專利名稱：水稻蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體類似蛋白基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水稻蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體類似蛋白基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體是定位于植物細(xì)胞質(zhì)膜上擔(dān)負(fù)著蔗糖跨膜運(yùn)輸?shù)闹匾d體蛋白。蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體在調(diào)控植物源器官內(nèi)光合同化物的輸出、光合同化物的分配以及庫器官內(nèi)光合同化物的輸入過程中發(fā)揮了重要功能(Hans Weber，Ljudmilla Borisjuk，Ute Heim，Norbert Sauer and Ulrich Wobus，(1997)A role for sugar transportersduring seed developmentmolecular characterization of a hexose and a sucrosecarrier in fava bean seeds.The Plant Cell 9895-908；Andreas Weise，Laurence Barker，Christina Kühn，Sylvie Lalonde，Henrik Buschmann，WolfB.Frommer，and John M.Ward(2000)A New Subfamily of Sucrose Transporters，SUT4，with Low Affinity/High Capacity Localized in Enucleate Sieve Elementsof Plants.The Plant Cell.121345-1356)。
蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白分子具有12次疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域，且該蛋白分子的氮端與碳端均定位于胞質(zhì)區(qū)(Laurence Barker，Christina Kühn，Andreas Weise，AlexanderSchulz，Christiane Gebhardt，Brigitte Hirner，Hanjo Hellmann，WaltraudSchulze，John M.Ward and Wolf B.Frommer(2000)Sut2，a putative sucrosesensor in sieve elements.The Plant Cell，121153-1164)。植物體的根、莖、葉、花和果實等許多器官中均有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的分布。雙子葉植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的研究進(jìn)展迅速，當(dāng)前的研究主要集中在三個方面蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的克隆及其性質(zhì)研究；蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的調(diào)控以及與植物組織和器官發(fā)育之間的關(guān)系研究。根據(jù)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體功能以及氨基酸結(jié)構(gòu)方面的特點(diǎn)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的雙子葉植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體可分為三類高親和力/低運(yùn)輸量的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體SUT1；低親和力/高運(yùn)輸量的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體SUT4和蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體類似蛋白亞家族SUT2(Laurence Barker，Christina Kühn，Andreas Weise，Alexander Schulz，Christiane Gebhardt，Brigitte Hirner，HanjoHellmann，Waltraud Schulze，John M.Ward and Wolf B.Frommer(2000)Sut2，a putative sucrose sensor in sieve elements.The Plant Cell，121153-1164)。如表1所示，這三個亞家族的成員在氨基酸結(jié)構(gòu)、功能、定位等方面存在顯著差異。SUT1和SUT4是具有不同蔗糖分子運(yùn)輸能力的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體。SUT2雖然不具備跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖分子的能力，但是SUT2能夠?qū)ν饨绛h(huán)境中的蔗糖分子產(chǎn)生特異性的應(yīng)答反應(yīng)，在調(diào)控糖信號介導(dǎo)的相關(guān)基因的表達(dá)和具備蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能載體的活性等方面發(fā)揮重要的生理功能。蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的表達(dá)具有組織器官特異性以及發(fā)育階段特異性。