點(diǎn)——DNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)——旁側(cè)序列”。
PB-Probe是由兩堿基序列反向互補(bǔ)的單鏈核酸分子構(gòu)成的線性(linear)雙鏈DNA分子。構(gòu)成PB-Probe的兩堿基序列反向互補(bǔ)的單鏈核酸分子可以依靠兩種途徑獲得，一是運(yùn)用固相化學(xué)合成兩條單鏈寡核苷酸，通過核酸退火，形成雙鏈DNA分子；二是設(shè)計(jì)并合成具有“旁側(cè)序列——DNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)——引物序列1——引物序列2”或“旁側(cè)序列——DNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)——引物序列1”的PCR引物，依靠PCR擴(kuò)增反應(yīng)從序列已知的自然生物基因組DNA中擴(kuò)增獲得需要的PB-Probe。PCR擴(kuò)增時(shí)可利用針對(duì)不同DNA片段的特異引物序列2擴(kuò)增制備PB-Probe，而在DNA結(jié)合蛋白檢測中使用針對(duì)引物序列1合成的通用PCR引物方便地?cái)U(kuò)增PB-Probe。若有可能，在PB-Probe制備及檢測中都可以使用引物序列1，如利用克隆在具有通用引物結(jié)合序列載體中的基因組DNA片段制備PB-Probe。
為了運(yùn)用核酸外切酶保護(hù)分析(Exonuclease Protection Assay)技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA結(jié)合蛋白的檢測，本發(fā)明對(duì)傳統(tǒng)DNA足跡分析(DNA footprinting)中的DNA探針進(jìn)行了重要改造，即在DNA探針的兩端各設(shè)立一個(gè)DNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)，在兩DNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)之間設(shè)立具有信息檢測功能的PCR引物結(jié)合序列和標(biāo)簽序列，蛋白質(zhì)與PB-Probe的兩DNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合與否，可依靠隨后的酸外切酶保護(hù)分析、PCR擴(kuò)增和芯片雜交加以指示。DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，可以是從自然生物基因組中鑒定發(fā)現(xiàn)的結(jié)合序列如共同基序(consensus)外，例如，p53蛋白的DNA結(jié)合位點(diǎn)為 SP1蛋白的DNA結(jié)合位點(diǎn)為 NF-κ蛋白的DNA結(jié)合位點(diǎn)為 等；也可以是經(jīng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)篩選的DNA結(jié)合蛋白對(duì)其有良好序列特異性結(jié)合親合性的核酸序列。由于有些核酸外切酶如核酸外切酶III有時(shí)會(huì)越過結(jié)合位點(diǎn)較小的DNA結(jié)合蛋白，在探針設(shè)計(jì)上，可以在PB-Probe的每一端增設(shè)一個(gè)以上的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，或設(shè)計(jì)使用親合力較高的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。在PB-Probe設(shè)計(jì)上還需要注意在PB-Probe的兩個(gè)末端增設(shè)一些旁側(cè)序列，以便DNA結(jié)合蛋白與PB-Probe的良好結(jié)合。有些DNA結(jié)合蛋白不需要旁側(cè)序列，也可以和DNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生良好的結(jié)合，此中情況下，也可以減少旁側(cè)序列的核苷酸數(shù)目或不要旁側(cè)序列。為了保證DNA結(jié)合蛋白按預(yù)定的行為與PB-Probe結(jié)合并實(shí)現(xiàn)對(duì)其檢測，一個(gè)PB-Probe上除專門在PB-Probe兩端設(shè)立的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)外，其他序列包括旁側(cè)序列、PCR引物結(jié)合位點(diǎn)和標(biāo)簽序列中都不得在含有DNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)。為了檢測不同的DNA結(jié)合蛋白，不同的PB-Probe含有不同DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，在檢測體系中需要檢測多少種DNA結(jié)合蛋白，就需要設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)種類的PB-Probe。在檢測的探針溶液中則含有所有種類的PB-Probe，以同步(simultaneously)檢測多種DNA結(jié)合蛋白。但是，由于在檢測中將多種PB-Probe混合在一起作為探針溶液與蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，因此一個(gè)PB-Probe上的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)序列不僅在該P(yáng)B-Probe上是唯一的，在探針溶液中的所有PB-Probe上也必須是唯一的，特異的，即一種PB-Probe上不得出現(xiàn)兩種DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。
