專利名稱：一種含(Arg)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種抗癌胚抗原的重組免疫毒素。具體地講，涉及一種含9個(gè)精氨酸肽段(Arg)9的基于假單胞菌外毒素的抗癌胚抗原的重組免疫毒素，編碼連接外毒素和抗癌胚抗原連接肽的核苷酸序列，含有所述序列的表達(dá)載體和含有這種表達(dá)載體的宿主細(xì)胞以及在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
某些細(xì)菌和植物產(chǎn)生的毒素與生長因子、抗體或其它具靶向細(xì)胞作用的分子相連可用于選擇性殺死攜帶相應(yīng)受體或抗原的靶細(xì)胞(Pastan等，1986；Vitetta等，1987；)。在這一類毒素中假單胞菌外毒素A(pseudomonas exotoxin A，PE)是一種具有極高活性的單體蛋白，以PE為基礎(chǔ)構(gòu)建的免疫毒素具有誘人的應(yīng)用前景。用以構(gòu)建免疫毒素的PE分子有多種形式，包括PE40、PE38、PE37、PE35及相應(yīng)的C末端為KDEL的改良形式(pastan等，1997)。免疫毒素發(fā)揮細(xì)胞殺傷作用的先決條件是免疫毒素的內(nèi)化作用(internalization)。某些抗體由于不能有效地引發(fā)抗體抗原結(jié)合后的受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(receptor-mediatedendocytosis)，因此構(gòu)建的免疫毒素活性不高，或者甚至不能作為免疫毒素的候選抗體，從而使免疫毒素的應(yīng)用范圍受到一定的限制(Matthew等，2000)。
PE是一個(gè)由綠膿桿菌(Pseudomonas areuginosa)分泌的由613個(gè)氨基酸組成的單鏈分子，由三個(gè)結(jié)構(gòu)域Domain I、Domain II、Domain III組成，其中Domain I分為a、b兩部分。Ia(1-252)為結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與真核細(xì)胞表面的α2巨球蛋白受體特異性結(jié)合；II(253-364)為轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域，在毒素跨越內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進(jìn)入胞質(zhì)的過程中發(fā)揮作用；III(400-613)為催化結(jié)構(gòu)域，包含ADP核糖基化酶，在NAD+的共同作用下導(dǎo)致真核細(xì)胞內(nèi)的延伸因子2(EF2)核糖基化而失活，引起細(xì)胞內(nèi)蛋白合成的抑制，促發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。Ib(365-399)將II和III兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分隔開來，功能不明。PE分子的C末端609-613的5個(gè)氨基酸REDLK是PE分子進(jìn)入細(xì)胞后與高爾基體中的KDEL受體結(jié)合必需的序列，使PE能有效地由高爾基體反相進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Hwang等，1987；Allured等，1986)。PE38是將PE分子的Ia和Ib中365-380氨基酸去掉后的一種截短形式。PE38KDEL是在PE38的基礎(chǔ)上將天然PE分子C末端的REDLK序列改為KDEL序列，從而使PE分子更有效地與KDEL受體結(jié)合，從而提高其生物學(xué)活性(Brinkmann等，1991)。PE35/KDEL是在PE38/KDEL的基礎(chǔ)上將253~279和365~380的氨基酸序列截去，去掉了毒素中的二硫鍵，使得毒素在進(jìn)入細(xì)胞后不用經(jīng)過胞內(nèi)蛋白酶解的作用而直接發(fā)揮催化活性，使活性提高(Mansfield等，1996)(圖1.A)。
免疫毒素發(fā)揮殺傷靶細(xì)胞生物作用的先決條件是免疫毒素能有效而快速地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，即免疫毒素的內(nèi)化作用。通常免疫毒素的內(nèi)化是由配體與受體結(jié)合后引起的受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用引發(fā)的。抗體的內(nèi)化受多種因素的影響受體類型；結(jié)合表位；內(nèi)化效率；內(nèi)吞小體內(nèi)藥物的釋放；抗原與抗體分離后有效的重新錨定于膜上。某些配體與受體的結(jié)合能有效地促進(jìn)其內(nèi)化，例如EGF受體，ErbB2受體，轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)受體等；某些抗原抗體的結(jié)合也能引發(fā)抗體的內(nèi)化，但速率較慢，例如神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(NCAM)，前列腺特異性的膜抗原(PSMA)，癌胚抗原(CEA)以及粘蛋白等；而大多數(shù)的抗體抗原結(jié)合不能引發(fā)有效的抗體內(nèi)化(Ulrik等，2000)。