專利名稱：一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞siRNA表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種siRNA表達(dá)載體，特別涉及一種用于表達(dá)哺乳動(dòng)物細(xì)胞siRNA的載體。
背景技術(shù)：
由小分子干涉RNA(small interference RNA，siRNA)阻抑基因表達(dá)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新方法。它通過(guò)外源導(dǎo)入與內(nèi)源基因同源的雙鏈RNA(dsRNA)來(lái)降解目標(biāo)mRNA，從而導(dǎo)致生物體內(nèi)特異基因的沉默，所以又稱為RNA干涉(RNA interference，RNAi)。RNAi通過(guò)關(guān)閉特異基因的表達(dá)而成為研究基因功能的有力工具，在基因表達(dá)調(diào)控、缺陷識(shí)別及基因性疾病的治療等方面顯出極為重要的應(yīng)用價(jià)值。RNAi的作用機(jī)制及相關(guān)研究已成為當(dāng)前國(guó)際生物醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)，并且被Science評(píng)為2001年最重要的成果之一。目前該技術(shù)已逐漸從細(xì)胞水平的研究轉(zhuǎn)向活體動(dòng)物的研究，是當(dāng)今功能基因組研究中最有活力的領(lǐng)域之一，而且還可以與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因(transgene)和基因敲除(gene knockout)研究手段相結(jié)合，進(jìn)行單基因或多基因功能的研究。
RNAi現(xiàn)象首先于1998年在線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)，這種雙鏈RNA導(dǎo)致的RNA干擾現(xiàn)象隨后在植物、果蠅、昆蟲(chóng)、真菌等生物及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也分別發(fā)現(xiàn)。關(guān)于RNAi的作用機(jī)制，目前認(rèn)為當(dāng)dsRNA(double-stranded RNA，dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞后，被一種dsRNA特異的核酸內(nèi)切酶Dicer識(shí)別，切割成21-23核苷酸長(zhǎng)的小片段，這些片段可與該核酸酶的dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并形成RISC(RNA-induced silencing complex，RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物)，RISC通過(guò)配對(duì)識(shí)別并繼續(xù)切割目的mRNA，如此循環(huán)，從而使目的基因沉默，產(chǎn)生RNA干擾現(xiàn)象。
雖然siRNA能夠有效地使目的基因沉默，但由于RNA合成成本高，易于降解，操作復(fù)雜，使得該項(xiàng)技術(shù)具有一定的局限性，因此，研究者開(kāi)始探索基于DNA載體的siRNA表達(dá)系統(tǒng)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中，是將帶有與siRNA互補(bǔ)的小片段DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，質(zhì)粒所攜帶的RNA polymeraseIII啟動(dòng)子將以小片段DNA為模板，并以連續(xù)的4-5個(gè)腺嘌呤(thymidines，T)為終止區(qū)進(jìn)行siRNA的合成(Sui et al.，2002；Bogenhagen，et al.，1980)，產(chǎn)生的siRNA將會(huì)干擾靶基因的表達(dá)。目前已經(jīng)推出多種用于siRNA表達(dá)的克隆載體，如pBS/U6或pSilencer載體(Sui et al.，2002，PNAS，99(8)5515-5520)，用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞RNAi瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)；pSIREN-RetroQ載體(BD Biosciences Clontech，2000，www.bdbioscience.co)，是一種通過(guò)重組腺病毒進(jìn)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞RNAi表達(dá)的載體；Matsukura等(2003，Nucleic Acid Research，31(15)e77)建立了用四環(huán)素控制的siRNA條件表達(dá)載體。