專利名稱：禽流感病毒反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種禽流感病毒檢測的方法。
背景技術(shù)：
禽流感(AI)是由A型流感病毒引起的急性高度接觸性傳染病，特別是雞對AI有較高的易感性，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。國際獸醫(yī)局將其定為A類烈性傳染病，并被列入國際生物武器公約動物類傳染病名單。雖然各國對禽流感防止策略不盡相同，但都把禽流感的快速診斷和及時監(jiān)測作為首要步驟。
傳統(tǒng)AIV診斷方法主要有病毒分離培養(yǎng)、瓊脂擴散實驗(AGID)、間接血凝抑制實驗(HI)及病毒中和實驗(NT)等，但這些傳統(tǒng)的診斷方法操作煩瑣、診斷時間長、結(jié)果重復(fù)性不好等。特別是AIV亞型眾多，且新的變異株不斷出現(xiàn)，而制備血清型特異性單克隆抗體相對困難，陷限制了傳統(tǒng)方法在實際中的應(yīng)用。
RT-PCR檢測方法是近幾年發(fā)展起來的一種現(xiàn)代分子生物學(xué)基因診斷技術(shù)，具有特異、敏感、簡便、快捷等特點，能在數(shù)小時內(nèi)檢出痕量病原，目前用于AIV檢測的RT-PCR方法越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。
目前國外有關(guān)檢測流感病毒RT-PCR方法，用于人流感病毒的檢測報道較多，而用于AIV的檢測的報道相對較少，RT-PCR方法用于AIV檢測首次報道是在1986年P(guān)erdue等在接種雞胚的尿囊液中檢測AIV。近幾年隨著分子生物學(xué)的深入發(fā)展，用于AIV檢測的RT-PCR方法不斷得到改進(jìn)和報道。2001年Munch等報道了基于NP基因建立了一步RT-PCR和PCR-ELISA方法并比較了二者敏感性，后者比前者敏感100倍，但沒有報道臨床病料檢測效果。2002年Spackman等報道了基于AIV MP基因和HA基因分別建立了AIV通用型RRT-PCR方法，和H5、H7亞型RRT-PCR方法，均可檢測到100fgRNA；通過檢測不同來源的1,550份棉拭子，所建立的方法與傳統(tǒng)病毒分離培養(yǎng)(VI)和HI實驗進(jìn)行了比較，比較結(jié)果表明通用型RRT-PCR檢測方法與VI相關(guān)性89％；H5、H7亞型RRT-PCR檢測方法的敏感性、特異性與VI和HI檢測結(jié)果相當(dāng)。2003年Suarez等建立的AIV RRT-PCR檢測方法，作為禽流感綜合防治措施之一，不但能對感染的禽和環(huán)境樣本檢測而且還能對不同種類消毒藥消毒效果，環(huán)境凈化狀況作出判斷。
同時基于RT-PCR方法對AIV的變異和致病性分析國外也有報道。1991年Bashirudin等報道了擴增HA基因來分析致病毒株與非致病毒株的序列差異，顯示了其診斷和抗原分析應(yīng)用前景。1995年Horimoto等報道了判斷H5N1和H5N2亞型AIV的致病性RT-PCR方法，2001年Munch等報道了判斷H7、H5亞型AIV的致病性及分型檢測的一步RT-PCR方法，但對H7亞型的檢測時要借助通用型AIV的檢測輔證；2002年Berinstein等報道了建立RT-PCR HMA方法用于H5、H7亞型AIV的變異檢測和致病性變化分析；2003年Starick等報道H7亞型AIV巢式RT-PCR檢測方法，不但能從臨床病料，雞蛋中檢測到AIV而且還能夠區(qū)別出H7亞型的致病性高低；同年Danish等報道建立了用于低致病性AIV檢測一步RT-PCR-ELISA方法，檢測了419份棉拭子，敏感性、特異性分別達(dá)到了91％和97％。通過RT-PCR檢測方法，判定AIV致病性高低和變異情況分析具有安全，確切、快速等優(yōu)點。