為了便于進(jìn)行PCR擴(kuò)增及檢測，本發(fā)明在PB-Probe的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)側(cè)設(shè)計(jì)了PCR引物結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)PB-Probe上，PCR引物結(jié)合位點(diǎn)的序列必須是唯一的，即只有PCR引物結(jié)合位點(diǎn)可供PCR引物結(jié)合，其他序列包括旁側(cè)序列、蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)和標(biāo)簽序列都不能和PCR引物退火。在一個(gè)PB-Probe上，標(biāo)簽序列兩側(cè)的兩PCR引物結(jié)合位點(diǎn)序列可以相同(5′→3′)，也可以不同；若不同，在PCR擴(kuò)增時(shí)就需要兩個(gè)不同的引物，及一對(duì)PCR引物；若相同，則只需要一個(gè)引物，就如RAPD一樣。由于在檢測中將多沖PB-Probe混合在一起作為探針溶液與蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，因此一個(gè)PB-Probe上的PCR引物結(jié)合位點(diǎn)序列不僅在該P(yáng)B-Probe上是唯一的，在探針溶液中的所有PB-Probe上也必須是唯一的，特異的?？梢姡景l(fā)明中若對(duì)不同的PB-Probe設(shè)計(jì)不同的PCR引物結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，探針溶液中PB-Probe種類越多，則需要設(shè)計(jì)合成的上PCR引物越多，則多重PCR的復(fù)雜性越大，特別是要兼顧PCR引物結(jié)合位點(diǎn)序列的特異性和一致的Tm值，則會(huì)更大地增加PB-Probe及PCR引物設(shè)計(jì)及合成的難度，因此這種設(shè)計(jì)方案顯然不是本發(fā)明優(yōu)先選擇的。比較而言，在所有PB-Probe上使用一對(duì)或一個(gè)通用的PCR引物結(jié)合位點(diǎn)，則極大地簡化了PB-Probe及PCR引物設(shè)計(jì)及合成，因此使用通用PCR引物結(jié)合位點(diǎn)和通用PCR引物是本發(fā)明最優(yōu)先采取的方案。
為了運(yùn)用DNA微陣列芯片實(shí)現(xiàn)DNA結(jié)合蛋白的高通量檢測，本發(fā)明的PB-Probe的兩PCR引物結(jié)合位點(diǎn)之間設(shè)立了特定的標(biāo)簽(Tag)序列。標(biāo)簽序列和蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)一樣，不僅要求在同一PB-Probe上其序列是唯一的，在探針溶液中的所有PB-Probe上也必須是唯一的，特異的。這樣，一個(gè)PB-Probe上的標(biāo)簽序列才能唯一性地代表該P(yáng)B-Probe要檢測的靶蛋白。PB-Probe標(biāo)簽序列的設(shè)計(jì)除序列特異性外，還應(yīng)當(dāng)注意其堿基組成，以便針對(duì)不同的PB-Probe標(biāo)簽序列設(shè)計(jì)Tag-DNA微陣列芯片的DNA探針，特別是要求所有CD-Probe要有一致的Tm值。若PB-Probe是從基因組DNA中擴(kuò)增制備，應(yīng)對(duì)每個(gè)PB-Probe的標(biāo)簽序列進(jìn)行詳盡的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)篩查，杜絕所有PB-Probe的標(biāo)簽序列上含有任何已知的DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)于序列已知的基因組及DNA克隆，這一工作并不困難。
運(yùn)用本發(fā)明檢測DNA結(jié)合蛋白，還需準(zhǔn)備PCR引物，以便在核酸外切酶酶切后擴(kuò)增PB-Probe。本發(fā)明PCR引物的準(zhǔn)備出遵循一般PCR引物設(shè)計(jì)的所有要求外，還應(yīng)當(dāng)按PB-Probe上PCR引物結(jié)合位點(diǎn)的序列特征進(jìn)行合成。正如前面對(duì)PB-Probe上PCR引物結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)的闡述，本發(fā)明盡量避免進(jìn)行多重的PCR引物設(shè)計(jì)和合成，也避免進(jìn)行多重PCR，應(yīng)是優(yōu)先使用通用PCR引物。
