專利名稱：一種l－山梨酮脫氫酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域中一種L-山梨酮脫氫酶及其編碼基因與表達(dá)方法、應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2-酮基-L-古龍酸(2-KGA)是合成抗壞血酸(維生素C)的重要中間體，已知有多種微生物能將L-山梨醇/山梨糖轉(zhuǎn)化為2-KGA。如Stoddard等所用的NRRL B-21627(美國專利US 5834231)，T.Hoshino等所提到的DSM4025(歐洲專利EP9611500.8)，尹光琳等提到的SCB329等(中國專利96116464.6)。
有多篇文獻(xiàn)報道用微生物能夠?qū)-山梨糖轉(zhuǎn)化為2-KGA，美國專利3907.639公開了屬于醋菌屬、假單孢菌、沙雷氏桿菌、葡萄狀球菌、氣桿菌、產(chǎn)堿桿菌、青霉菌、假絲酵母以及葡萄糖酸菌的微生物具有上述轉(zhuǎn)化活性。Kitamura等(EuropeJ.Appl.Microbiol.2.1.1975)報道在氧化葡萄糖桿菌生黑亞種IF03293中發(fā)現(xiàn)的L-山梨酮氧化酶的酶活性既不需要輔酶也不需要電子受體，Makover等(Biotechnol.Bioeng，17.1485.1975)也報道L-山梨酮脫氫酶(SNDH)活性存在于假單孢菌putida ATCC21812及氧化葡萄糖桿菌生黑亞種IF03293并指出NAD或NADP不是其輔酶。Fujiwara等(美國專利4902617)所發(fā)現(xiàn)的SNDH分子量為190000±20000道爾頓，由4個亞基組成，來源為氧化葡萄糖酸菌，美國專利5085993發(fā)現(xiàn)的SNDH來源于假單孢菌putida，其分子量約為47000道爾頓，在基因水平僅有YashimasaSaito等(Biotechnology and Bioengineering，Vol，58，NOS APRIL 20/May 5 1998)在氧化葡萄糖酸菌T-100中克隆出SNDH基因，該SNDH由498個氨基酸組成。
對比化學(xué)合成法生產(chǎn)維生素C的七步化學(xué)反應(yīng)，用微生物經(jīng)2步發(fā)酵由山梨醇生成2-KGA，再經(jīng)甲醇酯化生成維生素C是目前中國通用的方法。但在2步發(fā)酵中使用了3種微生物，即在由L-山梨糖到2-KGA的轉(zhuǎn)化過程中有2種微生物參與，其中一個是轉(zhuǎn)化L-山梨糖為2-KGA的產(chǎn)酸菌。有生產(chǎn)應(yīng)用價值的氧化葡萄糖酸桿菌通常單獨生長較慢，2-KGA的轉(zhuǎn)化率較低，所以目前工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用的均是采用兩菌共生，如枯草桿菌、蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌等與產(chǎn)酸菌共同發(fā)酵。而在實際生產(chǎn)中仍存在相當(dāng)多的問題，比如轉(zhuǎn)化率低、工藝控制較為復(fù)雜等。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種L-山梨酮脫氫酶及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的L-山梨酮脫氫酶，名稱為rSNDH，是具有序列表中SEQ ID No2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或與序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列具有至少80％同源性且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
所述SEQ ID №2來源于酮古龍酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104(CCTCCNo.M203094)，由429個氨基酸殘基組成。
酮古龍酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104，已于2003年11月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號為CCTCC No.M203094。
所述與序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列具有至少80％同源性且具有與SEQID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)優(yōu)選為與SEQ ID №2具有至少90％同源性且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)，尤其優(yōu)選為將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
所述L-山梨酮脫氫酶可為將與序列表中SEQ ID №1具有至少80％同源性的序列在宿主菌大腸桿菌或畢赤酵母中表達(dá)得到的蛋白質(zhì)。
一種L-山梨酮脫氫酶的編碼基因，名稱為rSNDH，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列，其中，優(yōu)選為與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
