專(zhuān)利名稱(chēng)：人血清白蛋白與白細(xì)胞介素2的融合蛋白及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一種人血清白蛋白與白細(xì)胞介素2的融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血清白蛋白是血漿的重要成份，也是許多內(nèi)源因子和外源藥物的載體，正常情況下不易透過(guò)腎小球。人血清白蛋白(HAS)是一種由585個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)(序列表中序列1)(A.Dugaiczyk et al.，PNAS，1982 7971-75)，其分子量約為66.5KD，血漿半衰期長(zhǎng)達(dá)2周以上。
HSA在細(xì)胞中是以一種含18個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽和6個(gè)前肽的原肽形式合成的，信號(hào)肽和前肽在轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌過(guò)程中被切除。人血清白蛋白已成功地在多種宿主中表達(dá)(EP330451和EP361991)。
白細(xì)胞介素2(IL-2)是T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生的15.5kD糖蛋白，在機(jī)體的免疫應(yīng)答中起重要作用。(人)白細(xì)胞介素2((h)IL-2)由133個(gè)氨基酸殘基組成(序列表中序列2)，有一個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵，和一個(gè)位于成熟蛋白第125位氨基酸殘基的半胱氨酸，這個(gè)半胱氨酸易與另兩個(gè)半胱氨酸形成錯(cuò)配二硫鍵，二硫鍵異常配對(duì)的IL-2沒(méi)有活性。將該半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸或丙氨酸可以避免這個(gè)問(wèn)題，而不改變其活性。IL-2主要作用于免疫細(xì)胞，包括T細(xì)胞、大顆粒淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、B細(xì)胞和少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞因子。在體內(nèi)，IL-2有抗腫瘤、抗微生物感染及免疫調(diào)節(jié)等作用。單獨(dú)使用或與IFN-α、單克隆抗體、LAK細(xì)胞等合用于臨床，對(duì)腎細(xì)胞癌、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和淋巴瘤等有一定的治療作用，對(duì)結(jié)腸癌也有療效，還能提高腫瘤病人對(duì)放、化療的耐受性。目前臨床上將其廣泛用于腫瘤、病毒性肝炎等的治療，療效顯著。但上述疾病一般病程較長(zhǎng)，因而需長(zhǎng)期使用IL-2，而IL-2的血漿半衰期僅為2小時(shí)左右，為維持藥效需大劑量頻繁注射，這不僅大大提高了治療成本，而且增加了病人的痛苦，增加了副反應(yīng)。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種可延長(zhǎng)人白細(xì)胞介素2的血漿半衰期的人血清白蛋白與白細(xì)胞介素2融合蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的人血清白蛋白與白細(xì)胞介素2的融合蛋白，包括與序列表中SEQID №1具有至少85％序列同源性的氨基酸殘基序列的第一區(qū)和與序列表中SEQ ID №2具有至少85％序列同源性的氨基酸殘基序列的第二區(qū)。
序列表中SEQ ID №1是由585個(gè)氨基酸殘基組成的人血清白蛋白；序列表中SEQ ID №2是由133個(gè)氨基酸殘基組成的人白細(xì)胞介素2。
其中，人血清白蛋白與白細(xì)胞介素2的融合蛋白優(yōu)選的是包括與序列表中SEQ ID№1具有至少95％序列同源性的氨基酸殘基序列的第一區(qū)和與序列表中SEQ ID №2具有至少95％序列同源性的氨基酸殘基序列的第二區(qū)；最優(yōu)選的是包括序列表中SEQID №1的氨基酸殘基序列的第一區(qū)和序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的第二區(qū)，或上述二區(qū)的功能等同物，所述功能等同物是在不改變所述融合蛋白特性的前提下，對(duì)所述融合蛋白個(gè)別氨基酸殘基的取代、缺失或添加得到的多肽。
其中，所述取代可發(fā)生在序列表中SEQ ID №2的自氨基端的第125位半胱氨酸，可被絲氨酸或丙氨酸取代。
在本發(fā)明的融合蛋白中，可以是與序列表中SEQ ID №1同源的第一區(qū)位于融合蛋白的N-末端，與序列表中SEQ ID №2同源的第二區(qū)位于融合蛋白的C-末端；也可以是與序列表中SEQ ID №2同源的第二區(qū)位于融合蛋白的N-末端，與序列表中SEQ ID №1同源的第一區(qū)位于融合蛋白的C-末端，但前一種情況的基因在酵母中的表達(dá)較高。
為了使融合蛋白兩部分間有較大的間隔，使人白細(xì)胞介素2部分最大可能地與白細(xì)胞介素2受體結(jié)合，所述與序列表中SEQ ID №1同源的第一區(qū)與序列表中SEQ ID№2同源的第二區(qū)之間設(shè)有連接肽，所述連接肽的通式是[GlyGlyGlyGlySer]n，n為1-10的整數(shù)；其中，優(yōu)選的是n為1-3的整數(shù)。
上述人血清白蛋白與白細(xì)胞介素2的融合蛋白最好為具有序列表中SEQ ID №4氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
序列表中SEQ ID №4是由723個(gè)氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)，其中自氨基端的第1位-第585位為人血清白蛋白的編碼序列，自氨基端的第586位-第590位為連接肽的編碼序列GlyGlyGlyGlySer，自氨基端的第591位-第723位為人白細(xì)胞介素2的編碼序列。
上述融合蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，其中，優(yōu)選的是由序列表中SEQ ID №4的氨基酸殘基序列組成的人血清白蛋白與白細(xì)胞介素2的融合蛋白的編碼基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №4蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列具有80％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中SEQ ID №3的DNA序列由2253個(gè)堿基組成，該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第9到第2253位堿基。
含有上述編碼基因的重組表達(dá)載體和細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組表達(dá)載體可為pHIL-D2HSAIL-2、pHIL-D2HSAIL-20、pHIL-D2HSAIL-22、pHIL-D2HSAIL-23、pPIC9-IL-2-HSA質(zhì)粒等；所細(xì)胞系可為含有上述編碼基因的細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞；其中優(yōu)選的是酵母，更優(yōu)選的是畢赤酵母，最優(yōu)選的是畢赤酵母GS115。
人血清白蛋白天然存在多態(tài)性，本發(fā)明融合蛋白中的人血清白蛋白部分也包括這些多態(tài)型。
