專利名稱：豬瘟病毒感染性cDNA及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬瘟病毒感染性cDNA及其構(gòu)建方法，特別是適合豬瘟病毒疫苗開發(fā)的豬瘟病毒感染性cDNA及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
豬瘟是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一，被國際獸疫局(OIE)列為A類傳染病。豬瘟病毒的感染，可導(dǎo)致各生長(zhǎng)階段豬的死亡，這不僅會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且也阻礙了我國豬肉制品走向國際市場(chǎng)。豬瘟病毒屬于黃病毒科瘟病毒，其基因組為長(zhǎng)約12.3kb的單股正鏈RNA，編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。豬瘟病毒與宿主細(xì)胞的相互關(guān)系比較復(fù)雜，對(duì)其致病機(jī)理的研究進(jìn)展緩慢。感染性cDNA是指通過RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng))擴(kuò)增RNA病毒基因組的cDNA片段，然后利用其限制性酶切位點(diǎn)，將cDNA片段順次相連并克隆于合適的載體，獲得基因組全長(zhǎng)cDNA克隆，以其轉(zhuǎn)染適宜宿主細(xì)胞，全長(zhǎng)cDNA在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄并包裝成感染性病毒粒子。感染性cDNA是研究病毒的復(fù)制、病毒的基因產(chǎn)物的功能和闡明病毒致病機(jī)理等方面極具價(jià)值的工具。如通過對(duì)病毒基因組進(jìn)行定點(diǎn)突變以產(chǎn)生特定的突變體病毒，也可以缺失或替換基因組的任意部分以產(chǎn)生突變體在分子水平上直接特定的病毒基因?qū)Σ《镜膹?fù)制、毒力和免疫等生物學(xué)功能。另外，從cDNA得到的感染性轉(zhuǎn)錄體，也將為研究病毒適應(yīng)細(xì)胞及其致弱的分子基礎(chǔ)提供幫助，借此可以制造有效的弱毒疫苗而無毒力反強(qiáng)的危險(xiǎn)，為研制新型的基因工程苗提供新的思路。雖然目前國外已經(jīng)報(bào)道有數(shù)個(gè)感染性cDNA構(gòu)建成功(Moormann RJM et al.，J. Virol.70763-770，1996；Meyers G etal.，J.Virol.701588-1595，1996；Ruggli N et al.，J.Virol.703478-3487，1996)，并用于研究病毒單個(gè)蛋白的功能，取得了一些可喜的進(jìn)展，但是，由于基因功能、致病機(jī)理、遺傳變異的復(fù)雜性，這些感染性cDNA并不適合我國豬瘟病毒疫苗的開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于建立一個(gè)適合我國豬瘟病毒情況的豬瘟病毒的基因操作技術(shù)平臺(tái)，加快我國豬瘟的研究和防制步伐，深入的開展豬瘟病毒的基因功能、致病機(jī)理、遺傳變異和新型疫苗的研制等方面的研究。
為了達(dá)到上述目的，實(shí)施以下技術(shù)方案一種豬瘟病毒cDNA，是以豬瘟病毒RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA；該cDNA的5’端上游具有T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子，3’末端具有單一的限制性酶切位點(diǎn)。
所述限制性酶切位點(diǎn)可以是SrfI(購自德國Stratagene公司)酶切位點(diǎn)或Sal I酶切位點(diǎn)；所述5’端上游最好具有Not I酶切位點(diǎn)；所述RNA最好是從感染豬瘟病毒的兔脾組織中提取的C-株RNA一種構(gòu)建豬瘟病毒感染性cDNA的方法，其步驟包括根據(jù)豬瘟病毒RNA設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄用帶有酶切位點(diǎn)的特異性引物；以所述RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，同時(shí)，使cDNA的5’端上游具有T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子，3’末端具有單一的限制性酶切位點(diǎn)；利用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng))和nPCR(多巢聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng))技術(shù)分段擴(kuò)增所述cDNA各片段；將擴(kuò)增后的cDNA各片段分別克隆入質(zhì)粒載體；將所述cDNA各片段連接，構(gòu)成帶有基因組全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒載體；純化回收全長(zhǎng)cDNA。
