專利名稱：用于中國漢族人群特異性rhd基因定型的引物及試劑盒及定型方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于中國漢族人群特異性RHD基因定型的PCR引物、一種中國漢族人群特異性RHD基因定型試劑盒、一種中國漢族人群特異性RHD基因的定型方法。
背景技術(shù)：
Rh血型的常規(guī)檢測方法是血清學(xué)間接抗人球蛋白試驗，但是存在一定的局限性，如由于疾病或其他因素的影響，某些個體的紅細(xì)胞在作血清學(xué)定型時結(jié)果難以判定；慢性長期輸血患者血清學(xué)結(jié)果有時會呈現(xiàn)“混合視野”；當(dāng)無法獲得紅細(xì)胞樣本或紅細(xì)胞樣本不足時，血清學(xué)方法無法進(jìn)行，如胎兒血型鑒定、法醫(yī)鑒定遺留物等?；驒z測方法則可彌補(bǔ)血清學(xué)技術(shù)的不足，具有重要的臨床實用價值。
國際上已經(jīng)有特異性針對白種人和黑人的RHD基因定型方法，通常采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)，并且進(jìn)入臨床常規(guī)應(yīng)用。在我國市場和實驗室出現(xiàn)有國外RHD基因定型試劑盒，但是由于不同民族間RHD分子背景不同，適合于其他民族的基因檢測方法并不適合中國人，歐美是根據(jù)白人的Rh血型分子背景設(shè)計檢測方法，黑人則是根據(jù)黑人的Rh分子機(jī)制設(shè)計，所以目前我們采用國外定型試劑盒作中國人的RHD基因分型時，結(jié)果不可靠，存在較高比率的假陽性或假陰性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是針對國外定型試劑盒作中國人的RHD基因分型時存在的上述問題，提供一種特異性的用于中國漢族人群特異性RHD基因定型的引物。
本發(fā)明的第二個目的是采用本發(fā)明的特異性PCR引物，提供一種能克服常規(guī)血清學(xué)方法的局限性，降低采用國外試劑盒存在的假陽性或假陰性率，能準(zhǔn)確進(jìn)行中國漢族人群的RHD基因定型的試劑盒。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種采用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行中國漢族人群特異性RHD基因定型的定型方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明的中國漢族人群特異性的RHD基因定型技術(shù)采用序列特異性引物-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，(sequence specificprimer-polymorase chain reaction，縮寫PCR-SSP或SSP-PCR或PCR/SSP)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)又稱體外擴(kuò)增技術(shù)，序列特異性引物-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)是其一種方式，也有稱為等位基因特異性或核甘酸特異性的PCR技術(shù)。
由于不同民族間Rh血型分子背景的差異，要建立中國漢族人群特異性的RHD基因定型技術(shù)，必須首先闡明中國人的Rh血型的分子遺傳機(jī)制，然后根據(jù)這一機(jī)制針對性設(shè)計檢測技術(shù)。
我們根據(jù)美國國家生物信息中心(NCBI)GenBank記錄的正常RHD基因和中國人各種RHD等位基因的序列，確定了6對特異性寡核苷酸引物，用于中國漢族人群特異性RHD基因定型。