編碼HSA的多聚核苷酸和編碼hIL-2的多聚核苷酸可以用本領(lǐng)域周知的方法，如PCR(Saiki等Science.239487-491，1988)、RT-PCR方法、人工合成的方法和構(gòu)建篩選cDNA文庫(kù)的方法等獲得，用作PCR模板和用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)的mRNA或cDNA可以來(lái)源于任何含有相應(yīng)mRNA或cDNA的組織、細(xì)胞、及文庫(kù)等，如從人肝胎cDNA文庫(kù)(購(gòu)自Clontech Laboratories Inc.USA)獲得。也可以用人工合成的方法獲得，人工合成時(shí)可選用宿主偏愛(ài)的密碼子，這樣往往可以提高產(chǎn)物的表達(dá)。根據(jù)需要，可用本領(lǐng)域公知的方法對(duì)多聚核苷酸進(jìn)行突變、缺失、插入、和與其它多聚核苷酸連接等。編碼HSA和編碼hIL-2的多聚核苷酸的融合，在保持各自閱讀框架不變的前提下，可以用本領(lǐng)域周知的各種方法，如通過(guò)PCR的方法，在編碼序列的兩側(cè)引入限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，通過(guò)酶切產(chǎn)生粘性末端，編碼HSA和編碼hIL-2的多聚核苷酸的粘性末端用DNA連接酶連接，從而獲得編碼融合蛋白的基因。如果需要，可在本發(fā)明的編碼融合蛋白基因的兩側(cè)引入多聚核苷酸，引入的多聚核苷酸可有限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)?？捎帽绢I(lǐng)域公知的方法將含編碼融合蛋白序列的核酸克隆到各種表達(dá)載體中去。所用標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆過(guò)程見(jiàn)J.薩姆布魯克等(J.薩姆布魯克等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社，1995.)。
表達(dá)載體和其對(duì)應(yīng)的宿主可以從公司購(gòu)得，如酵母表達(dá)載體pHIL-D2，pPIC9，pHIL-S1(Invitrogen Corp.San Diego.California.USA)，動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pSVK3、pMSG(Amersham Pharmacia Biotech Inc.USA)等。優(yōu)選的方法是將編碼本發(fā)明的融合蛋白或多肽的核酸克隆至酵母表達(dá)載體pHIL-D2，pPIC9等，這些質(zhì)粒為酵母整合型質(zhì)粒，帶有His4選擇性標(biāo)記。醇氧化酶操縱子(AOX1)5’序列和3’序列，用于方便編碼基因整合至酵母染色體，和控制編碼基因的表達(dá)。這些質(zhì)粒及對(duì)應(yīng)的宿主菌等可以從Invitrogen Corp.San Diego.California.USA構(gòu)得，優(yōu)選的啟動(dòng)子為AOX1。
表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白的宿主可以是酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌、動(dòng)物、植物等。表達(dá)的融合蛋白或多肽可以存在于宿主細(xì)胞內(nèi)，也可以是從宿主中分泌出來(lái)，優(yōu)選的表達(dá)方式是從宿主中分泌出來(lái)。分泌所用的信號(hào)肽，優(yōu)選的是天然的人血清白蛋白的信號(hào)肽，或酵母MFα信號(hào)肽，或這兩種信號(hào)肽的類(lèi)似物。更優(yōu)選的用天然的人血清白蛋白的信號(hào)肽，用該信號(hào)肽時(shí)融合蛋白表達(dá)水平較高。融合蛋白或多肽也可以不用信號(hào)肽，而在酵母中以胞內(nèi)可溶形式表達(dá)。編碼融合蛋白的核酸，可以插入至宿主染色體，或以游離質(zhì)粒形式存在。
將所需核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞可用通常的方法，如電穿孔，制備感受態(tài)的原生質(zhì)球等。陽(yáng)性細(xì)胞，即含有本發(fā)明DNA重組體的細(xì)胞，可通過(guò)人們熟知的技術(shù)加以鑒定，如細(xì)胞經(jīng)收集并裂解，提取DNA，然后PCR方法鑒定；細(xì)胞培養(yǎng)上清液中或細(xì)胞破碎液中的蛋白可用抗HSA或抗IL-2的抗體檢測(cè)。
可以通過(guò)培養(yǎng)含有本發(fā)明DNA重組載體的宿主，如重組酵母、重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞、重組細(xì)菌、轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物等，生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白。具體的培養(yǎng)方法可以用搖瓶或生物反應(yīng)器等，生產(chǎn)時(shí)優(yōu)選為生物反應(yīng)器。所用培養(yǎng)基應(yīng)能提供菌體(或細(xì)胞)生長(zhǎng)和產(chǎn)物表達(dá)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，應(yīng)包含氮源、碳源、pH緩沖成分等，培養(yǎng)基配方一般應(yīng)根據(jù)不同培養(yǎng)對(duì)象，通過(guò)試驗(yàn)獲得。培養(yǎng)可分為兩個(gè)階段，第一階段主要用于菌體(或細(xì)胞)的生長(zhǎng)，第二階段主要用于合成產(chǎn)物。
可以用各種分離蛋白的方法分離、純化本發(fā)明的融合蛋白，如鹽析、沉淀、超濾、液相層析等技術(shù)及這些技術(shù)的組合。其中液相層析可以用凝膠排阻、親和、離子交換、疏水、反相等層析技術(shù)。
本發(fā)明的融合蛋白可以有各種衍生物，這些衍生物可以是但不局限于其不同形式的鹽、修飾產(chǎn)物等，如在多肽的氨基、羧基、羥基、巰基上再進(jìn)行修飾；所用修飾劑可以但不局限于聚乙二醇，葡聚糖等。
本發(fā)明的融合蛋白及其衍生物可單獨(dú)使用，優(yōu)選的為與一個(gè)或多個(gè)藥學(xué)上可接受的載體一起組成藥物制劑。藥物載體一般應(yīng)與融合蛋白相容且不能對(duì)受體自身有害，典型的載體為水、鹽水、糖類(lèi)、醇類(lèi)或氨基酸，它們需無(wú)菌且無(wú)致熱原。藥物制劑可以單位劑量的形式存在，優(yōu)選的單元?jiǎng)┝堪ㄓ腥诤系鞍椎娜沼脛┝炕騿卧沼脛┝炕蚱溥m當(dāng)?shù)膩喎?，并可通過(guò)任何本領(lǐng)域已知的方法制備。這些方法包括將融合蛋白與一種或多種輔助成分混合的步驟。優(yōu)選的藥物制劑包括含水的液體制劑和含水量低于10％或不含水的凍干制劑(凍干制劑是將液體制劑冷凍干燥制備的，使用前加入無(wú)菌、無(wú)熱原的液態(tài)載體，如注射用水)。這些制劑可以含有緩沖劑，鹽類(lèi)，小分子糖類(lèi)等，使藥物的滲透性與受體血液中的滲透性相等或相似。藥物制劑可存在于單元?jiǎng)┝炕蚨鄤┝康娜萜髦校缑芊獾陌财?，西林瓶或小管中?br> 本發(fā)明的融合蛋白及其衍生物或其藥物組合物可以通過(guò)任何已知的方法，包括注射(如皮下或肌肉)、靜脈輸注、透皮、吸入、口服等方法給藥。優(yōu)選的方法為靜脈輸注或注射給藥。治療方式包括在一段時(shí)間內(nèi)使用單一劑量或復(fù)合劑量。
本發(fā)明的融合蛋白既可以保留激活人白細(xì)胞介素2受體的活性，作為該受體的激動(dòng)劑，制成人白細(xì)胞介素2類(lèi)藥物，也可以?xún)H保留與該受體結(jié)合的活性，作為該受體的抑制劑，制成治療某些與人白細(xì)胞介素2或其受體過(guò)量表達(dá)有關(guān)疾病的藥物。本發(fā)明的融合蛋白及其衍生物或其藥物組合物，作為IL-2類(lèi)藥物可單獨(dú)使用或與IFN-α、單克隆抗體、LAK細(xì)胞等合用用于治療各種可用IL-2治療的疾病，這些疾病可以是腫瘤、微生物感染等，如腎細(xì)胞癌、黑色素瘤、淋巴瘤結(jié)腸癌、病毒性肝炎等的治療。作為IL-2受體抑制劑可用于治療某些與白細(xì)胞介素2或其受體過(guò)量表達(dá)有關(guān)的疾病，如某些白血病等。使用劑量可通過(guò)融合蛋白相對(duì)于人白細(xì)胞介素2(hIL-2)的效價(jià)計(jì)算出，同時(shí)考慮融合蛋白相對(duì)于天然hIL-2延長(zhǎng)的半衰期。典型用量為6.25×104-6×105IU/kg。在由全長(zhǎng)HSA和全長(zhǎng)h IL-2形成的融合蛋白中，按照摩爾數(shù)相當(dāng)即意味著使用較大重量的融合蛋白，但使用頻率可降低，如一周三次、一周兩次、一周一次或更少。
本發(fā)明將人血清白蛋白分子，或與其具有至少85％序列同源的類(lèi)似物或片段與人白細(xì)胞介素2，或與其具有至少85％序列同源的類(lèi)似物或片段融合，所形成的融合蛋白既保留了與人白細(xì)胞介素2受體結(jié)合的活性，同時(shí)與人白細(xì)胞介素2相比，其血漿半衰期又得到了延長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的融合蛋白與rhIL-2相比，在小鼠血漿中的半衰期明顯延長(zhǎng)。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。