Tag-DNA微陣列芯片檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是本發(fā)明實(shí)現(xiàn)DNA結(jié)合蛋白檢測最后一步，也是體現(xiàn)本發(fā)明高通量特征的重要環(huán)節(jié)。Tag-DNA微陣列芯片的設(shè)計(jì)及制備具有如下特征①Tag-DNA微陣列芯片上固定著大量單鏈芯片DNA探針(Single-stranded CD-Probe)分子；②大量的CD-Probe分子的核苷酸序列各不相同，不同的CD-Probe分子其核苷酸序列在所有CD-Probe分子中是獨(dú)特的；③每一種CD-Probe分子的核苷酸序列設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)著一種PB-Probe的標(biāo)簽序列，即一種CD-Probe分子可與對(duì)應(yīng)的PB-Probe的標(biāo)簽序列的其中一條鏈雜交退火；④芯片上不同的CD-Probe分子對(duì)應(yīng)不同的PB-Probe的標(biāo)簽序列；⑤Tag-DNA微陣列芯片與PCR擴(kuò)增的PB-Probe分子雜交時(shí)，不同CD-Probe分子可反映一種對(duì)應(yīng)的PB-Probe分子的標(biāo)簽序列在PCR產(chǎn)物中的存在與否及數(shù)量多少；⑥為了提高芯片檢測的精確性，可針對(duì)一個(gè)PB-Probe的標(biāo)簽序列設(shè)計(jì)一個(gè)以上的CD-Probe，通過多CD-Probe信號(hào)的共顯性及信號(hào)強(qiáng)度的均勻性對(duì)PCR產(chǎn)物中相應(yīng)PB-Probe的量做出精確的判別；⑦Tag-DNA微陣列芯片應(yīng)設(shè)置陽性和陰性對(duì)照CD-Probe。
在DNA微陣列芯片檢測，一般要對(duì)檢測的DNA進(jìn)行熒光標(biāo)記，再與芯片雜交，雜交后芯片經(jīng)熒光掃描分析，就可以獲得各個(gè)探針的雜交信號(hào)，進(jìn)而判定檢測DNA中對(duì)應(yīng)于各種芯片探針的靶DNA分子的數(shù)量信息。在本發(fā)明中，為便于運(yùn)用Tag-DNA微陣列芯片對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測分析，也需要在PCR擴(kuò)增中對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記。若使用共PCR擴(kuò)增標(biāo)記，就可以在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中，加入熒光素標(biāo)記的單核苷酸，如Cy3-dUTP、Cy3-dCTP等，使其進(jìn)入PCR擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物鏈中；或使用熒光素標(biāo)記的PCR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，使PCR擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物鏈帶上熒光分子。此種情況下PCR產(chǎn)物與Tag-DNA微陣列芯片雜交后，芯片經(jīng)適當(dāng)洗滌，就可以直接用基因芯片掃描儀、熒光顯微鏡等儀器進(jìn)行熒光信號(hào)檢測。另外還可以采用其他標(biāo)記方法實(shí)現(xiàn)標(biāo)記，如PCR中使用帶DIG、生物素等的核苷酸，如DIG-dUTP、Biotin-dUTP等，也可以使用DIG、生物素等標(biāo)記的PCR產(chǎn)物等，標(biāo)記PCR產(chǎn)物；此種情況下PCR產(chǎn)物與Tag-DNA微陣列芯片雜交后，芯片經(jīng)適當(dāng)洗滌，再用熒光標(biāo)記的DIG-抗體、生物素抗體或鏈親合素等與Tag-DNA微陣列芯片雜交，芯片經(jīng)洗滌后，再用基因芯片掃描儀、熒光顯微鏡等儀器進(jìn)行熒光信號(hào)檢測。除了標(biāo)記PCR產(chǎn)物外，還可以采用不標(biāo)記PCR產(chǎn)物的其他技術(shù)實(shí)現(xiàn)PCR產(chǎn)物與Tag-DNA微陣列芯片雜交后的信號(hào)反映，如在PCR引物的5′末端增加一段寡核苷酸，其上4個(gè)其他堿基相間的插入多個(gè)dATP或dGTP，PCR產(chǎn)物與Tag-DNA微陣列芯片雜交后，進(jìn)行含Cy3-dUTP或Cy3-dCTP的在片DNA聚合酶延伸反應(yīng)，也可反映雜交信號(hào)；不過此種情況要求Tag-DNA微陣列芯片的CD-Probe是固定5′末端，而3′末端游離。另外若PCR引物的5′末端增加一段寡核苷酸，可以在PCR產(chǎn)物與Tag-DNA微陣列芯片雜交后，也可用一熒光標(biāo)記的寡核苷酸與PCR引物5′末端增加寡核苷酸再雜交，反映PCR產(chǎn)物與Tag-DNA微陣列芯片雜交信號(hào)。此外其他技術(shù)，如3D-DNADendrimers，Rolling Circle Amplification Technology(RCA)，Au-DNA等技術(shù)進(jìn)行PCR產(chǎn)物與Tag-DNA微陣列芯片雜交信號(hào)的反映。
本技術(shù)中用于檢測的DNA結(jié)合蛋白為各種來源的DNA結(jié)合蛋白，包括人工表達(dá)制備的DNA結(jié)合蛋白、從細(xì)胞或組織裂解物中分離純化的DNA結(jié)合蛋白和含有DNA結(jié)合蛋白的細(xì)胞或組織抽提物。檢測中首先要在適宜反應(yīng)溫度(如37C)將PB-Probe與DNA結(jié)合蛋白在結(jié)合緩沖液中一起孵育適當(dāng)時(shí)間，如20分鐘到半小時(shí)，其作用是DNA結(jié)合蛋白與PB-Probe在溶液中發(fā)生序列特異性識(shí)別并結(jié)合。結(jié)合反應(yīng)體系中加入的PB-Probe的量要適宜。檢測中可以在同一反應(yīng)體系中加入檢測不同DNA結(jié)合蛋白的PB-Probe，以高通量檢測多種DNA結(jié)合蛋白。