所述SEQ ID №1來源于酮古龍酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104 CCTCCNo.M203094，由1290個堿基組成，該基因的開放閱讀框架(ORF)為自5’端第1到第1290位堿基。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體和細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，利用現(xiàn)有分子生物學(xué)的方法可以得到不同的表達(dá)載體和細(xì)胞系(工程菌)如，含有本發(fā)明基因大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌TOP10或畢赤酵母X-33。也可用常規(guī)方法將含有本發(fā)明基因的上述工程菌固定于不同的載體中，制備固定化細(xì)胞。
可將本發(fā)明的L-山梨酮脫氫酶固定在瓊脂糖、丙烯酰胺、藻酸鈉等支持物上，制備固定化酶。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種表達(dá)L-山梨酮脫氫酶的方法。
本發(fā)明所提供的表達(dá)L-山梨酮脫氫酶的方法，是將以酮古龍酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104 CCTCC No.M203094基因組DNA為模板擴(kuò)增得到的L-山梨酮脫氫酶的編碼基因?qū)氡磉_(dá)宿主菌，得到陽性克隆，培養(yǎng)陽性克隆，表達(dá)L-山梨酮脫氫酶。
其中，酮古龍酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104 CCTCC No.M203094基因組DNA可按常規(guī)方法提取。以酮古龍酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104 CCTCCNo.M203094基因組DNA為模板擴(kuò)增L-山梨酮脫氫酶基因的一對引物可為序列表中SEQID№3和SEQ ID №4、SEQ ID №5和SEQ ID №6或SEQ ID №7和SEQ ID№8。
其中，SEQ ID №3由26個堿基組成，SEQ ID №4由24個堿基組成，SEQ ID№5由32個堿基組成，SEQ ID №6由24個堿基組成，SEQ ID №7由35個堿基組成，SEQ ID №8由24個堿基組成。
所述陽性克隆可為含有L-山梨酮脫氫酶編碼基因的大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌TOP10或畢赤酵母X-33。
本發(fā)明的L-山梨酮脫氫酶不依賴輔酶NAD，但輔酶NAD的存在能夠提高該酶的轉(zhuǎn)化效率，該酶將L-山梨酮轉(zhuǎn)化為2-KGA的PH范圍為5.0-9.0，最適為7.5。
本發(fā)明通過對酮古龍酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104 CCTCC No.M203094的全基因組序列測定，經(jīng)基因注釋，預(yù)測出與2-酮基-L-古龍酸合成有關(guān)的關(guān)鍵酶基因-L-山梨酮脫氫酶基因(rSNDH)。其DNA序列與所有已知的L-山梨酮脫氫酶基因序列相比同源性很低，翻譯成蛋白后與紅色非硫黃細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)有68％的同源性，與丁香假單胞菌SNDH有53％同源性，與苜蓿根瘤菌SNDH有50％同源性，而與另一種維生素C生產(chǎn)用菌氧化葡萄糖酸桿菌中的SNDH基本無同源性。用分子生物學(xué)手段將該基因表達(dá)于不同的載體及宿主中所產(chǎn)生的蛋白(酶)均能在體外有效地將L-山梨酮轉(zhuǎn)化為2-酮基-L-古龍酸(2-KGA)，不論任何形式表達(dá)的SNDH(包含體，分泌蛋白，融合蛋白)均在體外具有SNDH酶活性，同時，攜有本發(fā)明的rSNDH編碼基因的E.coli工程菌與2-KGA轉(zhuǎn)化菌共培養(yǎng)時，本發(fā)明的rSNDH顯著提高2-KGA的轉(zhuǎn)化率，本發(fā)明的rSNDH編碼基因為2-KGA合成中的關(guān)鍵酶基因?？衫帽景l(fā)明的L-山梨酮脫氫酶基因?qū)ΜF(xiàn)有的2-KGA產(chǎn)生菌進(jìn)行改造、定向育種，提高2-KGA的產(chǎn)量，如將本發(fā)明的L-山梨酮脫氫酶基因或其突變體或片段插入現(xiàn)有的2-KGA產(chǎn)生菌基因組中，以增強(qiáng)L-山梨酮脫氫酶的活性，或用分子生物學(xué)手段表達(dá)本發(fā)明的L-山梨酮脫氫酶基因，利用固定化酶法或固定化細(xì)胞法在體外合成2-KGA，或合成本發(fā)明的L-山梨酮脫氫酶基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)用于2-KGA的生產(chǎn)，降低2-KGA的生產(chǎn)成本、提高2-KGA的轉(zhuǎn)化率、減少對環(huán)境的污染、減少生產(chǎn)過程對能源的需求、提高產(chǎn)品的質(zhì)量。本發(fā)明具有重要的工業(yè)應(yīng)用前景。