圖1為pHIL-D2HSAIL-2質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程示意2為pD3HSAIL-20質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程示意3為pD3HSAIL-22質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程示意4為pPIC9-IL-2-HSA質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程示意5為純化的融合蛋白HSA/IL-2的SDS-PAGE分析圖6為融合蛋白HSA/IL-2酶聯(lián)免疫分析圖7為融合蛋白HSA/IL-2對(duì)CTLL-2細(xì)胞的刺激活性
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、hIL-2cDNA的克隆和HSA cDNA的克隆1、hIL-2cDNA的克隆(1)人外周血白細(xì)胞總RNA的制備靜脈抽取正常成年人血液5mL，肝素鈉抗凝。將血液用RPMI 1640培養(yǎng)基倍比稀釋后，加入淋巴細(xì)胞分離液，以2000r/min離心20min。吸取白細(xì)胞層，用含100ml/L小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基洗細(xì)胞3次并將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×109/L，加入終濃度為60mg/L的PHA，于37℃、50ml/L CO2培養(yǎng)箱中活化5h。收集細(xì)胞，用總RNA提取試劑盒，從細(xì)胞中提取總RNA用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
(2)hIL-2cDNA的克隆按照RT-PCR試劑盒的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以獲得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板進(jìn)行PCR獲得hIL-2cDNA，所用的引物IL-2a和IL-2b用寡聚核苷酸合成儀合成。
IL-2a5’ATGGATCC GCA CCT ACT TCA AGT TCT ACA AAG AAA AC 3’IL-2b5’GAGAATTC TTA AGT TAG TGT TGA GAT GAT GCT TTG AGA AAA GGT AATCCA3’PCR方法為100μl反應(yīng)體系中加入1μl人淋巴細(xì)胞cDNA，20μmol/L的IL-2a、IL-2b引物各2μl，2mmol/L的dNTP 8μl，10×反應(yīng)緩沖液10μl，pfu DNA聚合酶5U，(dNTP、反應(yīng)緩沖液、pfu DNA聚合酶均為上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品)。用Perk-Elmer公司的9600 PCR儀，PCR條件為94℃變性30秒，52℃退火1分鐘，72℃延伸30秒，循環(huán)32次。通過(guò)凝膠電泳分析反應(yīng)物顯出一預(yù)期大小(0.4kb)的條帶，PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒純化回收。用BamH I和EcoR I酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化后，克隆到用BamH I/EcoR I酶解的pUC19質(zhì)粒上(實(shí)驗(yàn)中的pfu酶、內(nèi)切酶、連接酶、pUC19質(zhì)粒、試劑盒等購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司和北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)，形成pUC-IL-2。BamH I-EcoR I區(qū)DNA測(cè)序結(jié)果表明此PCR產(chǎn)物序列和hIL-2序列相同，只是在其5’端和3’端分別加入了BamHI位點(diǎn)和EcoR I位點(diǎn)。并在3’-端EcoR I位點(diǎn)前加入了終止密碼子。
2、HSA cDNA的克隆用PCR方法從人肝胎cDNA文庫(kù)(購(gòu)自Clontech Laboratories Inc.USA)獲得帶有信號(hào)肽和前肽編碼序列的HSA cDNA，所用的引物HSA1和HSA2用寡聚核苷酸合成儀合成。
HSA15’GCTTCGAAACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCT3’(劃線(xiàn)的堿基序列為酶切位點(diǎn))
HSA25’TAGGATCCACCACCACCAAGGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC3’(劃線(xiàn)的堿基序列為酶切位點(diǎn))PCR條件為100μl反應(yīng)體系中，加入1μl人肝胎cDNA文庫(kù)，20umol/L的HSA1和HSA2引物各3μl，2mmol/L的dNTP，10μl，10×反應(yīng)緩沖液10μl，TaqplusI DNA聚合酶5U。用Perk-Elmer公司的9600 PCR儀，PCR條件為94℃變性1分鐘，52℃退火1分鐘，72℃延伸3分鐘，35個(gè)循環(huán)后，再72℃延伸10分鐘。通過(guò)凝膠電泳分析反應(yīng)物顯出一預(yù)期大小(1.8KD)的條帶，PCR產(chǎn)物電泳純化，用DNA片段回收試劑盒回收純化約1.8KD的目標(biāo)帶(實(shí)驗(yàn)中的TaqplusI DNA聚合酶、內(nèi)切酶、連接酶、試劑盒等購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司和北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)。取純化的HSA cDNA 6μl，加入1μl pGEM-T載體，8μl2×緩沖液，1μl T4DNA連接酶(pGEM-T載體、緩沖液和酶為Promega Corp.USA產(chǎn)品)，15℃反應(yīng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞(細(xì)胞購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)。轉(zhuǎn)化菌于含x-gal和IPTG和氨芐青霉素(50ug/ml)的LB瓊脂平皿上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取白色菌落，接種至3ml含氨芐青霉素(50ug/ml)的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，用常規(guī)方法抽提質(zhì)粒，用PstI酶切，(在載體上和HSA cDNA上各有PstI酶切位點(diǎn))，電泳分析鑒定陽(yáng)性克隆。從pGEM-T載體的多克隆位點(diǎn)兩端分別測(cè)序，并合成兩個(gè)測(cè)序引物HSA35’GCCAGAAGACATCCTTAC3’HSA45’AGTTGGAGTAGACACTTG3’從兩端中部接著測(cè)序，完成HSA cDNA全長(zhǎng)測(cè)序。獲得了含有與天然HSA cDNA序列一致的克隆，JM109(pGEMT-HSA)，這里克隆的HSA含有其天然的信號(hào)肽和前肽部分，以便于在表達(dá)時(shí)，直接利用其信號(hào)肽和前肽用于作為分泌信號(hào)。
實(shí)施例2、連接肽為GlyGlyGlyGlySer時(shí)，本發(fā)明融合蛋白的表達(dá)為了將HSA與hIL-2以融合蛋白形式從畢赤酵母分泌表達(dá)，如圖1所示，選擇pHIL-D2質(zhì)粒作為載體(Invitrogen Corp.USA)。在該載體AOX啟動(dòng)子下游NspV與EcoRI位點(diǎn)間插入HSA/IL-2基因，因pHIL-D2載體上有兩個(gè)NspV位點(diǎn)，為了方便操作，首先pHIL-D2載體用ClaI/ScaI酶切成3段，回收4kb片段，自身連接后命名為pD3載體。pD3載體用NspV/EcoRI切，回收線(xiàn)性化載體，將實(shí)施例1構(gòu)建的pUC-IL-2用BamHI/EcoRI切，回收約0.5kb的含IL-2cDNA的片段，將實(shí)施例1構(gòu)建的pGEMT-HSA用NspV/BamHI切，回收約1.8kb的含HSAcDNA的片段，將線(xiàn)性化pD3載體與含HSAcDNA，IL-2cDNA的片段用T4連接酶催化連接，轉(zhuǎn)化JM109，挑選陽(yáng)性克隆，分別用NspV/EcoRI和NspV/BamHI酶切鑒定，獲得結(jié)構(gòu)正確，帶有編碼含GlyGlyGlyGlySer接頭肽的HSA-IL-2融合蛋白基因的陽(yáng)性克隆JM109(pD3HSAIL-2)。pD3HSA IL-2質(zhì)粒，用ClaI/ScaI酶切，電泳回收線(xiàn)性化的6.3kb片段，pHIL-D2空載體用ClaI/ScaI切回收約4.2kb的片段。