我國學(xué)者催尚金，劉澤文等先后根據(jù)NP基因建立了普通RT-PCR方法和巢式RT-PCR，均具有較高度的特異性和敏感性，但只能鑒定到型。為了適應(yīng)進(jìn)出口活禽、禽肉制品中的AIV快速檢測的需要，20世紀(jì)90年代北京出入境檢驗檢疫局等單位研制成功的AIV熒光RT-PCR檢測試劑盒，通過了成果鑒定，這一成果在國內(nèi)屬于首次，在國際也屬于先進(jìn)水平。AIV熒光RT-PCR檢測試劑盒系列包括AIV通用型及H5、H7、H9亞型檢測試劑盒。對檢驗樣品先用AIV通用型試劑盒檢測是否含有AIV流感病毒，對其中陽性樣品再用H5、H7、H9亞型試劑盒分型檢測，也可直接進(jìn)行H5、H7、H9的檢測。與傳統(tǒng)的AIV雞胚分離方法相比具有快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確、安全等優(yōu)點但該方法成本高，需要特殊設(shè)備，熟練的技術(shù)人員，不易于推廣。結(jié)合我國養(yǎng)禽業(yè)實際情況開發(fā)快速、敏感、操作簡單、成本低廉的RT-PCR試劑盒是適應(yīng)目前我國禽病監(jiān)測的一種趨勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于建立了禽流感病毒通用型RT-PCR檢測方法和H5、H7、H9亞型分型檢測的三聯(lián)RT-PCR檢測方法，最終組裝成禽流感病毒(Avian Influenza Virus AIV)系列RT-PCR檢測試劑盒。
本發(fā)明的步驟是a、建立AIV基因儲備庫用收集到的H5、H9亞型AIV毒株，進(jìn)行克隆，建立AIV基因儲備庫；b、根據(jù)AIV M1P基因具有型的特異性，確定通用型RT-PCR檢測方法的靶序列為M1P基因；根據(jù)AIV HA基因具有亞型的特異性，確定亞型分型檢測的RT-PCR檢測方法的靶序列為HA基因；c、引物設(shè)計借助DNASTAR軟件設(shè)計特異性RT-PCR引物；d、通用型RT-PCR檢測方法建立用通用型引物對所收集到的H5、H9亞型AIV毒株進(jìn)行RT-PCR，建立通用型RT-PCR檢測方法；e、亞型單項RT-PCR檢測方法建立用H5、H7、H9亞型分型檢測引物分別對相應(yīng)毒株、質(zhì)粒進(jìn)行RT-PCR或PCR和反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立各亞型的單項RT-PCR檢測方法。
本發(fā)明的步驟是二聯(lián)RT-PCR檢測方法建立在單項RT-PCR檢測方法建立的基礎(chǔ)上，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立AIV二聯(lián)RT-PCR檢測方法。
本發(fā)明的步驟是三聯(lián)RT-PCR檢測方法建立在二聯(lián)RT-PCR檢測方法建立的基礎(chǔ)上，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立AIV三聯(lián)RT-PCR檢測方法。
本發(fā)明的試劑盒是配制了AIV RT緩沖液，AIV通用型PCR緩沖液，AIV亞型PCR緩沖液，各裝一管，并且將反轉(zhuǎn)錄引物，通用型引物----上下游引物的混合液，亞型分型檢測引物-----所有亞型AIV分型檢測引物按等比例的混合液，各裝一管，RT緩沖液、PCR緩沖液和引物混合液的配制，以此為基礎(chǔ)組裝成試劑盒。
本發(fā)明的反轉(zhuǎn)錄引物是AGCAAAAGCAGG本發(fā)明的通用型引物----上下游引物是M15‘-GTGCCCAGTGAGCGAGGAC-3’M25‘-TGCGGCAACAACAAGAGGAT-3’本發(fā)明的亞型分型檢測引物-----所有亞型AIV分型檢測引物是H9HA15’-CTGACCAACCTCCCTCTATGAA-3’H9HA25’-CAAGACGCCCAATACACAAAT-3’H5HA35’-TATGC(A/C)TACAAAATTGTCAAG-3’H5HA45’-ATACCATCCATCTACCATTCC-3’H7HA55’-TTCAGCATTATAGGACCACACTTC-3H7HA65’-GGATCAACCGCAGAACAGACCA-3本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果為本發(fā)明基于AIV高含量、高保守、高特異M1P基因設(shè)計引物，組裝的AIV通用型RT-PCR檢測試劑盒，可檢出15個亞型AIV；基于H5、H7、H9亞型的HA基因裂解位點設(shè)計引物，組裝的多聯(lián)RT-PCR檢測方法，可用于H5、H7、H9亞型的鑒定并可通過測序?qū)ζ溥M(jìn)行致病性分析，本發(fā)明通用型試劑盒的目的基因選擇和H5、H7、H9亞型多聯(lián)RT-PCR檢測試劑盒的組裝。