圖1為L-山梨酮脫氫酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜圖2為L-山梨酮脫氫酶基因在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)產(chǎn)物的SDS PAGE圖譜圖3為L-山梨酮脫氫酶基因在大腸桿菌TOP10中表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE圖譜圖4為L-山梨酮脫氫酶基因在畢赤酵母X-33中表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE圖譜圖5為陽性克隆大腸桿菌TOP10融合表達(dá)的rSNDH的活性曲線圖6為陽性克隆大腸桿菌TOP10融合表達(dá)的rSNDH的Chelating-SFF層析純化結(jié)果圖7為rSNDH的酶活性與pH的關(guān)系曲線圖8為rSNDH酶在輔酶存在條件下反應(yīng)0時間的HPLC圖譜圖9為rSNDH酶在輔酶存在條件下反應(yīng)5小時的HPLC圖譜圖10為L-山梨酮和2-酮基-L-古龍酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜圖11為rSNDH酶在沒有輔酶存在條件下反應(yīng)5小時的HPLC圖譜圖12為rSNDH酶在沒有輔酶存在條件下將L-山梨酮轉(zhuǎn)化為2-KGA的質(zhì)譜13為2-KGA標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖具體實施方式
實施例1、L-山梨酮脫氫酶基因rSNDH的獲得華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司維生素C生產(chǎn)用菌株酮古龍酸菌(Ketogulonigeniumsp.)WB0104 CCTCC No.M203094，用于發(fā)酵法將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為2-酮基-L-古龍酸，后者是維生素C的重要前體。收集對數(shù)生長期的酮古龍酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0 104(CCTCC No.M203094)，用HPLC方法檢測其培養(yǎng)上清中含有2-酮基-L-古龍酸，該HPLC方法中所用的儀器及試劑有Waters 515高效液相泵兩臺，Alltech 2000型ELSD；乙腈(HPLC級)；三氟乙酸(分析純)；Milli Q plus純水。ELSD霧化氣為N2，流速2.51/min，漂移管溫度100℃；色譜柱為Thermo Quest APS2 4.6mmi.d.×25cm 5μm；流動相乙腈-0.1％三氟乙酸水溶液(梯度)，流速1.3ml/min。進(jìn)樣量20ul。對照品L-山梨糖，2-酮基-L古龍酸。以細(xì)菌基因組DNA提取方法(《精編分子生物學(xué)實驗指南》科學(xué)出版社.39頁)提取基因組DNA，按全基因組鳥槍法進(jìn)行基因組序列測定(Fleischmann RD，Adams MD，et al.Science.1995.269(5223)496-512)，共進(jìn)行35000個反應(yīng)；測序總長度達(dá)18M，為其染色體DNA近6倍的覆蓋率。然后用PHRED-PHRAP，GLIMMER軟件包拼接注釋和進(jìn)行ORF預(yù)測根據(jù)基因注釋結(jié)果，預(yù)測L-山梨酮脫氫酶基因rSNDH序列為SEQ ID №1，編碼一個由429個氨基與紅色非硫黃細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)SNDH有68％的同源性，與丁香假單胞菌SNDH有53％同源性，與苜蓿根瘤菌SNDH有50％同源性，而與另一種維生素C生產(chǎn)用菌氧化葡萄糖酸桿菌中的SNDH基本無同源性。
實施例2、L-山梨酮脫氫酶基因rSNDH的表達(dá)1、PET-11B(Strategene)表達(dá)rSNDHPET11B表達(dá)引物5’引物GACATATGAGCGTTCTGGCCAAATTC(SEQ ID №3)3’引物CAGGATCCTTACGCAGCGGAAATC(SEQ ID №4)以酮古龍酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104(CCTCC No.M203094)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，50μl體系中含有終濃度為1.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPs，各0.2μmol/L的5’引物和3’引物，10mmol/L Tris-HCl，2u TaqDNA聚合酶；PCR反應(yīng)條件為94℃ 5分鐘；然后在如下條件下進(jìn)行30個循環(huán)94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃2分鐘；72℃10分鐘。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1所示，表明PCR產(chǎn)物大小為1.3Kb。圖中，分子量標(biāo)準(zhǔn)(marker)從小到大依次為250，500，750，1000，1500，2000，2500，3000，3500，4000，5000，6000，8000，10000，a為PET11B表達(dá)引物的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。
PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳回收純化與pGEM-T-VECTOR用T4DNA連接酶連接，然后轉(zhuǎn)化DH5α，挑取白斑，用QIAGEN的MINI質(zhì)粒提取柱提取質(zhì)粒并用酶切驗證，找出正確插入的pGEM-T-VECTOR-rSNDH質(zhì)粒后，經(jīng)NDEI/BAMHI，酶切并瓊脂糖電泳回收1.3kb后，與表達(dá)載體PET11B連接，轉(zhuǎn)化DH5α，鋪平板(含AMP100μg/ml)，挑取克隆并用酶切鑒定，得陽性克隆質(zhì)粒PET11B-rSNDH。