這就使免疫毒素的應(yīng)用范圍大大受到限制。目前較為成功地應(yīng)用于臨床的免疫毒素絕大多數(shù)集中在幾類能快速有效內(nèi)化的受體上。癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)是1965年Gold和Freedman首先從胎兒及結(jié)腸癌組織中發(fā)現(xiàn)的。CEA屬于非器官特異性腫瘤相關(guān)抗原，分泌CEA的腫瘤大多位于空腔臟器，如胃腸道、呼吸道、泌尿道等。因此，針對CEA的免疫毒素可用于對多種腫瘤的靶向治療。然而由于CEA是一種內(nèi)化速率緩慢的抗原，使得抗CEA免疫毒素的生物活性不能達(dá)到較高的水平，從而限制了它的臨床應(yīng)用。
某些蛋白包含某種使蛋白通過質(zhì)膜而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的活性轉(zhuǎn)位亞單位。典型的例子就是HIV-1蛋白的基本結(jié)構(gòu)域的Tat48-67(RKKRRQRRR)氨基酸序列構(gòu)成的亞單位(Lindgren等，2000；Jeang等，1999)。為了建立跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)所需的優(yōu)化的亞結(jié)構(gòu)，開發(fā)能將各類分子運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)的傳輸分子，研究者們構(gòu)建了一系列的Tat48-67的類似分子。它們的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能已經(jīng)在Jurkat細(xì)胞中得到了證實(shí)。通過對一系列類似分子的研究表明，Tat48-67中帶正電荷的氨基酸殘基在跨膜運(yùn)輸中發(fā)揮主要作用。然而僅有電荷作用是不夠的，同樣是帶正電荷的氨基酸殘基，組氨酸、賴氨酸和鳥氨酸構(gòu)成的肽段，其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的效率大大低于Tat48-67；相反，一種由9個(gè)L-型精氨酸殘基構(gòu)成的肽段(R9)的跨膜運(yùn)輸效率是Tat48-67的20倍；由9個(gè)D-型精氨酸殘基構(gòu)成的肽段(r9)的跨膜運(yùn)輸效率是Tat48-67的100倍以上(Wender等，2000)。這些研究表明Tat48-67中的精氨酸殘基組分在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能中發(fā)揮著比電荷作用和氨基酸主鏈結(jié)構(gòu)更為重要的作用。因此，精氨酸豐富的肽段可用于將各類分子運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)部。
以上背景技術(shù)涉及有關(guān)的引文，其詳細(xì)出處見本發(fā)明具體實(shí)施方案之后的參考文獻(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
基于背景技術(shù)所述，大多數(shù)的抗體抗原結(jié)合不能引發(fā)有效的抗體內(nèi)化。CEA是一種內(nèi)化速率緩慢的抗原，使得抗CEA免疫毒素的生物活性不能達(dá)到較高的水平，從而限制了它的臨床應(yīng)用，這就使免疫毒素的應(yīng)用范圍大大受到限制。某些抗體由于不能有效地引發(fā)抗體抗原結(jié)合后的受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，因此構(gòu)建的免疫毒素活性不高，或者甚至不能作為免疫毒素的候選抗體，從而也使免疫毒素的應(yīng)用受到一定的限制。
針對目前存在的上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種由抗CEA單鏈抗體與截短并改造的假單胞菌外毒素PE35/KDEL構(gòu)成的，并在毒素的607位氨基酸與單鏈抗體之間加入不同連接肽，能將內(nèi)化作用較弱的抗CEA免疫毒素快速而有效地運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)，顯著提高其殺傷靶細(xì)胞作用的一種新型抗CEA免疫毒素?？笴EA的單鏈抗體片段基因是由文獻(xiàn)報(bào)道(參考文獻(xiàn)11)的抗CEA單克隆抗體的VH和VL部分氨基酸序列，以重復(fù)性連接肽(G4S)3連接，反向翻譯成核苷酸序列，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室合成、拼接而成。
本發(fā)明具體地提供了所述抗CEA單鏈抗體與毒素之間的連接肽的氨基酸序列和其編碼該連接肽氨基酸的核苷酸序列。
連接肽氨基酸序列分別如下所示(Gly4Ser)2連接肽Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser；(Arg)9(Gly4Ser)2連接肽Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly GlyGly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。