T4連接酶催化連接pD3HSAIL-2的6.3kb片段與pHIL-D2的4.2kb片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109后，鋪于含氨芐青霉素(50ug/ml)的LB瓊脂平皿，挑選陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定，獲得克隆JM109(pHIL-D2HSAIL-2)。再抽提該質(zhì)粒約10μg，用NotI酶切。線(xiàn)性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115(酵母表達(dá)試劑盒由InvitrogenCorp.USA提供)，轉(zhuǎn)化后的GS115，鋪于含山梨醇的RDB瓊脂平皿(1mol/L山梨醇，1％葡萄糖，4×10-5％生物素，1.34％無(wú)氨基酸酵母氮源(YNB，Difco Corp.)，0.005％氨基酸混合液(谷氨酸、甲硫氨酸、賴(lài)氨酸、亮氨酸、異亮氨酸各0.005％))，37℃培養(yǎng)1-2周，挑取His+克隆。接種至裝有25mlBMGY培養(yǎng)基(100mmol/L磷酸鉀，pH6.0，4×10-5％生物素，1.34％無(wú)氨基酸酵母氮源，1％甘油)的300ml三角瓶，250轉(zhuǎn)/分鐘30℃培養(yǎng)48小時(shí)，加甲醇0.5％/24h，誘導(dǎo)培養(yǎng)4天，離心取上清，過(guò)濾除菌。用CTLL-2測(cè)定培養(yǎng)上清中IL-2的活性。活性測(cè)定的方法參見(jiàn)《中國(guó)生物制品規(guī)程》2000版(中國(guó)生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)編，化學(xué)工業(yè)出版社2000.6)P396-398。將CTLL-2細(xì)胞培養(yǎng)于含10％小牛血清和400-800IU/ml rhIL-2的1640培養(yǎng)基(Gibco BRL USA)中。每周傳代3次，用前用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)基洗細(xì)胞4次，稀釋至5×105細(xì)胞/ml。在96孔板上，樣品用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)基作適當(dāng)稀釋?zhuān)靠?0μl，每孔再加細(xì)胞50μl，5％CO2，37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)后，加MTT溶液(噻唑藍(lán)溶液，用磷酸鹽緩沖液配成5.0mg/ml的溶液，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌)20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)，加20％SDS(十二烷基磺酸鈉)溶液，37℃孵育18-24小時(shí)，用酶聯(lián)儀測(cè)定各樣品孔的吸光度值，挑選吸光度值高的克隆即為高表達(dá)克隆。得到的產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，分子量正確，酶聯(lián)免疫分析證明其具有血清白蛋白和人白細(xì)胞介素2的特性。同時(shí)CTLL-2細(xì)胞測(cè)活結(jié)果表明產(chǎn)物具有hIL-2的生物活性。
實(shí)施例3、HSA/IL-2(Ser125)融合蛋白的表達(dá)本實(shí)施例提供一種IL-2成熟蛋白第125位半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸的HSA/IL-2(Ser125)融合蛋白的制備方法用與實(shí)施例1和2相同的方法構(gòu)建pHIL-D2HSAIL-2，以之為模板，用PCR獲得hIL-2(Ser125)cDNA，所用的引物IL-2a和IL-2(Ser125)用寡聚核苷酸合成儀合成。
IL-2aATGGATCCGCA CCT ACT TCA AGT TCT ACA AAG AAA AC(劃線(xiàn)的堿基序列為酶切位點(diǎn))IL-2(Ser125)5’GAGAATTCTTATGTCAGTGTTGAGATGATGCTTTGACTAAAGGTAATCCATCTGTTCAG(劃線(xiàn)的堿基序列為酶切位點(diǎn))
PCR方法為100μl反應(yīng)體系中加入1μl 100倍稀釋的pD2HSA IL-2，20μmol/L的IL-2a、IL-2(Ser125)引物各3μl，2mmol/L的dNTP 10μl，10×反應(yīng)緩沖液10μl，pfu DNA聚合酶5U，(dNTP、反應(yīng)緩沖液、pfu DNA聚合酶均為上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品)。用Perk-Elmer公司的9600 PCR儀，PCR條件為94℃變性1分鐘，52℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，循環(huán)25次。通過(guò)凝膠電泳分析反應(yīng)物顯出一預(yù)期大小(0.4kb)的條帶，PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒純化回收。用BamH I和EcoRI酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化，與BamHI/EcoRI酶解切除IL-2編碼序列的pD2HSAIL-2質(zhì)粒連接(實(shí)驗(yàn)中的pfu酶、內(nèi)切酶、連接酶、pUC19質(zhì)粒、試劑盒等購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司和北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)，形成pD2HSAIL-2(Ser125)。DNA測(cè)序結(jié)果表明突變正確。pD2HSA IL-2(Ser125)用NotI酶切，線(xiàn)性化后，用與實(shí)施例2相同的方法構(gòu)建轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，篩選高效表達(dá)pD2HSA/IL-2(Ser125)融合蛋白的工程酵母。
實(shí)施例4、IL-2/HSA融合蛋白的表達(dá)pPIC9-IL-2-HSA質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程如圖4所示，具體可包括以下過(guò)程用與實(shí)施例1相似的PCR方法從肝胎cDNA文庫(kù)獲得hIL-2cDNA，所用的引物改為IL-2c和IL-2d，引物用寡聚核苷酸合成儀合成。
IL2c5’ATGAATTCCTCCGAGAAA AGA GCA CCT ACT TCA AGT TCT ACA AAG AAA AC3’(劃線(xiàn)的堿基序列為酶切位點(diǎn))IL-2d5’TAGGATCCACC ACC GCC AGT TAG TGT TGA GAT GAT GCT TTG AGA AAA GGTAAT CCA(劃線(xiàn)的堿基序列為酶切位點(diǎn))PCR擴(kuò)增后，在cDNA的5’-端引入一個(gè)EcorI位點(diǎn)和一個(gè)XhoI位點(diǎn)，同時(shí)在XhoI位點(diǎn)下游引人了KEX2酶切位點(diǎn)，用以切除表達(dá)的融合蛋白的信號(hào)肽，3’端引入BamHI位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物電泳純化后，克隆到用BamH I/ecoRI，酶解的pUC19(北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)質(zhì)粒上，形成pUC-IL-2。DNA測(cè)序結(jié)果表明此克隆序列和hIL-2序列相同，只是在其5’-端加入了EcoRI位點(diǎn)、XhoI位點(diǎn)、KEX2酶切位點(diǎn)，和3’端去除了終止密碼子，加入了柔性接頭GlyGlyGlyGlySer的編碼序列GGTGGTGGTGGATCC。
用PCR的方法從人肝胎cDNA文庫(kù)獲得HSA cDNA，所用的引物HSA5和HSA6用寡聚核苷酸合成儀合成HSA55’-TAGGATCC GAT GCA CAC AAG AGT GAG GTT-3’HSA65’-ATGAATTC TTAAAGGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC-3’
PCR方法同實(shí)施例1，PCR產(chǎn)物電泳純化后，克隆到用BamHI/SalI，酶解的pUC19(北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)質(zhì)粒上，形成pUCHSA2。DNA測(cè)序結(jié)果表明此克隆序列和HSA成熟肽的編碼序列相同，只是在其5’-端加入了BamHI位點(diǎn)，和3’端終止密碼子后加入SalI位點(diǎn)。