以上類似的方法已開(kāi)始用于在細(xì)胞或活體水平上進(jìn)行基因功能的研究。但對(duì)于建立穩(wěn)定siRNA表達(dá)細(xì)胞系以及通過(guò)顯微注射法(即類似于常規(guī)轉(zhuǎn)基因小鼠的方法)構(gòu)建基因沉默小鼠模型來(lái)說(shuō)，各有其一定的局限性，因?yàn)橥ǔＧ闆r下，外源DNA片段的插入不僅使目的基因的表達(dá)發(fā)生變化，而且往往由于導(dǎo)入的外源DNA片段的隨機(jī)插入而導(dǎo)致其它基因的破壞，從而干擾表現(xiàn)型，不能真正反映出目的基因的實(shí)際生物學(xué)功能。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種可用于建立哺乳動(dòng)物穩(wěn)定siRNA表達(dá)細(xì)胞系以及基因沉默小鼠模型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞siRNA表達(dá)載體。
本發(fā)明所提供的哺乳動(dòng)物細(xì)胞siRNA表達(dá)載體，以線性化狀態(tài)存在，包括兩個(gè)或三個(gè)LoxP位點(diǎn)、由鼠源磷酸甘油酸激酶(murine phosphoglycerate kinase)基因啟動(dòng)子控制的新霉素(neomycin)抗性基因、U6啟動(dòng)子和為待插入的寡核苷酸準(zhǔn)備的兩個(gè)粘性末端。
所述兩個(gè)粘性末端中的一個(gè)粘性末端為U6啟動(dòng)子的末端序列，其5′突出端序列為AAAC，另一個(gè)粘性末端的5′突出端序列為T(mén)TTT，如圖4所示。
待插入的siRNA片段應(yīng)具有與所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞siRNA表達(dá)載體的兩個(gè)粘性末端分別互補(bǔ)的粘性末端，如圖5所示。圖5中，*N19-21指siRNA基因內(nèi)選定的19-21個(gè)核苷酸序列；RN19-21是N19-21序列的反向互補(bǔ)序列；**是兩個(gè)重復(fù)序列之間的非靶基因序列，它可以是一個(gè)易于鑒定陽(yáng)性克隆的酶切位點(diǎn)，如NotI，SacI，EcoRI，或SacII，也可以是一些有關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道的9個(gè)堿基序列。
本發(fā)明結(jié)合了基因沉默、基因敲除以及轉(zhuǎn)基因的基本原理構(gòu)建了一種用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞siRNA表達(dá)的載體，本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞siRNA表達(dá)載體帶有經(jīng)過(guò)修飾后的兩個(gè)粘性末端(圖4)，一個(gè)末端可為U6啟動(dòng)子的末端序列，另一個(gè)末端可為T(mén)TTT，并以線性化的狀態(tài)存在(圖1-5)，易于直接連接用戶的雙鏈寡核苷酸(siDNA)片段(圖5)(可以應(yīng)用任何公司用于亞克隆連接的T4 ligase)，轉(zhuǎn)到細(xì)胞或動(dòng)物體中起始下游插入的小片段DNA的轉(zhuǎn)錄，在轉(zhuǎn)錄后形成一個(gè)具發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈mRNA。利用本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞siRNA表達(dá)不僅簡(jiǎn)便易行，省時(shí)，而且亞克隆成功率高，是目前利用RNAi技術(shù)進(jìn)行基因功能研究非常有力的研究工具。
本發(fā)明的pRNAi-Fneo Easy載體含有帶有兩個(gè)LoxP位點(diǎn)的由鼠源磷酸甘油酸激酶基因啟動(dòng)子控制的新霉素抗性基因片段和U6啟動(dòng)子(也位于兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間)，主要用于(1)哺乳動(dòng)物siRNA穩(wěn)定細(xì)胞系的建立(見(jiàn)圖6)；(2)可以通過(guò)重組酶(Cre)將抗性基因以及siRNA表達(dá)盒去除，對(duì)特定基因的功能在細(xì)胞水平上進(jìn)行雙向研究；(3)建立基因沉默小鼠模型，在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行基因的功能研究，還可以進(jìn)一步將基因沉默小鼠與含有由特定啟動(dòng)子控制的重組酶表達(dá)小鼠進(jìn)行交配，將新霉素+siRNA表達(dá)盒去除，對(duì)特定基因的功能在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行雙向研究，即進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)；(4)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)。