而且，SUT的轉(zhuǎn)運(yùn)活性在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯后水平都能夠進(jìn)行調(diào)控(Chi-aki Matsukura，Toshikazu Saitoh，Toshiro Hirose，Ryu Ohsugi，Pierdomenico Perata，and JunjiYamaguchi，(2000)Sugar Uptake and Transport in Rice Embryo.Expression ofCompanion Cell-Specific Sucrose Transporter(OsSUT1)Induced by Sugar andLight.Plant Physiology，12485-94)。外界信號分子如糖分子等能夠在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)(Chi-aki Matsukura，Toshikazu Saitoh，Toshiro Hirose，Ryu Ohsugi，Pierdomenico Perata，and Junji Yamaguchi，(2000)Sugar Uptake andTransport in Rice Embryo.Expression of Companion Cell-Specific SucroseTransporter(OsSUT1)Induced by Sugar and Light.Plant Physiology，12485-94)，蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的磷酸化狀態(tài)也能影響其轉(zhuǎn)運(yùn)活性(Gabriel Roblin，Soulaiman Sakr，Janine Bonmort，and Serge Delrot，(1998)Regulation of a plantplasma membrane sucrose transporter by phosphorylation.FEBS，424165-168)。SUT2、SUT1及SUT4共定位于同一篩分子質(zhì)膜上，而且SUT亞家族成員之間能夠相互作用并形成具有不同蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性的同源低聚物或異源低聚物(Anke Reinders，Waltraud Schulze，Christina Kühn，Laurence Barker，Alexander Schulz，John M.Ward and Wolf B.Frommer(2002)Protein-protein interact ions between sucrosetransporters of different affinities colocalized in the same enucleate sieveelement.The Plant Cell 141567-1577)。與雙子葉植物相比，單子葉植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的研究進(jìn)展較為緩慢。Hirose等從水稻穎果中分離出OsSUT1基因，該基因?qū)儆诟哂H和力/低運(yùn)輸量的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體SUT1亞家族成員。OsSUT1在水稻種子的萌發(fā)過程以及水稻穎果的發(fā)育過程中均發(fā)揮生理作用。在水稻營養(yǎng)生長期旗葉中進(jìn)行的OsSUT1的反義實驗證明，OsSUT1在這一時期旗葉的碳水化合物代謝過程中并未發(fā)揮重要功能(Ken Ishimura，Tatsurou Hirose，Naohiro Aoki，Sakiko Takahashi，Kiyomi Ono，Shinichi Yamamoto Jiangzhong，Wu，Shoko Saji，Tomoya Baba，Masashi Ugaki，Takashi Matsumoto，and Ryu Ohsugi(2001)Antisense expression of a rice sucrosetransporter OsSUT1 in rice(Oryza sativa L.).Plant Cell Physiology，421181-1185)。在水稻中進(jìn)行的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體研究表明，水稻中也可能存在有多個成員組成的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體家族。
表1植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體家族的組成及其性質(zhì)

蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體與植物發(fā)育之間的關(guān)系研究主要是通過轉(zhuǎn)基因手段實現(xiàn)的。蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的正義與反義實驗結(jié)果表明，蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體對光合同化物在植物體的各個器官間的合理分配是至關(guān)重要的(Lemoine，R.，Kuhn，C.，Thiele，N.，Delrot，S.，and Frommer，W.B.(1996)Antisense inhibition of the sucrosetransporterEffects on amount of carrier and sucrose transport activity.PlantCell Environ.191124-1131；Burke，L.，Hibberd J.M.，Quick，W.P.，Kuhn，C.，Hirner，B.，and Frommer，W.B.(1998)The H+-sucrose cotransporter NtSUT1 isessential for sugar export from tobacco leaves.Plant Physiol.11859-68)。因此，水稻結(jié)實器官胚乳中的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體相關(guān)基因家族新成員的克隆及其功能研究，特別是對定位在細(xì)胞質(zhì)膜上的感應(yīng)外界環(huán)境中蔗糖濃度變化的家族新成員SUT2的研究，可為利用生物技術(shù)應(yīng)用該基因資源，并通過在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯后水平調(diào)控其他類型的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的活性，從而調(diào)節(jié)植物體內(nèi)蔗糖分子的跨膜運(yùn)輸，提高水稻貯藏組織的淀粉合成效率和產(chǎn)量水平，具有重要的實際價值。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種水稻蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體類似蛋白基因及其編碼蛋白。