本發(fā)明的六對特異性寡核苷酸引物分別如下(1)上游引物D1-U其3’端位置是在RHD基因第一外顯子的第121位堿基處；下游引物D1-L其3’端位置是在RHD基因第一內(nèi)含子的第64位堿基處；(2)上游引物D2-U其3’端位置是在RHD基因第二外顯子的第270位堿基處；下游引物D2-L其3’端位置是在RHD基因第二內(nèi)含子的第94位堿基處；(3)上游引物D5-U其3’端位置是在RHD基因第五外顯子的第711位堿基處；下游引物D5-L其3’端位置是在RHD基因第五外顯子的第800位堿基處；(4)上游引物D6-U其3’端位置是在RHD基因第六外顯子的第909位堿基處；下游引物D6-L其3’端位置是在RHD基因第六內(nèi)含子的第104位堿基處；(5)上游引物D9-U其3’端位置是在RHD基因第八內(nèi)含子的第-67位堿基處；下游引物D9-L其3’端位置是在RHD基因第九外顯子的第1227位堿基處；(6)上游引物Del-U其3’端位置是在RHD基因第九外顯子的第1227位堿基處；下游引物Del-L其3’端位置是在RHD基因第九內(nèi)含子的第62位堿基處；上述每段特異性寡核苷酸引物的長度為16-27個核苷酸，引物序列以靠近3’端的4-5個堿基決定其反應(yīng)特異性，靠近5’端的堿基可根據(jù)情況增加或較少。
上述每對引物的位置如圖1所示圖1中1-10為RHD基因的10個外顯子，橫線為9個內(nèi)含子，標(biāo)有D1、D2、D5、D6、D9、E9的線條為PCR反應(yīng)擴(kuò)增的區(qū)域，也表示引物的大致位置。
上述六對特異性寡核苷酸引物采用如下序列較佳(1)上游引物D1-U5’-TGACGCTTCCTTAGAGGATC-3’，下游引物D1-L5’-TGCCCCTGGAGAACCAC-3’，(2)上游引物D2-U5’-CGCTTGGTGTGCAGTGA-3’，下游引物D2-L5’-CACAGCACTGGTGCTAGACA-3’，(3)上游引物D5-U5’-CAATCGAAAGGAAGAATGCC-3’，下游引物D5-L5’-AGCGCCCTGCTCACCT-3’，(4)上游引物D6-U5’-GGTCTTGTGGCTGGGCTG-3’，下游引物D6-L5’-CAATAAGAGAATGCGCCG-3’，(5)上游引物D9-U5’-CTGTCGTTTTGACACACAATATTTC-3’，下游引物D9-L5’-CACGTTAATAGGTGAAAAATCTTACC-3’，(6)上游引物Del-U5’-GATGACCAAGTTTTCTGGAAA-3’，下游引物Del-L5’-CATAAACAGCAAGTCAACATATATACT-3’。
上述較佳引物的序列、反應(yīng)特異性及位置請見如下表1
反應(yīng)管 引物名稱 特異性 基因序列引物序列(5’-3’)引物位置(RHD) BpD1 D1-U RHD/CE AJ2990205’-TGACGCTTCCTTAGAGGATC-3’exon 1，102-121 127D1-L RHD AB0351875’-TGCCCCTGGAGAACCAC-3’ intron 1，+80-64，D2 D2-U RHD270A AF3901155’-CGCTTGGTGTGCAGTGA-3’ exon 2，254-270 194D2-L RHD/CE AB0351905’-CACAGCACTGGTGCTAGACA-3’intron 2，+113-94D5 D5-U RHD/CE AJ2990245’-CAATCGAAAGGAAGAATGCC-3’exon 5，691-711 124D5-L RHD AB0351985’-AGCGCCCTGCTCACCT-3’intron 5，+14-exon 5，800D6 D6-U RHD/CE AJ2990255’-GGTCTTGTGGCTGGGCTG-3’exon 6，892-909 169D6-L RHD AB0352005’-CAATAAGAGAATGCGCCG-3’intron 6，+121-104D9 D9-U RHD AB0351965’-CTGTCGTTTTGACACACAATATTTC-3’ intron 8，-91-67 190D9-L RHD/CE AB0351855’-CACGTTA ATAGGTGAAAAATCTTACC-3’ intron 9，+25-exon 9，1227E9 Del-U RHD1227AAF3901105’-GATGACCAAGTTTTCTGGAAA-3’ exon 9，1207-1227 109Del-L RHD AB0351855’-CATAAACAGCAAGTCAACATATATACT-3’ intron 9，+88-62IC*HPA-1-U|4|HPA M32672 5’-GCCATAGTTCTGATTGCTG-3’ 1440-1459 367HPA-1-L4 HPA M32672 5’-CTTGTCTTCCCACCCCATTT-3’1787-1807表1中“IC”為一對內(nèi)對照引物，檢測人類血小板抗原，“基因序列”為在美國國家生物信息中心(NCBI)GenBank進(jìn)行登記的基因序列編號，“bp”表示擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基長度。
采用本發(fā)明的上述特異性寡核苷酸引物，制備成本發(fā)明的中國漢族人群特異性RHD基因定型試劑盒。
本發(fā)明的中國漢族人群特異性RHD基因定型試劑盒，包含本發(fā)明的上述六對特異性寡核苷酸引物，六對引物分別裝于六個容器內(nèi)。
本發(fā)明的試劑盒可以是僅包含六對分別裝于六個容器內(nèi)的引物；也可以還包含有PCR擴(kuò)增反應(yīng)液， PCR擴(kuò)增反應(yīng)液可設(shè)在每個容器內(nèi)，具體可包含純水、10×PCR Buffer、MgCl22.5mM、dNTPs 200μM、甘油5％(v/v)、甲酚紅0.005％(w/v)、特異性寡核苷酸引物0.5-6.25pM。
本發(fā)明的試劑盒還可包含有內(nèi)對照引物，例如表1中所示的內(nèi)對照引物IC。
本發(fā)明的試劑盒還可包含有DNA聚合酶。
上述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、內(nèi)對照引物可設(shè)在或不設(shè)在包含有本發(fā)明的特異性寡核苷酸引物的每個容器內(nèi)。
采用本發(fā)明的試劑盒對中國漢族人群特異性RHD基因進(jìn)行定型，該定型方法包括如下順序的步驟(1)試劑盒的準(zhǔn)備試劑盒包含6種RHD基因檢測用PCR分型混合液，分裝于6個容器內(nèi)，每種分型混合液包含有純水、10×PCRBuffer、MgCl22.5mM、dNTPs 200μM、甘油5％(v/v)、甲酚紅0.005％(w/v)、權(quán)利要求1中所述的六對中的一對特異性寡核苷酸引物0.5-6.25pM、內(nèi)對照引物1.25pM；(2)在反應(yīng)容器內(nèi)分別加入相應(yīng)的分型混合液8ul；(3)每個反應(yīng)容器加入1ul DNA樣品，含DNA 0.05-0.1微克；(4)每個反應(yīng)容器內(nèi)加入1ul稀釋好的DNA聚合酶，含DNA聚合酶0.2活力單位；(5)根據(jù)PCR擴(kuò)增儀類型，加或不加1滴石蠟油覆蓋反應(yīng)液；(6)離心數(shù)秒后放入PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增，在95℃下預(yù)變性5-10分鐘，接著進(jìn)入循環(huán)，在94℃下變性10秒鐘，在62℃下退火40秒鐘，共40個循環(huán)；(7)上步所得PCR產(chǎn)物直接點(diǎn)樣，于2％瓊脂糖凝膠電泳15-20分鐘，在紫外光下拍照記錄。
把上步所得的凝膠電泳圖與圖2所示的中國人特異性的RHD基因定型實驗結(jié)果判讀卡進(jìn)行對照，即可直接得出被測樣品的RHD基因型及表型。圖2所示的判讀卡為目前在中國人中發(fā)現(xiàn)的RHD等位基因的反應(yīng)格局，有色方格表示陽性反應(yīng)，空白方格表示陰性反應(yīng)。在判讀卡中“基因序列”為在美國國家生物信息中心(NCBI)GenBank中記錄的基因序列編號。
