專利名稱：一種漆酶及其生產(chǎn)方法與專用生產(chǎn)菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵工業(yè)領(lǐng)域，特別是涉及一種生產(chǎn)漆酶的方法及其專用菌株。
背景技術(shù)：
漆酶(p-diphenol oxygen oxidoreductase，EC 1.10.3.2.)是一種藍(lán)色、含有多個銅離子的酚氧化酶，能催化酚類物質(zhì)的氧化還原反應(yīng)，其反應(yīng)底物包括酚類及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等。目前通過不斷研究，漆酶可氧化的非酚底物范圍還在不斷擴(kuò)大。漆酶可降解木質(zhì)素中的酚類和非酚類結(jié)構(gòu)，在木質(zhì)素的生物降解中發(fā)揮著重要的作用，也可以用于降解芳香族化合物。漆酶還能使木素類多酚物質(zhì)以游離基方式進(jìn)行氧化聚合，可以替代傳統(tǒng)木材工業(yè)所應(yīng)用的合成樹脂膠粘劑或其它化學(xué)品，用這種無污染的酶學(xué)方法取代污染嚴(yán)重的化學(xué)方法，可以把污染消除在源頭。因此，漆酶在生物技術(shù)和環(huán)境保護(hù)方面有著巨大的應(yīng)用潛力。
白腐菌能夠產(chǎn)生漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)和錳氧化物酶(MnP)等，是目前能夠?qū)⒛举|(zhì)素徹底降解為二氧化碳和水的唯一生物。其產(chǎn)生的漆酶比木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶熱穩(wěn)定性更好。因此，這一生物類群引起了世界生物學(xué)家的極大興趣。白腐菌中的血紅密孔菌被認(rèn)為是研究漆酶的理想菌株，然而現(xiàn)有國內(nèi)已知菌株的漆酶酶活力都較低，最高達(dá)到21U/ml。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株產(chǎn)漆酶的血紅密孔菌。
本發(fā)明所提供的血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528已于2004年03月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC № 1124。
該血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528 CGMCC № 1124是從血紅密孔菌G5分離獲得的，其在固體培養(yǎng)基上的生長狀況如圖1所示，菌絲細(xì)胞的Giemsa染色如圖2所示。該菌株與其親本菌株G5的形態(tài)學(xué)差異如表1所示。
表1菌絲形態(tài)學(xué)差異


本發(fā)明所提供的血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528 CGMCC № 1124是一種需氧菌，最適生長溫度為30℃，發(fā)酵培養(yǎng)時分泌漆酶到培養(yǎng)基中，并伴隨著有大量的色素產(chǎn)生。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種漆酶及其生產(chǎn)漆酶的方法。
本發(fā)明所提供的漆酶，是發(fā)酵血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528 CGMCC№ 1124得到的。
生產(chǎn)漆酶的方法，包括發(fā)酵培養(yǎng)血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528CGMCC № 1124，和從發(fā)酵培養(yǎng)基中提取漆酶。
發(fā)酵培養(yǎng)過程需要在有氧和避光條件下進(jìn)行，培養(yǎng)至第4天需要向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物2，5二甲基苯胺，加入2，5二甲基苯胺的量以10μM為宜。所用的發(fā)酵培養(yǎng)基可以用麥芽糖、蔗糖或葡萄糖等作為碳源，對于菌絲的生長速度影響不大，但用麥芽糖時漆酶產(chǎn)量要高；培養(yǎng)基通常以酒石酸銨作為氮源，還包括有多種無機(jī)組份，如硫酸亞鐵、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅、氯化鈣、氯化鈷等，和一些營養(yǎng)成分，如維生素B1、B2、B6等。在培養(yǎng)基中加入小麥麩皮，漆酶產(chǎn)量可以提高2-3倍。
在實(shí)際應(yīng)用中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選由下列物質(zhì)組成，麥芽糖1.0-2.0％；酒石酸銨0.1-0.3％，KH2PO40.132-0.134％；NaH2PO4·12H2O0.038-0.040％；MgSO4·7H2O0.04-0.06％；琥珀酸鈉(CH2COONa)2·6H2O0.117-0.119％；FeSO4·7H2O0.00314-0.00316％；CaCl2·2H2O0.009-0.011％；MnSO4·H2O0.0034-0.0036％；CH3COONa·3H2O0.0407-0.0409％；CoCl2·6H2O0.005-0.007％；ZnSO4·7H2O0.0027-0.0029％；CuSO4·5H200.0167-0.0169％；小麥麩皮5-7克；Tween-800.9-1.1ml；VitaminB110μg；VitaminB25μg；VitaminB65μg，加水至1升，其中，所述的百分比是以水為基質(zhì)的固體重量對水體積的百分比。
所述從發(fā)酵培養(yǎng)基中提取漆酶包括以下步驟離心分離、超濾濃縮、硫酸銨分級沉淀、離子交換柱和凝膠過濾柱。