在DNA結(jié)合蛋白與PB-Probe發(fā)生序列特異性結(jié)合后，將核酸外切酶反應(yīng)液加入反應(yīng)體系中，使核酸外切酶對(duì)PB-Probe發(fā)生消化反應(yīng)，徹底降解未與DNA結(jié)合蛋白結(jié)合的PB-Probe，使降解的PB-Probe不能在隨后的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增出來。消化PB-Probe所使用核酸外切酶為具有在雙鏈DNA上可從3′→5′或5′→3′外切消化DNA逐個(gè)釋放單核苷酸的酶，如Ba131、exonuclease III、E.coli DNA Polymerase I、T4 phage DNA Polymerase、T7 phage DNAPolymerase、λphage exonuclease等酶。在酶的選用上，應(yīng)盡量選擇那些反應(yīng)效率高，反應(yīng)條件接近DNA/蛋白質(zhì)結(jié)合緩沖液性質(zhì)的核酸外切酶。在選用核酸外切酶時(shí)，那些可在單鏈和雙鏈DNA上都可以進(jìn)行核酸外切消化的酶更有利。若選用只能在雙鏈DNA上進(jìn)行核酸外切消化的酶時(shí)，如核酸外切酶III，需在核酸外切酶反應(yīng)適宜時(shí)間后，加入S1核酸酶消除核酸外切酶產(chǎn)生的單鏈DNA，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
我們的實(shí)驗(yàn)表明，核酸外切酶III為本發(fā)明技術(shù)中可以使用的一個(gè)非常理想的核酸外切酶，該酶具有對(duì)雙鏈DNA的3′→5′外切活性，而且在廣泛的鹽濃度(0-100nM NaCl活KCl)和pH(7.6-8.5)條件中都具有穩(wěn)定的活性；該酶在一般DNA/蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)溫度下(37℃)下具有很高的外切活性(～500bp/分鐘，Promega)；另外，一般DNA/蛋白質(zhì)結(jié)合緩沖液(具有Mg2+)就可以成為該酶的可行反應(yīng)條件，因此在進(jìn)行核酸外切酶III外切反應(yīng)時(shí)，僅僅加入一些酶就可以了，不需要再加入其他緩沖液，所以非常適合運(yùn)用本發(fā)明核酸外切酶酶切反應(yīng)中。核酸外切酶III的消化效率非常高，在37℃，每分鐘可切除420個(gè)核苷酸(Fermentas)，因此酶反應(yīng)的時(shí)間一般很短，而DNA/蛋白質(zhì)復(fù)合物的壽命一般比核酸外切酶III反應(yīng)所需要的時(shí)間長，加之核酸外切酶III的加入一般不會(huì)影響DNA/蛋白質(zhì)復(fù)合物，因此核酸外切酶III被廣泛地用于常規(guī)DNA足跡分析(DNAfootprinting)或核酸外切酶保護(hù)分析(exonuclease IIIprotection assay)中。核酸外切酶III的另一好處是，該酶已經(jīng)證實(shí)可用以分析細(xì)胞抽提物中的DNA結(jié)合蛋白，這對(duì)分析臨床樣品非常有利，因?yàn)榕R床樣品常常是組織或細(xì)胞，從這些樣品中只要抽提出核蛋白或細(xì)胞蛋白，就可以用核酸外切酶III進(jìn)行分析。因此，核酸外切酶III是本發(fā)明最優(yōu)先使用的核酸外切酶。但使用該酶時(shí)，不能使用3′端比5′端突出4個(gè)以上核苷酸的PB-Probe，平端和3′凹端的PB-Probe最好。
由于在核酸外切酶保護(hù)分析中延長酶反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致酶消化掉那些蛋白質(zhì)結(jié)合后動(dòng)態(tài)脫落的PB-Probe，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在核酸外切酶加入PB-Probe/蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)體系，反應(yīng)適當(dāng)時(shí)間后，應(yīng)加入EDTA等終止試劑或高溫加熱完全終止核酸外切酶酶切反應(yīng)，并立即對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行DNA純化，消除DNA結(jié)合蛋白及核酸外切酶等蛋白質(zhì)，以便PCR擴(kuò)增。
本技術(shù)中上面所述對(duì)一種待蛋白質(zhì)溶液檢測時(shí)，對(duì)PCR產(chǎn)物用一種熒光素標(biāo)記并與Tag-DNA微陣列芯片雜交，通過熒光信號(hào)的強(qiáng)弱反映蛋白質(zhì)存在與否及數(shù)量。除了這種方式的檢測外，還可以對(duì)兩份蛋白質(zhì)溶液，如一種為正常組織細(xì)胞核蛋白質(zhì)抽提物，另一種為疾病狀態(tài)組織細(xì)胞核蛋白質(zhì)抽提物，進(jìn)行比較檢測，此種情況下，一種蛋白PCR產(chǎn)物用一種熒光素標(biāo)記(如Cy3)，另一種蛋白PCR產(chǎn)物用另一種熒光素標(biāo)記(如Cy5)，最后將兩種PCR產(chǎn)物混合與Tag-DNA微陣列芯片共雜交，芯片用雙通道熒光(Cy3、Cy5)掃描后，疊加雙色熒光圖像，判斷蛋白質(zhì)表達(dá)或活化水平的上調(diào)(upregulate)或下調(diào)(downregulate)。
