專利名稱：外切酶－納米孔的單分子核酸測序方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的測定方法，特別是一種外切酶—納米孔的單分子核酸測序方法。
背景技術(shù)：
隨著后基因組世代的到來，對(duì)DNA和RNA等生物大分子序列測定的需求量大量增加，但目前的測序方法速度慢、費(fèi)用高、有缺口，嚴(yán)重妨礙了相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，如基因組測序，2006年6月NCBI公布的結(jié)果，已完成真核生物基因組測序的21個(gè)，完成組裝的100個(gè)，正在進(jìn)行的164個(gè)。實(shí)際上，這僅僅是拉開了大量基因組測序的序幕，因?yàn)閷?duì)基因組測序的需要是多方面的。但是，用目前的方法滿足上述多種測序的需求，還很不現(xiàn)實(shí)，主要是當(dāng)前的方法存在許多缺陷，可簡單地歸結(jié)為速度慢、費(fèi)用高和有大量缺口。所以，要實(shí)現(xiàn)上述各種“夢(mèng)想”，必須研發(fā)新的測序技術(shù)以替代當(dāng)前的測序方法。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Astier，Y.et al.，(2006)Toward singlemolecule DNA sequencingDirect identification of ribonucleoside anddeoxyribonucleoside 5’-monophosphates by using an engineered proteinnanopore equipped with a molecular adapter.Journal of the AmericanChemical Society 1281705-1710。在《美國化學(xué)協(xié)會(huì)雜志》以“朝向單分子DNA測序用適配分子工程化蛋白納米孔直接鑒別核苷和脫氧核苷5’一磷酸鹽”為題，報(bào)道了其研究結(jié)果。認(rèn)為，通過檢測外切酶降解而釋放的核苷5’一磷酸有可能對(duì)核酸單分子測序，用工程化的α-蛋白孔識(shí)別核苷和脫氧核苷5’一磷酸鹽，準(zhǔn)確率為93-98％。因采用的是蛋白質(zhì)納米孔，不能耐受較高的電壓、易老化，錯(cuò)誤率太高，還不能用于測序。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種外切酶—納米孔的單分子核酸測序方法。使其測定核酸(包括DNA和RNA)序列，測定速度快、測定質(zhì)量高、測定費(fèi)用低、基本不留缺口，可滿足以DNA序列為基礎(chǔ)的動(dòng)植物及微生物的遺傳改良、有害微生物的控制和各種生物基因組的大規(guī)模核酸測序的各種需求。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括如下步驟①單核苷酸的電信號(hào)檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；所述的單核苷酸的電信號(hào)檢測，是將電泳槽加入電泳液，在電泳槽中間，用帶有單個(gè)納米孔(直徑1-2nm，孔深在1-20μm)薄膜的傳感器將兩級(jí)隔開，分別檢測磷酸基團(tuán)位置固定3’或者5’脫氧腺苷—磷酸dAMP、脫氧鳥苷一磷酸dGMP、脫氧胞苷一磷酸dCMP和脫氧胸苷一磷酸dTMP，4種脫氧核苷一磷酸(dNMPs)、dmetCMP(甲基化脫氧胞苷一磷酸)或腺苷一磷酸rAMP、鳥苷一磷酸rGMP、胞苷一磷酸rCMP和尿苷一磷酸rUMP，4種核苷一磷酸(rNMPs)在穿越納米孔時(shí)留下的電信號(hào)，由于不同的核苷酸dNMPs或rNMPs(簡稱nt)的分子量和三維結(jié)構(gòu)的差異，當(dāng)穿越筒型納米孔時(shí)，它們穿越納米孔的時(shí)間(實(shí)驗(yàn)條件控制在約1000個(gè)穿越事件/秒)以及對(duì)離子流的阻力也各異，因此用膜片鉗檢測電信號(hào)時(shí)，將電信號(hào)轉(zhuǎn)換為各自的“筆跡”，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
②膜片鉗檢測電信號(hào)；所述的膜片鉗檢測電信號(hào)，在負(fù)極，將1條雙鏈DNA或單鏈DNA或RNA(以下統(tǒng)稱靶核酸)的3’或5’端固定，用每次只降解1個(gè)核苷酸、核苷酸降解物上磷酸基團(tuán)位置固定、每秒降解約1000個(gè)核苷酸、延續(xù)性長的雙鏈DNA或單鏈DNA或RNA外切酶(以下統(tǒng)稱外切酶)降解靶核酸，在外加電場作用下，降解產(chǎn)物按它們?cè)谠泻怂嶂械南鄬?duì)位置，有序地自負(fù)極向正極移動(dòng)過程中穿越納米孔，膜片鉗檢測電信號(hào)。