離心分離發(fā)酵液，用截留分子量為10000萬道爾頓的超濾柱超濾所得上清液，用兩步硫酸銨沉淀超濾濃縮液，所述兩步硫酸銨沉淀的硫酸銨飽和度分別為30％-40％和70％-90％。
本發(fā)明所提供的血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528 CGMCC № 1124經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，得到的漆酶酶活可高達(dá)63U/ml，而且該菌株在培養(yǎng)過程中不產(chǎn)生木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶，便于漆酶的提取，簡化了提取工藝，提取得到的漆酶酶活高，可廣泛應(yīng)用于酚類、芳胺、芳香羧酸及其衍生物的生物降解，造紙制漿生物漂白和廢水處理中，并且還可以在木材加工中替代化學(xué)膠合劑。


圖1為血紅密孔菌mk528 CGMCC № 1124的菌落形態(tài)照片圖2為血紅密孔菌mk528 CGMCC № 1124的Giema染色(×1100)顯微鏡照片具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、血紅密孔菌mk528的分離血紅密孔菌mk528是從血紅密孔菌G5雙核菌絲分離獲得，而血紅密孔菌G5是從血紅密孔菌子實(shí)體中獲得的雙核菌絲(唐舜，Lomascolo A，郭林等(2001)Isolationof white-rot fungi from China for screening laccase-hyperproducing strains.菌物系統(tǒng)20520-525)。
血紅密孔菌G5在含有瓊脂20g/l-1和麥芽抽提物20g/l-1的培養(yǎng)皿中30℃培養(yǎng)，培養(yǎng)7天后，將培養(yǎng)皿倒置并置于室溫中繼續(xù)培養(yǎng)3-4周。然后用高溫滅菌的蒸餾水從培養(yǎng)皿蓋中收集擔(dān)孢子，再將這些擔(dān)孢子懸浮液稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，涂布到含有瓊脂20g/l-1和麥芽抽提物20g/l-1的培養(yǎng)皿中，室溫培養(yǎng)，在第二天或第三天，再將可見的擔(dān)孢子小菌落從培養(yǎng)皿中單孢分離，再用丁香醛連氮的方法篩選漆酶高活性菌株，得到血紅密孔菌mk528。
實(shí)施例2、發(fā)酵培養(yǎng)血紅密孔菌mk528生產(chǎn)漆酶一、血紅密孔菌mk528的發(fā)酵固體種子培養(yǎng)基2％麥芽抽提物，2％瓊脂。
發(fā)酵培養(yǎng)基麥芽糖15g，酒石酸銨2g，KH2PO41.333g，NaH2PO4·12H2O 0.39g，MgSO4·7H2O 0.5g，琥珀酸鈉(CH2COONa)2·6H2O 1.18g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.0315g，CaCl2·2H2O0.1g，MnSO4·H2O 0.035g，CH3COONa·3H2O 0.408g，CoCl2·6H2O 0.06g，ZnSO4·7H2O 0.028g，CuSO4·5H2O 0.168g，小麥麩皮6g，Tween-80 1ml，維生素B110μg，維生素B25μg，維生素B65μg，加水至1L，在8磅高壓濕熱滅菌30分鐘。
將血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus(LFr)Murr.(MK528))接種至固體種子培養(yǎng)基上。30℃下培養(yǎng)6-8天。取菌落最邊沿的菌塊(直徑1cm，10塊)，接種到裝有100ml的經(jīng)高壓濕熱滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，在30℃和200rpm搖床中避光培養(yǎng)。培養(yǎng)至第4天加入誘導(dǎo)物2，5二甲基苯胺(2，5-Dimethylaniline)，使其終濃度為10μM，再培養(yǎng)8天，收取發(fā)酵液，測其酶活為63U/ml。
二、漆酶的提取取發(fā)酵液，5000rpm離心除去發(fā)酵沉淀物，取上清液經(jīng)真空抽濾，獲得的抽濾液經(jīng)PLGC膜(10000D)超濾，收集超濾濃縮液。隨后采用兩步硫酸銨沉淀法沉淀濃縮液第一步用35％(W/V)的飽和硫酸銨在4℃下攪拌沉淀，10000rpm離心1小時，棄沉淀，留上清；第二步向第一步所得的上清液加80％(W/V)的飽和硫酸銨，在4℃下攪拌沉淀，4℃靜至2小時，然后10000rpm離心1小時，棄上清，留沉淀。將第二步得到的沉淀用兩倍體積的100mM磷酸鉀緩沖液(pH 5.7)溶解，在10mM的磷酸鉀緩沖液中進(jìn)行透析過夜，得到粗漆酶制劑。其中超濾步驟得率為81.82％，硫酸銨沉淀步驟得率為88.89％，磷酸鉀緩沖液透析得率為96.46％。
取10ml所得粗漆酶制劑用于離子交換柱層析純化。離子交換介質(zhì)選用DEAESepharose F.F.，平衡緩沖液為20mM的組氨酸緩沖液(pH6.0)。洗脫過程采用梯度洗脫，梯度為0.1-0.6M NaCl的組氨酸洗脫液，流速為1mL/分鐘。將收集到的漆酶部分經(jīng)過Sephadex G-100，所用洗脫液為水，流速為0.5mL/分鐘。然后將漆酶收集液冷凍干燥，得藍(lán)色漆酶。
本實(shí)施例中，漆酶活力的測定采用國際通用的2，2’-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS){2，2'-azino-bis-[3-ethylthiazoline-6-sulphonate]}方法來測定。
酶活力的計算公式為U＝ΔA·V/(ε·L·T)在上述公式中，ΔA表示紫外分光光度計吸收值的變化，V表示反應(yīng)體系的體積(單位ml)，ε＝3.6×104M·cm-1＝36(μmol/ml)-1·cm-1，為氧化型ABTS的摩爾消光系數(shù)，L為比色皿的光徑(單位cm)，T為反應(yīng)的時間(單位分鐘)。