本發(fā)明的中國漢族人群特異性RHD基因定型試劑盒及定型方法具有如下優(yōu)點(diǎn)1.先進(jìn)性、特異性和高準(zhǔn)確率。本發(fā)明是國際上第一個中國漢族人特異性的RHD基因定型試劑盒及方法，是專門根據(jù)中國人的Rh分子背景和等位基因設(shè)計的，可檢測目前在中國人中觀察到的全部RHD等位基因，因此具有很高的準(zhǔn)確率，經(jīng)過442例中國漢族人個體的檢測，目前尚未發(fā)現(xiàn)RHD基因定型結(jié)果出現(xiàn)錯誤的現(xiàn)象，避免了使用國外RHD基因分型試劑盒存在的高比率假陽性和假陰性現(xiàn)象。Rh表型中存在高比率的Del表型個體幾乎是中國人獨(dú)有分子遺傳特點(diǎn)，本發(fā)明不僅可以檢測Del基因，還可以調(diào)查其基因頻率，并區(qū)分RHDel/RHD，RHDel/RHd基因型。因此本發(fā)明的試劑盒是醫(yī)院輸血科和血站血型工作者的必備工具之一。
2.本發(fā)明的定型方法簡便快速、易于操作。本發(fā)明的定型方法采用序列特異性引物-PCR技術(shù)，共包括6個反應(yīng)管，一塊96孔板可完成12個樣品，而國外同類試劑盒含10個反應(yīng)管；本發(fā)明的定型方法PCR反應(yīng)耗時較短，僅1個多小時；對PCR擴(kuò)增儀的型號無嚴(yán)格要求，9700型、9600型、2400型及梯度變溫型擴(kuò)增儀等均可；PCR產(chǎn)物電泳無需上樣緩沖液，可直接電泳；DNA聚合酶可用熱啟動酶(金牌酶)，也可用普通Taq酶。因此本發(fā)明的定型方法應(yīng)用彈性比較大，實驗人員不需要特殊培訓(xùn)，根據(jù)說明書即可操作。
本發(fā)明的試劑盒及定型方法概括起來可至少用于以下幾個方面①當(dāng)血清學(xué)IAT檢測結(jié)果難以判定時；②胎兒Rh表型預(yù)測及其它無法獲取有效的紅細(xì)胞樣本時；③慢性長期輸血患者、血液病患者、自身免疫病患者、或紅細(xì)胞直接抗人球蛋白試驗陽性患者的Rh血型鑒定；④D放散型血型鑒定；⑤Rh免疫血液學(xué)及免疫遺傳學(xué)科研工作，如RHD基因頻率調(diào)查、基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)等。


圖1是本發(fā)明的PCR引物設(shè)計圖。
圖2是中國人特異性的RHD基因定型實驗結(jié)果判讀卡圖。
圖3、圖4是實施例一的兩個凝膠電泳圖。
具體實施例方式
實施例一一、中國漢族人群特異性RHD基因定型試劑盒組成包括6種RHD基因檢測用PCR分型混合液及DNA聚合酶稀釋液，6種分型混合液分裝于6個試管內(nèi)，分別為D1、D2、D5、D6、D9、E9。每種分型混合液總體積為25ul，含10×PCR Buffer 2.5ul、25mM MgCl22.5ul、10mM dNTPs 0.5ul、50％甘油2.5ul、0.05％甲酚紅2.5ul、本發(fā)明較佳的6對特異性寡核苷酸引物中的一對特異性寡核苷酸引物62.5pM 2.5ul、內(nèi)對照引物IC(參見表1)12.5pM 2.5ul，其余為純水，試劑盒直接放于-20℃以下凍存。
二、中國漢族人群特異性RHD基因定型10個待檢DNA樣品A、B、C、D、E、F、G、H、I、J。
一塊96孔的微孔板，每個樣品6個反應(yīng)孔?？譇1-A6為樣品A，孔A7-A12為樣品B，孔B1-B6為樣品C，孔B7-B12為樣品D，孔C1-C6為樣品E，孔C7-C12為樣品F，孔D1-D6為樣品G，孔D7-D12為樣品H，孔E1-E6為樣品I，孔E7-E12為樣品J。