選擇pPIC9質(zhì)粒作為表達(dá)載體(Invitrogen Corp.USA)。在該載體AOX啟動(dòng)子下游XhoI與EcoRI位點(diǎn)間插入IL-2/HSA基因。將上面構(gòu)建的pUC19-IL-2用BamHI/EcoRI酶切，回收約0.4kb的含IL-2cDNA的片段；將pUCHSA2用BamHI/SalI酶切，回收約1.8kb的含HSA cDNA的片段；將pPIC9質(zhì)粒用SalI/EcoRI酶切，回收線(xiàn)性化片段，將這三個(gè)片段用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化JM109，挑選陽(yáng)性克隆，分別用SalI/BamHI和BamHI/EcoRI酶切鑒定，獲得結(jié)構(gòu)正確，帶有接頭肽GlyGlyGlyGlySer的融合蛋白IL-2-HSA基因的陽(yáng)性克隆JM109(pPIC9 IL-2-HSA)。pPIC9 IL-2-HSA質(zhì)粒用Bg/II酶切線(xiàn)性化后，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115(Invitrogen Corp.USA公司酵母表達(dá)試劑盒提供的方法)，轉(zhuǎn)化后的GS115，鋪于含山梨醇的RDB瓊脂平皿(配方同實(shí)施例2)，37℃培養(yǎng)1-2周，挑取His+克隆。搖瓶培養(yǎng)和表達(dá)菌株篩選方法同實(shí)施例2，工程酵母的培養(yǎng)、產(chǎn)物純化、IL-2活性測(cè)定、HSA抗原性測(cè)定方法同實(shí)施例2。結(jié)果表明表達(dá)的IL-2/HSA融合蛋白分子量正確，有刺激CTlL-2細(xì)胞增殖，即hIL-2的活性和HSA的抗原性，但表達(dá)水平低于實(shí)施例2的HSA/IL-2。
實(shí)施例5、帶不同接頭的融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒pD3HSAIL-20的構(gòu)建過(guò)程如圖2所示，將實(shí)施例2中構(gòu)建的質(zhì)粒pD3HSAIL-2，用BamHI/StuI雙酶切，回收大片段，用綠豆芽核酸酶處理，切除突出末端，T4DNA連結(jié)酶平端連接，轉(zhuǎn)化JM109菌，挑選陽(yáng)性克隆，酶切鑒定，獲得帶有在HSAcDNA末端缺失CTT(亮氨酸)后與IL-2 cDNA直接融合基因的質(zhì)粒pD3HSAIL-20。
同樣，在HSA和IL-2可以加入多種柔性接頭，如[GlyGlyGlyGlySer]n，n可以是1-10。如當(dāng)n＝2時(shí)，可合成寡聚核苷酸L2a5’CCTTGGTGGTGGCGGTTCCGGCGGTGGTG 3’L2b5’GATCCACCACCGCCGGAACCGCCACCACCAAGG3’pD3HSAIL-22質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程如圖3所示，將實(shí)施例2中構(gòu)建的質(zhì)粒pD3HSAIL-2，用BamHI/StuI雙酶切，回收大片段，寡聚核苷酸L2a與L2b退火后與回收的大片段連接，轉(zhuǎn)化JM109，挑取陽(yáng)性克隆，酶切鑒定和序列分析，獲得帶有在HSAcDNA末端與IL-2cDNA間插入編碼[GlyGlyGlyGlySer]2(即GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)柔性接頭的寡聚核苷酸的質(zhì)粒pD3HSAIL-22。
當(dāng)n＝3時(shí)，可合成寡聚核苷酸
L3a5’CCTTGGTGGTGGCGGTTCCGGCGGTGGTGGCTCCGGTGGCGGCG3’L3b5’GATCCGCCGCCACCGGAGCCACCACCGCCGGAACCGCCACCACCAAGG3’將實(shí)施例2中構(gòu)建的質(zhì)粒D3HSAIL-2，用BamHI/StuI雙酶切，回收大片段，寡聚核苷酸L3a與L3b退火后與回收的大片段連接，轉(zhuǎn)化JM109，挑取陽(yáng)性克隆，酶切鑒定，獲得帶有在HSAcDNA末端與GM-CSF cDNA間插入編碼[GlyGlyGlyGlySer]3(即GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)柔性接頭的寡聚核苷酸的質(zhì)粒pD3HSAIL-23。可用相似的方法改造實(shí)施例4構(gòu)建的pPIC9 IL-2-HSA質(zhì)粒，以在IL-2與HSA間插入不同的接頭。
將以上構(gòu)建的質(zhì)粒，如pD3HSAIL-20、pD3HSAIL-22、pD3HSAIL-23分別用與實(shí)施例2相同的方法構(gòu)建對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒pHIL-D2HSAIL-20、pHIL-D2HSAIL-22、pHIL-D2HSAIL-23，并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，獲得表達(dá)HSA末端缺失亮氨酸后與IL-2直接融合的HSA/IL-20融合蛋白、HSA與IL-2間插入[GlyGlyGlyGlySer]2柔性接頭的融合蛋白HSA/IL-22、及HSA與IL-2插入[GlyGlyGlyGlySer]3柔性接頭的融合蛋白HSA/IL-23等。得到的產(chǎn)物SDS-PAGE分析，分子量正確，酶聯(lián)免疫分析證明其具有血清白蛋白和人白細(xì)胞介素2的特性。同時(shí)CTLL-2細(xì)胞測(cè)活結(jié)果表明產(chǎn)物具有hIL-2的生物活性。
實(shí)施例6、工程酵母的發(fā)酵和融合蛋白的純化以實(shí)施例2構(gòu)建的表達(dá)HSA/IL-2融合蛋白的工程酵母發(fā)酵和融合蛋白的純化為例，其它工程酵母的發(fā)酵和融合蛋白的純化可用相同或相似的方法。
工程酵母接種100mlYPD培養(yǎng)基(酵母抽提物10g/L，胰蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L)，搖床30℃，280轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)24h。接種至裝有2.5L基礎(chǔ)培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐(B.Braun Corp.Germany)，其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制方法為濃磷酸3.5ml/L，CaSO4.2H2O 0.15g/L，K2SO42.4g/L，MgSO4.7H2O 1.95g/L，KOH 0.65g/L，121℃高壓滅菌30分鐘，再加入30ml/L甘油(單獨(dú)121℃高壓滅菌30分鐘)，1ml/L PTM(配方為CuSO4.5H2O 6.0g/L，CoCl2.6H2O 3.0g/L、MnSO4.H2O 3.0g/L，H3BO30.02g/L，F(xiàn)eSO4.7H2O 65.0g/L NaMoO4.2H2O 0.2g/L，ZnSO4.7H2O 20.0g/L，KI 0.1g/L，濃H2SO45ml/L，121℃高壓滅菌30分鐘)，0.5ml/L 0.02％生物素(過(guò)濾除菌)。接種前用氨水將培養(yǎng)基pH調(diào)至5.8。發(fā)酵過(guò)程控制溫度為30℃，溶氧始終大于20％飽和度，pH值不高于6.0，培養(yǎng)至甘油耗盡后，開(kāi)始流加甘油(50％甘油，加12ml/LPTM，2ml/L0.02％生物素)，繼續(xù)培養(yǎng)，至密度OD600值約為150時(shí)，開(kāi)始補(bǔ)加甲醇(分析純甲醇，加12ml/LPTM，2ml/L 0.02％生物素)誘導(dǎo)。誘導(dǎo)培養(yǎng)48-72小時(shí)。50ml培養(yǎng)液離心取上清，加入硫酸銨至20％飽和度，混勻后4℃放置過(guò)夜，離心取沉淀，用3ml25mmol/LTris-HCl(pH7.0)溶解，用Supdex 200(Amersham Pharmacia Biotech UK)Φ1.6×100cm柱層析分離，流動(dòng)相為25mmol/LTris-HCl(pH7.0)，150mmol/LNaCl，流速為1ml/L，紫外檢測(cè)，收集第一峰(保留時(shí)間為70-85分鐘)，即為純化的融合蛋白，SDS-PAGE分析呈均一條帶，如圖5所示，其中1為分子量標(biāo)準(zhǔn)，自上而下分別為94，67，43，30KD；2為純化前的HSA/IL-2樣品；3-5為純化的HSA/IL-2。