具體實施例方式1.引物設(shè)計登錄NCBI在GenBank查到AIV M基因序列20個，H5亞型HA基因15個，H9亞型和H7亞型HA基因各12個。借助DNASTAR軟件針對M基因設(shè)計一套特異性引物，建立AIV通用型M RT-PCR檢測方法。引物序列如下M15‘-GTGCCCAGTGAGCGAGGAC-3’M25‘-TGCGGCAACAACAAGAGGAT-3’針對H5、H7、H9的HA基因各設(shè)計一套特異性引物，要求所擴出的目的帶含有HA裂解位點，引物序列如下；H9HA15’-CTGACCAACCTCCCTCTATGAA-3’H9HA25’-CAAGACGCCCAATACACAAAT-3’H5HA35’-TATGC(A/C)TACAAAATTGTCAAG-3’H5HA45’-ATACCATCCATCTACCATTCC-3’H7HA55’-TTCAGCATTATAGGACCACACTTC-3H7HA65’-GGATCAACCGCAGAACAGACCA-3反轉(zhuǎn)錄引物AGCAAAAGCAGG2、建立提取AIV基因組方法2.1待檢樣品準(zhǔn)備2.1.1臨床樣品的準(zhǔn)備2.1.1.1咽喉拭子采集和預(yù)處理用滅菌的棉拭子取可疑雞喉頭、腭裂、泄殖腔的分泌物，浸泡在1mlPBS(PH7.2)中。室溫放置30分鐘，洗脫棉拭子上的黏附的分泌物，擰干棄去棉拭子。置于高速離心機以3,000rpm離心5min，收集上清液。供RNA抽提，或-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.1.1.2病(死)禽臨床組織病料的采集和預(yù)處理無菌采取適量病(死)禽的肺氣管、脾、胸腺，肝等，置于乳缽或玻璃研磨器中加入5倍量的無菌PBS(PH7.2)，充分研磨。反復(fù)凍融三次，以3,000rpm離心5min，收集上清液。供RNA抽提，或-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.1.2病毒分離物的收獲及處理收獲懷疑感染AIV的雞胚尿囊液或產(chǎn)生病變的單層細(xì)胞培養(yǎng)物，供RNA抽提，或-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.2待檢樣品RNA抽提取經(jīng)過預(yù)處理的0.25ml待檢樣品中加入0.75ml TRIZOL LSReagent。用加樣器充分混合均勻，室溫作用5-10min。繼續(xù)加入0.2ml氯仿，震蕩混勻，室溫作用15min。于4℃不超過12000rpm離心10min，收集上清(勿吸到兩液相間的沉淀物)，加入0.5ml異丙醇，顛倒混合均勻，室溫作用10min。4℃不超過12000rpm離心10min，小心到去上清液，重新加入1.5ml 75％冷乙醇。7500-10000rpm離心10min，小心到去乙醇，將離心管倒置于超凈工作臺15min，風(fēng)干黏附于管底的核酸沉淀。最后加30l DEPC H2O至核酸沉淀中，55℃-60℃水浴8-15min，冰上保存?zhèn)溆谩?br> 3.AIV通用型RT-PCR檢測方法建立3.1設(shè)計引物M15‘-GTGCCCAGTGAGCGAGGAC-3’
M25‘-TGCGGCAACAACAAGAGGAT-3’3.2 RT反應(yīng)體系為30ul條件優(yōu)化后，采用TaKaRa公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶建立如下反轉(zhuǎn)錄體系提取的RNA 6ul，反轉(zhuǎn)錄引物0.5ul，無RNA酶水8ul，70℃反應(yīng)5分鐘，放于冰上加入5×buffer 6ul，dNTP(10Mm)1.5ul，M-MLV 1.0ul，Rnase Inhibitor1ul，無RNA酶的水6ul，42℃孵育20分鐘，95℃5分鐘。