③根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將電信號(hào)轉(zhuǎn)換為具體的核苷酸，并根據(jù)外切酶的切割方向，獲得靶核酸的堿基序列。
所述的根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將電信號(hào)轉(zhuǎn)換為具體的核苷酸，是指將一個(gè)核酸分子固定于電泳槽負(fù)極，用外切酶從自由端逐個(gè)降解并釋放核苷酸，在外加電場作用下，核苷酸有序地自負(fù)極向正極移動(dòng)時(shí)穿越納米孔，膜片鉗記載各核苷酸的筆跡，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將電信號(hào)轉(zhuǎn)換為堿基，再根據(jù)外切酶的切割方向，實(shí)現(xiàn)核酸的單分子測序。
所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用一根單壁碳納米管包埋于聚合物中的薄膜直徑和孔深作為二維可控的單孔傳感器，在外加電場作用下，膜片鉗檢測各種核苷和脫氧核苷5’(或3’)一磷酸自負(fù)極向正極移動(dòng)過程中穿越納米孔時(shí)產(chǎn)生的電信號(hào)(穿孔時(shí)間和產(chǎn)生的電阻)，將各種堿基的筆跡分開，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
上述的每一個(gè)納米孔作為一個(gè)測序單元，將該單元組裝成陣列(如10×100或100×100)，構(gòu)成高通量測序儀。
如果核酸為dsDNA(雙鏈DNA)，測序后還可用ssDNA(單鏈DNA)外切酶對(duì)其互補(bǔ)鏈測序，進(jìn)一步提高測序的準(zhǔn)確性，此外，還可通過對(duì)甲基化脫氧胞苷(dmetC)一磷酸筆跡的識(shí)別，為高等生物來源于不同組織器官細(xì)胞的DNA甲基化模式研究提供新的診斷工具。
本發(fā)明采用的是直徑和孔深均可控制的單壁碳納米管(SWCNT)包埋于多聚物的筒型單納米孔，硬度高、表面光潔、無靜電，可耐受較高的電壓、更經(jīng)久耐用、信噪比更高，所以，對(duì)核苷和脫氧核苷一磷酸的識(shí)別準(zhǔn)確性更高，本發(fā)明不僅可檢測核苷和脫氧核苷5’一磷酸，還可以檢測3’一磷酸，而且還可檢測天然真核生物DNA中的甲基化胞苷。


圖1.本發(fā)明測序示意圖具體實(shí)施方式
實(shí)施例1DNA片段測序①dNMPs筆跡的檢測將兩級(jí)與膜片鉗連接的電泳槽中加入電泳液，用直徑和孔深可控的納米元件從中間將電泳槽隔開，每次只加入一種超稀釋的核苷酸，打開電源記載單個(gè)核苷酸穿越納米孔時(shí)的電信號(hào)；如此對(duì)各類核苷酸的穿孔電信號(hào)進(jìn)行檢測，最后確定各自特異的筆跡，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并編寫軟件。
②計(jì)算核苷酸的泳動(dòng)速度，求出堿基序列的外切酶最遠(yuǎn)作用點(diǎn)；當(dāng)每次上述檢測結(jié)束時(shí)，將正負(fù)電極相互轉(zhuǎn)換，使聚集在原正極的核苷酸向新的正極泳動(dòng)，計(jì)算電極轉(zhuǎn)換至核苷酸到達(dá)納米孔的時(shí)間，獲得特定條件下它們?cè)陔娪疽褐械挠緞?dòng)速度，求出在確保外切酶產(chǎn)物達(dá)到納米孔時(shí)仍保留原靶核酸的堿基序列的外切酶最遠(yuǎn)作用點(diǎn)。
③單分子操作采用磁珠捕獲法；1.將單細(xì)胞破壁后提取DNA，再經(jīng)超聲波破碎為大片段DNA備用；將抗生物素包衣的磁珠按Margulies等(Genome sequencing in microfabricatedhigh-density picolitre reactors.2005，Nature 437376-380.刊物名稱自然；題目“在微型制作的高密度皮升反應(yīng)器中的基因組測序”)的方法與長度、序列已知和末端用生物素標(biāo)記的DNA片段按1∶1連接，即每個(gè)磁珠只連接1個(gè)片段；連接在磁珠上的DNA片段與靶核酸片段用連接酶連接，顯微獲取單個(gè)磁珠。
④單分子DNA片段的固定將帶有1個(gè)靶核酸分子的磁珠固定到安裝在一個(gè)測序單元電泳槽負(fù)極端的磁鐵上，磁鐵與納米孔的距離不超過步驟②中所稱的外切酶最遠(yuǎn)作用點(diǎn)，將一條靶核酸一端固定，最后使整個(gè)陣列的每一個(gè)測序單元都有一條靶核酸。
⑤序列檢測在電泳槽負(fù)極添加外切酶，待單個(gè)酶分子與DNA結(jié)合后，添加鎂離子，立即打開電源，收集電信號(hào)，并用軟件讀取DNA序列，完成序列組裝。
