專利名稱：一種蚯蚓纖溶酶基因和基因工程菌株及其構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種正蚓科粉正蚓屬蚯蚓纖溶酶基因的核苷酸序列，同時還涉及該基因的制備方法，本發(fā)明還涉及一種表達該基因的畢赤酵母基因工程菌株的構(gòu)建以及基因工程纖溶酶在藥物研究開發(fā)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
急性心肌梗死、腦梗死、肺栓塞、外周動脈血栓和深部靜脈血栓等心腦血管疾病是危害人類生命和健康的主要疾病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全世界每年大約有1200萬人死于心臟病和腦卒中。在我國，隨著經(jīng)濟的高速發(fā)展，人民群眾物質(zhì)生活水平的提高，心腦血管疾病的發(fā)病率及其病死率亦正逐年提高。因此，研制和發(fā)展高效、特異、安全、不良反應(yīng)小的溶血栓藥物，一直是近年來世界范圍的熱門課題。
蚯蚓，俗稱地龍，在我國已有數(shù)千年的應(yīng)用歷史，可清熱、平肝、止喘、通絡(luò)，主治高熱狂躁、驚風(fēng)抽搐等病癥。1983年日本H.Mihara首次發(fā)現(xiàn)正蚓科(Lumbrici dae)蚯蚓水提物有直接溶解纖維蛋白及纖溶酶原激活作用，其活性成分稱為纖溶酶(earthworm fibrinolytic enzyme，EFE)，又稱蚓激酶。纖溶酶溶栓的藥理機制主要有1)與纖維蛋白具有特殊親和力，不僅水解富含纖溶酶原的纖維蛋白，還可以水解不含纖溶酶原的纖維蛋白，使纖維蛋白迅速降解，還可以水解纖維蛋白原。2)類似tPA，激活纖溶酶原而發(fā)揮間接作用，體外實驗表明纖溶酶對牛血管內(nèi)皮細胞tPA的釋放有刺激作用。3)水解凝血因子I，抑制了血小板在其表面的粘附。
研究結(jié)果表明蚯蚓體內(nèi)的纖溶酶具有多種組分，僅在粉正蚓(Lumbricus rubellus)中已經(jīng)分離到至少6種不同的組分?，F(xiàn)今國外已經(jīng)從蚯蚓中分離了6個編碼纖溶酶基因的cDNA序列。國內(nèi)也已從赤子愛勝蚓、雙胸蚓等蚯蚓中克隆到了蚯蚓纖溶酶基因，但未見有從粉正蚓中分離纖溶酶基因并進行克隆表達的報道。
目前已有多種蚯蚓纖溶酶制劑應(yīng)用于臨床，主要為各種膠囊制劑，都是從蚯蚓腸腔和體液中提取的，如普恩復(fù)、百奧、博洛克，溶栓膠囊等，多用在心腦血管疾病方面。此外由于纖溶酶可改善血液流變學(xué)，降低血小板聚集率，所以可以用在與血液流變學(xué)相關(guān)的一些疾病中，如美尼爾病、突發(fā)性耳聾、肺心病等。
傳統(tǒng)的蚯蚓纖溶酶膠囊制劑應(yīng)用于臨床有一定的療效，但也存在明顯的缺陷，首先是成分復(fù)雜，不能靜脈注射，而口服給藥作用緩慢，因而不能應(yīng)用于治療急性心、腦血管栓塞疾?。黄浯文z囊制作工藝復(fù)雜，生產(chǎn)受蚯蚓養(yǎng)殖季節(jié)、周期的限制，產(chǎn)品產(chǎn)量、質(zhì)量不穩(wěn)定；從蟲體中分離純化纖溶酶工藝煩瑣，產(chǎn)品中可能含有各種小分子多肽或其它化學(xué)物質(zhì)，可能引起機體的過敏反應(yīng)。而運用基因工程的方法則可以通過簡單的發(fā)酵大量獲得纖溶酶，分離純化工藝簡單，產(chǎn)品純度高，成本底。因此，基因工程纖溶酶在醫(yī)療、衛(wèi)生、保健類藥物的研發(fā)領(lǐng)域中具有廣泛的用途，可用于制備用于治療栓塞性心血管疾病的注射水劑、口服藥劑等，還可用于生產(chǎn)具有預(yù)防血栓疾病、有益心血管健康的保健品。
在基因工程藥物開發(fā)方面，目前應(yīng)用最廣泛、技術(shù)比較成熟的表達系統(tǒng)有大腸桿菌系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)和CHO細胞表達系統(tǒng)。
大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛、最成熟的表達系統(tǒng)，適合于表達非糖基化蛋白質(zhì)及二級結(jié)構(gòu)較簡單的蛋白質(zhì)，表達產(chǎn)物一般是在細胞質(zhì)內(nèi)形成包涵體，產(chǎn)物需要經(jīng)過復(fù)性才具有活性，也有的載體可分泌目的蛋白于細胞間質(zhì)，或在細胞質(zhì)內(nèi)可溶性表達。其最大的缺點是不能進行表達后的加工和修飾(比如糖基化)，而這種加工過程是很多蛋白質(zhì)獲得功能所必需的。
CHO細胞表達系統(tǒng)這是目前構(gòu)建及表達難度相對較大的表達系統(tǒng)，適合表達糖基化蛋白和空間結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的蛋白質(zhì)，表達產(chǎn)物一般存在于細胞質(zhì)中，如果在基因構(gòu)建時在目的蛋白前加一段信號肽，表達產(chǎn)物會分泌到胞外，通過細胞翻譯后包裝成為有活性的蛋白，但表達量低、成本高、純化困難使其難以在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種正蚓科粉正蚓屬蚯蚓纖溶酶基因，該基因編碼的蛋白質(zhì)具有溶栓作用。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種制備正蚓科粉正蚓屬蚯蚓纖溶酶基因的方法，該方法簡單，操作方便易行。
本發(fā)明進一步目的在于提供一種基因工程菌株，該菌株能表達蚯蚓纖溶酶。同時還涉及該菌株的制備方法，用于制備基因工程纖溶酶蛋白。
本發(fā)明的目的進一步提供一種制備基因工程畢赤酵母菌株的方法，該基因工程菌株可以用來表達蚯蚓纖溶酶基因，獲得基因工程纖溶酶蛋白。
本發(fā)明還涉及基因工程纖溶酶蛋白在治療心血管疾病藥物中的應(yīng)用，該類藥物具有溶栓作用和對腦缺血的保護作用。
本發(fā)明的技術(shù)要點之一為正蚓科粉正蚓屬蚯蚓纖溶酶基因的核苷酸序列及其制備方法，在本發(fā)明的一個實施例中提供了一種正蚓科粉正蚓屬蚯蚓纖溶酶基因的核苷酸序列及其制備方法，該方法是以正蚓科粉正蚓屬蚯蚓總RNA為模板，用特異性寡核苷酸引物，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR方法得到纖溶酶基因cDNA。粉正蚓購于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，基因測序結(jié)果表明cDNA由747核苷酸組成，5′端至3′端序列為正蚓科粉正蚓屬蚯蚓纖溶酶基因的核苷酸序列 (SEQ ID NO1)acatggaacttcctcccggaacaaaaattgtcggaggaattgaagctagaccatacgagttcccatggcaggtgtccgtccgaaggaaatcttccgattcccatttctgcggaggtagcatcatcaacgatcgttgggttgtctgcgctgctcactgcatgcagggagaggcccccgctctggtttcattggtcgtgggtgagcacgacaggagtgcagcgagtacagtacgtcagactcatgacgttgatagcatcttcgttcacgaggactacaacacaaataccctagagaacgacgtttctgtcatcaagacatctgttgccatcactttcgacatcaacgttggtccaatctgcgccccagatccggctaacgactacgtctaccgtaagagccagtgttccggatggggaactatcaattcaggtggaatctgctgtcccaacgttctgcgatacgtgacgctgaatgacacaaccaaccaatactgcgaagatgtatacccactaaattcaatctacgacgatatgatttgcgcgtcggacaacactgggggtaacgacagagactcctgccagggtgactccggcggccctctgagcgtcaaggatggtagtggaatcttcagcctgattggtattgtgtcttggggaattggttgcgcttctggctatccaggagtctactcccgcgtcggattccatgctgcatggatcaccgacatcatcaccaacaactaaaccg其中3-740位核苷酸是基因編碼的成熟肽序列，即纖溶酶蛋白序列，741-743位是終止密碼子TAA。該基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列為正蚓科粉正蚓屬蚯蚓纖溶酶的氨基酸序列 (SEQ ID NO2)MELPPGTKIVGGIEARPYEFPWQVSVRRKSSDSHFCGGSIINDRWVVCAAHCMQGEAPALVSLVVGEHDRSAASTVRQTHDVDSIFVHEDYNTNTLENDVSVIKTSVAITFDINVGPICAPDPANDYVYRKSQCSGWGTINSGGICCPNVLRYVTLNDTTNQYCEDVYPLNSIYDDMICASDNTGGNDRDSCQGDSGGPLSVKDGSGIFSLIGIVSWGIGCASGYPGVYSRVGFHAAWITDIITNN本發(fā)明涉及的纖溶酶蛋白分子量為26.4kD，等電點為4.5，富含甘氨酸、絲氨酸、纈氨酸和天冬氨酸。其生物化學(xué)特性還有①熱穩(wěn)定性纖溶酶60℃加熱30分鐘后，酶活性沒有明顯降低，65℃以上，酶活性開始下降，85℃加熱30分鐘酶活性完全喪失；②酸穩(wěn)定性纖溶酶在pH1～11間酶活性沒有明顯變化，pH低于1或高于11時，酶活性明顯下降，最佳纖溶反應(yīng)的pH值范圍較寬，在7～10之間。
本發(fā)明涉及的纖溶酶基因還可以通過以下方法獲得(1)亞克隆以本發(fā)明所涉及的基因片段為模板，或者以含有本發(fā)明所涉及的基因片段的重組質(zhì)粒為模板，或者以含有本發(fā)明所涉及的基因片段的基因工程菌株DNA為模板，通過常規(guī)分子生物學(xué)操作方法(如PCR)，亞克隆得到相應(yīng)基因片段，這些片段可以包括全部的或者部分的本發(fā)明所涉及基因序列，這些片段可在細菌、酵母、動植物細胞或其它真核、原核生物中表達，得到蛋白質(zhì)或多肽片段，這些蛋白質(zhì)或多肽片段與本發(fā)明所涉及的蛋白質(zhì)有相同的生物學(xué)功能；(2)人工合成根據(jù)本發(fā)明所涉及的氨基酸或者核苷酸序列，可以通過化學(xué)合成的方法合成DNA片段，這些片段可以包括全部的或者部分的本發(fā)明所涉及基因序列，可以克隆到相應(yīng)的載體中進行表達，表達的蛋白質(zhì)或多肽與本發(fā)明所涉及的蛋白質(zhì)有相同的生物學(xué)功能。