本發(fā)明的pRNAiD-Fneo Easy載體不僅含有由鼠源磷酸甘油酸激酶基因啟動(dòng)子控制的新霉素抗性基因，而且將U6-RNAi表達(dá)盒置于兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間，所以本載體既可以用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)以及建立siRNA穩(wěn)定細(xì)胞系，還可以用于建立基因沉默小鼠模型，并且還可以通過(guò)將基因沉默小鼠與含有由特定啟動(dòng)子控制的重組酶表達(dá)小鼠進(jìn)行交配，將siRNA表達(dá)盒去除，對(duì)特定基因的功能在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行雙向研究。
本發(fā)明的pRNAi-DELneo Easy載體含有兩邊帶有LoxP位點(diǎn)的由鼠源磷酸甘油酸激酶基因啟動(dòng)子控制的新霉素抗性基因以及U6啟動(dòng)子。該載體不僅用于siRNA的瞬時(shí)表達(dá)以及siRNA穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選，而且方便在一個(gè)基因siRNA(基因沉默)穩(wěn)定細(xì)胞系建成后，通過(guò)重組酶去除抗性基因，再進(jìn)行下一個(gè)基因RNAi穩(wěn)定細(xì)胞系的建立。因此，既可用于單基因功能的研究，又可以用于雙基因協(xié)同作用的功能研究，同時(shí)可用于建立單基因或雙基因沉默藥物篩選細(xì)胞模型。


圖1為pRNAi-Fneo Easy vector的酶切圖譜圖2為pRNAiD-Fneo Easy vector的酶切圖譜圖3為pRNAi-DELneo Easy vector的酶切圖譜圖4為哺乳動(dòng)物細(xì)胞siRNA表達(dá)載體用于連接siRNA互補(bǔ)的小片段DNA(寡核苷酸)的部分序列圖5為小片段DNA(寡核苷酸)的序列結(jié)構(gòu)示意6用pRNAi-Fneo Easy vector載體構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系(Hela)的RT-PCR結(jié)果圖7為pEasy-Flox vector的酶切圖譜具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、pRNAi-Fneo Easy載體的構(gòu)建以pEasy-Flox(見(jiàn)圖7，圖中 表示單一酶切位點(diǎn))和pBluescript(http//www.stratagene.com/vectors/selection/plasmidl.htm)質(zhì)粒為基本骨架，用NotI+XhoI將含有新霉素基因和三個(gè)LoxP位點(diǎn)的DNA片段連接到pBluescript載體上首先構(gòu)建了一個(gè)基礎(chǔ)載體，然后用引物1(5‘-FUP1CAACTGTTGGGAAGGGCGAT-3’)和引物2(5’-TCGAGTCGACAAAAACCGTCTTCGAAGACCCCAAACAAGGCTTTTCTCCAA-3’)通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)從pBS/U6載體(Sui et al.，2002，PNAS，99(8)5515-5520)上獲得含有U6啟動(dòng)子的DNA片段，通過(guò)XbaI+SalI酶切位點(diǎn)連接到基礎(chǔ)載體上，然后，按照常規(guī)方法進(jìn)行如下操作用CaCl2法轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，獲得陽(yáng)性克隆后，再進(jìn)行質(zhì)粒提取、BbsI酶切線性化、瓊脂糖凝膠純化，最終得到5400bp的pRNAi-Fneo Easy載體(如圖1)。
實(shí)施例2、pRNAiD-Fneo Easy載體的購(gòu)建將pRNAi-Fneo Easy載體用Not1+EcoR1酶切，用Klenow酶平端化后，進(jìn)行自連，然后用CaCl2法轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌、質(zhì)粒提取、BbsI酶切線性化、瓊脂糖凝膠純化，最終得到5730bp的pRNAiD-Fneo Easy載體(如圖2)實(shí)施例3、pRNAi-DELneo Easy載體的構(gòu)建將pRNAi-Fneo Easy載體用Sal1+Xho1酶切，用Klenow酶平端化后，進(jìn)行自連，然后用CaCl2法轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌、質(zhì)粒提取、BbsI酶切線性化、瓊脂糖凝膠純化，最終得到5730bp的pRNAi-DElneo Easy載體(如圖3)。