提取陽性克隆(含質(zhì)粒PET11B-rSNDH)中的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化表達(dá)用宿主大腸桿菌BL21(DE3)。挑單菌落接種到5mlLB培養(yǎng)基中(含AMP100μg/ml)37℃培養(yǎng)過夜，按1％接種量接種到50mlLB培養(yǎng)基中(含AMP100μg/ml)培養(yǎng)至OD＝0.6-1，加IPTG誘導(dǎo)(終濃度1.0mmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4個小時，離心收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖2所示，表明在45000道爾頓處檢測到特異條帶，說明檢測到L-山梨酮脫氫酶基因的表達(dá)產(chǎn)物。圖中，分子量標(biāo)準(zhǔn)(marker)兩條帶大小分別為60000，45000；a為誘導(dǎo)前對照，b為誘導(dǎo)后PET11B表達(dá)的rSNDH，箭頭所指為目的條帶。
2、PBAD/THIO-TOPO表達(dá)SNDHPBAD/TOPO THIOFUSION表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen)是一種快速高效的克隆表達(dá)系統(tǒng)，可以將PCR產(chǎn)物直接用于克隆，不用連接酶處理，5分鐘就可完成連接到載體用于表達(dá)，而且采用了THIOREDOXIN TRX硫氧還蛋白作為融合肽來表達(dá)外源蛋白，使外源蛋白以可溶的活性形式表達(dá)。采用PBAD的啟動子，用阿拉伯糖作為誘導(dǎo)物。
PBAD/THIO-TOPO表達(dá)引物5’引物GAGAATTCGATGAGCGTTCTGGCCAAATTCAC(SEQ ID №5)3’引物GATTACGCAGCGGAAATCCGCCAG(SEQ ID №6)PCR反應(yīng)條件94℃5分鐘，(94℃1分鐘，59℃1分鐘，72℃2分鐘)30個循環(huán)，72℃10分鐘。
PCR反應(yīng)體系以酮古龍酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104(CCTCC No.M203094)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，50μl體系中含有終濃度為1.5mmol/L MgCl2，0.2mmol/L dNTPs，各0.2μmol/L的5’引物和3’引物，10mmol/LTris-HCl，2uTaqDNA聚合酶。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1所示，表明PCR產(chǎn)物大小為1.3Kb。圖中，b為PBAD/THIO-TOPO表達(dá)引物PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果。PCR產(chǎn)物與PBAD/THIO-TOPO直接連接(克隆過程參照INVITORGEN PBAD/TOPO-THIOFUSION表達(dá)試劑盒)，然后轉(zhuǎn)化TOP10，挑單菌落接種到5mlLB培養(yǎng)基中(含AMP100μg/ml)37℃培養(yǎng)過夜，用QIAGEN的MINI質(zhì)粒提取柱提取質(zhì)粒并用酶切驗證，找出正確插入PBAD-rSNDH的質(zhì)粒后，確定為陽性克隆。
挑陽性克隆單菌落接種到5mlLB培養(yǎng)基中(含AMP100μg/ml)37℃培養(yǎng)過夜，按1％接種量接種到50mlLB培養(yǎng)基中(含AMP100μg/ml)培養(yǎng)至OD＝0.6-1，加阿拉伯糖誘導(dǎo)(終濃度0.02％)，繼續(xù)培養(yǎng)4個小時，離心收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖3所示，表明在57000道爾頓處檢測到特異條帶，說明檢測到L-山梨酮脫氫酶基因的表達(dá)產(chǎn)物。圖中，a為PBAD-rSNDH，分子量標(biāo)準(zhǔn)(marker)從大到小分別為94000，67000，43000，30000；箭頭所指為目的條帶。
3.畢赤酵母酵母中表達(dá)SNDH(1)L-山梨酮脫氫酶基因?qū)虢湍副磉_(dá)載體采用INVITROGEN畢赤酵母piczα表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建在畢赤酵母中表達(dá)rSNDH的表達(dá)載體piczαA/SND。
設(shè)計引物如下5’引物CACTCGAGAAAAGA ATGAGCGTTCTGGCCAAATTC(SEQ ID №7)3’引物CACTCGAGTTACGCAGCGGAAATC(SEQ ID №8)。
PCR反應(yīng)條件如下94℃3分鐘然后30個循環(huán)(94℃1分鐘，62℃1分鐘，72℃2分鐘)，72℃10分鐘。