用CTLL-2細(xì)胞測(cè)定HSA/IL-2的活性(《中國(guó)生物制品規(guī)程》2000版(中國(guó)生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)編，化學(xué)工業(yè)出版社2000.6P396-398)。將CTLL-2細(xì)胞培養(yǎng)于含10％小牛血清和400-800IU/ml rhIL-2的1640培養(yǎng)基(Gibco BRL USA)中。每周傳代3次，用前用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)基洗細(xì)胞4次，稀釋至5×105細(xì)胞/ml。在96孔板上，樣品HSA/IL-2用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)基作適當(dāng)稀釋后在96孔板上作2倍稀釋?zhuān)靠?0μl，每孔再加細(xì)胞50μl，5％CO2，37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)后，加MTT溶液(噻唑藍(lán)溶液，用磷酸鹽緩沖液配成5.0mg/ml的溶液，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌)20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)，加20％SDS(十二烷基磺酸鈉)溶液，37℃孵育18-24小時(shí)，用酶聯(lián)儀測(cè)定各樣品孔的吸光度值，與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，計(jì)算樣品HSA/IL-2的活性，如圖7所示，橫軸為2倍梯度稀釋的孔數(shù)，縱軸是吸光度值，測(cè)得純化樣品HSA/IL-2的活性為3×106U/mg。用樣品HSA/IL-2稀釋后包被酶聯(lián)板，分別用兔抗人血清白蛋白抗體作為一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，檢測(cè)樣品HSA/IL-2，結(jié)果如圖6所示，從圖中的結(jié)果可知，樣品HSA/IL-2具有HSA的抗原性。
取相同活性劑量的融合蛋白HSA/IL-2和rhIL-2，小鼠尾靜脈給藥，不同時(shí)間取血清用CTLL-2細(xì)胞(方法同上)測(cè)定其中的IL-2活性。與rhIL-2相比，融合蛋白HSA/IL-2在小鼠血漿中的半衰期約為15h左右。
序列表<160>4<210>1<211>585<212>PRT<213>人屬人(Homo sapiens)<400>1Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly1 5 10 15Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr20 25 30Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu35 40 45Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu50 55 60Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys65 70 75Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu MET Ala Asp Cys80 85 90Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His95 100 105Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val110 115 120Asp Val MET Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu125 130 135Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr140 145 150Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe155 160 165
Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro170 175 180Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys185 190 195Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala200 205 210Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys215 220 225Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys230 235 240Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp245 250 255Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser260 265 270Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu275 280 285Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu MET Pro Ala290 295 300Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val305 310 315Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe320 320 330Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu335 340 345Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys350 355 360Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp365 370 375Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln380 385 390Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn
395 400 405Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr410 415 420Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser425 430 435Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu440 445 450Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu455 460 465Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser470 475 480Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu485 490 495Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His500 505 510Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys515 520 525Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr530 535 540Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val545 550 555Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu560 565 570Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu575 580 585<210>2<211>133<212>PRT<213>人屬人(Homo sapiens)<400>2