所述的編碼連接肽的核苷酸序列，不限于、但其中包括如下所示核苷酸序列編碼(Gly4Ser)2連接肽的核苷酸序列GGC GGC GGC GGC ACG GGT GGT GGT GGT AGC編碼(Arg)9(Gly4Ser)2連接肽的核苷酸序列CGC CGC CGT CGT CGC CGC CGC CGC CGT GGC GGC GGC GGC ACG GGT GGT GGTGGT AGC本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種含有如上所述的核苷酸序列的表達(dá)載體，它們分別是如圖2所示的表達(dá)載體pCIT35g、pCIT35a。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種含有如上所述的核苷酸序列的或pCIT35g或pCIT35a表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。其中之一，宿主細(xì)胞選自大腸桿菌E coli。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種用于治療腫瘤的藥物，其中之一，如上所述的抗CEA免疫毒素，或者說是提供一種按照本發(fā)明有關(guān)技術(shù)步驟，在制備治療腫瘤藥物的方法，該方法可以在制備治療腫瘤相關(guān)抗原藥物，如鼻咽癌和結(jié)腸癌藥物中應(yīng)用。
另外，在本申請的上下文的公開內(nèi)容的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的其它方面對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。
本發(fā)明所涉及的以假單胞菌外毒素免疫毒素A(Pseudomonas exotoxinA，PE)的截短形式PE35為基礎(chǔ)構(gòu)建的重組免疫毒素，其PE35是PE的一種截短形式。在天然PE的基礎(chǔ)上將結(jié)合結(jié)構(gòu)域Domain Ia(1～252)以及轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域Domain II(253~364)中的253～279的氨基酸序列截去，去掉了毒素內(nèi)的二硫鍵，使免疫毒素進(jìn)入細(xì)胞后無需經(jīng)過蛋白酶降解的過程，而直接以活性形式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。PE35/KDEL是將PE35的C末端氨基酸序列由REDLK突變?yōu)镵DEL的形式，可提高毒素與高爾基體上的受體結(jié)合的效率，使毒素能更有效地反向進(jìn)入到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，進(jìn)而轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)中發(fā)揮生物學(xué)作用(圖1.A)。以PE35為基礎(chǔ)構(gòu)建的免疫毒素由于無需經(jīng)過蛋白酶切的過程，使其活性較之相應(yīng)的PE38免疫毒素大大提高。在PE35免疫毒素中，抗體分子通常是以化學(xué)耦(偶)聯(lián)和基因重組兩種形式與毒素相連的。對于用單鏈抗體(scFv)構(gòu)建的免疫毒素多以基因重組的形式構(gòu)建而成。PE35免疫毒素中，單鏈抗體基因通常位于毒素的607位氨基酸的下游，再緊接604～613位的氨基酸序列，這種形式的插入被證明不影響毒素功能的發(fā)揮(圖1.B)。
用于構(gòu)建免疫毒素的抗體分子大多在與相應(yīng)的抗原或受體結(jié)合后引發(fā)快速而有效的受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(Receptor-mediatedendocytosis)，這也是免疫毒素發(fā)揮生物學(xué)功能的先決條件。對于大多數(shù)不能有效而快速內(nèi)化的抗體來說，免疫毒素的活性就會大打折扣。癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)是一種內(nèi)化速率比較緩慢的抗原。本發(fā)明構(gòu)建的一種抗CEA PE35免疫毒素是在編碼毒素的607位氨基酸的基因下游直接插入抗CEA單鏈抗體的基因片段，再緊接編碼604～613位氨基酸序列的基因。這種形式的免疫毒素與相應(yīng)的PE38免疫毒素相比，活性并無提高，且略有下降。原因主要是抗體序列位于毒素內(nèi)部，抗原結(jié)合活性受到影響，內(nèi)化作用降低，引起活性的下降。在抗體與毒素607位氨基酸之間加入連接肽(Gly4Ser)2后，抗體的結(jié)合活性得到改善，殺傷活性與PE38免疫毒素區(qū)別不大。說明抗CEA抗體與抗原結(jié)合后引發(fā)的內(nèi)化作用不明顯。