⑥互補(bǔ)鏈序列的檢測待dsDNA外切酶降解結(jié)束后，再用ssDNA外切酶降解剩下的ddDNA互補(bǔ)鏈，如果降解dsDNA的外切酶為5’→3’，則需選用3’→5’ddDNA外切酶，反之亦然。此次檢測互補(bǔ)鏈，除可與上一步測序結(jié)果相互印證外，在不能直接檢測dmetCMP筆跡是，還可通過此步驟檢測DNA中胞苷的甲基化狀態(tài)。
效果在目前儀器的分辨能力下(1個(gè)事件/毫秒)，適于本發(fā)明的外切酶活性以500-1000nts/秒為宜，即每個(gè)測序單元每秒檢測500-1000個(gè)堿基序列，每小時(shí)最快檢測360kb(千堿基對(duì))。
高通量核酸測序儀的測序速度＝陣列中的測序單元數(shù)×測序單元測序速度，如果是100×100陣列，則測序儀的測序最高速度為3600mb(百萬堿基對(duì))，也即人類的8C(單倍體細(xì)胞基因組大小)基因組可在7小時(shí)以內(nèi)完成測序，費(fèi)用在1萬元以內(nèi)，測序準(zhǔn)確性在99％以上，還能檢測高等生物不同組織器官來源細(xì)胞的甲基化狀態(tài)。
實(shí)施例2完整染色體測序①單分子操作本例中的核苷酸筆跡檢測、外切酶最遠(yuǎn)作用點(diǎn)同實(shí)施例1。
用顯微鏡、流式細(xì)胞儀或其他方法輔助，提取單條染色體，按實(shí)施例1的方法將染色體固定在磁珠上。
②染色體固定將帶有1條完整染色體的磁珠固定到安裝在一個(gè)測序單元電泳槽負(fù)極端的磁鐵上，磁鐵與納米孔的距離不超過外切酶最遠(yuǎn)作用點(diǎn)，最后使整個(gè)陣列的每一個(gè)測序單元都有一條染色體。
③序列檢測在電泳槽負(fù)極添加核酸外切酶，待單個(gè)酶分子與DNA結(jié)合后，添加鎂離子，立即打開電源，收集電信號(hào)，并用軟件讀取DNA序列。
④互補(bǔ)鏈序列的檢測同實(shí)施例1。
效果以整條染色體為底物進(jìn)行測序，雖然陣列的作用得不到像實(shí)施例1那樣的充分發(fā)揮如人類體細(xì)胞有46條染色體，因此只有46個(gè)測序單元的陣列就可滿足測序，人類最長的第一染色體約245,203,898bp(堿基對(duì))，在外切酶活性為1000nts/秒，約需680小時(shí)，雖然速度會(huì)下降，但最后的序列無需拼接和組裝，可解決當(dāng)前測序方法中存在的缺口問題。
實(shí)施例3RNA測序①rNMPs筆跡的檢測同實(shí)施例1，根據(jù)它們產(chǎn)生的特異電信號(hào)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
②按照實(shí)施例1的方法將RNA單分子固定到電泳槽負(fù)極，用RNA外切酶逐個(gè)降解核苷酸，膜片鉗記載筆跡，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將電信號(hào)轉(zhuǎn)換為序列信息。
③亦可以RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA(互補(bǔ)DNA)，再按實(shí)施例1的步驟獲得RNA的序列。
實(shí)施效果適于本發(fā)明的RNA/DNA外切酶活性在1000nts/秒為宜，如檢測mRNA序列，按mRNA平均長度1000nts計(jì)，100×100的陣列，即每秒可完成10000個(gè)mRNA或cDNA序列的測定。
權(quán)利要求
1.一種外切酶-納米孔的單分子核酸測序方法，其特征在于，包括如下步驟①單核苷和脫氧核苷一磷酸以及dmetCMP的電信號(hào)檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；②DNA/RNA的酶切，單個(gè)核苷和脫氧核苷一磷酸穿越納米孔，膜片鉗記載電信號(hào)；③根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將電信號(hào)轉(zhuǎn)換為具體的核苷酸，結(jié)合外切酶的切割方向，獲得靶核酸的堿基序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外切酶-納米孔的單分子核酸測序方法，其特征是，所述的單核苷酸的電信號(hào)檢測，電泳槽加入電泳液，在電泳槽中間，用帶有單個(gè)納米孔薄膜的傳感器將兩級(jí)隔開，分別檢測磷酸基團(tuán)位置固定3’或者5’脫氧腺苷一磷酸dAMP、脫氧鳥苷一磷酸dGMP、脫氧胞苷一磷酸dCMP和脫氧胸苷一磷酸dTMP4種脫氧核苷一磷酸(dNMPs)、dmetCMP(甲基化脫氧胞苷一磷酸)或腺苷一磷酸rAMP、鳥苷一磷酸rGMP、胞苷一磷酸rCMP和尿苷一磷酸rUMP等4種核苷一磷酸(rNMPs)在穿越納米孔時(shí)留下的電信號(hào)，由于不同的核苷酸dNMPs或rNMPs的分子量和三維結(jié)構(gòu)的差異，當(dāng)穿越筒型納米孔時(shí)，將給出不同的電信號(hào)，用膜片鉗記載電信號(hào)，將電信號(hào)轉(zhuǎn)換為各自的“筆跡”，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的外切酶-納米孔的單分子核酸測序的方法，其特征是，所述的單個(gè)納米孔，其直徑1-2nm，孔深在1-20μm。