本發(fā)明所涉及的基因片段可以進行修飾，比如突變基因的某些核苷酸序列，但并不影響其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列；可以增加、缺失本發(fā)明所涉及的氨基酸或者核苷酸序列，這些修飾不會影響蛋白質(zhì)的生物化學(xué)特性、高級結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，比如可以在蛋白質(zhì)或多肽N-端或C-端加上分泌信號肽，還可以加上適當?shù)慕宇^(如6個組氨酸)便于蛋白質(zhì)提取、純化。
本發(fā)明所涉及的基因與載體連接后可以克隆到相應(yīng)的宿主中，以便于基因的保存、擴增和表達。應(yīng)用于本發(fā)明的克隆載體包括但不僅限于下列載體pBR322、pBR325、pACYC177、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKC101、SV 40、pBluescript II SK+/-、pQE、pGEM-T、pET系列載體。載體特征及克隆方法可參見冷泉港實驗室編寫的《分子克隆實驗手冊》。應(yīng)用于本發(fā)明的宿主——載體系統(tǒng)包括但不僅限于下列系統(tǒng)細菌——噬菌體系統(tǒng)，細菌——質(zhì)粒載體系統(tǒng)，酵母——酵母載體系統(tǒng)，哺乳動物——病毒系統(tǒng)(牛痘病毒、腺病毒等)，昆蟲細胞——桿狀病毒系統(tǒng)。
在本發(fā)明的一個實施例中提供了一種正蚓科粉正蚓屬蚯蚓纖溶酶基因的制備及克隆到大腸桿菌(E.coli)的方法，該方法包括擴增引物合成，蚯蚓總RNA提取，mRNA的反轉(zhuǎn)錄，目的基因的PCR擴增、目的基因片段的回收、目的基因片段克隆入載體、蚯蚓纖溶酶cDNA序列測定。
(1)擴增引物合成根據(jù)GeneBank中已經(jīng)發(fā)表的蚯蚓纖溶酶cDNA序列設(shè)計PCR寡核苷酸擴增引物。上游引物(P1)長18個核苷酸ACATGGAACTTCCTCCCG，下游引物(P2)長19個核苷酸ATCACCAACAACTAAACCG，引物經(jīng)PACE純化。
(2)蚯蚓總RNA提取取3～5條蚯蚓成體，用DEPC處理過的滅菌水漂洗后，放在鋪有濕濾紙的平皿中饑餓過夜，使其盡可能的吐盡體內(nèi)的泥沙。再次用DEPC水清洗干凈后，在液氮中研磨成粉末狀，按照QIAGEN公司RNeasyR Mini Kit的產(chǎn)品說明書提取總RNA。將提取到的RNA溶液貯存于-80℃以備用。
(3)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈按照Promega公司的ReverseTranscription Reaction試劑盒說明書進行，以O(shè)ligo(dT)20為引物合成cDNA第一鏈。反應(yīng)條件為42℃1小時；95℃5分鐘；3℃5分鐘。
(4)目的基因的PCR擴增按照Reverse Transcription Reaction試劑盒中給出的PCR反應(yīng)體系參數(shù)進行PCR反應(yīng)。以cDNA第一條鏈為模板進行PCR擴增，其反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性4分鐘；94℃變性1分鐘，55℃退火1.5分鐘，72℃延伸2分鐘，20個循環(huán)；94℃變性1分鐘，55℃退火1.5分鐘，72℃延伸2分鐘，10個循環(huán)；72℃再延伸10分鐘。
(5)目的基因片段的回收按照上海華舜生物工程公司PCR產(chǎn)物回收試劑盒說明書回收目的基因片段。
(6)目的基因片段克隆入載體回收的PCR產(chǎn)物與T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞大腸桿菌(E.coli)JM109，挑取菌落快速提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，所得到的陽性克隆子是包含本發(fā)明涉及基因的大腸桿菌，用于基因的增殖和保藏。
(7)蚯蚓纖溶酶cDNA序列測定提取質(zhì)粒DNA雙脫氧法測定核苷酸序列，測序引物為M13啟動子引物。正蚓科粉正蚓屬蚯蚓纖溶酶基因核苷酸的序列測定結(jié)果蚯蚓纖溶酶cDNA序列長747個核苷酸，腺嘌呤核苷(A)、胞嘧啶核苷(C)、鳥嘌噙核苷(G)及胸腺嘧啶核苷(T)的含量分別為A-185、C-197、G-189；T-176?；虺墒祀男蛄袨榈?-740位核苷酸，編碼246個氨基酸，其余核苷序列為非編碼區(qū)。該蛋白質(zhì)cDNA成熟肽終止密碼子位于基因第741-743位，終止密碼為TAA。
本發(fā)明的技術(shù)要點之二是表達纖溶酶基因的畢赤酵母基因工程菌株的構(gòu)建及表達，該菌株可以表達纖溶酶基因，得到基因工程纖溶酶蛋白用于制備治療心血管疾病的藥物。
本發(fā)明所涉及的纖溶酶基因可以在包括但不僅限于下列載體-宿主系統(tǒng)中進行表達，獲得基因工程蛋白大腸桿菌系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、CHO細胞表達系統(tǒng)、桿狀病毒表達系統(tǒng)、絲狀真菌表達系統(tǒng)、芽孢桿菌表達系統(tǒng)。
畢赤(Pichia)酵母表達系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來的一種高效的真核表達系統(tǒng)，與其它表達系統(tǒng)相比，它具有以下優(yōu)點(1)表達量高，因為畢赤酵母生長速度快，而且表達載體使用的是強啟動子——乙醇氧化酶啟動子，外源蛋白表達量很高。(2)穩(wěn)定性好，由于該系統(tǒng)的表達載體在酵母中不是以自主復(fù)制的質(zhì)粒存在，而是通過同源重組穩(wěn)定的整合在酵母染色體上，所以構(gòu)建的工程菌株十分穩(wěn)定。(3)純化容易，操作簡便。表達產(chǎn)物一般分泌到胞外，可以直接從培養(yǎng)液中檢測目的蛋白，不需要復(fù)性，而且可以直接從上清中提取蛋白。(4)活性高。外源蛋白在畢赤酵母中分泌表達的最大好處就是能夠進行蛋白質(zhì)翻譯后加工，包括二硫鍵的成形成、蛋白質(zhì)折疊及糖基化等。與啤酒酵母等其他一些真核表達系統(tǒng)相比，畢赤酵母對外源蛋白糖基化更接近于哺乳動物的糖基化，因此畢赤酵母表達的糖蛋白被認為更適宜用于人體。(5)便于工業(yè)化生產(chǎn)。畢赤酵母有現(xiàn)成的、成熟的發(fā)酵技術(shù)進行擴大培養(yǎng)，而且畢赤酵母表達系統(tǒng)可以利用甲醇作為唯一碳源生長，大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)方便，成本低，易于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
本發(fā)明涉及的蚯蚓纖溶酶cDNA來源于粉正蚓(Lumbricusrubellus)，該片段共有741bp，編碼246個氨基酸。本發(fā)明在酵母系統(tǒng)中表達該基因，通過發(fā)酵的方法生產(chǎn)得到基因工程纖溶酶，并通過纖維蛋白平板法檢測了該蛋白的生物活性。目前國內(nèi)已有蚯蚓纖溶酶在大腸桿菌中表達方面的研究，但其在酵母中的表達未見報道。
畢赤酵母表達載體包括但不僅限于下列載體pPIC6、pPIC6α、pPICZ、pPICαZ、pPIC9k、pPIC3.5k、pPAO815、pGAPZ、pGAPαZ；畢赤酵母表達菌株包括但不僅限于下列菌株GS115、KM71、KM71H、X-33、SMD1168、SMD1168H。
在本發(fā)明的一個實施例中提供了一種構(gòu)建基因工程菌株、在畢赤酵母中表達蚯蚓纖溶酶基因的方法，該方法是用pPIC6αA載體(Invitrogen公司)在畢赤酵母X-33中表達蚯蚓纖溶酶基因，畢赤酵母Pichiapastoris X-33(pPIC6αA-EFE)，該菌株在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，編號為M204005，該菌株的制備方法為(1)蚯蚓纖溶酶基因的PCR擴增；(2)PCR產(chǎn)物克隆至T載體；(3)穿梭表達質(zhì)粒的構(gòu)建；(4)表達纖溶酶基因的酵母基因工程菌株的構(gòu)建。
(1)蚯蚓纖溶酶基因的PCR擴增以含有纖溶酶基因的T載體質(zhì)粒為模板，根據(jù)EFE成熟肽和表達載體pPIC6αA上的克隆位點設(shè)計引物，并在上游引物中加入6個連續(xù)的組氨酸編碼序列，之后加入腸激酶切割位點序列，并設(shè)計了一對蚯蚓纖溶酶PCR擴增引物。因此，該工程菌株的表達產(chǎn)物為融合蛋白，在纖溶酶蛋白的N端有6個連續(xù)的組氨酸，用于表達產(chǎn)物的分離純化，純化產(chǎn)物經(jīng)過腸激酶切割后可切去融合蛋白N端的非天然存在氨基酸，得到與天然纖溶酶組成完全相同的基因工程蛋白。在本發(fā)明的一個實施例中提供了一對引物序列，上游引物P1CGAATTCCACCACCACCACCACCACGGTGGTGGTAGCAGCGACGACAAG ATGGAACTTCCTCCCGGAACA (下劃線處為內(nèi)切酶EcoRI位點)。下游引物P2GTCTAGATTAGTTGTTGGTGATGATGTCGGTGATCCATGCAGCAT(下劃線處為內(nèi)切酶XbaI位點)。
(2)PCR產(chǎn)物克隆至T載體回收PCR產(chǎn)物中的基因片段，并克隆于pGEM-T載體，將該重組載體(pGEM-T-EFE2)轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中。
(3)穿梭表達質(zhì)粒的構(gòu)建提取重組載體pGEM-T-EFE2，用EcoRI和XbaI雙酶切以得到目的片段EFE；同樣酶切pPIC6αA空載體并在CIAP作用下使之去磷酸化。將去磷酸化后的線性化的pPIC6αA空載體與雙酶切后得到的EFE在T4DNA連接酶的作用下4℃過夜，以得到重組表達載體pPIC6αA-EFE，將該重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中進行擴增。
(4)表達纖溶酶基因的酵母基因工程菌株的構(gòu)建；a.穿梭表達質(zhì)粒的線形化提取重組質(zhì)粒pPIC6αA-EFE，用SacI酶切成線性，同樣酶切空質(zhì)粒pPIC6αA作為對照。