本發(fā)明所提供的一種以假單胞菌外毒素免疫毒素A(Pseudomonasexotoxin A，PE)的截短形式PE35為基礎(chǔ)構(gòu)建的重組免疫毒素，是在毒素的607位氨基酸與抗體序列之間插入(Arg)9(Gly4Ser)2，既保持抗原結(jié)合活性和特異性不受影響，又顯著提高了免疫毒素的內(nèi)化效率，使免疫毒素的細(xì)胞殺傷活性顯著提高，本發(fā)明與相應(yīng)未經(jīng)改造的PE35免疫毒素相比活性大大的提高，具有顯著的技術(shù)進(jìn)步。本發(fā)明可應(yīng)用于自身不能有效內(nèi)化的被認(rèn)為不適合構(gòu)建為免疫毒素的抗體，使免疫毒素的可應(yīng)用范圍大大提高，具有很好的實(shí)用性。
目前，國內(nèi)外未見到有與本發(fā)明相同的報(bào)道。


附圖1.不同形式的PE和以PE為基礎(chǔ)構(gòu)建的抗CEA免疫毒素的結(jié)構(gòu)示意圖1.A.假單胞菌外毒素及其截?cái)喔脑煨问降慕Y(jié)構(gòu)示意圖(a)PE；(b)PE38/KDEL；(c)PE35/KDEL1.B.以PE38/KDEL和PE35/KDEL為基礎(chǔ)構(gòu)建的抗CEA免疫毒素的結(jié)構(gòu)示意圖上CEA(Fv)/PE38/KDEL；下PE35/CEA(Fv)/KDEL附圖2.質(zhì)粒pCIT35、pCIT35g、pCIT35a的結(jié)構(gòu)示意圖附圖3.表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和western blotting分析圖3.A.表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析APE35/GS/CEA(Fv)/KDEL；BPE35/r9/CEA(Fv)/KDEL圖3.B.表達(dá)產(chǎn)物包涵體洗滌的SDS-PAGE分析a蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；b表達(dá)產(chǎn)物超聲上清；c表達(dá)產(chǎn)物超聲沉淀；d洗滌后的包涵體圖3.C.表達(dá)產(chǎn)物的western blotting分析aPE35/GS/CEA(Fv)/KDEL；bPE35/r9/CEA(Fv)/KDELc預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)附圖4.流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞結(jié)合活性附圖5.不同形式的抗CEA免疫毒素內(nèi)化的共聚焦顯微圖像ACEA(Fv)/PE38/KDEL BPE35/CEA(Fv)/KDELCPE35/GS/CEA(Fv)/KDEL DPE35/r9/CEA(Fv)/KDEL附圖6.不同作用時(shí)間及不同作用溫度下PE35/r9/CEA(Fv)/KDEL的內(nèi)化效果的共聚焦顯微圖像；A37℃0.5hr、B37℃1h、C37℃2h、D4℃2h左FITC染色；中PI染色；右疊加圖像附圖7.不同形式的抗CEA PE35免疫毒素對人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的殺傷作用附圖8.PE35/r9/CEA(Fv)/KDEL對不同腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
設(shè)計(jì)合成適當(dāng)大小的核苷酸片段，通過重疊PCR擴(kuò)增得到(Arg)9(Gly4Ser)2的基因序列，并在末端引入適當(dāng)酶切位點(diǎn)。將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，插入經(jīng)相應(yīng)酶切后的PE35/CEA(Fv)/KDEL表達(dá)載體pCIT35中，構(gòu)建含連接肽(Gly4Ser)2的免疫毒素PE35/GS/CEA(Fv)/KDEL的表達(dá)載體pCIT35g和含連接肽(Arg)9(Gly4Ser)2的免疫毒素PE35/r9/CEA(Fv)/KDEL的表達(dá)載體pCIT35a。用構(gòu)建好的表達(dá)載體pCIT35a和pCIT35g的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞大腸桿菌菌株BL21(DE3)star。挑取陽性克隆菌轉(zhuǎn)接到含氨芐青霉素100μg/ml的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD550為0.5左右，向培養(yǎng)物中加入終濃度為0.4mmol/l的IPTG，誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時(shí)。收集表達(dá)產(chǎn)物，超聲破碎菌體，12000rpm離心10min，上清和沉淀分別進(jìn)行12％SDS-PAGE分析和western印跡分析。表達(dá)的包涵體經(jīng)過洗滌過程，變性后經(jīng)稀釋和變性劑濃度梯度透析相結(jié)合的方法復(fù)性。產(chǎn)物進(jìn)行生物學(xué)活性的鑒定，包括流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面抗原結(jié)合活性，間接免疫熒光共聚焦顯微技術(shù)鑒定產(chǎn)物的內(nèi)化性質(zhì)，四唑鹽(MTT)法鑒定細(xì)胞殺傷活性。具體操作流程如下實(shí)施例1、表達(dá)載體pCIT35的構(gòu)建PE35KDEL是PE分子的一種截短和改造形式，它的基因片段是以PE38的基因(來自載體pMS8-38f+T，由NIH Brinkmann博士惠贈)為模板，設(shè)計(jì)如下引物(1)Nde355’-gACATATgTgggAACAACTggAgCAgTgC-3’和(2)EcoR5’-CAggAATTCATATTCgATTgggCTg-3’擴(kuò)增改造得到的。