(3)、技術(shù)效果DNA結(jié)合蛋白因負(fù)責(zé)基因表達(dá)的調(diào)控等重要的細(xì)胞功能而成為目前基因組和蛋白組研究所重視的一類重要蛋白質(zhì)，而且許多疾病與DNA結(jié)合蛋白異常表達(dá)及活化間存在的密的關(guān)系，引起了生物醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)NA結(jié)合蛋白研究的關(guān)注，DNA結(jié)合蛋白已經(jīng)成為疾病治療和藥物研究的重要靶點(diǎn)。因此，建立高通量DNA結(jié)合蛋白功能檢測及分析技術(shù)非常迫切。為此，本發(fā)明提出了一種非蛋白標(biāo)記的DNA結(jié)合蛋白高通量檢測技術(shù)，利用本技術(shù)檢測DNA結(jié)合蛋白，可以克服傳統(tǒng)檢測DNA結(jié)合蛋白方法以及雙鏈DNA微陣列芯片的一些技術(shù)缺陷，實(shí)現(xiàn)DNA結(jié)合蛋白的高效分析。
本發(fā)明提出的“核酸外切酶保護(hù)DNA探針雜交Tag-DNA微陣列芯片檢測DNA結(jié)合蛋白”技術(shù)，將核酸外切酶III保護(hù)分析技術(shù)、PCR擴(kuò)增技術(shù)和DNA微陣列芯片技術(shù)結(jié)合在一起，建立了一種高效檢測分析DNA結(jié)合蛋白的新方法。經(jīng)我們的實(shí)驗(yàn)研究，本發(fā)明提出的技術(shù)可操作性強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性良好。在推廣應(yīng)用中，當(dāng)我們商業(yè)化生產(chǎn)和提供PB-Probe、CD-Probe和Tag-DNA微陣列芯片及相關(guān)成套試劑的情況下，只經(jīng)過四個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟就可以完成對(duì)多DNA結(jié)合蛋白的同步分析。本發(fā)明提供的DNA結(jié)合蛋白檢測新技術(shù)，可以借助常規(guī)PCR儀、基因芯片點(diǎn)樣儀、基因芯片掃描等儀器實(shí)現(xiàn)DNA結(jié)合蛋白的高通量檢測，這些儀器已經(jīng)在很多實(shí)驗(yàn)室得到應(yīng)用，因此極大地方便了本技術(shù)的推廣使用。商業(yè)化提供的試劑盒可投入到科研、醫(yī)療等應(yīng)用領(lǐng)域，用與DNA結(jié)合蛋白的相關(guān)研究、診斷和藥物篩選。因此，該技術(shù)將為分子生物學(xué)、功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域中的DNA結(jié)合蛋白的相關(guān)研究提供一種新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，促進(jìn)這些領(lǐng)域中DNA結(jié)合蛋白相關(guān)的科學(xué)研究和開發(fā)。
本發(fā)明技術(shù)生產(chǎn)的DNA結(jié)合蛋白檢測試劑盒，將在臨床輔助診斷和生物醫(yī)學(xué)中針對(duì)DNA結(jié)合蛋白的藥物篩選研究具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。例如，DNA結(jié)合蛋白p53、NF-kB的表達(dá)及活化異常，在許多疾病中發(fā)揮的重要作用，因此成為臨床診斷中觀測的重要靶點(diǎn)，同時(shí)也是轉(zhuǎn)錄治療和藥物篩選重要靶點(diǎn)。
四

圖1核酸外切酶保護(hù)DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結(jié)合蛋白技術(shù)流程注解PB蛋白質(zhì)結(jié)合(Protein Binding)；ED核酸外切酶消化(Exonuclease Digestion)；P純化(Purification)；A擴(kuò)增(Amplification by PCR)；CH芯片雜交(Chip Hybridization)；S掃描(Scanning)。
圖2PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖3Tag-DNA微陣列芯片雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果五具體實(shí)施方式
此處僅以制備PB-Probe檢測DNA結(jié)合蛋白NF-κB的實(shí)驗(yàn)為例，說明本發(fā)明技術(shù)的具體
1、NF-κB PB-Probe，PCR引物，Tag-DNA微陣列芯片制備NF-κB PB-Probe 其中＿＿為NF-κB結(jié)合位點(diǎn)， 為PCR primer結(jié)合位點(diǎn)， 為Tag序列。
NF-κB PB-Probe制備時(shí)，將兩寡核苷酸以100μM濃度溶解在TEN緩沖液(10mM Tris，1mM EDTA，0.1M NaCl，pH8.0)中；將配對(duì)寡核苷酸溶液等摩爾(molar)混合，95℃保溫10分鐘，緩慢冷卻到15～25℃。用TEN緩沖液稀釋部分PB-Probe原液至濃度為5μM，4℃保存?zhèn)溆谩?br> PCR引物primerR5′...GCTGGGCTGCTGC...3′Tm46.5GC76.9％primerF5′...CCGCTACGGCTCG...3′Tm47.5GC76.9％PCR引物寡核苷酸以50μM濃度溶解在水中。