b.轉(zhuǎn)化方法參考Invitrogen公司表達載體說明書利用生化方法將線性化的重組質(zhì)粒pPIC6αA-EFE和空質(zhì)粒pPIC6αA轉(zhuǎn)化X-33酵母菌株，在含有殺稻瘟素(Blasticidin)300mg/ml的YPD(1％酵母抽提物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3天，直到有單菌落出現(xiàn)。
c篩選陽性轉(zhuǎn)化子挑取10-20個單菌落于YPD液體培養(yǎng)基中30℃，250rpm搖床培養(yǎng)直至對數(shù)生長晚期，提取基因組進行重組子的PCR鑒定。引物為Invitrogen公司表達載體提供的通用引物，其序列為上游GACTGGTTCCAATTGACAAGC，下游GCAAATGGCATTCTGACATCC，鑒定的陽性克隆畢赤酵母工程菌株命名為Pichia pastorisX-33(pPIC6αA-EFE)，該菌株在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏編號為CCTCC M204005。
在畢赤酵母中有兩個編碼乙醇氧化酶的基因AOX1和AOX2，可以利用甲醇作為唯一碳源快速生長，而當培養(yǎng)基中存在其它碳源時，AOX基因不表達。在畢赤酵母工程菌株中，外源基因被克隆至AOX1啟動子控制下，因此必須以甲醇作為誘導(dǎo)劑，同時也是唯一碳源來實現(xiàn)外源蛋白的高效表達，在誘導(dǎo)表達時，應(yīng)補充甲醇以維持其0.5％的含量。
在本發(fā)明的一個實施例中提供了一種畢赤酵母工程菌株誘導(dǎo)表達的方法，可用于畢赤酵母工程菌株誘導(dǎo)表達的培養(yǎng)基包括但不僅限于下列培養(yǎng)基MGY、MM、BMM、BMMY，各種培養(yǎng)基的配置方法為本技術(shù)領(lǐng)域人員非常熟悉的方法，可以通過參考相關(guān)文獻獲得詳情。
蛋白質(zhì)的分離和純化有多種方法，其原理是根據(jù)目的蛋白的物理和化學(xué)性質(zhì)將其與其他蛋白質(zhì)分離。如根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小和蛋白形狀可選擇離心法、超濾法、凝膠過濾層析法，根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的不同可選擇硫酸銨沉淀法或丙酮沉淀法，根據(jù)等電點的不同選擇等電聚焦電泳法或等電沉淀法，根據(jù)疏水性不同可選擇疏水作用層析法、反向HPLC法，根據(jù)蛋白質(zhì)與金屬離子的結(jié)合能力選擇固定化金屬親和層析法。
在本發(fā)明的一個實施例中提供了一種在畢赤酵母X-33中表達、分離、純化蚯蚓纖溶酶基因，獲得基因工程蛋白的方法，該方法包括(1)畢赤酵母工程菌株的誘導(dǎo)表達；(2)基因工程纖溶酶的分離、純化；(3)基因工程纖溶酶蛋白的功能研究及活性測定。
(1)畢赤酵母工程菌株的誘導(dǎo)表達畢赤酵母工程菌株誘導(dǎo)表達方法如下挑取重組菌的單菌落到20mlYPD液體培養(yǎng)基，30℃、250rpm培養(yǎng)進行活化；16個小時后取10ml活化后的菌液轉(zhuǎn)接500ml MGY液體培養(yǎng)基30℃、250rpm培養(yǎng)增濃；增濃24小時后的菌液經(jīng)離心收集菌體(1500g、10分鐘、4℃)；將收集到的菌體用重懸于1000ml MM液體培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)表達，每24h添加甲醇至終濃度為0.5％；誘導(dǎo)96h后離心收集發(fā)酵液上清(30000g、20分鐘、4℃)；(2)基因工程纖溶酶的分離、純化可用于基因工程纖溶酶分離、純化的方法包括但不僅限于下列方法Ni2+柱層析法、離子交換層析法、親和層析法、凝膠過濾層析法、電泳回收法、超濾法、硫酸銨沉淀法等。
在本發(fā)明的實施例中提供一種分離、純化基因工程纖溶酶的方法，分為3個步驟，首先是Ni2+柱層析純化，基因工程纖溶酶蛋白有6個連續(xù)的組氨酸殘基，它們能與Ni2+結(jié)合使基因工程蛋白結(jié)合在固定的金屬離子柱上，而其它雜蛋白不能與金屬離子柱結(jié)合被直接洗脫下來，最后用適當?shù)南疵撘簩⒛康牡鞍踪|(zhì)洗脫下來從而達到蛋白純化的目的。Ni2+柱層析純化產(chǎn)物加入高度純化的牛內(nèi)腸激酶或重組的內(nèi)腸激酶，進行降解反應(yīng)，可切去融合蛋白中的非天然氨基酸殘基，得到與天然蛋白氨基酸組成完全相同的基因工程蛋白。最后將腸激酶降解的樣品直接加入QAE-Tyoypearl 550C層析柱中，由于不同蛋白質(zhì)等電點的不同將基因工程纖溶酶分離純化，純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析驗證。
(3)基因工程纖溶酶蛋白的功能研究及活性測定當前尚無蚯蚓纖溶酶活性測定的國家標準，然而作為一種新的藥品，需要建立一套活性和效價測定的方法。同時這種測定方法應(yīng)該既準確可靠，又簡便易行。當前的測定方法只能參考其它溶栓藥物的活性測定方法。比如尿激酶活性的氣泡上升法和測定蝮蛇抗栓酶的精氨酸脂酶法(TAME)法，但這兩種方法均不適用測定蚯蚓纖溶酶，因為纖溶酶具有纖維蛋白溶酶原激活劑和蛋白水解酶的作用，在溶解血栓時能發(fā)揮這兩種功能，而且該酶的溶酶活性顯著大于激酶活性。
纖維蛋白平板法能夠客觀地表示出纖溶酶溶栓的能力。血纖維蛋白平板中含有纖維蛋白溶酶原，在纖溶酶的激酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白溶酶。加之應(yīng)纖溶酶的溶酶作用，使血纖維蛋白發(fā)生水解作用，變成可溶性的小分子肽和氨基酸，從而使加樣處平板形成半透明溶圈，并根據(jù)圈的大小確定酶的活性單位。在一定范圍內(nèi)，平板溶圈大小與濃度程線形關(guān)系，因此測定纖維蛋白平板的活性可看成纖溶酶和激活酶的雙重作用。該方法具有操作簡單，溶解圈清晰、易于觀察，重復(fù)性好等優(yōu)點。
應(yīng)用與本發(fā)明所涉及基因的基因工程纖溶酶蛋白的功能研究及活性測定的方法包括但不僅限于下列方法纖維蛋白平板法、氣泡上升法、精氨酸脂酶法。
在本發(fā)明的一個實施例中提供一種纖維蛋白平板法測定基因工程纖溶酶的生物學(xué)活性的方法，通過活性測定，本發(fā)明的基因工程菌株發(fā)酵液的活性單位超過3,390,000U/L。
本發(fā)明的技術(shù)要點之三為基因工程纖溶酶蛋白在治療心腦血管疾病中的應(yīng)用。
本發(fā)明所涉及的基因工程蛋白在醫(yī)療、衛(wèi)生、保健類藥物的研發(fā)領(lǐng)域中具有廣泛的用途，可用于制備治療栓塞性心血管疾病的凍干劑、水針劑、片劑、栓劑、噴霧劑等，還可用于生產(chǎn)具有預(yù)防血栓疾病、有益心血管健康的保健品。
與傳統(tǒng)的蚯蚓纖溶酶膠囊制劑相比，本發(fā)明所涉及的基因工程藥物有如下優(yōu)點(1)蚯蚓纖溶酶膠囊制劑口服給藥作用緩慢，不能靜脈注射，不能應(yīng)用于治療急性心、腦血管栓塞疾?。?2)膠囊制作工藝復(fù)雜，需要人工大量養(yǎng)殖蚯蚓，從蟲體中分離純化纖溶酶工藝煩瑣，產(chǎn)品中可能含有各種小分子多肽或其它化學(xué)物質(zhì)，可能引起機體的過敏反應(yīng)。而運用基因工程的方法則可以通過簡單的發(fā)酵大量獲得纖溶酶，分離純化工藝簡單，產(chǎn)品純度高，成本底。
與其它溶栓類藥物(包括生物提取的和基因工程藥物)相比，本發(fā)明所涉及基因工程藥物有如下優(yōu)點(1)鏈激酶(streptokinase SK)和尿激酶(urokinase UK)SK和UK屬于第一代溶栓藥物，它們可以直接或者間接的激活纖溶酶原使之轉(zhuǎn)變成具有溶纖活性的纖溶酶。SK是從β型溶血性鏈球菌培養(yǎng)液中提取的一種外源性纖溶酶原激活物，是間接的纖溶酶原激活劑。UK是從人的尿液中分離出來的絲氨酸蛋白酶，也可由人胚胎腎細胞培養(yǎng)液中獲得。這兩種酶在實際使用過程存在兩個不可避免的問題首先，他們作用的專一性差，在溶解血栓時常導(dǎo)致纖溶蛋白酶原的系統(tǒng)性激活，而造成對凝固蛋白的無差別性的消化，增加了治療過程中內(nèi)出血的危險；其次，和底物結(jié)合的親和力小，直接溶栓效果弱。在治療時使用劑量大，導(dǎo)致治療成本昂貴。SK是一種非酶蛋白，在使用中最大的問題是它的抗原性。幾乎所有人的血液中或多或少都含有抗SK抗體?？贵w的存在一方面“中和”藥物，使藥效降低，另一方面可能引起過敏反應(yīng)。
(2)組織型纖溶酶原激活劑(tissue type plasminogen activator，tPA)tPA是一種主要由血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶，能催化無活性的纖溶酶原變成有活性的纖溶酶，使血栓溶解。正常人tPA的血漿濃度約為5ng/ml，半衰期5分鐘。tPA對存在于血栓部分的纖溶酶原的特異性使用其做為第二代溶栓藥物受到重視，在歐美發(fā)達國家，用基因工程方法生產(chǎn)的tPA已經(jīng)開始用于臨床，顯示了一定的優(yōu)越性。但是由于半衰期短，需要反復(fù)大量用藥才能奏效，由此增加了系統(tǒng)性溶纖而導(dǎo)致內(nèi)出血的可能性，且由于造價高而限制了它的廣泛使用。
(3)其它的溶栓劑除了UK，SK和tPA之外，目前研究的還有蛇毒抗栓酶，單鏈尿激酶型纖溶酶原激活物(pro-UK)，乙?；w溶酶原鏈激酶激活性復(fù)合物(APSAC)等。但這些制劑有的應(yīng)用存在較大的副作用，會發(fā)生過敏反應(yīng)；有的作用機理不明，使用萬分復(fù)雜，對制品品質(zhì)要求極高，有的價格昂貴。
生物提取的溶栓類藥物在生產(chǎn)過程中，需活性炭吸附，主要是用來脫色、吸附熱源、除雜質(zhì)和助濾。本發(fā)明所涉及的基因工程蛋白純度高，品質(zhì)純粹、無熱原，避免脫炭過程和活性炭對環(huán)境的污染，生產(chǎn)成本低，可直接用于生產(chǎn)注射用水劑、粉劑。
本發(fā)明生產(chǎn)的基因工程纖溶酶可以與藥學(xué)上可以接受的載體(如賦形劑、填充劑、吸收促進劑等)混合，或者與其它藥物混合使用，可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法將其制成所需的劑型，可通過口服、注射等方式給藥。這些劑型包括但不僅限于凍干劑、水針劑、片劑、栓劑、噴霧劑。