在PE35KDEL的編碼607位氨基酸的核苷酸序列位點(diǎn)之后用XhoI和SacI的酶切位點(diǎn)，插入抗CEA單鏈抗體的基因片段，得到PE35/CEA(Fv)KDEL的基因片段。pCIT35是在通用表達(dá)載體pET21a(+)(Novagen公司)的基礎(chǔ)上將PE35/CEA(Fv)/KDEL的基因片段插入到NdeI，EcoRI雙酶切位點(diǎn)中構(gòu)建而成(圖2.A)。
實(shí)施例2、表達(dá)載體pCIT35a的構(gòu)建本表達(dá)載體在pCIT35的基礎(chǔ)上將含有(Gly4Ser)2連接肽核苷酸序列的引物以pCIT35質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出含(Gly4Ser)2且5’端含SacII，，3’端含XhoI的核苷酸片段，雙酶切后插入經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶消化的pCIT35載體中，構(gòu)建成表達(dá)載體pCIT35g(圖2.B)。將含有(Arg)9(Gly4Ser)2連接肽核苷酸序列的引物以pCIT35質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出含(Arg)9(Gly4Ser)2且5’端含SacII，3’端含XhoI的核苷酸片段，雙酶切后插入經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶消化的pCIT35載體中，構(gòu)建成表達(dá)載體pCIT35a(圖2.C)。
設(shè)計(jì)合成4個(gè)寡核苷酸片段，SacFor5’-CACCCgCggCACgCAgAACT-3’ 20ntsGSArg15’- ACGACGGCGGCGATCGATCGGTTTGCCGGG-3’ 48ntsGSArg25’-CCGCTCGAGGCTACCACCACCACCCGTGCCGCCGCC -3’ 54ntsGS5’-CCGCTCGAGGCTACCACCACCACCCGTGCCGCCGCCGCCAATCGATCGGTTTGCCGGG-3’ 58nts下劃線標(biāo)記酶切位點(diǎn)；陰影部分為重疊PCR中互補(bǔ)的核苷酸序列。
1.載體pCIT35質(zhì)粒的提取采取堿法小量提取質(zhì)粒挑取pCIT35轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌TOP10后的陽性克隆的單菌落于5ml LB培養(yǎng)液(含Amp 100μg/ml)中37℃培養(yǎng)過夜，12000rpm離心1分鐘收集菌體。沉淀懸于100μlSolutionI(50mmol/l Glucose，10mmol/l EDTA，25mmol/l Tris pH8.0)中，充分混勻。加入200μl新配制的SolutionII(0.2mol/l NaOH，1％SDS)，蓋緊管蓋，輕柔的顛倒4-5次，將離心管至于冰浴中放置3分鐘。加入150μl預(yù)冷的SolutionIII(3mol/l Kac，pH4.8)，反復(fù)顛倒數(shù)次，于冰浴放置5分鐘。4℃，12000rpm離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)入另一離心管中。加等量體積的酚∶氯仿(1∶1)，振蕩混合有機(jī)相和水相，于4℃以12000rpm離心2分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。用2倍體積的乙醇于室溫沉淀核酸，振蕩混合，于室溫放置2分鐘。于4℃，12000rpm離心5分鐘，收集核酸沉淀。小心吸去上清液，將離心管倒置于紙巾上，以使所有液體流出排干。加1ml70％乙醇于沉淀中，洗滌DNA沉淀，沉淀干燥后溶于50μlddH2O中。
2.重疊PCR擴(kuò)增含連接肽序列的核苷酸片段2.1 編碼含Arg9(Gly4Ser)2連接肽的核苷酸序列的擴(kuò)增以pCIT35質(zhì)粒為模板采取兩步擴(kuò)增得到全長片段。第一步以SacFor和GSArg1為上下游引物各10pmol加入離心管中，加入質(zhì)粒模板1μl，10×PCR buffer 2μl，2μldNTPs(2mmol/l)，0.2μl pfu DNA聚合酶(5u/μl)，用ddH2O補(bǔ)足總體積至20μl，混勻，進(jìn)行30輪PCR循環(huán)94℃變性1分鐘，55℃退火30秒，72℃延伸40秒。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，利用申能博彩瓊脂糖凝膠DNA回收Kit，回收所需的DNA片段。以回收的DNA片段為模板加入10pmol于離心管中，加入引物SacFor和GSArg2各10pmol，10×PCR buffer 2μl，2μldNTPs(2mmol/l)，0.2μlpfu DNA聚合酶(5u/μl)，用ddH2O補(bǔ)足總體積至20μl，混勻，進(jìn)行30輪PCR循環(huán)94℃變性1分鐘，55℃退火30秒℃，72℃延伸40秒。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，利用申能博彩瓊脂糖凝膠DNA回收Kit，回收所需的DNA片段。