Tag-DNA微陣列芯片CD-Probe5′...NH2-TTTTTTTTTTCTGCACTGCTCATTAATATACTTCTGG...3′positive5′...NH2-TTTTTTTTTTCTGCATGTATAGAACATAAGGTGTCGC...3′negative control將CD-Probe寡核苷酸以100μM濃度溶解在碳酸緩沖液(0.1M carbonatebuffer，pH9.0)。再將碳酸緩沖液稀釋的50μM的CD-Probe寡核苷酸用PixSys5500(Cartesian Technology Inc.)點(diǎn)樣到醛基修飾玻片(SuperAldehyde slide，Telechem)表面，點(diǎn)樣后置于濕盒內(nèi)用300mM K2HPO4(pH9.0)浸濕的濾紙上，密封濕盒，在37℃溫育30分鐘，再用2×SSC/1％SDS溶液洗滌2分鐘，用水簡單淋洗，N2吹干。芯片再用硼氫化鈉溶液
浸泡玻片30分鐘，除去過剩醛基，1％SDS溶液洗滌2分鐘，用水簡單淋洗，N2吹干。
2、NF-κB PB-Probe與DNA結(jié)合蛋白NF-κB的結(jié)合將2μl(1gsu/μl)DNA結(jié)合蛋白NF-κB蛋白[rhNF-κB(p50)，Promega)]、2μl 5×DNA結(jié)合緩沖液(50mM HEPES pH7.9，250mM KCl，12.5mM DTT，0.5mM EDTA，0.25％NP-40，50％Glycerol，25％fetal bovine serum)和2μl 5μM NF-κB PB-Probe混合，再加入4μl水，形成DNA/蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)液。將DNA/蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)液在37℃孵育30分鐘。
3、核酸外切酶III反應(yīng)將2μl 10×反應(yīng)緩沖液[660mM Tris-HCl(pH8.0 at 30℃)，6.6mM MgCl2]和0.2μl 200U/μlExonuclease III(MBI Fermentas，#EN0191)加入結(jié)合反應(yīng)體系中，37℃孵育5分鐘。再向酶反應(yīng)溶液中加入75μl S1核酸酶反應(yīng)液[40.5mM potassium acetate(pH4.6)，0.34M NaCl，1.35mMZnSO4，6.75％glycerol，S1 Nuclease 0.25U/μl)，37℃孵育5分鐘。加入10μl S1終止液(300mM Tris，50mM EDTA)，70℃加熱10分鐘滅活S1 Nuclease。用酚∶氯仿(1∶1)、酚∶氯仿∶異戊醇(24∶1)各抽提終止的酶反應(yīng)溶液一次，再用冰乙醇沉淀DNA
，最后1ml 75％-20℃冰乙醇洗滌DNA一次，干燥DNA沉淀，將DNA溶解在10μl水中。
4、PCR擴(kuò)增反應(yīng)及標(biāo)記用上面純化的DNA做模板，primerF和primerR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。100μl-PCR反應(yīng)體系為2μl模板DNA，0.5μM primerR，0.5μM primerF，0.2mM dATP，0.2mM dGTP，0.2mMdTTP，0.15mM dCTP，0.05mM Cy3-dCTP(Amersham Pharmacia)，2mM MgSO4，10mM KCl，8mM(NH4)SO4，10mM Tris-HCl，pH9.0，0.05％NP-40，0.05U/μl Taq(Shenergy Biocolor)。PCR程序95℃2分鐘，94℃30秒、50℃45秒、72℃1分鐘循環(huán)25次，72℃5分鐘。用酚∶氯仿(1∶1)、酚∶氯仿∶異戊醇(24∶1)各抽提PCR產(chǎn)物一次，再用-20℃冰乙醇沉淀DNA
，最后用-20℃75％冰乙醇洗滌DNA一次，干燥DNA沉淀。將DNA溶解在50μl水中，95℃加熱10分鐘，冰上驟冷保存。
5、PCR擴(kuò)增及標(biāo)記產(chǎn)物與Tag-DNA微陣列芯片雜交檢測取2μl經(jīng)純化溶解在水中的PCR產(chǎn)物與2μl 5×標(biāo)準(zhǔn)雜交液[25×SSC，0.5％N-lauroylsarcosine，0.1％SDS，5％blocking reagent(Roche)]混合，再加水6μl。將雜交液滴加到Tag-DNA微陣列芯片上，用蓋玻片覆蓋雜交液。將芯片放入雜交盒內(nèi)，密封，60℃孵育3小時(shí)。取出芯片，用2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS溶液各洗滌芯片一次，再用水簡單淋洗，300rpm離心芯片，除去芯片上殘留液體。用基因芯片掃描儀(ScanArrayLite，PackardBioScience BioChip Technologies)上獲取熒光圖像，掃描參數(shù)為Cy3通道、90％激光強(qiáng)度，80％PMT增益、5μm分辨率.。熒光偽彩圖像的信號(hào)強(qiáng)度用微陣列分析軟件(QuantArraymicroarray analysis software，Packard BioScience BioChip Technologies)進(jìn)行分析。
權(quán)利要求