本發(fā)明所涉及的基因工程藥物可應(yīng)用于心腦血管疾病的治療或輔助治療中，這些疾病包括但不僅限于缺血性腦病，急性心肌梗死合并高纖維蛋白原血癥，冠心病、冠心病引起的高粘滯血癥、冠心病心絞痛、不穩(wěn)定性心絞痛、纖維蛋白原和血小板聚集增高癥，本發(fā)明所涉及的基因工程藥物還可應(yīng)用于血液流變學(xué)相關(guān)的一些疾病的治療及輔助治療中，這些疾病包括但不僅限于美尼爾病、突發(fā)性耳聾、肺心病、糖尿病、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、腎病綜合癥。
本發(fā)明所涉及的基因工程蛋白可以作為主要活性成分應(yīng)用于保健品的生產(chǎn)，用于預(yù)防血栓疾病、增進心腦血管健康。
上述以基因工程纖溶酶為主要活性成分的藥物或其它生物制品，其制作過程或方法為該技術(shù)領(lǐng)域人員所熟悉，生產(chǎn)過程應(yīng)依照國家相關(guān)的法律、法規(guī)進行，包括《中華人民共和國藥典》(國家藥典委員會，2000)和《中國生物制品規(guī)程》(中國生物制品標準化委員會，2000)。
在本發(fā)明的實施例中，提供了一種制備基因工程纖溶酶溶栓藥物制劑的方法，并且在動物模型中進行了溶栓和對腦缺血保護作用的試驗，結(jié)果表明本發(fā)明所涉及的基因工程纖溶酶有良好的溶栓作用，并對試驗動物的腦缺血有保護作用，這些都可以作為例證說明本發(fā)明說涉及的基因工程纖溶酶在心腦血管疾病藥物研發(fā)領(lǐng)域中的用途。
全世界有心腦血管疾病人約1500萬，所需的溶栓劑的潛在市場約20億美元，可用纖溶酶進行治療的各類病人約5000萬人，潛在市場約35億美元，因此，基因工程纖溶酶具有廣闊的市場前景。
一種基因工程菌株，畢赤酵母Pichia pastoris X-33(pPIC6αA-EFE)，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2004年1月12日，保藏編號CCTCC NoM204005。


附圖1纖溶酶基因的PCR擴增結(jié)果泳道1為DNA分子量標準(λDNA/HindIII)；泳道2為反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一條鏈；泳道3為纖溶酶基因的PCR擴增產(chǎn)物附圖2重組質(zhì)粒pUCm-T-EFE的酶切鑒定結(jié)果泳道1為DNA分子量標準(λDNA/HindIII)；泳道2、3纖溶酶基因的PCR擴增產(chǎn)物，泳道4為DNA分子量標準(λDNA/EcoRI+HindIII)；泳道5為重組質(zhì)粒pUCm-T-EFE用NotI和SalI雙酶切的結(jié)果；泳道6為重組質(zhì)粒pUCm-T-EFE用SalI單酶切的結(jié)果；泳道7為重組質(zhì)粒pUCm-T-EFE用SphI單酶切的結(jié)果。
附圖3重組表達載體pPIC6αA-EFE的酶切鑒定結(jié)果泳道1為PCR分子量標準；泳道2為重組表達載體的PCR鑒定結(jié)果；泳道3為重組表達載體用EcoRI+XbaI雙酶切的結(jié)果；泳道4為重組表達載體用SacI單酶切的結(jié)果；泳道5為DNA分子量標準(λDNA/EcoRI+HindIII)附圖4基因工程纖溶酶純化后的SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果泳道1為小分子量蛋白標準；泳道2為純化后的基因工程菌Pichiapastoris X-33(pPIC6αA-EFE)上清，即基因工程纖溶酶蛋白。
附圖5纖維蛋白平板法測定纖溶酶的生物學(xué)活性a為純化后的基因工程纖溶酶蛋白；b為10ul纖溶酶標準品(10000U/ml)；c為10ul對照菌Pichia pastoris X-33(pPIC6αA)上清純化后產(chǎn)物。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖及實施例子對本發(fā)明作進一步說明，但并不作為對本發(fā)明權(quán)利范圍的限制。
所有實施例中的培養(yǎng)基及分子生物學(xué)操作方法為該領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉，可以參考Sambrook等“分子克隆“(實驗室手冊，冷泉港，1989)及“精編分子生物學(xué)實驗指南”(美/F.奧斯伯等著，顏子穎等譯，北京，科學(xué)出版社，1998)。
實施例1.蚯蚓纖溶酶的基因PCR擴增及克隆(1)擴增引物合成根據(jù)GeneBank中已經(jīng)發(fā)表的蚯蚓纖溶酶cDNA序列設(shè)計PCR寡核苷酸擴增引物。上游引物長18個核苷酸ACATGGAACTTCCTCCCG，下游引物長19個核苷酸ATCACCAACAACTAAACCG。引物由上海生工生物工程有限公司合成，經(jīng)PAGE純化。
(2)蚯蚓總RNA提取取3～5條蚯蚓成體，用DEPC處理過的滅菌水漂洗后，放在鋪有濕濾紙的平皿中饑餓過夜，使其盡可能的吐盡體內(nèi)的泥沙。再次用DEPC水清洗干凈后，在液氮中研磨成粉末狀，按照QIAGEN公司RNeasyRMini Kit的產(chǎn)品說明書提取總RNA。將提取到的RNA溶液貯存于-80℃，以備用。
(3)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈按照Promega公司的Reverse Transcription Reaction試劑盒說明書進行，以O(shè)ligo(dT)20為引物合成cDNA第一鏈。具體操作步驟如下將以下試劑加入一個經(jīng)DEPC浸泡并滅菌處理過的PCR反應(yīng)管中25mMMgCl212μl；緩沖液6μl；10mM dNTP 6μl；Recombinant RNasinRibonuclease Inhibitor 2μl；AVM反轉(zhuǎn)錄酶4μl；Oligo(dT)206μl；蚯蚓總RNA 15μl；滅菌雙蒸水9μl。反應(yīng)條件為42℃1小時；95℃5分鐘；3℃5分鐘。
(4)目的基因的PCR擴增取8μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物，按照Reverse Transcription Reaction試劑盒中給出的PCR反應(yīng)體系參數(shù)進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)組分為緩沖液2.5μl；25mM MgCl21.5μl；10mM dNTP 2μl；上游引物1μl；下游引物1μl；mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物15μl；RT-PCR酶混合物2μl；滅菌雙蒸水5μl。其反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性4分鐘；94℃變性1分鐘，55℃退火1.5分鐘，72℃延伸2分鐘，20個循環(huán)；94℃變性1分鐘，55℃退火1.5分鐘，72℃延伸2分鐘，10個循環(huán)；72℃再延伸10分鐘。1％瓊脂糖檢測PCR結(jié)果，電泳結(jié)果如附圖1所示。
(5)目的基因片段的回收按照上海華舜生物工程公司PCR產(chǎn)物回收試劑盒說明書回收目的基因片段，其過程如下取30μlPCR反應(yīng)產(chǎn)物加入1.4mlPB液(試劑盒提供)，混合物移入吸附柱中離心15秒，棄廢液；在吸附柱中加入400μlPB液，靜置1分鐘后，離心15秒，棄廢液；再加入500μlW1液(試劑盒提供)，離心15秒，棄廢液，重復(fù)一次；在吸附柱中加入300μl T1液(試劑盒提供)，靜置1分鐘后，離心30秒，收集離心液，貯存于-20℃。
(6)目的基因片段克隆入載體目的基因片段克隆入pUCm-T載體，該載體購自上海生工生物工程公司。反應(yīng)組分如下PCR產(chǎn)物5μl；pUCm-T載體1μl；10×T4DNA連接酶緩沖液1μl；T4DNA連接酶1μl；去離子水2μl；總體積為10μl，4℃連接過夜。
感受態(tài)細胞的制備挑取單個JM109菌落，接種于3ml不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接種于50mlLB培養(yǎng)液中，37℃振蕩3小時，待菌液OD值為0.6時，4℃5000rpm離心8分鐘，棄上清，沉淀用0.1M CaCl2懸浮，再5000rpm離心8分鐘，棄上清，沉淀以適量0.1M CaCl2重懸，分裝后置冰浴內(nèi)6小時備用。
連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化取上述連接產(chǎn)物5μl加入100μl感受態(tài)細胞冰浴60分鐘，42℃熱休克90秒，再置冰浴2分鐘，加入無氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基0.9ml，37℃培養(yǎng)1小時，取200μl菌液加入40μl 20mg/ml 5-溴-4氯-3吲哚(D-半乳糖苷(X-gal))及4μl 0.1M異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)混勻后涂含氨芐青霉素LB平皿，37℃培養(yǎng)16小時，挑取白色菌落快速提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖檢測。結(jié)果如圖2所示，其陽性克隆命名為pUCm-T-EFE。
質(zhì)粒DNA的快速小量制備挑取單菌落接種于4ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。菌液加入1.5ml離心管中，5000rpm離心8分鐘，棄上清、沉淀懸浮于15μl懸浮液(50mM葡萄糖，25mMTris-HCl，10mMEDTA，PH8.0)，加200μl裂解液(0.2MNaOH，1％SDS)，置冰浴5分鐘后，加150μl中和液(3.0MKAc，pH4.8)，冰浴10分鐘，12000rpm離心10分鐘，棄沉淀，上清加等體積酚/氯仿抽提一次，上清加2倍體積無水乙醇，12000rpm離心10分鐘，沉淀物用70％乙醇洗1次，真空抽干加入20μl TE(10mMTris-HCl，1mM EDTA，PH8.0和1μl RNaseA 10mg/ml)，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> (7)蚯蚓纖溶酶cDNA序列測定提取質(zhì)粒DNA雙脫氧法測定核苷酸序列，序列測定由上海生工生物工程有限公司完成，測序引物為M13啟動子引物。