2.2 編碼含(Gly4Ser)2連接肽的核苷酸序列的擴(kuò)增以pCIT35質(zhì)粒為模板采取兩步擴(kuò)增得到全長片段。第一步以SacFor和GS為上下游引物各10pmol加入離心管中，加入質(zhì)粒模板1μl，10×PCR buffer 2μl，2μldNTPs(2mmol/l)，0.2μl pfu DNA聚合酶(5u/μl)，用ddH2O補(bǔ)足總體積至20μl，混勻，進(jìn)行30輪PCR循環(huán)94℃變性1分鐘，55℃退火30秒，72℃延伸40秒。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，利用申能博彩瓊脂糖凝膠DNA回收Kit，回收所需的DNA片段。
3.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶消化及純化用SacII和XhoI對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行消化取約1μg DNA片段在40μl反應(yīng)體系中(1×buffer K，30u的SacII和30u的XhoI)，37℃酶解4小時(shí)，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測消化完全后，在長波紫外燈下切膠回收所需的條帶，參照申能博彩生物技術(shù)公司膠回收kit說明，用柱回收和純化所需的酶切片段。
4.載體質(zhì)粒pCIT35的限制性內(nèi)切酶消化及純化用SacII和XhoI對載體DNA進(jìn)行消化取1μg質(zhì)粒在40μl反應(yīng)體系中(1×Buffer K，30u的SacII和30u的XhoI)，37℃酶解4小時(shí)，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測消化完全后，在長波紫外燈下切膠回收所需的條帶，參照申能博彩生物技術(shù)公司膠回收kit說明，用柱回收和純化所需的酶切片段。
5.DNA連接反應(yīng)取回收的雙酶切pCIT35約40ng，雙酶切PCR片段20ng，加入2μl10×T4連接酶(約20u)，加ddH2O至總體積20μl，混勻，16℃連接過夜。
6.感受態(tài)細(xì)胞的制備用氯化鈣制備大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞從培養(yǎng)平板上挑取單克隆，轉(zhuǎn)接在5ml培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)過夜。按1∶100的比例轉(zhuǎn)接至20~40ml無抗生素培養(yǎng)基中，快速振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4~0.6時(shí)，冰浴15分鐘。4℃4000rpm離心10分鐘收集菌體，棄上清，加入20ml預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2，重懸混勻，冰浴40分鐘。4℃4000rpm離心10分鐘，棄上清后加入預(yù)冷的含15％甘油0.1mol/L CaCl21~2ml，輕輕懸起菌體，分裝。存于-80℃。
7.重組DNA的轉(zhuǎn)化，陽性克隆的篩選及測序鑒定在200μl感受態(tài)細(xì)胞中加入10μl連接混合物，混勻。冰浴30分鐘，42℃熱激100秒， 然后迅速冰浴2分鐘。加入0.8ml LB培養(yǎng)基，37℃輕搖(＜150rpm)45分鐘復(fù)蘇，10,000rpm離心1分鐘，棄上清，加100～200μlLB培養(yǎng)基重懸沉淀，涂布于含Amp 100μg/ml的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取平板上生長的單菌落，采用堿法小量提取質(zhì)粒，分別用SacII和XhoI雙酶切；SacFor，GSArg2為引物的PCR鑒定插入外源片段的質(zhì)粒。將鑒定后的質(zhì)粒送博亞生物技術(shù)公司測序鑒定，鑒定后測序正確的陽性質(zhì)粒pCIT35a。
實(shí)施例3、含不同連接肽的抗CEA免疫毒素的表達(dá)1.免疫毒素的表達(dá)表達(dá)載體質(zhì)粒pCIT35a和pCIT35g轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli菌株BL21(DE3)star，(Novagen公司)挑取單克隆于LB(含100μg/ml Amp)培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)過夜。以10％的比例轉(zhuǎn)接，37℃生長至OD600約0.6-0.8，加入IPTG至終濃度為0.4mmol/ml，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，離心收集菌體。菌體重懸于超聲緩沖液中，凍融三次，離心，12000rpm，30分鐘。沉淀重懸于超聲緩沖液中，冰浴超聲。離心收集上清和沉淀，進(jìn)行12％SDS-PAGE分析。