以酮古龍酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104(CCTCC No.M203094)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后按常規(guī)方法將PCR產(chǎn)物連接pGEM-T-VECTOR，轉(zhuǎn)化后挑選白斑菌落，提質(zhì)粒，測序鑒定。將測序鑒定正確的pGEM-T-rSNDH和piczαA質(zhì)粒DNA分別用XHOI處理后，試劑盒回收約1200bp和3.3kb的片段，用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌，涂在LB平板(含ZEOCIN 25μg/ml)。提取質(zhì)粒，酶切鑒定。挑選連接方向與插入大小都正確的重組質(zhì)粒piczαA-rSNDH，用QIAGENMIDI質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，用于轉(zhuǎn)化畢赤酵母。
(2)重組質(zhì)粒的線性化將重組質(zhì)粒20μg piczαA-rSNDH用Sac I單酶切后，用水?dāng)U大至300μl體系，等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提1次，上清加1/10體積3M NaAc和2.5倍體積無水乙醇沉淀DNA，70％乙醇洗滌后，真空抽干，溶于20μl TE。
(3)感受態(tài)酵母宿主細(xì)胞的制備接種畢赤酵母表達(dá)宿主菌X-33于5ml YPD培養(yǎng)基中，30℃振搖過夜，次日轉(zhuǎn)到500ml新鮮YPD培養(yǎng)基中，30℃振搖培養(yǎng)至A600nm≈1.3-1.5，4℃ 5000rpm離心5min，棄上清，分別以500ml、250ml冰冷滅菌水及20ml冰冷1M山梨醇重懸洗滌菌體，將細(xì)胞重懸于1ml冰冷1M山梨醇中，制備成感受態(tài)。
(4)電轉(zhuǎn)化將100μl感受態(tài)細(xì)胞與5-10μg線性化的重組質(zhì)?；旌希D(zhuǎn)入0.2cm電轉(zhuǎn)杯，冰浴5min，于Bio-Rad Gene Pulser電轉(zhuǎn)儀1500V，25μF，200Ω條件下電轉(zhuǎn)化，立即加入1ml冰浴1M山梨醇，取100μl涂布于YPDS含ZEOCIN(Invitrogen)100μg/ml選擇平板上，30℃孵育2-3d，出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子。
(5)陽性克隆的直接PCR檢測接種轉(zhuǎn)化子單菌落于10μl無菌水中，加入5μl溶細(xì)胞酶(5U/μl)，30℃振搖10min，置于液氮氣相1min，室溫下解凍后直接用作模板，用一對檢測引物α-Factor和3’AOX1(Invitrigen easy select Pichia Expression Kit Manual)進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果檢測到L-山梨酮脫氫酶基因。
(6)表達(dá)實驗接種轉(zhuǎn)化子單菌落于50mlBMGY培養(yǎng)基于30℃培養(yǎng)至A600nm≈4.0時，每日補(bǔ)甲醇，氨水，誘導(dǎo)表達(dá)6d，樣品離心收集上清，SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖4所示，表明在45000道爾頓處檢測到特異條帶，說明檢測到L-山梨酮脫氫酶基因的表達(dá)產(chǎn)物。圖中，箭頭所指為rSNDH，分子量標(biāo)準(zhǔn)依次為94000，67000，43000，30000，20100。
實施例3、L-山梨酮脫氫酶基因功能驗證1、以NAD為輔酶，酶活性測定實施例3、L-山梨酮脫氫酶基因功能驗證1、以NAD為輔酶，酶活性測定參照文獻(xiàn)(Agri.Biol.Chem.54(5)1211-1218，1990)和SugiSANA等(Agric，Biol，Chem，55，363-370，1991)，以L-山梨酮為底物、NAD為電子受體，測定波長340nm處的光吸收值。所建立的以L-山梨酮為底物，以NAD為輔酶的酶活活性測定方法基本反應(yīng)液由L-山梨酮2.0mg，NAD 0.4mg，PB 50mM，pH7.0組成，在25℃水浴條件下，分別加入實施例2中三種表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的L-山梨酮脫氫酶(rSNDH)粗酶0.1mg/ml各10ul，總體積820ul，陽性克隆酵母X-33選上清液，陽性克隆大腸桿菌BL21(DE3)和TOP10菌體破壁去上清，測定340nm處光吸收的變化率，測定結(jié)果顯示各種形式表達(dá)的rSNDH均有活性，其中在陽性克隆大腸桿菌TOP10融合表達(dá)的rSNDH的活性如圖5所示，表明融合rSNDH有酶活活性，酶活力為0.1217u/mg。遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報導(dǎo)的粗酶活性(48.5mu/mg)。(酶活力單位定義為每分鐘催化還原1uMol NAD所需的酶量。經(jīng)測定表明該酶將L-山梨酮轉(zhuǎn)化為2-KGA的PH范圍為5.0-9.0，其中最適作用PH為7.5，如圖7所示。
2.rSNDH對L-山梨酮的體外轉(zhuǎn)化通過Chelating-SFF層析對陽性克隆大腸桿菌TOP10融合表達(dá)的rSNDH進(jìn)行純化，其中層析柱1.6×10cm，親和離子Ni2+，層析條件50mM PB緩沖液，pH7.0，咪唑(Imidazole)梯度。純化結(jié)果如圖6所示，箭頭所指為純化的rSNDH，分子量約為57000，分子量標(biāo)準(zhǔn)依次為94000，67000，43000，30000，20100。