定型步驟如下1.每個反應(yīng)孔加入相應(yīng)的分型混合液8ul；2.每個反應(yīng)孔加入1ul DNA樣品，含DNA 0.05-0.1微克；3.每個反應(yīng)孔加入1ul金牌DNA聚合酶稀釋液，約含0.2活力單位；4.采用9600型PCR擴(kuò)增儀，加1滴石蠟油覆蓋反應(yīng)液；5.離心數(shù)秒后擴(kuò)增在95℃下預(yù)變性10分鐘，接著進(jìn)入循環(huán)，在94℃下變性10秒鐘，在62℃下退火40秒鐘，共40個循環(huán)，最后保存在4℃；6.上步所得PCR產(chǎn)物直接點(diǎn)樣，于2％瓊脂糖凝膠電泳20分鐘，紫外光下拍照記錄。
三、結(jié)果電泳圖請見圖3和圖4，圖中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，D1、D2、D5、D6、D9及E9分別表示各種分型混合液，也即表示各種反應(yīng)孔，IC為內(nèi)對照(產(chǎn)物367bp)。
把圖3和圖4的結(jié)果與圖2所示的中國人特異性的RHD基因定型實驗結(jié)果判讀卡進(jìn)行比較，即可得出各個樣品的RHD基因型如下A為正常Rh陽性個體，其D1、D5、D6和D9反應(yīng)孔為陽性；B為正常Rh陰性個體，其全部反應(yīng)為陰性，僅存在內(nèi)對照條帶；C為攜帶RHD270A等位基因(基因序列為AF390115)的Rh陰性個體；D為攜帶RHDIVS6+1-4delGTAA，904-905insGGCTT等位基因(基因序列為AF390113)的Rh陰性個體；E為攜帶RHD710delC等位基因(基因序列為AF390112)的Rh陰性個體；F為D放散型表型個體，含Del等位基因；G為RHD/Del雜合的Rh陽性個體；H為DVa(Hus)表型個體，含RHD-CE(5)-D等位基因；I為DVIIII表型個體，含RHD-CE(3-6)-D等位基因；J為攜帶RHD-CE(2-9)-D2等位基因的Rh陰性個體。
權(quán)利要求
1.一種用于中國漢族人群特異性RHD基因定型的引物，選自如下六對特異性寡核苷酸引物之一(1)上游引物D1-U其3’端位置是在RHD基因第一外顯子的第121位堿基處；下游引物D1-L其3’端位置是在RHD基因第內(nèi)含子的第64位堿基處；(2)上游引物D2-U其3’端位置是在RHD基因第二外顯子的第270位堿基處；下游引物D2-L其3’端位置是在RHD基因第二內(nèi)含子的第94位堿基處；(3)上游引物D5-U其3’端位置是在RHD基因第五外顯子的第711位堿基處；下游引物D5-L其3’端位置是在RHD基因第五外顯子的第800位堿基處；(4)上游引物D6-U其3’端位置是在RHD基因第六外顯子的第909位堿基處；下游引物D6-L其3’端位置是在RHD基因第六內(nèi)含子的第104位堿基處；(5)上游引物D9-U其3’端位置是在RHD基因第八內(nèi)含子的第-67位堿基處；下游引物D9-L其3’端位置是在RHD基因第九外顯子的第1227位堿基處；(6)上游引物Del-U其3’端位置是在RHD基因第九外顯子的第1227位堿基處；下游引物Del-L其3’端位置是在RHD基因第九內(nèi)含子的第62位堿基處；上述每段特異性寡核苷酸引物的長度為16-27個核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于中國漢族人群特異性RHD基因定型的引物，其核苷酸序列分別為(1)上游引物D1-U5’-TGACGCTTCCTTAGAGGATC-3’，下游引物D1-L5’-TGCCCCTGGAGAACCAC-3’，(2)上游引物D2-U5’-CGCTTGGTGTGCAGTGA-3’，下游引物D2-L5’-CACAGCACTGGTGCTAGACA-3’，(3)上游引物D5-U5’-CAATCGAAAGGAAGAATGCC-3’，下游引物D5-L5’-AGCGCCCTGCTCACCT-3’，(4)上游引物D6-U5’-GGTCTTGTGGCTGGGCTG-3’，下游引物D6-L5’-CAATAAGAGAATGCGCCG-3’，(5)上游引物D9-U5’-CTGTCGTTTTGACACACAATATTTC-3’，下游引物D9-L5’-CACGTTAATAGGTGAAAAATCTTACC-3’，(6)上游引物Del-U5’-GATGACCAAGTTTTCTGGAAA-3’，下游引物Del-L5’-CATAAACAGCAAGTCAACATATACT-3’。