聚丙烯酰胺的配制參見下表1濃縮膠5 分離膠12 封口膠％ ％30％Acr/Bis(29∶1)(ml) 0.5 6.0 0.535M Tris-HCl(pH8.8)(ml) -3.8 -1.0M 0.38 - 0.5Tris-HCl(pH6.8)(ml)0.03 0.15 0.0210％SDS(ml)0.03 0.15 0.0210％AP(ml) 0.0030.006 0.0012TEMED(ml) 2.1 4.9 0.93ddH2O樣品的處理適量蛋白樣品與等體積的2×SDS凝膠加樣緩沖液(100mmol/Tris-HCl pH6.8，200mmol/DTT，4％SDS，0.2％溴酚藍(lán)，20％甘油)混合，沸水浴加熱5分鐘，待上樣。
電泳電泳緩沖液25mmol/Tris-HCl，pH8.3，0.1％SDS。取適量體積的樣品上樣，恒壓60V，待樣品進(jìn)入分離膠，恒壓120V。
染色及脫色采用考馬斯亮藍(lán)R250染色(0.25g考馬斯亮藍(lán)R250溶于100ml甲醇-冰乙酸溶液中(90ml甲醇∶水(1∶1，v/v)和10ml冰乙酸)，室溫染色6-12小時(shí)。用甲醇-冰乙酸溶液脫色，室溫脫色至具有明顯條帶，照相，結(jié)果參見附圖3.A，兩種免疫毒素在分子量標(biāo)準(zhǔn)的66kDa左右有明顯蛋白條帶。
Western印跡上述SDS-PAGE分離的樣品用amersham pharmacia biotech的Hoefer TE 22 Mighty SmallTMTransphor Tank Transfer Unit裝置，在轉(zhuǎn)移緩沖液(39mmol/甘氨酸，40mmol/l Tris堿，0.03％SDS，20％甲醇)400mA轉(zhuǎn)移1.5小時(shí)，將轉(zhuǎn)印后的膜放入封閉液中封閉2小時(shí)(封閉液5％脫脂牛奶溶解于TBS中(TBS100mmol/l Tris-HCl，pH7.5，0.9％NaCl)，用TBST(含0.1％Tween 20的TBS)洗三遍，每次5分鐘。與按1∶1000稀釋于TBS中的抗E-tag小鼠單克隆抗體室溫結(jié)合1小時(shí)，TBST洗三次。再加入按1∶5000比例稀釋于TBS中的HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體室溫結(jié)合1小時(shí)，TBST洗5遍。最后在底物顯色液中(6mg/ml DAB，1％H2O2)顯色5-15分鐘，拍照，結(jié)果見附圖3.C。
2.包涵體的復(fù)性包涵體經(jīng)洗滌(50mM Tris-HC，pH8.0；50mM Tris-HC，pH8.0，10mMEDTA和2％Triton各一次，每次30分鐘)后，純度可明顯提高(圖3.B)。洗滌后的包涵體蛋白溶解于包涵體裂解液(10mM pH7.2磷酸鈉緩沖液，8M尿素)中，37℃裂解1小時(shí)，12,000rpm離心30分鐘，取上清。變性蛋白透析到含4M尿素的10mM pH7.2磷酸鈉緩沖液，然后用稀釋復(fù)性液稀釋10倍，4℃放置過夜使蛋白復(fù)性。將復(fù)性的蛋白溶液裝入透析袋對PBS溶液透析過夜，12,000rpm離心20分鐘，取上清，測定蛋白濃度，分裝，4℃貯存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例4、免疫毒素的活性測定3.免疫毒素細(xì)胞結(jié)合活性的測定采用間接熒光標(biāo)記的方法，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測抗CEA免疫毒素對靶細(xì)胞的結(jié)合活性。105個(gè)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2分別與10μg/ml的免疫毒素200μl于4℃孵育90min，未加樣品的細(xì)胞作對照組，PBA(1％BSA/PBS)洗三次。加入按1∶1000稀釋后的鼠抗E-tag單克隆抗體200μl 4℃孵育60min，PBA洗三次。加入200μl FITC-羊抗鼠Ig(1μg/106細(xì)胞)4℃孵育60min，PBA洗三次，流式細(xì)胞儀檢測。圖4結(jié)果表明，在抗體與毒素之間加入(Gly4Ser)2能有效提高免疫毒素的細(xì)胞結(jié)合活性，避免因抗體插入位置的改變引起的抗原結(jié)合能力的降低。
4.免疫毒素的內(nèi)化實(shí)驗(yàn)在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的孔內(nèi)放置蓋玻片，按每孔105個(gè)細(xì)胞將CNE-2細(xì)胞鋪于孔內(nèi)，于37℃，5％CO2過夜培養(yǎng)。傾盡培養(yǎng)液，在孔內(nèi)分別加入10μg/ml免疫毒素樣品1ml，設(shè)立對照孔，加入相同體積的PBA。于37℃溫育2h。PBA洗三次后，用pH4.0的Gly-HCl緩沖液洗三次，每次10min，以除去細(xì)胞表面抗原結(jié)合的免疫毒素。PBA洗三次后，用4％多聚甲醛于室溫固定5min，PBA洗三次。加入冰丙酮作用30s，PBA洗三次。加入按1∶1000稀釋后9E10腹水1ml 4℃孵育60min，PBA洗三次。加入1ml按1∶500稀釋的FITC-羊抗鼠Ig 4℃孵育60min，PBA洗三次。將蓋玻片從培養(yǎng)板中取出，倒扣于滴加有封片劑(90％甘油，10％PBS，5mM對苯二胺)的載玻片上，于共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。結(jié)果表明，在抗體與毒素之間插入Arg9肽段能有效的提高免疫毒素的內(nèi)化效率，并且在較短的時(shí)間及4℃均能有效發(fā)揮作用(圖5、6)。