測定結(jié)果蚯蚓纖溶酶cDNA序列長747個核苷酸，腺嘌呤核苷(A)、胞嘧啶核苷(C)、鳥嘌呤核苷(G)及胸腺嘧啶核苷(T)的含量分別為A-185、C-197、G-189；T-176(sequence No.1)，編碼246個氨基酸(見sequence No.2)?；虺墒祀男蛄袨榈?-740位核苷酸，其余核苷序列為非編碼區(qū)。該蛋白質(zhì)cDNA成熟肽終止密碼子位于基因第741-743位，終止密碼為TAA。
(8)蚯蚓纖溶酶基因的修飾和改造本發(fā)明所涉及的基因片段可以進行修飾，比如突變基因的某些核苷酸序列，但并不影響其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列；可以增加、缺失本發(fā)明所涉及的氨基酸或者核苷酸序列，這些修飾不會影響蛋白質(zhì)的生物化學(xué)特性、高級結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，比如可以在蛋白質(zhì)或多肽N-端或C-端加上分泌信號肽，還可以加上適當?shù)慕宇^(如6個組氨酸)便于蛋白質(zhì)提取、純化?？梢匀斯ず铣扇炕虿糠值暮塑账嵝蛄校铣傻暮塑账嵝蛄行蛄锌梢耘c本發(fā)明提供的序列有差異，但其編碼的蛋白質(zhì)與本發(fā)明所涉及的蛋白質(zhì)序列相同，這些可能的人工合成序列如下atggarytnccnccnggnacnaarathgtnggnggnathgargcnmgnccntaygarttyccntggcargtnwsngtnmgnmgnaarwsnwsngaywsncayttytgyggnggnwsnathathaaygaymgntgggtngtntgygcngcncaytgyatgcarggngargcnccngcnytngtnwsnytngtngtnggngarcaygaymgnwsngcngcnwsnacngtnmgncaracncaygaygtngaywsnathttygtncaygargaytayaayacnaayacnytngaraaygaygtnwsngtnathaaracnwsngtngcnathacnttygayathaaygtnggnccnathtgygcnccngayccngcnaaygaytaygtntaymgnaarwsncartgywsnggntggggnacnathaaywsnggnggnathtgytgyccnaaygtnytnmgntaygtnacnytnaaygayacnacnaaycartaytgygargaygtntayccnytnaaywsnathtaygaygayatgathtgygcnwsngayaayacnggnggnaaygaymgngaywsntgycarggngaywsnggnggnccnytnwsngtnaargayggnwsnggnathttywsnytnathggnathgtnwsntggggnathggntgygcnwsnggntayccnggngtntaywsnmgngtnggnttycaygcngcntggathacngayathathacnaayaay其中m代表a或c；r代表a或g；w代表a或t；s代表c或g；y代表c或t；k代表g或t；v代表a或c或g；h代表a或c或t；d代表a或g或t；b代表c或g或t；n代表g或a或t或c。
實施例2.表達纖溶酶基因的畢赤酵母基因工程菌株的構(gòu)建(1)蚯蚓纖溶酶基因的PCR擴增以pUCm-T-EFE質(zhì)粒為模板，根據(jù)EFE成熟肽和表達載體pPIC6αA上的克隆位點設(shè)計引物，上游引物P1CGAATTCCACCACCACCACCACCACGGTGGTGGTGACGACGACGACAAGATGGAACTTCCTCCCGGAACA(下劃線處為內(nèi)切酶EcoRI位點)。下游引物P2GTCTAGATTAGTTGTTGGTGATGATGTCGGTGATCCATGCAGCAT(下劃線處為內(nèi)切酶XbaI位點)。引物由上海Sangon生物工程公司合成，合成產(chǎn)物經(jīng)PAGE純化。反應(yīng)組分為緩沖液2.5μl；25mM MgCl2 1.5μl；10mM dNTP 2μl；上游引物1μl；下游引物1μl；pUCm-T-EFE質(zhì)粒1μl；LA Taq DNA聚合酶2μl；滅菌雙蒸水19μl。其反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性4分鐘；94℃變性1分鐘，55℃退火1.5分鐘，72℃延伸2分鐘，30個循環(huán)；72℃再延伸10分鐘。
(2)PCR產(chǎn)物克隆至T載體按照上海華舜生物工程公司PCR產(chǎn)物回收試劑盒說明書回收目的基因片段，擴增產(chǎn)物克隆于pGEM-T載體(Promega公司)得到重組載體pGEM-T-EFE2，將該重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中。
(3)穿梭表達質(zhì)粒的構(gòu)建提取重組載體pGEM-T-EFE2，用EcoRI和XbaI雙酶切以得到目的片段EFE；同樣酶切pPIC6αA空載體并在CIAP作用下使之去磷酸化。將去磷酸化后的線性化的pPIC6αA空載體與雙酶切后得到的EFE在T4DNA連接酶的作用下4℃過夜，以得到重組表達載體pPIC6αA-EFE，將該重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中進行擴增。挑取白色菌落快速提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖檢測結(jié)果如圖3所示。
(4)轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33方法參考Invitrogen 公司表達載體說明書(Pichia expressionvectors for selection on blasticidin and purification of recombinant proteinsmanual)。
挑取畢赤酵母X-33單菌落于接種5毫升YPD培養(yǎng)基，30℃250rpm搖床培養(yǎng)過夜，按1％接種量接種200mlYPD液體培養(yǎng)基，30℃250rpm搖床培養(yǎng)3-5小時，菌體濃度達到0.8-1.0，1500g離心10分鐘，沉淀用10ml滅菌雙蒸水重懸，1500g離心10分鐘，沉淀重懸于0.4ml 100mM的LiCl中并轉(zhuǎn)移至滅菌的1.5ml離心管中，12000g離心15秒，棄上清，加入0.1 6ml 0.1M的LiCl重懸，備用。
提取重組質(zhì)粒pPIC6αA-EFE，用SacI酶切成線性，同樣酶切空質(zhì)粒pPIC6αA作為對照。
取50μl上述感受態(tài)細胞，12000g離心15秒，用移液器小心吸取上清，按順序依次加入下列組分240μl 50％PEG；36μl 1M LiCl；25μl 2mg/ml鮭魚精DNA；50μl(5-10μg)線形化重組質(zhì)粒pPIC6aA-EFE。以線形化空質(zhì)粒pPIC6αA作為對照。劇烈震蕩一分鐘使完全混勻，30℃靜置30分鐘，42℃熱激20-25分鐘，6000-8000rpm離心15分鐘，沉淀用1mlYPD培養(yǎng)基重懸，30℃培養(yǎng)1-4小時，取25-100μl圖布于含有300μg/ml殺稻瘟素(Blasticidin)的YPD固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2-3天，直到有單菌落出現(xiàn)。
(5)篩選陽性轉(zhuǎn)化子挑取10-20個單菌落于YPD液體培養(yǎng)基中30℃，250rpm搖床培養(yǎng)直至對數(shù)生長晚期，提取基因組進行重組子的PCR鑒定。
酵母基因組DNA制備方法取1.5ml培養(yǎng)液4000r/分鐘離心10分鐘。菌體用液氮碾磨破壁。加7mL DNA緩沖液(100mmol/LTris--HCl，pH8.0，10mmol/L EDTA，1％SDS)混勻，65℃保溫1h。10000r/分鐘離心15分鐘。上清用苯酚抽提2次，每次5000r/分鐘離心7分鐘。再用氯仿抽提1次，5000r/分鐘離心7分鐘。用2.5倍乙醇沉淀(加0.3mol/L醋酸鈉，pH5.2)，10000r/分鐘離心10分鐘。70％乙醇洗滌，電吹風(fēng)吹干，加TE或水懸浮。
PCR鑒定方法引物為Invitrogen 公司表達載體提供的通用引物，其序列為上游GACTGGTTCCAATTGACAAGC；下游GCAAATGGCATTC TGACATCC。PCR按常規(guī)方法進行，擴增條件為94℃45秒，54℃1分鐘，72℃1分鐘，40個循環(huán)。擴增產(chǎn)物用用0.8％瓊脂糖檢測其大小是否正確，結(jié)果如附圖3所示。
所獲得的陽性克隆命名為Pichia pastoris X-33(pPIC6αA-EFE)，該菌株在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏編號為CCTCC M204005。
實施例3.基因工程纖溶酶蛋白的表達、分離、純化；(1)畢赤酵母工程菌株X-33(pPIC6αA-EFE)的發(fā)酵過程a.挑取重組菌的單菌落入20mlYPD液體培養(yǎng)基(1％酵母抽提物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)，30℃、250rpm培養(yǎng)進行活化；b.16個小時后取10ml活化后的菌液轉(zhuǎn)接500ml MGY液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基30℃、250rpm培養(yǎng)增濃；c.增濃24小時后的菌液經(jīng)離心收集菌體(1500g、10分鐘、4℃)；d.將收集到的菌體用重懸于1000ml MM液體培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)表達，每24h添加甲醇至終濃度為0.5％；