本發(fā)明所提供的水稻蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體類似蛋白基因，來源于水稻，名稱為OsSUT2，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由1830個堿基組成，該基因的讀碼框為自5’端第35位到第1822位堿基。
水稻蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體類似蛋白基因OsSUT2編碼蛋白，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中序列2氨基酸殘基序列是由595個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，自氨基端第292-298位和自氨基端第351-360位氨基酸殘基序列為SUT2亞家族成員的保守結(jié)構(gòu)域。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體及細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增水稻蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體類似蛋白基因OsSUT2中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明獲得的水稻蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體類似蛋白基因OsSUT2的表達(dá)受蔗糖分子的調(diào)控，擔(dān)負(fù)著胚乳發(fā)育糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蔗糖分子的感受器功能。作為水稻穎果發(fā)育過程的恒定表達(dá)重要組成成分，將通過蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體有效地調(diào)控蔗糖分子的轉(zhuǎn)運(yùn)和胚乳發(fā)育與淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)有效地利用該基因，將可通過改造OsSUT2對蔗糖分子的感受能力，調(diào)節(jié)水稻蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，提高籽粒淀粉合成碳素流的供應(yīng)，改善光合同化物在水稻植株內(nèi)的分配以及超高產(chǎn)潛力水稻的充實性，最終達(dá)到提高超高產(chǎn)潛力水稻的產(chǎn)量，將在水稻育種中發(fā)揮重要作用。


圖1a為OsSUT2對不同類型單糖及雙糖分子的應(yīng)答反應(yīng)的電泳圖譜圖1b為圖1a中電泳圖譜的定量掃描結(jié)果(Pharmacia)圖2a為三種酵母菌株在YPD-葡萄糖培養(yǎng)基上的生長情況圖2b為三種酵母菌株在YPD-蔗糖培養(yǎng)基上的生長情況圖2c為三種酵母菌株在CM/Trp-葡萄糖培養(yǎng)基上的生長情況圖2d為三種酵母菌株在CM/Trp-蔗糖培養(yǎng)基上的生長情況圖3為OsSUT2在水稻穎果發(fā)育過程的表達(dá)狀態(tài)的RT-PCR檢測結(jié)果具體實施方式
實施例1、水稻蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體類似蛋白基因OsSUT2的獲得根據(jù)部分單子葉植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因，即ZmSUT1、HvSUT1、HvSUT2和OsSUT1的同源性比對的結(jié)果，選取了兩段同源性較高的序列并據(jù)此設(shè)計了一對引物上游引物5’-GCTCTCGCTCCTCACGCCCTACAT-3’；下游引物5’-TGGGTCCCCATGGTAAACCTCACG-3’。
利用這對引物，以抽穗后4天的水稻穎果總RNA的逆轉(zhuǎn)錄樣品為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系模板1μl總RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，10×Taq緩沖液2μl，2.5mM dNTP 1.6μl，10μM上游引物和下游引物各1μl，1U Taq酶，加水補(bǔ)至總體積20μl。PCR循環(huán)條件94℃變性3分鐘后，按如下常數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。將經(jīng)電泳分離純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEMT-Easy Vector連接后轉(zhuǎn)化宿主菌JM109，選取陽性克隆送至上海生工進(jìn)行核苷酸序列測定。將測序結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對，比對結(jié)果表明，擴(kuò)增片斷是一個新的水稻蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體的部分片斷。