3.免疫毒素的體外殺傷活性測定稀釋生長良好的表達(dá)CEA的腫瘤細(xì)胞CNE-2、SW1116及不表達(dá)CEA的人卵巢癌細(xì)胞SKOV3和人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1 105個(gè)/ml，每孔100μL鋪96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置5％CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在細(xì)胞接近鋪滿孔底表面時(shí)，加入不同濃度的免疫毒素，繼續(xù)培養(yǎng)48h。加入終濃度為0.5mg/ml四唑鹽(MTT)溶液溫育4h，傾盡培養(yǎng)液。附著于培養(yǎng)孔壁上的氧化態(tài)MTT紫色結(jié)晶以二甲基亞砜(DMSO)充分溶解，570nm測定光密度值。每種細(xì)胞均設(shè)死細(xì)胞和活細(xì)胞對照，其它步驟同上。腫瘤細(xì)胞殺傷效果由下列公式計(jì)算得出 圖7、8的結(jié)果表明，含Arg9的抗CEA/PE35免疫毒素對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷活性明顯提高。
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權(quán)利要求
1.一種抗CEA免疫毒素，其特征在于是由抗CEA單鏈抗體與截短并改造的假單胞菌外毒素PE35/KDEL構(gòu)成的，并在毒素的607位氨基酸與單鏈抗體之間加入不同連接肽，能將內(nèi)化作用較弱的抗CEA免疫毒素快速而有效地運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)，顯著提高其殺傷靶細(xì)胞作用的一種抗CEA免疫毒素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗CEA免疫毒素，其不同連接肽的氨基酸序列，其中包括(Gly4Ser)2連接肽Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly GlySer；或(Arg)9(Gly4Ser)2連接肽Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg ArgGly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。
3.一種編碼權(quán)利要求2所述連接肽的核苷酸序列。
4.編碼權(quán)利要求2所述的(Gly4Ser)2連接肽的核苷酸序列GGC GGC GGC GGC ACG GGT GGT GGT GGT AGC；編碼(Arg)9(Gly4Ser)2連接肽的核苷酸序列CGC CGC CGT CGT CGC CGC CGC CGC CGT GGC GGC GGC GGC ACG GGT GGTGGT GGT AGC。
5.一種含有根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的核苷酸序列的表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，是一種如圖2所示的表達(dá)載體pCIT35g或pCIT35a。
7.一種含有權(quán)利要求5或6所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌E coli。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8所述的，任選其中之一項(xiàng)在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的在制備鼻咽癌和結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用。
11.按照權(quán)利要求8或9所述權(quán)項(xiàng)要求制備的一種用于治療腫瘤的抗CEA免疫毒素藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于一種抗癌胚抗原的重組免疫毒素。具體地講，涉及一種含9個(gè)精氨酸肽段(Arg)
文檔編號C12N15/70GK1676531SQ20041003330
公開日2005年10月5日 申請日期2004年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月2日
發(fā)明者何丹, 黃華樑, 楊慧, 林晴, 尹長城, 張眾 申請人:北京安波特基因工程技術(shù)有限公司