按常規(guī)方法進(jìn)行了rSNDH對L-山梨酮的體外轉(zhuǎn)化試驗，反應(yīng)體系緩沖液50mMPB，pH8.0，L-山梨酮5mg/ml，rSNDH酶0.08mg/ml，NAD0.5mg/ml。37℃反應(yīng)5小時，產(chǎn)物2-KGA以HPLC方法定量測定，結(jié)果如圖8、9、10和11所示，表明rSNDH在體外將L-山梨酮轉(zhuǎn)化為2-KGA，輔酶NAD的存在有效地提高2-KGA的轉(zhuǎn)化率。圖中2-KGA的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為2mg/ml；L-山梨酮的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為2mg/ml；在無輔酶存在的條件下，2-KGA的生成濃度為0.86mg/ml；在有輔酶存在的條件下，2-KGA的生成濃度為1.42mg/ml。其中對無NAD參與反應(yīng)的轉(zhuǎn)化試驗用LS-MS驗證2-KGA的產(chǎn)生(電噴霧電離源ESI，電噴霧電壓3.0KV，電噴霧接口干燥氣N2，流速250L/hr，脫溶劑溫度190℃，碰撞誘導(dǎo)解離電壓30V，離子源溫度120℃)，結(jié)果如圖12和13所示，證明有2-KGA的特征吸收。
實施例4、表達(dá)rSNDH的宿主與酮古龍酸菌WB0104共培養(yǎng)將培養(yǎng)好的酮古龍酸菌WB0104種液及含有或無PBAD-rSNDH質(zhì)粒的E.coli TOP10混合(10∶1)共3ml(含L-山梨糖2.0％)接種到20ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵瓶培養(yǎng)基L-山梨糖8.0％，酵母膏0.2％，玉米漿2.0％，尿素1.2％，KH2PO40.1％，MgSO4.7H2O0.01％，輕質(zhì)碳酸鈣0.5％。在29℃，200rpm條件下培養(yǎng)，在24h測定古龍酸含量、40h左右取樣測發(fā)酵液體積、測定L-山梨糖(蒽酮法)和2-酮基-L-古龍酸含量(HPLC法)，根據(jù)L-山梨糖含量確定發(fā)酵終點取樣時間，并計算最終轉(zhuǎn)化率。結(jié)果如表1所示，表明rSNDH的表達(dá)顯著提高2-KGA的轉(zhuǎn)化率。

表1酮古龍酸菌WB0104和PBAD-rSNDH對L-山梨糖的轉(zhuǎn)化

注阿拉伯糖的終濃度為0.02％
序列表<160>8<210>1<211>1290<212>DNA<213>酮古龍酸菌WB0104(Ketogulonigenium sp.)<400>1atgagcgttc tggccaaatt cacttccatc gtcggcggcg tcatggtgct gctgcgtcgc60ggtcagacgc ctgcgcaaca ggcctttggc gcaacgccca gcatcccgcc tgcgcgcgaa 120cagggcatta tgaccctgaa aatgcccagc gccaaaggct gggagccggg gcacaagccc 180gtcgccgcac cgggtttgca ggtgaatgcc tatgccatgg gccttgacca tccgcgctgg 240ctgcatgtgc tggacaatgg cgatgtactg gtggccgaaa gctcgaacaa ggcgcgcaag 300ccgcgtagtt tcatggatca cgcacaggtc gcgacgatgc gccgtgccgg cgcgctgggc 360gaaagcgcga accggattac ccgcctgagc gatccggcgg gcacgggcac ggcgagtgat 420agccgcgtgt tcttgcagga tctgaaccaa cccttcggca tggccgtggt gggggatcgt 480ttctttgtcg gcaataccga tggtgtggtc gcctttgctt tcgatacggc cacgcagcag 540gctgttggcg ctggcgccaa actggtggat ttcaaacctg gtggccactg gacacgcagc 600ctgctggcct cgcaggatgg gcgcaagctc tatgcgggcg tcggttcgct gtcgaatatc 660ggtgatcaag gtatggaggc cgaagaaggc cgcgccgccg tttgggagct ggatctggac 720accggcgccg cgcgcatctt tgcgggcggt ctgcgcaatg ccgtcggcct tgcatgggag 780ccgacgaccg gcgccctctg gaccgtggtg aacgagcgcg acgggctggg cgacgagacc 840ccgcccgact acctgacatc ggtgcaggac ggcggctttt atggctggcc ctatagctat 900tgggacaaga tcgtcgatga tcgcgtgccg caagacgcag gcctggtcgc ccgttcgatc 960acgcccgatt acgcgctggg cgggcatacc gcgtcgctgg gcctgtgctg gatgccagcg 1020ggcacactgc cggggctgcc ggacgggatg gtgatcggtc agcacggctc atggaaccgc 1080gcgaaactca gcggctataa ggtggtcttt gtgccgtttg aaaatggccg cccctcgggc 1140cccagcgtcg atctgctgtc gggctttttg tcggatgatg aaaagcaatc ctatggccgc 1200ccggtggggg ttgtcgtcgg gccggatcag cgatccattc tggtcgccga tgatgtcggc 1260aatgcgatct ggcggatttc cgctgcgtaa 1290