本發(fā)明的豬瘟病毒cDNA，因在5’端導(dǎo)入了Not I酶切位點(diǎn)和T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子序列，3’末端具有單一的限制性酶切位點(diǎn)，能產(chǎn)生精確的3’末端，從而能夠在分子水平上通過突變、插入、缺失和替換來研究豬瘟病毒的復(fù)制機(jī)理、毒力及其決定因素和致弱機(jī)制、致病機(jī)理、基因產(chǎn)物的功能、宿主嗜性以及核酸疫苗、標(biāo)記疫苗等新型疫苗的研究開發(fā)，是進(jìn)一步研究和防制豬瘟的極有價(jià)值的工具。


圖1是表示覆蓋基因組的7個(gè)cDNA片段；圖2是表示構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA的技術(shù)流程圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例首先，根據(jù)豬瘟病毒RNA設(shè)計(jì)用于反轉(zhuǎn)錄的帶有酶切位點(diǎn)的特異性引物，各引物如下P15’ATGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGTATACGAGGTTAGTTCATTCTC3’1-23N1’5’CTAGTCGACTTTACTCCTTCCACCACGATC3’998-1018N15’AGGTACATAGCATGCTGGATACC3’1218-1240P25’ATGAGAAGGACAGCAGAACTAGGCC3’961-985P2’5’ACAGCAGAACTAGGCCACCTGA3’970-991N2’5’ATGTCGACGCCCAATCTTTCATCTGATGCATGC3’3236-3260N25’CTTTAGGTCTGCATGGCATAGGG3’3260-3282P35’TAACACGACTGTCAAGGTGCATGCAT3’3218-3243P3’5’TCAAGGTGCATGCATCAGATG3’3229-3249N3’5’TAGTCGACACATAACACCTAGCTCCTTCC3’5471-5491N35’ATGGCTCCTTTAGTCCCTGATATGT3’5512-5536P45’TACACACACCAAGGTGGCATCAGTT3’5313-5337P4’5’ATCAGTTCAGTGGACCATGTC3’5331-5351N4’5’ATGTCGACGTAACACCTGATTCTATCGCG3’6497-6517N45’CAATCGTGACAGCCATTCTCTTCAG3’6609-6633P55’AGAGTACTTGGACATTGCTGG3’6287-6307P5’5’ATGCGGCCGCGGCAGTGGAGACAGCAAAGAAATTG3’6371-6395N5’5’GTAACCGTAGCAGCGGGAATCTCTT3’9094-9118N55’TTAGTCCCTGGATATTGGCCT3’9377-9388P65’CTCAAAATGAAGAGAGGGTGCGCAT3’8997-9021P6’5’ATTAGCGGCCGCAATGAAGAGAGGGTGCGCAT3’9002-9021N6’5’CTTCTCATTCTTTGGGATCGC3’10692-10712N65’TCGTTGACGTCCCTCTTCTCATTCT3’10702-10726P75’AACTGGAGAGAGGAATAAACAGG3’10546-10568P7’5’TAGCGGCCGCATAAACAGGAAGGGTGCTGCT3’
10560-10580N75’ATGTCGACGCCCGGGCCGTTAGAAATTACCTTAGTCC3’12286-12310。
其中，P表示正向，N表示反向，各引物后的數(shù)字表示酶切位置。
從感染豬瘟病毒的兔脾組織(豬瘟C-株毒，為中國獸藥監(jiān)察所的兔脾淋組織毒第480代，系中國農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所保存)中提取豬瘟病毒(C-株)基因組RNA(使用TRIzol(R)Reagent Total RNA Isolation Reagent試劑盒，GIBCOBRL公司出品)，用上述特異性引物分7段反轉(zhuǎn)錄cDNA各片段。然后，利用PCR和nPCR技術(shù)分7段擴(kuò)增cDNA各片段，如圖1所示，5’端至3’端依次分別命名為F1、F2……F7，其中各片段在基因組中的位置為F11-1028，F(xiàn)2970-3260，F(xiàn)33229-5491，F(xiàn)45497-6633，F(xiàn)56371-9118，F(xiàn)69002-10712，F(xiàn)710530-12310。