3.3 PCR反應(yīng)體系為25ul10×ExTaq Buffer(Mg2+Free)2.5μL、dNTP Mixture(10mM)0.5μL、MgCl2(2.5mM)2μL、M1(20pmol/μL)0.5ul、M2(20pmol/μL)0.5μL、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物適量、TaKaRa Ex Taq(5U/μL)0.25μL，補水至25μL。擴增儀內(nèi)擴增。
3.4建立循環(huán)參數(shù)94℃預(yù)變性5min，94℃變性40s，60℃退火40s，72℃延伸1min，30個循環(huán)，最后72℃延伸反應(yīng)10min。
3.5特異性試驗應(yīng)用M1、M2引物分別對2株NDV分離株尿囊液、1株IBV分離株尿囊液、1株IBDV分離株尿囊等相近RNA病毒及H5、H7、H9亞型分離株尿囊液進(jìn)行RT-PCR，驗證RT-RCP反應(yīng)的特異性，并通過DNASTAR軟件分析檢測其他亞型AIV時的情況。
3.6敏感性試驗將尿囊液按10的倍數(shù)進(jìn)行倍比稀釋接種雞胚，48h收集尿囊液，進(jìn)行雞紅細(xì)胞凝集實驗，發(fā)生紅細(xì)胞凝集的反應(yīng)的尿囊液最小稀釋倍數(shù)100μL為1EID。將陰性棉拭子分別浸泡在含1EID、10EID、100EID、1000EID1稀釋液中，取250μL提RNA，模擬病料檢測4、分別建立AIV H5、H7、H9亞型單項RT-PCR檢測方法4.1設(shè)計引物H9HA15’-CTGACCAACCTCCCTCTATGAA-3’H9HA25’-CAAGACGCCCAATACACAAAT-3’H5HA35’-TATGC(A/C)TACAAAATTCTCAAG-3’H5HA45’-ATACCATCCATCTACCATTCC-3’H7HA55’-TTCAGCATTATAGGACCACACTTC-3H7HA65’-GGATCAACCGCAGAACAGACCA-34.2反轉(zhuǎn)錄體系為30ul 同3.24.3 PCR反應(yīng)體系為25ul 同3.34.4建立循環(huán)參數(shù)94℃預(yù)變性5min，94℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min，30個循環(huán)，最后72℃延伸反應(yīng)10min。
4.5特異性及敏感性檢測 同3.5 3.65分別建立二聯(lián)AIV H5、H7亞型，H5、H9亞型，H7、H9亞型二聯(lián)RT-PCR方法檢測方法5.1建立二聯(lián)PCR檢測方法首先通過對質(zhì)粒的PCR初步確定二聯(lián)PCR反應(yīng)體系，實驗證實所設(shè)計的引物對在進(jìn)行二聯(lián)PCR反應(yīng)時依就具有較好的特異性，然后對已收集到的毒株進(jìn)行檢測和條件優(yōu)化，為多重RT-PCR作準(zhǔn)備。
5.2反轉(zhuǎn)錄體系為30ul同3.25.3 PCR反應(yīng)體系為25ul分別將各兩個亞型的AIV上下游引物各1ul(10pmol/ul)，10×ExTaq Buffer(Mg2+Free)2.5μL、dNTP Mixture(10mM)0.5μL、MgCl2(2.5mM)2μL、取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物適量，補水至25ul，擴增儀內(nèi)擴增。
5.4建立循環(huán)參數(shù)94℃預(yù)變性5min，94℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min，30個循環(huán)，最后72℃延伸反應(yīng)10min。