以獲得的擴(kuò)增片斷為“探針”在華大基因組數(shù)據(jù)庫(http//btn.genomics.org.cn8080/rice/)中進(jìn)行Blastn分析，獲取了包含擴(kuò)增片斷序列的contig5025，利用GENSCAN和Blastx對contig5025的序列進(jìn)行分析，預(yù)測出上述擴(kuò)增片斷所代表的新基因的序列。根據(jù)預(yù)測的結(jié)果設(shè)計了擴(kuò)增新基因編碼區(qū)的一對引物上游引物5’-ATCTCACCAAACCCTACC-3’；下游引物5’-TGTTCTGCTCAGCCAAAT-3’。利用這對引物，以抽穗后4天的水稻穎果總RNA的逆轉(zhuǎn)錄樣品為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系模板1μl總RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，10×Pfx Taq緩沖液5μl，2.5mM dNTP 6μl，50mM MgSO41μl，20μM上游引物和下游引物各1μl，1.25U Pfx taq酶，加水補(bǔ)至總體積50μl。擴(kuò)增程序為94℃變性3分鐘后，按如下常數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增94℃變性15秒，53℃退火30秒，68℃延伸2分鐘，共30個循環(huán)，最后68℃延伸10分鐘。將分離純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEMT-Easy Vector連接后轉(zhuǎn)化宿主菌JM109，選取陽性克隆送至上海生工進(jìn)行核苷酸序列測定。
測序結(jié)果顯示，目的片段中包含一個長度為1788bp的完整的開放閱讀框，該開放閱讀框編碼由595個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。將測序結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對，核苷酸序列同源性比對的結(jié)果表明，目的片斷與LeSUT2和OsSUT1基因的同源性分別為61.2％和53.0％。將目的片斷編碼的氨基酸序列提交至TMPRED數(shù)據(jù)庫(www.ch.embnet.org/software/TMPRED.form.html)中進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測，預(yù)測結(jié)果表明目的蛋白具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體典型的12次跨膜結(jié)構(gòu)域，而且，目的蛋白的中央環(huán)和氮端的長度比SUT1和SUT4的相應(yīng)區(qū)域長。此外，目的蛋白具有雙子葉植物SUT2的兩個保守的結(jié)構(gòu)域。因此，該基因是SUT2亞家族在單子葉植物中的一個新成員，命名為OsSUT2。OsSUT2基因序列及其編碼蛋白OsSUT2的氨基酸序列分別如序列表中的序列1和序列2所示，序列表中的序列1由1830個堿基組成，自5′端第35-1822位堿基為開放閱讀框，編碼序列表中序列2的蛋白質(zhì)OsSUT2，它由595個氨基酸殘基組成，自氨基端第292-298位和自氨基端第351-360位氨基酸殘基序列為SUT2亞家族成員的保守結(jié)構(gòu)域。
實施例2、水稻蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體類似蛋白基因OsSUT2對糖分子的應(yīng)答反應(yīng)利用濃度均為50mmol/L的甘露醇溶液、果糖溶液、蔗糖溶液和蔗糖同分異構(gòu)體Paltinose溶液對水稻葉片進(jìn)行處理，并通過RT-PCR的方法檢測蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因?qū)Σ煌愋偷奶欠肿拥膽?yīng)答反應(yīng)。擴(kuò)增引物如下上游引物5’-GCTCTCGCTCCTCACGCCCTACAT-3’；下游引物5’-TGGGTCCCCATGGTAAACCTCACG-3’。擴(kuò)增體系模板1μl總RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，10×Taq緩沖液2μl，2.5mM dNTP 1.6μl，10μM上游引物和下游引物各1μl，1U Taq酶，加水補(bǔ)至總體積20μl。PCR循環(huán)條件94℃變性3分鐘后，按如下常數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，共20個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測。
檢測結(jié)果以及定量結(jié)果如圖1a和圖1b所示，OsSUT2對Paltinose分子有特異性的應(yīng)答反應(yīng)，而對甘露醇分子以及果糖分子沒有應(yīng)答反應(yīng)。在本實驗中，甘露醇以及Paltinose分別作為滲透壓以及代謝過程的對照。甘露醇和Paltinose溶液的處理結(jié)果表明，OsSUT2對Paltinose分子的特異性應(yīng)答反應(yīng)與溶液中的滲透壓以及代謝過程沒有關(guān)系。而OsSUT1基因?qū)ι鲜鎏欠肿泳鶝]有應(yīng)答反應(yīng)。圖1a和圖1b中，H2O、Man、Fru、Suc和Pal分別表示無菌水、甘露醇溶液、果糖溶液、蔗糖溶液以及蔗糖同分異構(gòu)體Paltinose溶液；rRNA和OsActin的擴(kuò)增結(jié)果表明模板量一致。
通過水稻蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體類似蛋白基因OsSUT2對糖分子應(yīng)答實驗證明，獲得的OsSUT2能夠特異識別細(xì)胞外蔗糖分子，并導(dǎo)致其在轉(zhuǎn)錄水平的變化，從而將引起細(xì)胞內(nèi)的一系列信號級聯(lián)應(yīng)答反應(yīng)。