本發(fā)明中酶活力測定條件為反應(yīng)體積V＝1mL，比色皿的光徑L＝0.5cm，反應(yīng)時間T＝30秒。其中反應(yīng)體系的體積1mL內(nèi)含有的500μL 50mM的酒石酸緩沖液(pH 4)，390μL的水，100μL500μM的ABTS和10μL的發(fā)酵液，選用波長為420nm。如果發(fā)酵液中漆酶活力太高，可適當(dāng)稀釋。
權(quán)利要求
1.血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528 CGMCC № 1124。
2.一種漆酶，是發(fā)酵血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528 CGMCC № 1124得到的。
3.一種生產(chǎn)漆酶的方法，包括發(fā)酵培養(yǎng)血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528 CGMCC № 1124，和從發(fā)酵培養(yǎng)基中提取漆酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)漆酶的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)在有氧和避光條件下進(jìn)行；發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括麥芽糖、酒石酸銨和無機(jī)組分，所述無機(jī)組分包括硫酸亞鐵、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅、氯化鈣和氯化鈷。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)漆酶的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基由下列物質(zhì)組成，麥芽糖1.0-2.0％；酒石酸銨0.1-0.3％，KH2PO40.132-0.134％；NaH2PO4·12H2O0.038-0.040％；MgSO4·7H2O0.04-0.06％；琥珀酸鈉(CH2COONa)2·6H2O0.117-0.119％；FeSO4·7H2O0.00314-0.00316％；CaCl2·2H2O0.009-0.011％；MnSO4·H2O0.0034-0.0036％；CH3COONa·3H2O0.0407-0.0409％；CoCl2·6H2O0.005-0.007％；ZnSO4·7H2O0.0027-0.0029％；CuSO4·5H2O0.0167-0.0169％；小麥麩皮5-7克；Tween-800.9-1.1ml；VitaminB110μg；VitaminB25μg；VitaminB65μg，加水至1升，其中，所述的百分比是以水為基質(zhì)的固體重量對水體積的百分比。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的生產(chǎn)漆酶的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)3-5天后向培養(yǎng)基中加入2，5-二甲基苯胺。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生產(chǎn)漆酶的方法，其特征在于所述加入2，5二甲基苯胺的量為10μM。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)漆酶的方法，其特征在于，所述從發(fā)酵培養(yǎng)基中提取漆酶包括以下步驟離心分離、超濾濃縮、硫酸銨分級沉淀、離子交換柱和凝膠過濾柱。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的生產(chǎn)漆酶的方法，其特征在于所述超濾濃縮用截留分子量為10000萬道爾頓的超濾柱超濾；所述硫酸銨分級沉淀采用兩步硫酸銨沉淀的硫酸銨飽和度分別為30％～40％和70％～90％。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種漆酶及其生產(chǎn)方法與專用生產(chǎn)菌株，涉及微生物發(fā)酵工業(yè)領(lǐng)域。本發(fā)明所提供的菌株為血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528 CGMCC №1124。本發(fā)明所提供的漆酶，是發(fā)酵血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528 CGMCC № 1124得到的。生產(chǎn)漆酶的方法，包括發(fā)酵培養(yǎng)血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528 CGMCC № 1124，和從發(fā)酵培養(yǎng)基中提取漆酶。本發(fā)明所提供的血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)mk528 CGMCC № 1124經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，得到的發(fā)酵液漆酶酶活高達(dá)63U/ml；而且該菌株在培養(yǎng)過程中不產(chǎn)生木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶，便于漆酶的提取，提取得到的漆酶可廣泛應(yīng)用于造紙廢水處理，和木材加工行業(yè)中取代甲醛等化學(xué)藥品。
文檔編號C12N1/00GK1690186SQ20041003401
公開日2005年11月2日 申請日期2004年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月21日
發(fā)明者郭林, 王文惠, 張虎成, 李偉 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所