5.5特異性及敏感性檢測同3.5 3.66建立AIV H5、H7、H9亞型三聯(lián)RT-PCR檢測方法6.1反轉(zhuǎn)錄體系為30ul 同3.26.2 PCR反應(yīng)體系為25ulH5亞型的AIV上下游引物各1ul(10pmol/ul)、H9亞型的AIV上下游引物各0.8ul(10pmol/ul)、10×ExTaq Buffer(Mg2+Free)2.5μL、dNTP Mixture(10mM)0.5μL、MgCl2(2.5mM)2μL、H7亞型的AIV上下游引物各0.6ul(10pmol/ul)、exTaq酶0.25ul，取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物適量，補水至25ul，擴增儀內(nèi)擴增。
6.3建立循環(huán)參數(shù)94℃預(yù)變性5min，94℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min，30個循環(huán)，最后72℃延伸反應(yīng)10min。
6.4特異性及敏感性檢測同3.5 3.67 RT-PCR檢測結(jié)果判斷7.1電泳將10μlPCR產(chǎn)物與3μl加樣緩沖液混合均勻，加至瓊脂糖凝膠樣品孔中。同時設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量對照。以90-115伏穩(wěn)壓，電泳至溴芬藍(lán)指示劑到達(dá)1/3瓊脂糖凝膠處停止，置于紫外檢測儀上觀察或凝膠成相系統(tǒng)拍照觀察，與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)及陰陽性對照比較，分析結(jié)果。
7.2判定結(jié)果通用型AIV檢測陽性對照及陽性樣品擴增片段為560bp，陰性對照則無；AIV亞型檢測，不設(shè)陽性對照，只設(shè)陰性對照，H5亞型陽性樣品目的帶大小為290bp、H7亞型陽性樣品目的帶大小為720bp、H9亞型陽性樣品目的帶大小為547bp，陰性對照則無。陰陽性對照應(yīng)分別出現(xiàn)陰陽性結(jié)果，否則，全部樣品應(yīng)重做8.試劑盒研制本發(fā)明通過系列實驗，配制了AIV RT緩沖液(含有RT Buffer、dNTP等成分)，AIV通用型PCR緩沖液(含有Mg2+、Buffer、dNTP等成分)，AIV亞型PCR緩沖液(含有Mg2+、Buffer、dNTP等成分)，各裝一管。并且將反轉(zhuǎn)錄引物，通用型引物(上下游引物的混合液)，亞型分型檢測引物(所有亞型AIV分型檢測引物按前述比列的混合液)，各裝一管。RT緩沖液、PCR緩沖液和引物混合液的配制，以此為基礎(chǔ)組裝成試劑盒，極大的方便了操作。
*試劑盒說明本試劑盒主要用于禽流感病毒(AIV)的定性和分型檢測。根據(jù)AIV某些基因的高度保守性和特異性，設(shè)計一套通用型引物用于檢測15個亞型的A型流感病毒，擴增片段為567bp。根據(jù)H5、H9、H7亞型HA基因特點分別在其裂解位點兩側(cè)保守區(qū)各設(shè)計一套引物，建立聯(lián)合RT-PCR用于H5、H9、H7檢測和分型，通過測序可進(jìn)行致病力高低判定等，擴增片段為H5亞型290bp、H9亞型547bp、H7亞型720bp。對檢測樣品可先用AIV通用型引物檢測是否含有AIV，對其中初檢陽性樣品再用H5、H7、H9試劑盒分型檢測，也可直接用H5、H7、H9試劑盒進(jìn)行分型檢測。
*試劑盒組成

*操作步驟1.RNA樣品制備1.1使用器具盡量用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿應(yīng)用0.1％DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液37℃下處理12小時，然后在120℃下高壓滅菌30分鐘以除去DEPC。
1.2試劑配制用于RNA操作的試劑，須用干熱滅菌(180℃，60分鐘)或進(jìn)行DEPC處理滅菌后(如上述)的玻璃器皿盛裝(也可用RNA實驗用的一次性塑料容器)，使用的無菌水必須用0.1％的DEPC處理后進(jìn)行高溫高壓滅菌。