實施例3、酵母突變體互補(bǔ)實驗將OsSUT2基因的編碼區(qū)亞克隆到大腸桿菌/酵母穿梭質(zhì)粒112A1NE中(張雷，刁豐秋，楊志攀，黃美絹和吳乃虎(2001)一種胡蘿卜蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族新成員的分離及功能鑒定科學(xué)通報，第46卷第14期1190-1195)。以112A1NE為對照，與112A1NE-OsSUT2一同轉(zhuǎn)化酵母突變體SUSY3/ura3(Laurence Barker，Christina Kühn，Andreas Weise，Alexander Schulz，Christiane Gebhardt，Brigitte Hirner，Hanjo Hellmann，Waltraud Schulze，John M.Ward and WolfB.Frommer(2000)Sut2，a putative sucrose sensor in sieve elements.The PlantCell，121153-1164)。根據(jù)酵母突變體、112A1NE轉(zhuǎn)化子和112A1NE-OsSUT2轉(zhuǎn)化子在不同酵母培養(yǎng)基上的生長情況，檢驗OsSUT2是否具有轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖分子的能力。結(jié)果如圖2a、圖2b、圖2c和圖2d所示酵母菌株SUSY3/ura3是蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體以及細(xì)胞壁結(jié)合的轉(zhuǎn)化酶缺失的酵母突變體，因而，該突變體只能在YPD-葡萄糖培養(yǎng)基上生長，而不能在YPD-蔗糖培養(yǎng)基上生長(圖2a和圖2b)；圖2b表明OsSUT2轉(zhuǎn)化子不能在YPD-蔗糖培養(yǎng)基上生長，所以O(shè)sSUT2不具備轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖的能力。為了檢驗112A1NE和112A1NE-OsSUT2是否轉(zhuǎn)移進(jìn)酵母突變體內(nèi)，選用了CM/Trp-葡萄糖培養(yǎng)基對112A1NE和112A1NE-OsSUT2進(jìn)行培養(yǎng)。圖2C表明只有112A1NE和112A1NE-OsSUT2能在CM/Trp-葡萄糖培養(yǎng)基上生長，而SUSY3/ura3則在該培養(yǎng)基上不能生長；圖2d表明同樣三種酵母菌株在CM/Trp-蔗糖培養(yǎng)基都不能生長。這一實驗結(jié)果證明，112A1NE和112A1NE-OsSUT2已經(jīng)成功轉(zhuǎn)移進(jìn)酵母突變體內(nèi)。圖2a、圖2b、圖2c和圖2d中，SUSY3/ura3、112A1NE和112A1NE-OsSUT2分別表示酵母突變體、空載體轉(zhuǎn)化子和OsSUT2轉(zhuǎn)化子；A、B、C和D分別表示酵母菌株分別接種于YPD-葡萄糖、YPD-蔗糖、CM/Trp-葡萄糖和CM/Trp-蔗糖培養(yǎng)基。
本實施例通過應(yīng)用特異酵母突變體的互補(bǔ)實驗證明，獲得的OsSUT2不具備轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖的能力。
實施例4、OsSUT2在水稻穎果發(fā)育過程中的表達(dá)以水稻穎果總RNA的逆轉(zhuǎn)錄樣品為模板通過RT-PCR的方法檢測水稻蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的表達(dá)。擴(kuò)增引物如下上游引物5’-GCTCTCGCTCCTCACGCCCTACAT-3’；下游引物5’-TGGGTCCCCATGGTAAACCTCACG-3’。擴(kuò)增體系模板1μl總RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，10×Taq緩沖液2μl，2.5mM dNTP 1.6μl，10μM上游引物和下游引物各1μl，1U Taq酶，加水補(bǔ)至總體積20μl。PCR循環(huán)條件94℃變性3分鐘后，按如下常數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，共20個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測。
OsSUT在水稻穎果發(fā)育過程中的表達(dá)狀態(tài)的RT-PCR檢測結(jié)果如圖3所示，表明在水稻穎果發(fā)育過程中，具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能的OsSUT1的表達(dá)與發(fā)育進(jìn)程具有密切的相關(guān)，呈現(xiàn)顯著的發(fā)育時期特異性；相對而言，OsSUT2呈現(xiàn)組成型恒定表達(dá)的特征。圖3中，泳道上的數(shù)字表示抽穗后的天數(shù)，“-”表示抽穗前；rRNA表示模板量。
序列表<160>2<210>1<211>1830<212>DNA<213>水稻屬水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>1atctcaccaa accctaccag atctacgccc cgccatggac tccgccgccg gcggtggcgg60cctcacggcc atccgcctgc cctaccgcca cctccgcgac gccgagatgg agctcgtcag120cctcaacggc ggcacccccc gcggaggctc ccccaaggac cccgacgcca cgcaccagca180ggggcccccc gccgcccgta ccaccaccac caggaagctc gtcctcgcct gcatggtcgc240cgccggcgtg cagttcggct gggcgcttca gctctcgctc ctcacgccct acatccagac300cctaggaata gaccatgcca tggcatcatt catttggctt tgtggaccta ttactggttt360tgtggttcaa ccatgtgttg gtgtctggag tgacaaatgc cgttcaaagt atggaagaag420gagaccgttc attttggctg gatgcttgat gatatgcttt gctgtaactt taatcggatt480ttctgcagac cttggttaca ttttaggaga taccactgag cactgcagta catataaagg540ttcaagattt cgagccgcta ttattttcgt