<210>2<211>429<212>PRT<213>酮古龍酸菌WB0104(Ketogulonigenium sp.)<400>2Met Ser Val Leu Ala Lys Phe Thr Ser Ile Val Gly Gly Val Met Val1 5 10 15Leu Leu Arg Arg Gly Gln Thr Pro Ala Gln Gln Ala Phe Gly Ala Thr20 25 30Pro Ser Ile Pro Pro Ala Arg Glu Gln Gly Ile Met Thr Leu Lys Met35 40 45Pro Ser Ala Lys Gly Trp Glu Pro Gly His Lys Pro Val Ala Ala Pro50 55 60Gly Leu Gln Val Asn Ala Tyr Ala Met Gly Leu Asp His Pro Arg Trp65 70 75 80Leu His Val Leu Asp Asn Gly Asp Val Leu Val Ala Glu Ser Ser Asn85 90 95Lys Ala Arg Lys Pro Arg Ser Phe Met Asp His Ala Gln Val Ala Thr100 105 110Met Arg Arg Ala Gly Ala Leu Gly Glu Ser Ala Asn Arg Ile Thr Arg115 120 125Leu Ser Asp Pro Ala Gly Thr Gly Thr Ala Ser Asp Ser Arg Val Phe130 135 140Leu Gln Asp Leu Asn Gln Pro Phe Gly Met Ala Val Val Gly Asp Arg145 150 155 160Phe Phe Val Gly Asn Thr Asp Gly Val Val Ala Phe Ala Phe Asp Thr165 170 175Ala Thr Gln Gln Ala Val Gly Ala Gly Ala Lys Leu Val Asp Phe Lys180 185 190Pro Gly Gly His Trp Thr Arg Ser Leu Leu Ala Ser Gln Asp Gly Arg195 200 205
Lys Leu Tyr Ala Gly Val Gly Ser Leu Ser Asn Ile Gly Asp Gln Gly210 215 220Met Glu Ala Glu Glu Gly Arg Ala Ala Val Trp Glu Leu Asp Leu Asp225 230 235 240Thr Gly Ala Ala Arg Ile Phe Ala Gly Gly Leu Arg Asn Ala Val Gly245 250 255Leu Ala Trp Glu Pro Thr Thr Gly Ala Leu Trp Thr Val Val Asn Glu260 265 270Arg Asp Gly Leu Gly Asp Glu Thr Pro Pro Asp Tyr Leu Thr Ser Val275 280 285Gln Asp Gly Gly Phe Tyr Gly Trp Pro Tyr Ser Tyr Trp Asp Lys Ile290 295 300Val Asp Asp Arg Val Pro Gln Asp Ala Gly Leu Val Ala Arg Ser Ile305 310 315 320Thr Pro Asp Tyr Ala Leu Gly Gly His Thr Ala Ser Leu Gly Leu Cys325 330 335Trp Met Pro Ala Gly Thr Leu Pro Gly Leu Pro Asp Gly Met Val Ile340 345 350Gly Gln His Gly Ser Trp Asn Arg Ala Lys Leu Ser Gly Tyr Lys Val355 360 365Val Phe Val Pro Phe Glu Asn Gly Arg Pro Ser Gly Pro Ser Val Asp370 375 380Leu Leu Ser Gly Phe Leu Ser Asp Asp Glu Lys Gln Ser Tyr Gly Arg385 390 395 400Pro Val Gly Val Val Val Gly Pro Asp Gln Arg Ser Ile Leu Val Ala405 410 415Asp Asp Val Gly Asn AlaIle Trp Arg Ile Ser Ala Ala420425<210>3<211>26<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>
<400>3gacatatgag cgttctggcc aaattc 26<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4caggatcctt acgcagcgga aatc 24<210>5<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5gagaattcga tgagcgttct ggccaaattc ac 32<210>6
<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>6gattacgcag cggaaatccg ccag 24<210>7<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>7cactcgagaa aagaatgagc gtt ctggcca aattc35<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>8cactcgagtt acgcagcgga aatc 2權(quán)利要求