如圖2所示，利用圖1所示的工具酶分別將所得片段克隆入質(zhì)粒pMD18-T(購自Taraka公司)或pGEM-T Easy(購自Promega公司)載體中并測(cè)序，其中F3和F4克隆入質(zhì)粒pMD18-T，形成質(zhì)粒pMD1 8-T/F34；再采用圖2所示的限制性內(nèi)切酶(購自Promega和Taraka公司)和T4 DNA連接酶(購自上海生工公司)，將F1、F2、F 34片段連接并克隆于pGEM-5Zf(+)后，得到重組質(zhì)粒pGEM-5ZF(+)/F1-4；將片段F5、F6和F7連接并克隆于pGEM-5ZF(+)中，得到重組質(zhì)粒pGEM-5Zf(+)/F5-7；最后將連接片段F1-4和F5-7連接并克隆于pGEM-5Zf(+)中，得到基因組全長(zhǎng)cDNA pGEM-5Zf(+)/F1-7，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確。
用限制性內(nèi)切酶SrfI將全長(zhǎng)cDNA pGEM-5Zf(+)/F1-7線性化(即將環(huán)形質(zhì)粒用酶切開，成為線形)，并用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收；用MEGAscript T7kit(購自Ambion Inc公司)體外轉(zhuǎn)錄，并用RNA電泳分析轉(zhuǎn)錄出的全長(zhǎng)基因組RNA占的比例大小。用無RNA酶的DNA核酸酶RQ1(購自Promega公司)去除DNA模板，經(jīng)蛋白酶K(購自Taraka公司)處理后，進(jìn)行RNA純化(RNA純化試劑盒，購自QIAGEN公司)，分成小份，置-70℃?zhèn)溆?。轉(zhuǎn)染時(shí)，先用OPTI-MEMI培養(yǎng)基(購自GIBCOBRL公司)清洗SK-6細(xì)胞(約70％融合度，蘭州獸醫(yī)研究所病毒室保存)，再用DMRIE-C(購自Invitrogen公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代數(shù)次后，采用直接熒光抗體染色(豬瘟熒光素標(biāo)記抗體購自中國獸藥監(jiān)察所)和夾心ELISA(Classical Swine Fever Virus Antigen Test Kit，IDEXX)等方法鑒定其具有感染性。
權(quán)利要求
1.一種豬瘟病毒cDNA，是以豬瘟病毒RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA；該cDNA的5’端上游具有T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子，3’末端具有單一的限制性酶切位點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬瘟病毒cDNA，其特征在于，所述限制性酶切位點(diǎn)是Srf I酶切位點(diǎn)或Sal I酶切位點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的豬瘟病毒感染性cDNA，其特征在于，所述5’端上游具有Not I酶切位點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的豬瘟病毒cDNA，其特征在于，所述RNA是從感染豬瘟病毒的兔脾組織中提取的C-株RNA。
5.一種構(gòu)建豬瘟病毒cDNA的方法，其步驟包括1)根據(jù)豬瘟病毒RNA設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄用帶有酶切位點(diǎn)的特異性引物；2)以所述RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，同時(shí)，使cDNA的5’端上游具有T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子，3’末端具有單一的限制性酶切位點(diǎn)；3)利用PCR和nPCR技術(shù)分段擴(kuò)增所述cDNA各片段；4)將擴(kuò)增后的cDNA各片段分別克隆入質(zhì)粒載體；5)將所述cDNA各片段連接，構(gòu)成帶有基因組全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒載體；6)純化回收全長(zhǎng)cDNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述特異性引物及其酶切位置如下P15’ATGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGTATACGAGGTTAGTTCATTCTC3’1-23N1’5’CTAGTCGACTTTACTCCTTCCACCACGATC3’998-1018N15’AGGTACATAGCATGCTGGATACC3’1218-1240P25’ATGAGAAGGACAGCAGAACTAGGCC3’961-985P2’5’ACAGCAGAACTAGGCCACCTGA3’970-991N2’5’ATGTCGACGCCCAATCTTTCATCTGATGCATGC3’3236-3260N25’CTTTAGGTCTGCATGGCATAGGG3’3260-3282P35’TAACACGACTGTCAAGGTGCATGCAT3’3218-3243P3’5’TCAAGGTGCATGCATCAGATG3’ 