e.誘導(dǎo)96h后離心收集發(fā)酵液上清(30000g、20分鐘、4℃)；(2)樣品處理及Ni2+柱層析過程發(fā)酵液上清灌裝透析袋，經(jīng)以下步驟得柱層析樣品；a.PEG20000(聚乙二醇20000)掩埋透析袋濃縮，濃縮約10倍；b.雙蒸水洗凈透析袋外表面，將裝有濃縮發(fā)酵液的透析袋浸沒在與原發(fā)酵液體積相等的1×BINDING BUFFER(5mMimidazole+0.5M NaCl+20mM Tris·HCl PH＝7.9)內(nèi)過夜，以平衡發(fā)酵液PH、離子濃度；c.同步驟a，濃縮至體積約為原發(fā)酵液的1/10；d.向透析袋中加入1×BINDING BUFFER，將濃縮過的樣品稀釋4倍；e.同步驟c；f.從透析袋中取出濃縮發(fā)酵液，并用少量1×BINDING BUFFER將透析袋中的剩余樣品洗凈，收集；g.將濃縮發(fā)酵液高速離心(15000RPM，15分鐘)，離心后的上清用0.45um微孔濾膜(MILLIPORE公司)過濾得到待柱層析的樣品。
注以上步驟均在4℃進行。
Ni2+柱層析a.Ni2+柱用10床1×BINDING BUFFER、10床無菌水清洗柱床，用10床1×CHARGE BUFFER(5Mm NiSO4)補充Ni2+，再用10床1×BINDING BUFFER清洗柱床，準備開始吸附層析(1床即是柱內(nèi)介質(zhì)的體積)；b.濃縮過的樣品用蠕動泵以循環(huán)方式經(jīng)過Ni2+柱，使帶有6×HIS樣品充分與Ni2+結(jié)合，過夜后從Ni2+柱出口收集與Ni2+反應(yīng)后的樣品(穿漏液)；c.使20床1×BINDING BUFFER流過Ni2+柱，以沖洗留在柱內(nèi)的少量樣品；d.用5mM-100mM的咪唑溶液洗脫Ni2+柱上非目的蛋白(洗脫床數(shù)和洗脫溶液濃度視總蛋白含量和非目的蛋白與Ni2+結(jié)合能力靈活變化)注如果按上面配方，則洗脫雜蛋白溶液為60mM咪唑。
e.用1×ELUTE BUFFER洗脫目的蛋白，分步收集，每1床(實際小于柱床體積)體積為一管，SDS-PAGE檢驗?zāi)康牡鞍自谙疵撘褐械姆植?。Ni2+柱用1×ELUTE BUFFER(1M imidazole+0.5M NaCl+20mMTris·HCl PH＝7.9)繼續(xù)洗脫，洗掉柱床中全部蛋白，再用1×STRIPBUFFER(100Mm EDTA+0.5M NaCl+20mM Tris·HCl PH＝7.9)洗去柱子上的Ni2+離子。
(3)牛內(nèi)腸激酶降解(Enterokinase Cleavage)將Ni2+柱純化的纖溶酶用1000倍體積緩沖液A(25mMHepes/pH8.0，5mM EDTA)透析6-8小時后，加入高度純化的牛內(nèi)腸激酶(Sigma公司)，進行降解反應(yīng)，反應(yīng)條件如下1份酶2000份底物(重量比)37℃反應(yīng)15-20小時后加入P-Aminobenzawidine終止反應(yīng)(4)QAE-Toyopearl 550C陰離子交換樹脂柱層析柱子的制備將樹脂混合均一后，取出大約50毫升的樹脂加入緩沖液A(25mM Hepes/pH8.0，5mM EDTA)；樹脂沉淀后，去掉上清液，再加上等體積緩沖液A，于樹脂混合均一后，自然沉淀，這樣重復(fù)3次。固定好一支層析柱(1.5×30cm)后，堵住柱出口，隨后將緩沖液A處理的樹脂裝入柱內(nèi)。然后打開柱子下面出口后，使樹脂中緩沖液慢慢流出柱子，然后用200毫升緩沖液A，在4℃以下條件下，繼續(xù)平衡層析柱。
樣品的制備將10毫升Ni2+親和層析純化的樣品液，裝入半透膜透析袋中，用2000毫升的緩沖液A，在4℃以下條件，進行過夜透析。
純化過程(4℃以下溫度操作)將透析后的樣品加入層析柱，收集流出液；用3×柱床體積(150毫升)的緩沖液A洗柱子；用緩沖液A和緩沖液B(25mM Hepes/pH8.0，300mM NaCl，5mM EDTA)，通過一個線性梯度形成器，制備的NaCl濃度梯度緩沖液洗脫層析柱。(緩沖液A 200毫升；緩沖液B 200毫升)；洗脫樣品用自動樣品收集器以每部分1毫升體積分步收集。用OD280nm紫外光監(jiān)測蛋白洗脫峰。用SDS-PAGE確認主蛋白峰樣品管含纖溶酶后，將這些樣混合。
(5)純化產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析a.凝膠的灌制參照參見Sambrook等“分子克隆“(實驗室手冊，冷泉港，1989)的方法，配制8％的分離膠溶液15ml，依次混合各成分后加入催化劑TEMED(N，N，N’，N’四甲基乙二胺)，立即混勻開灌膠，封一層0.1％SDS(二烷基硫酸鈉)覆蓋液面，37℃下聚合30分鐘。聚合完全后排凈凝膠上的液體，以同樣方法灌濃縮膠，插入梳子，避免產(chǎn)生氣泡。
b.上樣及電泳在酵母誘導(dǎo)發(fā)酵液中加等體積2×SDS凝膠加樣緩沖液，于100℃加熱3-5分鐘變性，按順序加樣，最后在所有不用的加樣孔中加上等體積的加樣緩沖液，以100V電泳至溴酚蘭進分離膠，提高電壓至150V，當溴酚蘭到達底部前約1cm處結(jié)束電泳(約需4hr)。
c.凝膠染色參見《蛋白質(zhì)純化與鑒定實驗指南》(美國D.R.馬歇克等著，朱厚礎(chǔ)等譯，科學(xué)出版社，2002)。室溫下，凝膠在旋轉(zhuǎn)平臺上緩慢搖動，并進行下列步驟。
將凝膠在50％的甲醛溶液中浸泡2次，每次15分鐘；在5％的甲醛中浸泡10分鐘；用雙蒸水迅速洗3次；在10μmol/L二硫蘇糖醇(DTT)溶液中浸泡20分鐘；在0.1％AgNO3(0.1％，w/v)中進浸泡20分鐘；先用雙蒸水快速洗1次，然后用顯影液(15g碳酸鈉溶于500ml水中，用前加入250μl 37％(w/v)甲醛溶液)快速洗2次，每次不超過15秒；在顯影液中浸泡數(shù)分鐘，直至顯出蛋白質(zhì)帶；加入固體檸檬酸(每200ml顯影液加入約10g檸檬酸)，停止顯影；用鋁箔蓋住凝膠繼續(xù)浸泡10分鐘，然后用雙蒸水徹底清洗。
d.電泳結(jié)果如附圖4所示。
實施例4.基因工程纖溶酶蛋白的功能研究及活性測定采用纖維蛋白平板法測定纖溶酶的生物學(xué)活性，通過活性測定，發(fā)酵液的活性單位超過3E+06U/L。圖5為測定時的纖溶圈，檢測方法可參考郝蘇麗等的方法[郝蘇麗，沈佳，蚓激酶生物活性檢測方法的研究，中國藥事1996年第10卷第6期]，具體操作方法如下。
(1)鋪板取纖維蛋白原液(稱取纖維蛋白原適量。用Tris-HCl緩沖液配成每毫升中含4.2mg可凝蛋白的溶液)12.7ml，纖維蛋白溶酶原液(取纖維蛋白溶酶原用Tris-HCl緩沖液配成每毫升中含lu的溶液)0.67ml，瓊脂液(稱取瓊脂0.8g加Tris-HCl緩沖液100ml，加熱溶解)13.4ml.凝血酶液(取凝血酶用Tris-HCl緩沖液配成含70B.PU的溶液)0.67ml?；靹?倒人直徑9cm的有機玻璃盤內(nèi)。室溫放置半小時。凝好的板均勻無氣泡，呈乳白色。
(2)點樣稱取纖溶酶標準品適量。用Tris-HCI緩沖液配成每毫升中含2200，1100，550，270四個濃度。用微量注射器吸取10μl標準液點于板上。點與點間應(yīng)留有一定間距，然后蓋上玻扳。置37℃恒溫培育18小時，去蓋，用游標卡尺測量其溶圈的垂直直徑，以兩直徑乘積為縱座標。標準品單位為橫座標，在雙對數(shù)座標紙上作圖繪制標準曲線或求回歸方程。供試品的單位取在標準曲線范圍內(nèi)。以供試品溶圈垂直兩直徑乘積，在纖溶酶標推曲線上查活力單位。
(3)檢測結(jié)果兩直徑乘積為縱座標，標準品單位為橫座標，回歸方程為lgY＝-1.573+0.544 lgX，Y為溶圈的垂直直徑乘積，單位為cm2，X為活性單位。結(jié)果表明，發(fā)酵液的活性單位為3.39E+06U/L。
實施例5.基因工程纖溶酶制備溶栓類藥物將純化的纖溶酶在緩沖液(23克甘氨酸/升，1.6克磷酸氫二鈉/升，0.55克磷酸二氫鈉/升，pH7.0)透析后，用超濾濃縮到每毫升含1毫克濃度，用0.22μm孔徑的膜過濾滅菌。然后，大約1毫升樣品液(約300000活力單位)裝瓶，冷凍干燥，制成成品。使用時，樣品首選用1毫升醫(yī)用水溶解，用作生物測活和注射病人。
基因工程纖溶酶樣品規(guī)格為300000U基因工程纖溶酶；23mg甘氨酸；1.6mg磷酸氫二鈉；0.55mg磷酸二氫鈉。另外配備5毫升醫(yī)用級水。
實施例6.基因工程纖溶酶蛋白制劑的應(yīng)用——小鼠抗凝實驗方法參考陳健康等的文獻進行[陳健康，王雷，李珂，郭峰，楊軍，銀杏黃酮與基因工程纖溶酶的抗凝溶栓作用，心臟雜志2001，13(4)308-309]。
挑選昆明種雄性小鼠30只，隨機分為3組，體重20±2g。連續(xù)給藥3天，各組分別注射5000U/kg基因工程纖溶酶，0.2mg阿司匹林，對照組注射生理鹽水0.5mL。第3天用藥后2小時開始實驗。將小鼠尾尖部剪斷1cm，間隔10s用濾紙吸去血清，不得擠壓，記錄小鼠出血時間。
實驗結(jié)果(見表1)表明，基因工程纖溶酶組和阿司匹林組出血時間均延長，基因工程纖溶酶用藥組和對照組比較有顯著性意義，說明基因工程纖溶酶有很好的抗凝血作用。
表1 實驗小鼠尾部出血時間對照表

(與對照組相比，ρ＜0.05)實施例7.基因工程纖溶酶蛋白制劑的應(yīng)用——對大鼠實驗性腦缺血的保護作用(1)大鼠大腦中動脈閉塞模型(MCAO)的制備方法參照文獻進行[Tamura A，Graham DI，McCulloch J，Teasdale GM.，F(xiàn)ocal cerebral ischaemia in the ratl.Description of technique and earlyneuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion.J CerebBlood Flow Metab.1981；1(1)53-60.][馮亦璞，閏韶華，小鼠短暫性MCAO模型，張均田，現(xiàn)代藥理實驗方法，北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1998]。
用10％水合氯醛(300mg/kg)ip麻醉大鼠，仰位固定，頸部正中切口，暴露右側(cè)頸總動脈，由分叉處向頭端依次游離，結(jié)扎并剪斷枕骨下動脈和甲狀腺上動脈，在頸外動脈遠端結(jié)扎并切斷，游離備用。分離頸內(nèi)動脈，用絲線在頸外動脈根部打一松扣，夾閉頸總動脈和頸內(nèi)動脈，用細線經(jīng)頸外動脈主干切口，緩慢向頸內(nèi)動脈入顱方向推進，以頸總動脈分叉處為標記，推進20毫米左右。扎緊頸外動脈根部松扣。一小時后，小心拔出細線，扎緊動脈殘端，用外科無損傷縫合線縫合皮膚，完成大腦中動脈栓塞。術(shù)中術(shù)后室溫控制在22±1℃。
雄性Wister大鼠(50±50g)，隨機分成4個組，即假手術(shù)組、模型組、基因工程纖溶酶(2500U/kg)組，基因工程纖溶酶(5000U/kg)組。其中假手術(shù)組暴露左大腦中動脈和左頸總動脈，不結(jié)扎。各給藥組于結(jié)扎前10分鐘分別靜脈注射基因工程纖溶酶，模型組則給予生理鹽水0.5ml。