1.核酸外切酶保護(hù)DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結(jié)合蛋白，提出了一種檢測DNA結(jié)合蛋白的新方法，其特征在于運(yùn)用該方法檢測DNA結(jié)合蛋白包括如下步驟a)制備蛋白質(zhì)結(jié)合DNA探針(簡稱PB-Probe)、PCR引物和Tag-DNA微陣列芯片；b)PB-Probe與DNA結(jié)合蛋白結(jié)合；c)核酸外切酶酶切；d)PCR擴(kuò)增及標(biāo)記；e)PCR產(chǎn)物與Tag-DNA微陣列芯片雜交檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸外切酶保護(hù)DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結(jié)合蛋白，其特征在于步驟(a)準(zhǔn)備的PB-Probe，每種PB-Probe都是由核苷酸序列組件“旁側(cè)序列→DNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)→PCR引物結(jié)合位點(diǎn)→標(biāo)簽序列→PCR引物結(jié)合位點(diǎn)→DNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)→旁側(cè)序列”構(gòu)成的線性雙鏈DNA分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的PB-Probe的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)，其特征在于一種PB-Probe只含有一種DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，不同PB-Probe含有不同DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)；在所有PB-Probe的DNA序列中，一種PB-Probe的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)只出現(xiàn)在該種PB-Probe的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)位置上，其他PB-Probe DNA序列中不存在該種PB-Probe的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的PB-Probe的PCR引物結(jié)合位點(diǎn)，其特征在于一種PB-Probe可含有兩個(gè)序列不同或相同的PCR引物結(jié)合位點(diǎn)，不同PB-Probe也可含有序列不同或相同的PCR引物結(jié)合位點(diǎn)；在所有PB-Probe的DNA序列中，PCR引物結(jié)合位點(diǎn)只出現(xiàn)在PB-Probe的PCR引物結(jié)合位點(diǎn)位置上，其他PB-Probe DNA序列中不存在PCR引物結(jié)合位點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的PB-Probe的標(biāo)簽序列，其特征在于不同PB-Probe含有不同序列的標(biāo)簽序列；在所有PB-Probe的DNA序列中，一種PB-Probe的標(biāo)簽序列只出現(xiàn)在該種PB-Probe的標(biāo)簽序列位置上，其他PB-Probe DNA序列中不存在該種PB-Probe的標(biāo)簽序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的PB-Probe的旁側(cè)序列，其特征在于一種PB-Probe可含有兩個(gè)序列不同或相同的旁側(cè)序列，不同PB-Probe也可含有序列不同或相同的旁側(cè)序列；在所有PB-Probe的旁側(cè)序列中，不存在所有PB-Probe的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)、PCR引物結(jié)合位點(diǎn)和標(biāo)簽序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸外切酶保護(hù)DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結(jié)合蛋白，其特征在于步驟(a)準(zhǔn)備的PCR引物，可與PB-Probe的PCR引物結(jié)合位點(diǎn)特異性退火結(jié)合；依據(jù)PB-Probe上PCR引物結(jié)合位點(diǎn)的序列設(shè)計(jì)，不同PB-Probe可以使用不同的PCR引物，也可以使用相同的PCR引物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸外切酶保護(hù)DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結(jié)合蛋白，其特征在于步驟(a)中準(zhǔn)備的Tag-DNA微陣列芯片，固定著大量單鏈芯片DNA探針(簡稱CD-Probe)，各CD-Probe的核苷酸序列各不相同，一種CD-Probe只與一種PB-Probe的標(biāo)簽序列特異性雜交退火，不同的CD-Probe可與不同的PB-Probe標(biāo)簽序列特異性雜交退火；Tag-DNA微陣列芯片上有檢測所有PB-Probe的CD-Probe。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸外切酶保護(hù)DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結(jié)合蛋白，其特征在于步驟(b)中PB-Probe與DNA結(jié)合蛋白結(jié)合，其中PB-Probe為多種PB-Probe的等量混合物，以便在一次檢測中同步獲得多種DNA結(jié)合蛋白的信息。