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu1 5 10 15His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn20 25 30Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr35 40 45Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu50 55 60Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser65 70 75Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn80 85 90Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys95 100 105Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg110 115 120Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr125 130 133<210>3<211>2253<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3ttcgaaacca tgaagtgggt aacctttatt tcccttcttt ttctctttag ctcggcttat60tccaggggtg tgtttcgtcg agatgcacac aagagtgagg ttgctcatcg gtttaaagat120ttgggagaag aaaatttcaa agccttggtg ttgattgcct ttgctcagta tcttcagcag180tgtccatttg aagatcatgt aaaattagtg aatgaagtaa ctgaatttgc aaaaacatgt240gtagctgatg agtcagctga aaattgtgac aaatcacttc ataccctttt tggagacaaa300
ttatgcacag ttgcaactct tcgtgaaacc tatggtgaaa tggctgactg ctgtgcaaaa360caagaacctg agagaaatga atgcttcttg caacacaaag atgacaaccc aaacctcccc420cgattggtga gaccagaggt tgatgtgatg tgcactgctt ttcatgacaa tgaagagaca480tttttgaaaa aatacttata tgaaattgcc agaagacatc cttactttta tgccccggaa540ctccttttct ttgctaaaag gtataaagct gcttttacag aatgttgcca agctgctgat600aaagctgcct gcctgttgcc aaagctcgat gaacttcggg atgaagggaa ggcttcgtct660gccaaacaga gactcaaatg tgccagtctc caaaaatttg gagaaagagc tttcaaagca720tgggcagtgg ctcgcctgag ccagagattt cccaaagctg agtttgcaga agtttccaag780ttagtgacag atcttaccaa agtccacacg gaatgctgcc atggagatct gcttgaatgt840gctgatgaca gggcggacct tgccaagtat atctgtgaaa atcaggattc gatctccagt900aaactgaagg aatgctgtga aaaacctctg ttggaaaaat cccactgcat tgccgaagtg960gaaaatgatg agatgcctgc tgacttgcct tcattagctg ctgattttgt tgaaagtaag1020gatgtttgca aaaactatgc tgaggcaaag gatgtcttcc tgggcatgtt tttgtatgaa1080tatgcaagaa ggcatcctga ttactctgtc gtgctgctgc tgagacttgc caagacatat1140gaaaccactc tagagaagtg ctgtgccgct gcagatcctc atgaatgcta tgccaaagtg1200ttcgatgaat ttaaacctct tgtggaagag cctcagaatt taatcaaaca aaattgtgag1260ctttttgagc agcttggaga gtacaaattc cagaatgcgc tattagttcg ttacaccaag1320aaagtacccc aagtgtcaac tccaactctt gtagaggtct caagaaacct aggaaaagtg1380ggcagcaaat gttgtaaaca tcctgaagca aaaagaatgc cctgtgcaga agactatcta1440tccgtggtcc tgaaccagtt atgtgtgttg catgagaaaa cgccagtaag tgacagagtc1500acaaaatgct gcacagagtc cttggtgaac aggcgaccat gcttttcagc tctggaagtc1560gatgaaacat acgttcccaa agagtttaat gctgaaacat tcaccttcca tgcagatata1620tgcacacttt ctgagaagga gagacaaatc aagaaacaaa ctgcacttgt tgagcttgtg1680aaacacaagc ccaaggcaac aaaagagcaa ctgaaagctg ttatggatga tttcgcagct1740tttgtagaga agtgctgcaa ggctgacgat aaggagacct gctttgccga ggagggtaaa1800aaacttgttg ctgcaagtca agctgcctta ggccttggtg gtggtggatc cgcacctact1860tcaagttcta caaagaaaac acagctacaa ctggagcatt tactgctgga tttacagatg1920attttgaatg gaattaataa ttacaagaat cccaaactca ccaggatgct cacatttaag1980ttttacatgc ccaagaaggc cacagaactg aaacatcttc agtgtctaga agaagaactc2040aaacctctgg aggaagtgct aaatttagct caaagcaaaa actttcactt aagacccagg2100gacttaatca gcaatatcaa cgtaatagtt ctggaactaa agggacctga aacaacattc2160atgtgtgaat atgctgatga gacagcaacc attgtagaat ttctgaacag atggattacc2220
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<223>
<400>4Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly1 5 10 15Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr20 25 30Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu35 40 45Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu50 55 60Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys65 70 75Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu MET Ala Asp Cys80 85 90Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His95 100 105Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val110 115 120Asp Val MET Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu125 130 135Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr140 145 150Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe
155 160 165Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro170 175 180Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys185 190 195Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala200 205 210Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys215 220 225Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys230 235 240Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp245 250 255Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser260 265 270Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu275 280 285Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu MET Pro Ala290 295 300Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val305 310 315Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe320 320 330Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu335 340 345Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys350 355 360Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp365 370 375Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln380 385 390
Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn395 400 405Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr410 415 420Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser425 430 435Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu440 445 450Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu455 460 465Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser470 475 480Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu485 490 495Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His500 505 510Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys515 520 525Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr530 535 540Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val545 550 555Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu560 565 570Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu575 580 585Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr590 595 600Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu605 610 615Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu
620 625 630Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His635 640 645Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu650 655 660Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu665 670 675Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu680 685 690Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val695 700 705Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser710 715 720Thr Leu Thr72權(quán)利要求
1.一種人血清白蛋白與白細(xì)胞介素2的融合蛋白，包括與序列表中SEQ ID №1具有至少85％序列同源性的氨基酸殘基序列的第一區(qū)和與序列表中SEQ ID №2具有至少85％序列同源性的氨基酸殘基序列的第二區(qū)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述人血清白蛋白與白細(xì)胞介素2的融合蛋白包括序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列的第一區(qū)和序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列的第二區(qū)，或上述二區(qū)的功能等同物；所述功能等同物是在不改變所述融合蛋白特性的前提下，對(duì)所述融合蛋白個(gè)別氨基酸殘基的取代、缺失或添加得到的多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其特征在于所述取代發(fā)生在序列表中SEQID №2的自氨基端的第125位半胱氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其特征在于所述第125位半胱氨酸被絲氨酸或丙氨酸取代。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的融合蛋白，其特征在于所述與序列表中SEQ ID №1同源的第一區(qū)與序列表中SEQ ID №2同源的第二區(qū)之間設(shè)有連接肽，所述連接肽的通式是[GlyGlyGlyGlySer]n，n為1-10的整數(shù)，優(yōu)選為1-3的整數(shù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的融合蛋白，其特征在于所述人血清白蛋白與白細(xì)胞介素2的融合蛋為具有序列表中SEQ ID №4氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
7.編碼權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述融合蛋白的DNA序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的DNA序列，其特征在于所述DNA序列是序列表中SEQID №3。
9.含有權(quán)利要求7所述DNA序列的表達(dá)載體和細(xì)胞系。
10.權(quán)利要求1所述人血清白蛋白與白細(xì)胞介素2的融合蛋白在制備人白細(xì)胞介素2類(lèi)藥物和/或制備治療與人白細(xì)胞介素2或其受體過(guò)量表達(dá)有關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人血清白蛋白與白細(xì)胞介素2的融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，其目的是提供一種可延長(zhǎng)人白細(xì)胞介素2的血漿半衰期的人血清白蛋白與白細(xì)胞介素2融合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的人血清白蛋白與白細(xì)胞介素2的融合蛋白，包括與序列表中SEQ ID №1具有至少85％序列同源性的氨基酸殘基序列的第一區(qū)和與序列表中SEQ ID №2具有至少85％序列同源性的氨基酸殘基序列的第二區(qū)。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的融合蛋白與rhIL－2相比，在小鼠血漿中的半衰期明顯延長(zhǎng)，可用于制備人白細(xì)胞介素2類(lèi)藥物和/或制備治療與人白細(xì)胞介素2或其受體過(guò)量表達(dá)有關(guān)疾病的藥物。
文檔編號(hào)C12N15/62GK1626554SQ200310117068
公開(kāi)日2005年6月15日 申請(qǐng)日期2003年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月8日
發(fā)明者吳軍, 唱韶紅, 鞏新, 馬清鈞 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所