(2)基因工程纖溶酶對腦缺血大鼠存活時間的影響實驗結(jié)果見表2表2 基因工程纖溶酶對腦缺血大鼠存活時間的影響Tahle 2 Effect of Lumbroinase on survival time in ischemic mice(x±S)分組 例數(shù)(n) 存活時間(min)對照組 15 9.5±4.1假手術(shù)組 15 8.2±5.4基因工程纖溶酶15 11±8(2500U/kg)基因工程纖溶酶15 68±282(5000U/kg)與對照組相比，ρ＜0.001(3)基因工程纖溶酶對腦缺血大鼠大腦動脈24h后梗死面積和腦組織含水量的影響，實驗結(jié)果見表3
表3 基因工程纖溶酶對小鼠大腦中動脈閉塞24h后梗死面積及組織的含水量Table 3 Inhibitory effect of lumbrokinase on infarction area and water contentin brain ofter 24h MCAO in rats (x±S)分 組 例數(shù)(n) 梗死面積(1/2) 含水量(mL/g)假手術(shù)組8 1.22±0.053.74±0.09模型組 8 7.17±0.37c4.99±0.45c基因工程纖溶8 5.77±0.22bd4.77±0.34酶(2500U/kg)基因工程纖溶8 4.07±0.65b4.41±0.56a酶(2500U/kg)與模型組比較，aρ＜0.05，bρ＜0.01；與假手術(shù)組比較，cρ＜0.001；與模型+基因工程纖溶酶2500U/kg和5000U/kg組比較，dρ＜0.05。
(4)基因工程纖溶酶對大鼠大腦中動脈閉塞24小時后神經(jīng)功能障礙的影響上述3組動物在大腦中動脈結(jié)扎術(shù)后24小時觀察其神經(jīng)功能障礙的情況，將神經(jīng)功能障礙分為5級I級為無神經(jīng)系統(tǒng)功能損害，記1分；II級僅有輕度功能障礙，表現(xiàn)為行走時雖不用扶持，但步態(tài)欠穩(wěn)，提尾時腦損傷對側(cè)前肢屈曲，記2分；III級有中度功能障礙，表現(xiàn)為在扶持下方可站立，不持久，提尾時腦損傷對側(cè)前肢屈曲，向手術(shù)側(cè)轉(zhuǎn)圈，記3分；IV級為重度功能障礙，表現(xiàn)為有意識變化，嗜睡，反應(yīng)遲鈍，不能站立，記4分；V級為死亡，記5分。該方法為溶栓類藥物常用的測定方法，可參考[Lawner PM，Laurent JP，Simeone FA，F(xiàn)ink EA，Effect ofextracranial-intracranial bypass and pentobarbital on acute stroke in dogs.JNeurosurg.1982 Jan；56(1)92-96.][Diaz FG，Mastri AR，Ausman JI，Chou SN.，JNeurosurg.Acute cerebral revascularization after regional cerebral ischemia in thedog.，1979 Nov；51(5)644-653.]。
實驗結(jié)果見表4。
表4 基因工程纖溶酶對小鼠大腦中動脈閉塞24h后神經(jīng)功能障礙的影響Table 4 Influence of lumbrokinase on neurologic deficits(ND)scoresproduced by 24h MCAO in rats(x±S)分 組例數(shù)(n)神經(jīng)功能障礙評分模型組 8 4.21±0.3d假手術(shù)組 8 1.45±0.5基因工程纖溶 8 2.16±0.5b酶(2500U/kg)基因工程纖溶 8 1.67±0.3b酶(5000U/kg)與模型組比較，bρ＜0.01；與假手術(shù)組比較，dρ＜.001。
(5)基因工程纖溶酶對小鼠大腦中動脈閉塞24小時后腦組織總抗氧化能力、NO含量及NOS活性的影響實驗結(jié)果見表5。
表5 基因工程纖溶酶對小鼠大腦中動脈閉塞24h后腦組織總抗氧化能力，一氧化氮含量和一氧化氮合酶活性的影響Table 5 Effect of Lumbrokinase on T-AOC.NO content and NOS activity after24h MCAO(n＝6，x±S))總抗氧化能力 NO NOS分 組(kU/g) (μmol/g) (kU/g)正常對照 3.17±0.56 1.11±0.200.39±0.06模型組1.20±0.15d3.20±0.54d0.84±0.79d假手術(shù)組 3.16±0.58 1.09±0.200.41±0.04基因工程纖溶酶1.71±0.24af3.20±0.380.75±0.15(2500U/kg)基因工程纖溶酶2.20±0.18be2.80±0.35a0.74±0.09a(5000U/kg)與假手術(shù)組比較，dρ＜0.001；與模型組比較，aρ＜0.05，bρ＜0.01；與模型+基因工程纖溶酶5000U/kg組比較，eρ＜0.05，，fρ＜0.01。
上述實驗結(jié)果表明基因工程纖溶酶可縮小梗死面積、減輕腦水腫和缺血后腦組織總抗氧化能力的降低，減低NO含量、降低NOS活性，故對腦缺血起到保護作用。
實施例8.基因工程纖溶酶蛋白制劑的應(yīng)用——溶栓作用家兔頸外靜脈血栓法操作簡便，不需特殊儀器，在國內(nèi)外均有研究室采用，是研究藥物溶血栓作用的可行方法。該方法可參考[趙煒明，許超千，何樹莊，王玲，基因工程纖溶酶溶栓作用的實驗研究哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2002(36)3183-185][徐叔云，卞如濂，陳修主編.藥理實驗方法學(xué).北京人民衛(wèi)生出版社，1982.][朱燕，何執(zhí)中，孫可迪，王少飛，基因工程纖溶酶對實驗性血栓的影響，中國藥科大學(xué)學(xué)報，2000，31(1)50～52。](1)制造頸動-靜脈旁路實驗?zāi)Ｐ蛯嶒炌糜?0％烏拉坦5ml/kg耳緣靜脈注射麻醉，背位固定，剝離氣管，插入一塑料套管(氣管分泌物多時可通過此套管吸出)，分離左側(cè)頸外靜脈和右側(cè)頸總動脈。在三段聚乙烯管中段放入一段長6cm的4號手術(shù)絲線，聚乙烯管內(nèi)充滿肝素生理鹽水溶液(50U/ml)用聚乙烯管的一端插入左頸外靜脈后，由聚乙烯管準確注入肝素生理鹽水溶液(50U/ml)抗凝，然后再將聚乙烯管的另一端插入右頸總動脈，打開動脈夾，血液從右頸總動脈流至聚乙烯管內(nèi)，返回左頸外靜脈，形成頸動-靜脈旁路，維持3h后，取血，中斷血流，迅速取出絲線稱重。
(2)實驗分組及給藥途徑家兔36只，體重2.5士0.2kg，隨機分成6組，分別為模型組、生理鹽水對照組、基因工程纖溶酶小劑量組、基因工程纖溶酶中劑量組、基因工程纖溶酶大劑量組、尿激酶陽性對照組。
各組具體給藥途徑如下模型組所制造的頸動-靜脈旁路模型；生理鹽水對照組耳緣靜脈等體積注射生理鹽水；基因工程纖溶酶小劑量組耳緣靜脈注射基因工程纖溶酶1250U/kg；基因工程纖溶酶中劑量組耳緣靜脈注射基因工程纖溶酶2500U/kg；基因工程纖溶酶大劑量組耳緣靜脈注射基因工程纖溶酶5000U/kg；尿激酶陽性對照組耳緣靜脈注射尿激酶2×104U/kg。
給藥方法頸動-靜脈旁路模型建立后，生理鹽水對照組、基因工程纖溶酶小劑量組、中劑量組、大劑量組及尿激酶陽性對照組分別于旁路建立后15min給藥，觀察3h。
(3)溶栓作用采用兔動-靜脈旁路血栓形成模型，測定蚯蚓纖溶酶的溶栓作用(血栓濕重、干重)；心臟取血，測定蚯蚓纖溶酶對血漿纖維蛋白酶(FIB)、血漿優(yōu)球蛋白溶解時間(ELT)、纖維蛋白裂解產(chǎn)物(FDP)等生化指標的影響。
實驗結(jié)果見表6和表7。本實驗中基因工程纖溶酶中劑量組與大劑量組可使ELT顯著縮短，說明基因工程纖溶酶激活了纖溶系統(tǒng)。本實驗中基因工程纖溶酶小劑量組、中劑量組和大劑量組與模型組相比可明顯增加FDP含量，說明基因工程纖溶酶可使血液系統(tǒng)的纖溶活性增強。在本實驗中，F(xiàn)IB沒有明顯的變化，表明基因工程纖溶酶不易產(chǎn)生出血的副反應(yīng)。
表6基因工程纖溶酶對ETL FDP數(shù)值及FIB含量的影響ELT(min)FDP(ng·L-1)組別FIB(g·L-1)＜120≥130＜55-20≥20模型組 0 7.9 8.1 00 4.60±2.89生理鹽水組 0 7.9 8.1 00 5.90±2.98基因工程纖溶酶小 0 7.8 4.9 02.55.34±2.80☆劑量組(1250U/kg)基因工程纖溶酶中4.1·4.1·1.1·4·3·3.75±1.84☆劑量組(2500U/kg)基因工程纖溶酶大5·3·1·1·6·3.00±1.93☆劑量組(5000U/kg)尿激酶組 5·3·0·1·7·2.60±1.02☆ELT，F(xiàn)DP均以例數(shù)計，經(jīng)秩和檢驗，·與生理鹽水組比較，均為ρ＜0.01；FIB含量經(jīng)q檢驗，☆與生理鹽水組比較ρ＜0.05。
表7基因工程纖溶酶對家兔體內(nèi)血栓形成的影響(x±S)組 別 例 劑量 濕重(ng)干重(ng) 抑制率數(shù)(％)模型組 8 70.25±2.04 22.01±1.83重理鹽水組 8 85.31±3.61 28.25±1.02基因工程纖溶 8 1250U/kg 63.58±9.60△△19.55±3.67△△24.5酶小劑量組基因工程纖溶 8 2500U/kg 39.00±5.9··△△☆14.26±1.05··△△53.6酶中劑量組☆基因工程纖溶 8 5000U/kg 29.49±4.58··△△12.21±2.01··△△65.3酶大劑量組尿激酶組 8 2×104U/kg21.11±5.48··△△8.91±2.07··△△75.1··與模型組比較，ρ＜0.01；△△與生理鹽水組比較ρ＜0.01；☆大、中、小劑量組比較；ρ＜0.05。
SEQUENCE LISTINGNO1<110> 綠色生命實驗室有限公司<120> 一種蚯蚓纖溶酶基因和基因工程菌株及其構(gòu)建和應(yīng)用<130> 正蚓科粉正蚓屬蚯蚓(Lumbricus rubellus)纖溶酶基因核苷酸序列<160> 1<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 747<212> DNA<213> Lumbricus rubellus<220>
<221> cDNA<222> (3)..(740)<223>