3229-3249N3’5’TAGTCGACACATAACACCTAGCTCCTTCC3’ 5471-5491N35’ATGGCTCCTTTAGTCCCTGATATGT3’ 5512-5536P45’TACACACACCAAGGTGGCATCAGTT3’ 5313-5337P4’5’ATCAGTTCAGTGGACCATGTC3’ 5331-5351N4’5’ATGTCGACGTAACACCTGATTCTATCGCG3’ 6497-6517N45’CAATCGTGACAGCCATTCTCTTCAG3’ 6609-6633P55’AGAGTACTTGGACATTGCTGG3’ 6287-6307P5’5’ATGCGGCCGCGGCAGTGGAGACAGCAAAGAAATTG3’6371-6395N5’5’GTAACCGTAGCAGCGGGAATCTCTT3’ 9094-9118N55’TTAGTCCCTGGATATTGGCCT3’ 9377-9388P65’CTCAAAATGAAGAGAGGGTGCGCAT3’ 8997-9021P6’5’ATTAGCGGCCGCAATGAAGAGAGGGTGCGCAT3’ 9002-9021N6’5’CTTCTCATTCTTTGGGATCGC3’ 10692-10712N65’TCGTTGACGTCCCTCTTCTCATTCT3’ 10702-10726P75’AACTGGAGAGAGGAATAAACAGG3’ 10546-10568P7’5’TAGCGGCCGCATAAACAGGAAGGGTGCTGCT3’ 10560-10580N7 5’ATGTCGACGCCCGGGCCGTTAGAAATTACCTTAGTCC3’12286-12310；其中，P表示正向，N表示反向。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述分段擴(kuò)增是分成7個(gè)片段進(jìn)行擴(kuò)增的，其中各片段的位置依次為1-1028、970-3260、3229-5491、5497-6633、6371-9118、9002-10712、10530-12310。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述純化回收全長(zhǎng)cDNA是采用限制性內(nèi)切酶Srf I將帶有全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒載體線性化，并用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收。
9.根據(jù)權(quán)利要求5～7之一所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)粒載體采用pGEM-5Zf(+)。
10.根據(jù)權(quán)利要求5～7之一所述的方法，其特征在于，所述RNA是從感染豬瘟病毒的兔脾組織中提取的C-株RNA。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于建立一個(gè)適合我國豬瘟病毒情況的豬瘟病毒的基因操作技術(shù)平臺(tái)。為了達(dá)到該目的，本發(fā)明的豬瘟病毒cDNA，是以豬瘟病毒RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA；該cDNA的5’端上游具有T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子，3’末端具有單一的限制性酶切位點(diǎn)。構(gòu)建豬瘟病毒感染性cDNA的方法步驟包括根據(jù)豬瘟病毒RNA設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄用帶有酶切位點(diǎn)的特異性引物；以所述RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；分段擴(kuò)增所述cDNA各片段；將擴(kuò)增后的cDNA各片段分別克隆入質(zhì)粒載體；將所述cDNA各片段連接，構(gòu)成帶有基因組全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒載體；純化回收全長(zhǎng)cDNA。
文檔編號(hào)C12N15/34GK1539976SQ20031010341
公開日2004年10月27日 申請(qǐng)日期2003年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月31日
發(fā)明者劉湘濤, 胡建和, 謝慶閣, 尚佑軍 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所