1.3 RNA提取①取經(jīng)過預(yù)處理的50-100mg組織樣品或250l組織懸液(如果樣品小于250l加水至250l)與750l TRIZOLS試劑混合均勻(使病毒裂解)；②將上述混合物15-30℃孵育5min，加入氯仿200l，上下振蕩搖勻，繼續(xù)孵育10-15min；③2-8℃，≤12000g離心15min；④取上層水相轉(zhuǎn)移到新離心管中，加500l異丙醇，15-30℃孵育10min；⑤重復(fù)步驟③；⑥棄上清，75％乙醇清洗，加入1ml75％乙醇，搖動管使沉淀懸??；⑦2-8℃，≤7500g離心10-15min；⑧棄上清，干燥10-15min，管底沉淀即為RNA；⑨用Solution B 25-30μl溶解RNA沉淀，55-60℃孵育10min，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 2.RT-PCR2.1 RT反應(yīng)體系配制及反應(yīng)條件的設(shè)置

2.2 PCR反應(yīng)體系配制2.2 PCR反應(yīng)體系配制

2.3 PCR反應(yīng)條件94℃ 5min

72℃ 10min。
*注意事項使用本試劑盒時，一定要認(rèn)真閱讀本說明書與注意事項。
①進(jìn)行RNA操作時，為保證其不被RNA酶降解并有一定的純度，建議在無菌條件下進(jìn)行；在冰盒上操作；使用RNA操作專用實驗臺；戴一次性手套；使用專門的并經(jīng)過處理的器具、儀器、試劑和無菌水；在操作過程中避免講話等；
②為防止RNA降解，提取的RNA請在2小時內(nèi)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；③本試劑盒為了避免RT與PCR試劑混淆，以不同顏色的蓋子加以區(qū)分，并且裝RT試劑的管蓋用英文字母標(biāo)識，裝PCR試劑的管蓋用數(shù)字標(biāo)識。
④需要進(jìn)行數(shù)次RT-PCR反應(yīng)時，應(yīng)先配制各種試劑的混合液，然后再分裝到每個反應(yīng)管中。這樣，既可以減少污染和試劑損失，又可使所取的試劑體積更準(zhǔn)確，減少實驗操作或?qū)嶒炛g誤差的產(chǎn)生；⑤酶制品應(yīng)在實驗前才從-20℃取出，使用后立即放回-20℃中保存。首次使用時應(yīng)1000rpm稍事離心；⑥務(wù)必使用高壓滅菌的新槍頭(Tip)，以防止樣品間的污染；⑦在每次使用試劑盒時一定要設(shè)陰性與陽性對照(陰陽性模板量各2μl)，保證檢測的準(zhǔn)確性；⑧為保證RT效果，針對不同來源病料檢測，建議先進(jìn)行預(yù)實驗反轉(zhuǎn)錄模板按10μl、5μl、3μl、1μl設(shè)定梯度進(jìn)行RT，通過PCR確定RT模板量。
⑨最佳的PCR條件，因PCR擴增儀不同而不同，所以在使用樣品前應(yīng)先做一下Control反應(yīng)，以確定最佳的PCR條件；⑩試劑應(yīng)在-20℃下貯存運輸。
權(quán)利要求
1.一種禽流感病毒反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測方法，其步驟是a、建立AIV基因儲備庫用收集到的H5、H9亞型AIV毒株，進(jìn)行克隆，建立AIV基因儲備庫；b、根據(jù)AIV M1P基因具有型的特異性，確定通用型RT-PCR檢測方法的靶序列為M1P基因；根據(jù)AIV HA基因具有亞型的特異性，確定亞型分型檢測的RT-PCR檢測方法的靶序列為HA基因；c、引物設(shè)計借助DNASTAR軟件設(shè)計特異性RT-PCR引物；d、通用型RT-PCR檢測方法建立用通用型引物對所收集到的H5、H9亞型AIV毒株進(jìn)行RT-PCR，建立通用型RT-PCR檢測方法；e、亞型單項RT-PCR檢測方法建立用H5、H7、H9亞型分型檢測引物分別對相應(yīng)毒株、質(zhì)粒進(jìn)行RT-PCR或PCR和反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立各亞型的單項RT-PCR檢測方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