<400> 1acatggaact tcctcccgga acaaaaattg tcggaggaat tgaagctaga ccatacgagt 60tcccatggca ggtgtccgtc cgaaggaaat cttccgattc ccatttctgc ggaggtagca120tcatcaacga tcgttgggtt gtctgcgctg ctcactgcat gcagggagag gcccccgctc180tggtttcatt ggtcgtgggt gagcacgaca ggagtgcagc gagtacagta cgtcagactc240atgacgttga tagcatcttc gttcacgagg actacaacac aaatacccta gagaacgacg300tttctgtcat caagacatct gttgccatca ctttcgacat caacgttggt ccaatctgcg360ccccagatcc ggctaacgac tacgtctacc gtaagagcca gtgttccgga tggggaacta420tcaattcagg tggaatctgc tgtcccaacg ttctgcgata cgtgacgctg aatgacacaa480ccaaccaata ctgcgaagat gtatacccac taaattcaat ctacgacgat atgatttgcg540cgtcggacaa cactgggggt aacgacagag actcctgcca gggtgactcc ggcggccctc600tgagcgtcaa ggatggtagt ggaatcttca gcctgattgg tattgtgtct tggggaattg660gttgcgcttc tggctatcca ggagtctact cccgcgtcgg attccatgct gcatggatca720ccgacatcat caccaacaac taaaccg747
SEQUENCE LISTINGNO2<110> 綠色生命實驗室有限公司<120> 一種蚯蚓纖溶酶基因和基因工程菌株及其構(gòu)建和應(yīng)用<130>
正蚓科粉正蚓屬蚯蚓(Lumbricus rubellus)纖溶酶基因氨基酸序列<160> 1<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 246<212> PRT<213> Lumbricus rubellus<220><221> PEPTIDE<222> (1)..(246)<223>
<400> 1Met Glu Leu Pro Pro Gly Thr Lys Ile Val Gly Gly Ile Glu Ala Arg15 10 15Pro Tyr Glu Phe Pro Trp Gln Val Ser Val Arg Arg Lys Ser Ser Asp20 25 30Ser His Phe Cys Gly Gly Ser Ile Ile Asn Asp Arg Trp Val Val Cys35 40 45Ala Ala His Cys Met Gln Gly Glu Ala Pro Ala Leu Val Ser Leu Val50 55 60Val Gly Glu His Asp Arg Ser Ala Ala Ser Thr Val Arg Gln Thr His65 70 75 80
Asp Val Asp Ser Ile Phe Val His Glu Asp Tyr Asn Thr Asn Thr Leu85 90 95Glu Asn Asp Val Ser Val Ile Lys Thr Ser Val Ala Ile Thr Phe Asp100 105 110Ile Asn Val Gly Pro Ile Cys Ala Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Val115 120 125Tyr Arg Lys Ser Gln Cys Ser Gly Trp Gly Thr Ile Asn Ser Gly Gly130 135 140Ile Cys Cys Pro Asn Val Leu Arg Tyr Val Thr Leu Asn Asp Thr Thr145 150 155 160Asn Gln Tyr Cys Glu Asp Val Tyr Pro Leu Asn Ser Ile Tyr Asp Asp165 170 175Met Ile Cys Ala Ser Asp Asn Thr Gly Gly Asn Asp Arg Asp Ser Cys180 185 190Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly Ile195 200 205Phe Ser Leu Ile Gly Ile Val Ser Trp Gly Ile Gly Cys Ala Ser Gly210 215 220Tyr Pro Gly Val Tyr Ser Arg Val Gly Phe His Ala Ala Trp Ile Thr225 230 235 240Asp Ile Ile Thr Asn Asn24權(quán)利要求
1.一種蚯蚓纖溶酶基因，其包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2.一種編碼權(quán)利要求1的蚯蚓纖溶酶蛋白，其包含SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
3.一種實現(xiàn)權(quán)利要求1所述的蚯蚓纖溶酶基因的方法，包括下列步驟A、擴增引物合成根據(jù)GeneBank中已經(jīng)發(fā)表的蚯蚓纖溶酶cDNA序列設(shè)計引物，上游引物P1長18個核苷酸ACATGGAACTTCCTCCCG，下游引物P2長19個核苷酸ATCACCAACAACTAAACCG.，引物經(jīng)PAGE純化；B、蚯蚓總RNA提取取3～5條蚯蚓成體，用DEPC處理過的滅菌水漂洗后，放在鋪有濕濾紙的平皿中饑餓過夜，再次用DEPC水清洗干凈后，在液氮中研磨成粉末狀，提取總RNA貯存于-80℃；C、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈以O(shè)ligo(dT)20為引物合成cDNA第一鏈，反應(yīng)條件為42℃ 1小時；95℃ 5分鐘；3℃ 5分鐘；D、目的基因的PCR擴增以cDNA第一條鏈為模板進行PCR擴增，其反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性4分鐘；94℃變性1分鐘，55℃退火1.5分鐘，72℃延伸2分鐘，20個循環(huán)；94℃變性1分鐘，55℃退火1.5分鐘，72℃延伸2分鐘，10個循環(huán)；72℃再延伸10分鐘；E、目的基因片段的回收，按照PCR產(chǎn)物回收試劑盒說明書回收目的基因片段；F、目的基因片段克隆入載體回收目的基因片段并與T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞大腸桿菌JM109，挑取菌落快速提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，所得到的陽性克隆子是包含本發(fā)明涉及基因的大腸桿菌，用于基因的增殖和保藏。
4.一種基因工程菌株，其特征是畢赤酵母Pichia pastoris X-33(pPIC6αA-EFE)CCTCC NoM204005。
5.一種實現(xiàn)權(quán)利要求4的基因工程菌株的制備方法，其特征是A、蚯蚓纖溶酶基因的PCR擴增以含有纖溶酶基因的T載體質(zhì)粒為模板，根據(jù)EFE成熟肽和表達載體pPIC6αA上的克隆位點設(shè)計引物，并在上游引物中加入6個連續(xù)的組氨酸編碼序列，之后加入腸激酶切割位點序列，并設(shè)計了一對蚯蚓纖溶酶PCR擴增引物；B、PCR產(chǎn)物克隆至T載體回收PCR產(chǎn)物中的基因片段，并克隆于pGEM-T載體，將該重組載體pGEM-T-EFE2轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中；C、穿梭表達質(zhì)粒的構(gòu)建提取重組載體pGEM-T-EFE2，用EcoR I和Xba I雙酶切以得到目的片段EFE；同樣酶切pPIC6αA空載體并在CIAP作用下使之去磷酸化，將去磷酸化后的線性化的pPIC6αA空載體與雙酶切后得到的EFE在T4DNA連接酶的作用下4℃過夜，以得到重組表達載體pPIC6αA-EFE，將該重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中進行擴增；D、表達纖溶酶基因的酵母基因工程菌株的構(gòu)建，首先是穿梭表達質(zhì)粒的線形化，提取重組質(zhì)粒pPIC6αA-EFE，用SacI酶切成線性，同樣酶切空質(zhì)粒pPIC6αA作為對照；其次是轉(zhuǎn)化，利用生化方法將線性化的重組質(zhì)粒pPIC6αA-EFE和空質(zhì)粒pPIC6αA轉(zhuǎn)化X-33酵母菌株，在含有殺稻瘟素300mg/ml的YPD固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3天，直到有單菌落出現(xiàn)；第三是篩選陽性轉(zhuǎn)化子，挑取10-20個單菌落于YPD液體培養(yǎng)基中30℃，250rpm搖床培養(yǎng)直至對數(shù)生長晚期，提取基因組進行重組子的PCR鑒定。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因工程菌株的制備方法，其特征是蚯蚓纖溶酶PCR擴增所用的PCR引物為上游引物CGAATTCCACCACCACCACCACCACGGTGGTGGTGACGACGACGACAAGATGGAACTTCCTCCCGGAACA；下游引物GTCTAGATTAGTTGTTGGTGATGATGTCGGTGATCCATGCAGCAT。
7.一種基因工程纖溶酶蛋白在治療心血管類疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蚯蚓纖溶酶基因和基因工程菌株及其構(gòu)建和應(yīng)用，纖溶酶基因由747核苷酸組成，編碼246個氨基酸，該基因在畢赤酵母中表達出有活性的基因工程纖溶酶蛋白，發(fā)酵液活性單位超過3,390,000U/L，該基因工程纖溶酶蛋白在醫(yī)療、衛(wèi)生、保健類藥物的研發(fā)領(lǐng)域中具有廣泛的用途。
文檔編號C12N15/57GK1563387SQ20041003447
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月14日
發(fā)明者孟小林, 徐進平, 胡燕, 張俊杰, 魯偉, 王健, 孟海洋 申請人:綠色生命實驗室有限公司