tcttgggttc tggatgttgg atctcgcaaa600ccatacagtt caaggtcctg ctcgtgccct tttagctgac ctttcaggtc ctgatcagtg660taattctgca aatgcaattt tttgcacatg gatggctgtt ggaaacgttc ttggtttttc720atctggtgct agtgggaatt ggcacaagtg gtttcctttt ctaatgacaa gagcatgctg780tgaagcttgt agtaatttga aagccgcttt tctggttgca gttgtattcc ttttgttttg840tatgtctgtt accctgtact ttgctgaaga gatcccgctg gaaccaacag atgcacaacg900attatctgat tctgcgcctc tcctgaatgg ttctagagat gataacaatg catcaaatga960acctcgtaat ggagcacttc ctaatggtca tacagatgga agcaatgtcc cagctaactc1020caacgctgag gactccaatt caaacagaga gaatgtcgaa gttttcaatg atggaccagg1080agcagttttg gtgaatattt tgactagcat gaggcatcta cctcctggaa tgtactctgt1140tcttctagtt atggctctaa catggttgtc gtggtttccc tttttccttt ttgatactga1200ctggatggga cgtgaggttt accatgggga cccaaatggc aacttgagtg aaaggaaagc1260ttatgacaac ggtgtccgag aaggtgcatt tggtttgcta ttgaattcag ttgtccttgg1320
atttgggtcc ttccttgttg atccactatg ccggctgatg ggtgctagac tggtttgggc1380aatcagcaac ttcacagtgt ttatctgcat gctggctaca gcaatattaa gttggatctc1440ttttgatttg tactcaagta aacttcacca catcattgga gcaaataaaa cagtgaagaa1500ttcagccttg attgttttct ccctacttgg actgccactc tcgatcacat atggcgttcc1560tttttctgtg actgctgagc tgactgctgg aacaggaagt ggacaaggtc tggcaacagg1620agtcctgaac cttgcaatcg ttgttccgca gatagtagtg tcactaggag caggtccatg1680ggatgctctc tttgggggag ggaacgtccc tgctttcgcc ttggcttccg ttttctcact1740aggagctggt gtcctcgcgg tccttaagct acccaagctg ccaaactctt acagatctgc1800tgggttccat ggatttggct gagcagaaca 1830<210>2<211>595<212>PRT<213>水稻屬水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>2Met Asp Ser Ala Ala Gly Gly Gly Gly Leu Thr Ala Ile Arg Leu Pro1 5 10 15Tyr Arg His Leu Arg Asp Ala Glu Met Glu Leu Val Ser Leu Asn Gly20 25 30Gly Thr Pro Arg Gly Gly Ser Pro Lys Asp Pro Asp Ala Thr His Gln35 40 45Gln Gly Pro Pro Ala Ala Arg Thr Thr Thr Thr Arg Lys Leu Val Leu50 55 60Ala Cys Met Val Ala Ala Gly Val Gln Phe Gly Trp Ala Leu Gln Leu65 70 75 80Ser Leu Leu Thr Pro Tyr Ile Gln Thr Leu Gly Ile Asp His Ala Met85 90 95Ala Ser Phe Ile Trp Leu Cys Gly Pro Ile Thr Gly Phe Val Val Gln100 105 110Pro Cys Val Gly Val Trp Ser Asp Lys Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Arg115 120 125
Arg Arg Pro Phe Ile Leu Ala Gly Cys Leu Met Ile Cys Phe Ala Val130 135 140Thr Leu Ile Gly Phe Ser Ala Asp Leu Gly Tyr Ile Leu Gly Asp Thr145 150 155 160Thr Glu His Cys Ser Thr Tyr Lys Gly Ser Arg Phe Arg Ala Ala Ile165 170 175Ile Phe Val Leu Gly Phe Trp Met Leu Asp Leu Ala Asn Asn Thr Val180 185 190Gln Gly Pro Ala Arg Ala Leu Leu Ala Asp Leu Ser Gly Pro Asp Gln195 200 205Cys Asn Ser Ala Asn Ala Ile Phe Cys Thr Trp Met Ala Val Gly Asn210 215 220Val Leu Gly Phe Ser Ser Gly Ala Ser Gly Asn Trp His Lys Trp Phe225 230 235 240Pro Phe Leu Met Thr Arg Ala Cys Cys Glu Ala Cys Ser Asn Leu Lys245 250 255Ala Ala Phe Leu Val Ala Val Val Phe Leu Leu Phe Cys Met Ser Val260 265 270Thr Leu Tyr Phe Ala Glu Glu Ile Pro Leu Glu Pro