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的外切酶-納米孔的單分子核酸測序方法，其特征是，所述的穿越筒型納米孔，穿越時(shí)間的實(shí)驗(yàn)條件控制在平均穿越1000nts/秒，符合當(dāng)前膜片鉗的分辨率。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外切酶-納米孔的單分子核酸測序的方法，其特征是，所述的膜片鉗檢測電信號(hào)，在負(fù)極，將靶核酸1條雙鏈DNA或單鏈DNA或RNA的3’或5’端固定，用每次只降解1個(gè)核苷酸、核苷酸降解物上磷酸基團(tuán)位置固定、每秒降解約500-1000個(gè)核苷酸、延續(xù)性長的雙鏈DNA或單鏈DNA或RNA外切酶降解靶核酸，在外加電場作用下，降解產(chǎn)物按它們?cè)谠泻怂嶂械南鄬?duì)位置，有序地自負(fù)極向正極移動(dòng)過程中穿越納米孔時(shí)，膜片鉗檢測電信號(hào)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的外切酶-納米孔的單分子核酸測序方法，其特征是，所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用一根單壁碳納米管包埋于聚合物中的薄膜直徑和孔深作為二維可控的單孔傳感器，在外加電場作用下，膜片鉗檢測各種核苷酸和脫氧核苷酸5’(或3’)一磷酸自負(fù)極向正極移動(dòng)過程中穿越納米孔時(shí)產(chǎn)生穿孔時(shí)間和產(chǎn)生的電阻的電信號(hào)，將各種堿基的筆跡分開，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的外切酶-納米孔的單分子核酸測序的方法，其特征是，所述的根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將電信號(hào)轉(zhuǎn)換為具體的核苷酸，是指將一個(gè)核酸分子固定于電泳槽負(fù)極，用核酸外切酶從自由端逐個(gè)降解并釋放核苷酸，在外加電場作用下，核苷酸有序地自負(fù)極向正極移動(dòng)時(shí)穿越納米孔，膜片鉗記載各核苷酸的筆跡，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將電信號(hào)轉(zhuǎn)換為堿基序列，實(shí)現(xiàn)核酸的單分子測序。
8.根據(jù)權(quán)利要求2或者3或者4所述的外切酶-納米孔的單分子核酸測序的方法，其特征是，所述的納米孔，每一個(gè)納米孔作為一個(gè)測序單元，將該單元組裝成陣列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或者2或者5所述的外切酶-納米孔的單分子核酸測序的方法，其特征是，如果核酸為dsDNA，測序后還可用ssDNA外切酶對(duì)其互補(bǔ)鏈測序。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的外切酶－納米孔的單分子核酸測序的方法。包括如下步驟①單分子核苷酸的電信號(hào)檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；②將核酸固定在電泳槽負(fù)極，外切酶逐個(gè)降解核苷酸，穿越納米孔時(shí)，膜片鉗檢測電信號(hào)；③根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將電信號(hào)轉(zhuǎn)換為具體的核苷酸，根據(jù)外切酶的切割方向，獲得靶核酸的堿基序列。本發(fā)明采用的是直徑和孔深均可控制的單壁碳納米管包埋于多聚物的筒型單納米孔，硬度高、表面光潔、無靜電，可耐受較高的電壓、更經(jīng)久耐用、信噪比更高，所以，對(duì)核苷和脫氧核苷一磷酸的識(shí)別準(zhǔn)確性更高，本發(fā)明不僅可檢測核苷和脫氧核苷5’一磷酸，還可檢測核苷和脫氧核苷3’一磷酸，而且還可檢測天然真核生物DNA中的甲基化胞苷。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1932039SQ20061011629
公開日2007年3月21日 申請(qǐng)日期2006年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月21日
發(fā)明者王志民 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)