3.一種中國漢族人群特異性RHD基因定型試劑盒，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的六對特異性寡核苷酸引物，六對引物分別裝于六個容器內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的中國漢族人群特異性RHD基因定型試劑盒，其特征在于還包含有PCR擴(kuò)增反應(yīng)液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的中國漢族人群特異性RHD基因定型試劑盒，其特征在于所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液設(shè)在每個容器內(nèi)，它包含有純水、10×PCR Buffer、MgCl22.5mM、dNTPs 200μM、甘油5％(v/v)、甲酚紅0.005％(w/v)、特異性寡核苷酸引物6.25pM。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的中國漢族人群特異性RHD基因定型試劑盒，其特征在于還包含有內(nèi)對照引物。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的中國漢族人群特異性RHD基因定型試劑盒，其特征在于還包含有DNA聚合酶。
8.一種中國漢族人群特異性RHD基因的定型方法，其特征在于包括如下順序的步驟(1)試劑盒的準(zhǔn)備試劑盒包含6種RHD基因檢測用PCR分型混合液，分裝于6個容器內(nèi)，每種分型混合液包含有純水、10×PCRBuffer、MgCl22.5mM、dNTPs 200μM、甘油5％(v/v)、甲酚紅0.005％(w/v)、權(quán)利要求1中所述的六對中的一對特異性寡核苷酸引物0.5-6.25pM、內(nèi)對照引物1.25pM；(2)在反應(yīng)容器內(nèi)分別加入相應(yīng)的分型混合液8ul；(3)每個反應(yīng)容器加入1ul DNA樣品，含DNA 0.05-0.1微克；(4)每個反應(yīng)容器加入1ul稀釋好的DNA聚合酶，含DNA聚合酶0.2活力單位；(5)根據(jù)PCR擴(kuò)增儀類型，加或不加1滴石蠟油覆蓋反應(yīng)液；(6)離心數(shù)秒后放入PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增，在95℃下預(yù)變性5-10分鐘，接著進(jìn)入循環(huán)，在94℃下變性10秒鐘，在62℃下退火40秒鐘，共40個循環(huán)；(7)上步所得PCR產(chǎn)物直接點(diǎn)樣，于2％瓊脂糖凝膠電泳15-20分鐘，在紫外光下拍照記錄。
全文摘要
本發(fā)明為一種用于中國漢族人群特異性RHD基因定型的引物及試劑盒及定型方法。本發(fā)明的六對特異性寡核苷酸引物是根據(jù)美國國家生物信息中心(NCBI)記錄的正常RHD基因和中國漢族人群各種RHD等位基因的序列而確定的，基于該特異性寡核苷酸引物的本發(fā)明的試劑盒及定型方法，具有先進(jìn)性、特異性和高準(zhǔn)確率，而且在定型時簡便快速、易于操作。
文檔編號C12Q1/68GK1552918SQ20031011742
公開日2004年12月8日 申請日期2003年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月15日
發(fā)明者邵超鵬, 熊文, 周一炎 申請人:深圳市血液中心