的禽流感病毒反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測方法，其步驟是二聯(lián)RT-PCR檢測方法建立在單項RT-PCR檢測方法建立的基礎(chǔ)上，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立AIV二聯(lián)RT-PCR檢測方法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的禽流感病毒反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測方法，其步驟是三聯(lián)RT-PCR檢測方法建立在二聯(lián)RT-PCR檢測方法建立的基礎(chǔ)上，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立AIV三聯(lián)RT-PCR檢測方法。
4.一種禽流感病毒反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測試劑盒，其特征是配制了AIV RT緩沖液，AIV通用型PCR緩沖液，AIV亞型PCR緩沖液，各裝一管，并且將反轉(zhuǎn)錄引物，通用型引物----上下游引物的混合液，亞型分型檢測引物-----所有亞型AIV分型檢測引物按等比例的混合液，各裝一管，RT緩沖液、PCR緩沖液和引物混合液的配制，以此為基礎(chǔ)組裝成試劑盒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的禽流感病毒反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測試劑盒，其特征是反轉(zhuǎn)錄引物是AGCAAAAGCAGG
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的禽流感病毒反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測試劑盒，其特征是通用型引物----上下游引物是M15‘-GTGCCCAGTGAGCGAGGAC-3’M25‘-TGCGGCAACAACAAGAGGAT-3’
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的禽流感病毒反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測試劑盒，其特征是亞型分型檢測引物-----所有亞型AIV分型檢測引物是H9HA15’-CTGACCAACCTCCCTCTATGAA-3’H9HA25’-CAAGACGCCCAATACACAAAT-3’H5HA35’-TATGC(A/C)TACAAAATTGTCAAG-3’H5HA45’-ATACCATCCATCTACCATTCC-3’H7HA55’-TTCAGCATTATAGGACCACACTTC-3H7HA65’-GGATCAACCGCAGAACAGACCA-全文摘要
一種禽流感病毒反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測方法及試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種禽流感病毒檢測的方法。本發(fā)明目的在于建立了禽流感病毒通用型RT－PCR檢測方法和H5、H7、H9亞型分型檢測的三聯(lián)RT－PCR檢測方法，最終組裝成禽流感病毒(Avian Influenza Virus AIV)系列RT－PCR檢測試劑盒。
文檔編號C12Q1/25GK1690220SQ20041001080
公開日2005年11月2日 申請日期2004年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月19日
發(fā)明者金寧一, 馬鳴瀟, 鄭敏, 李昌, 王振國, 金擴世, 秦曉冰, 魯會軍, 夏志平, 金洪濤 申請人:中國人民解放軍軍需大學(xué)軍事獸醫(yī)研究所