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸外切酶保護(hù)DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結(jié)合蛋白，其特征在于步驟(b)中PB-Probe與DNA結(jié)合蛋白結(jié)合，其中DNA結(jié)合蛋白為各種來源的DNA結(jié)合蛋白，包括人工表達(dá)制備的DNA結(jié)合蛋白、從細(xì)胞或組織裂解物中分離純化的DNA結(jié)合蛋白和含有DNA結(jié)合蛋白的細(xì)胞或組織抽提物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸外切酶保護(hù)DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結(jié)合蛋白，其特征在于步驟(b)中PB-Probe與DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合，是DNA結(jié)合蛋白與PB-Probe間發(fā)生序列特異性識(shí)別并結(jié)合的過程。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸外切酶保護(hù)DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結(jié)合蛋白，其特征在于步驟(c)中的核酸外切酶酶切是指將核酸外切酶加入步驟(b)反應(yīng)產(chǎn)物中，使核酸外切酶從PB-Probe的兩端發(fā)生外切消化反應(yīng)的過程。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸外切酶保護(hù)DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結(jié)合蛋白，其特征在于步驟(c)中的核酸外切酶，為具有核酸外切活性的核酸酶，這些酶能從雙鏈DNA的3′或5′發(fā)生外切反應(yīng)，逐個(gè)釋放單核苷酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸外切酶保護(hù)DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結(jié)合蛋白，其特征在于步驟(d)PCR擴(kuò)增及標(biāo)記，是指以步驟(c)DNA產(chǎn)物為模板，以步驟(a)制備的PCR引物為引物進(jìn)行的PCR擴(kuò)增反應(yīng)；在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中，可加入標(biāo)記物修飾的單核苷酸，或標(biāo)記物修飾的PCR引物，使PCR擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物帶上標(biāo)記。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸外切酶保護(hù)DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結(jié)合蛋白，其特征在于步驟(e)PCR產(chǎn)物與Tag-DNA微陣列芯片雜交檢測，是將PCR產(chǎn)物與雜交液混合，再與Tag-DNA微陣列芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)，使PCR產(chǎn)物與CD-Probe發(fā)生序列特異性退火的過程。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸外切酶保護(hù)DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結(jié)合蛋白，其特征在于步驟(e)PCR產(chǎn)物與Tag-DNA微陣列芯片雜交檢測，在PCR產(chǎn)物與Tag-DNA微陣列芯片雜交后，要依據(jù)PCR產(chǎn)物標(biāo)記的化學(xué)性質(zhì)，進(jìn)行信號(hào)獲取的過程。
全文摘要
核酸外切酶保護(hù)DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結(jié)合蛋白，提出了一種檢測DNA結(jié)合蛋白的新方法，其特征在于運(yùn)用該方法檢測DNA結(jié)合蛋白包括如下步驟(a)制備蛋白質(zhì)結(jié)合DNA探針、PCR引物和Tag－DNA微陣列芯片；(b)蛋白質(zhì)結(jié)合DNA探針與DNA結(jié)合蛋白結(jié)合；(c)核酸外切酶酶切；(d)PCR擴(kuò)增及標(biāo)記；PCR產(chǎn)物與Tag－DNA微陣列芯片雜交檢測。本發(fā)明提出的“核酸外切酶保護(hù)DNA探針雜交DNA微陣列芯片檢測DNA結(jié)合蛋白”檢測DNA結(jié)合蛋白的特點(diǎn)是，不需對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行任何化學(xué)修飾及標(biāo)記，可同步對(duì)多種DNA結(jié)合蛋白進(jìn)行高通量檢測，檢測靈敏度高。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1746318SQ200410041930
公開日2006年3月15日 申請日期2004年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月10日
發(fā)明者王進(jìn)科 申請人:王進(jìn)科, 南京新益華集團(tuán)有限公司