Thr Asp Ala Gln275 280 285Arg Leu Ser Asp Ser Ala Pro Leu Leu Asn Gly Ser Arg Asp Asp Asn290 295 300Asn Ala Ser Asn Glu Pro Arg Asn Gly Ala Leu Pro Asn Gly His Thr305 310 315 320Asp Gly Ser Asn Val Pro Ala Asn Ser Asn Ala Glu Asp Ser Asn Ser325 330 335Asn Arg Glu Asn Val Glu Val Phe Asn Asp Gly Pro Gly Ala Val Leu340 345 350Val Asn Ile Leu Thr Ser Met Arg His Leu Pro Pro Gly Met Tyr Ser355 360 365Val Leu Leu Val Met Ala Leu Thr Trp Leu Ser Trp Phe Pro Phe Phe370 375 380
Leu Phe Asp Thr Asp Trp Met Gly Arg Glu Val Tyr His Gly Asp Pro385 390 395 400Asn Gly Asn Leu Ser Glu Arg Lys Ala Tyr Asp Asn Gly Val Arg Glu405 410 415Gly Ala Phe Gly Leu Leu Leu Asn Ser Val Val Leu Gly Ile Gly Ser420 425 430Phe Leu Val Asp Pro Leu Cys Arg Leu Met Gly Ala Arg Leu Val Trp435 440 445Ala Ile Ser Asn Phe Thr Val Phe Ile Cys Met Leu Ala Thr Ala Ile450 455 460Leu Ser Trp Ile Ser Phe Asp Leu Tyr Ser Ser Lys Leu His His Ile465 470 475 480Ile Gly Ala Asn Lys Thr Val Lys Asn Ser Ala Leu Ile Val Phe Ser485 490 495Leu Leu Gly Leu Pro Leu Ser Ile Thr Tyr Ser Val Pro Phe Ser Val500 505 510Thr Ala Glu Leu Thr Ala Gly Thr Gly Gly Gly Gln Gly Leu Ala Thr515 520 525Gly Val Leu Asn Leu Ala Ile Val Val Pro Gln Ile Val Val Ser Leu530 535 540Gly Ala Gly Pro Trp Asp Ala Leu Phe Gly Gly Gly Asn Val Pro Ala545 550 555 560Phe Ala Leu Ala Ser Val Phe Ser Leu Gly Ala Gly Val Leu Ala Val565 570 575Leu Lys Leu Pro Lys Leu Pro Asn Ser Tyr Arg Ser Ala Gly Phe His580 585 590Gly Phe Gly59權(quán)利要求
1.一種水稻蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體類似蛋白基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于所述水稻蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體類似蛋白基因是序列表中的SEQ ID №1。
3.水稻蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體類似蛋白基因編碼蛋白，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述水稻蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體類似蛋白基因編碼蛋白是序列表中的SEQ ID №2。
5.含有權(quán)利要求1所述水稻蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體類似蛋白基因的表達(dá)載體。
6.含有權(quán)利要求1所述水稻蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體類似蛋白基因的細(xì)胞系。
7.擴(kuò)增權(quán)利要求1所述水稻蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體類似蛋白基因的任一片段的引物。
8.權(quán)利要求1所述水稻蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體類似蛋白基因在水稻育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體類似蛋白基因及其編碼蛋白與應(yīng)用，本發(fā)明所提供的水稻蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體類似蛋白基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。水稻蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體類似蛋白基因編碼蛋白，是具有序列表中SEQ ID№2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的水稻蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體類似蛋白基因?qū)⒃谒居N中發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N15/63GK1626659SQ20031011706
公開日2005年6月15日 申請日期2003年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月8日
發(fā)明者王英典, 王欣生, 陳星 , 程偉 申請人:北京師范大學(xué)