1.一種L-山梨酮脫氫酶，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或與序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列具有至少80％同源性且具有與SEQ ID№2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的L-山梨酮脫氫酶，其特征在于所述L-山梨酮脫氫酶是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的L-山梨酮脫氫酶，其特征在于所述與序列表中SEQ ID№2的氨基酸殘基序列具有至少80％同源性且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQID №2衍生的蛋白質(zhì)為與SEQ ID №2具有至少90％同源性且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的L-山梨酮脫氫酶，其特征在于所述L-山梨酮脫氫酶是將與序列表中SEQ ID №1具有至少80％同源性的序列在宿主菌大腸桿菌或畢赤酵母中表達(dá)得到的蛋白質(zhì)。
5.一種L-山梨酮脫氫酶的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
6.含有權(quán)利要求5所述基因的表達(dá)載體和細(xì)胞系。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體和細(xì)胞系，其特征在于所述細(xì)胞系為含有L-山梨酮脫氫酶編碼基因的大腸桿菌或畢赤酵母。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體和細(xì)胞系，其特征在于所述細(xì)胞系為固定化細(xì)胞。
9.一種表達(dá)L-山梨酮脫氫酶的方法，是將以酮古龍酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104 CCTCC No.M203094基因組DNA為模板擴(kuò)增得到的L-山梨酮脫氫酶的編碼基因?qū)氡磉_(dá)宿主菌，得到陽性克隆，培養(yǎng)陽性克隆，表達(dá)L-山梨酮脫氫酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述以酮古龍酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104 CCTCC No.M203094基因組DNA為模板擴(kuò)增L-山梨酮脫氫酶基因的一對引物為序列表中SEQ ID №3和SEQ ID №4、SEQ ID №5和SEQ ID №6或SEQ ID №7和SEQ ID №8。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述陽性克隆為含有L-山梨酮脫氫酶基因的大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌TOP10或畢赤酵母X-33。
12.權(quán)利要求1至4任一所述的L-山梨酮脫氫酶在將L-山梨酮轉(zhuǎn)化為2-KGA過程中的應(yīng)用。
13.權(quán)利要求5所述的L-山梨酮脫氫酶的編碼基因在將L-山梨酮轉(zhuǎn)化為2-KGA過程中的應(yīng)用。
14.權(quán)利要求6至8任一所述的含有L-山梨酮脫氫酶的編碼基因的表達(dá)載體和細(xì)胞系在將L-山梨酮轉(zhuǎn)化為2-KGA過程中的應(yīng)用。
15.權(quán)利要求5所述的基因在增強(qiáng)L-山梨酮脫氫酶活性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種L－山梨酮脫氫酶及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的L－山梨酮脫氫酶，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)或與序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列具有至少80％同源性且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。L－山梨酮脫氫酶的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。攜有本發(fā)明的L－山梨酮脫氫酶的編碼基因的E.coli工程菌與2－KGA轉(zhuǎn)化菌共培養(yǎng)時，本發(fā)明的rSNDH顯著提高2－KGA的轉(zhuǎn)化率。
文檔編號C12N9/04GK1621518SQ20031011683
公開日2005年6月1日 申請日期2003年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月28日
發(fā)明者賈茜, 金奇, 吳洪濤, 楊帆, 孫君偉, 張笑冰, 郝愛魚, 耿文飛, 徐平, 修建新, 趙穎, 謝萍, 米造吉 申請人:華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司, 中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所