實(shí)施例4、用pRNAi-Fneo Easy載體構(gòu)建TIMR(一種新的與癌癥有關(guān)的細(xì)胞因子)穩(wěn)定細(xì)胞系采用常規(guī)的方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染以及進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選，即用磷酸鈣法轉(zhuǎn)化Hela細(xì)胞，用G418進(jìn)行篩選，用RT-PCR的方法檢測(cè)目的片段是否整合到基因組中(如圖6，A為空細(xì)胞對(duì)照；B為T(mén)IMR-dsRNA穩(wěn)定細(xì)胞系)，共設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，即引物1(Neo1)(Upper)5’-CATAGCCTGAAGAACGAGAT-3’引物2(PU6)(Lower)5’-GCTTTTCTCCAAGGGATAT-3’引物3(PNK 1)(Upper)5’-CAGCTTTTGTTCCCTTTAGT-3’引物4(PNK2)(Lower)5’-CACATGTTCTTTCCTGCGT-3’
權(quán)利要求
1.一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞siRNA表達(dá)載體，以線性化狀態(tài)存在，包括兩個(gè)或三個(gè)LoxP位點(diǎn)、由鼠源磷酸甘油酸激酶基因啟動(dòng)子控制的新霉素抗性基因、U6啟動(dòng)子和為待插入的siRNA基因準(zhǔn)備的兩個(gè)粘性末端。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于所述兩個(gè)粘性末端中的一個(gè)粘性末端為U6啟動(dòng)子的末端序列，其5′突出端序列為AAAC，另一個(gè)粘性末端的5′突出端序列為T(mén)TTT。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)載體，其特征在于所述待插入的siRNA基因具有與所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞siRNA表達(dá)載體的兩個(gè)粘性末端分別互補(bǔ)的粘性末端。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的pRNAi-Fneo Easy vector表達(dá)載體，其特征在于所述siRNA互補(bǔ)DNA片段的正義鏈和反義鏈分別為ATTTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNSNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAA。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞siRNA表達(dá)載體為NotI和EcoRI酶切pRNAi-Fneo Easy vector得到的pRNAiD-Fneo Easyvector。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞siRNA表達(dá)載體為Sal1+Xho1酶切pRNAi-Fneo Easy vector得到的pRNAi-DElneo Easy。
7.根據(jù)權(quán)利要求4、5、6所述的表達(dá)載體，其特征在于所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞siRNA表達(dá)載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和小鼠體內(nèi)進(jìn)行基因沉默和沉默靶基因恢復(fù)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞siRNA表達(dá)載體，以線性化狀態(tài)存在，包括兩個(gè)或三個(gè)LoxP位點(diǎn)、由鼠源磷酸甘油酸激酶基因啟動(dòng)子控制的新霉素抗性基因、U6啟動(dòng)子和兩個(gè)粘性末端。本發(fā)明的目的是提供一種可用于建立哺乳動(dòng)物穩(wěn)定siRNA表達(dá)細(xì)胞系以及基因沉默小鼠模型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞siRNA表達(dá)載體，可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和小鼠體內(nèi)進(jìn)行基因沉默和沉默靶基因恢復(fù)中應(yīng)用，從而對(duì)基因功能進(jìn)行雙向研究。
文檔編號(hào)C12N15/85GK1626663SQ200310117340
公開(kāi)日2005年6月15日 申請(qǐng)日期2003年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月10日
發(fā)明者張淑平, 常智杰, 傅新元 申請(qǐng)人:清華大學(xué)