專利名稱：一種雙歧桿菌凍干粉的制備方法及其產(chǎn)品和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雙歧桿菌凍干粉及其制備方法，還涉及該雙歧桿菌凍干粉作為食品或飲料添加劑的用途。
背景技術(shù)：
雙歧桿菌(Bifidobacterium)是人和動(dòng)物腸道內(nèi)重要的生理性細(xì)菌，它的存在有利于提高人和動(dòng)物消化道的健康狀況?，F(xiàn)代眾多研究表明消化道微生物在人體健康和疾病方面起著重要作用，例如營(yíng)養(yǎng)、生理功能、藥物功效、癌癥、免疫反應(yīng)、老化等均與消化道菌群密切相關(guān)。雙歧桿菌在代謝過程中產(chǎn)生有機(jī)酸，有抑制腸道腐生細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，從而起到調(diào)節(jié)腸道菌群，防治腹瀉，改善維生素代謝，提高免疫機(jī)能等作用，對(duì)人體健康有多項(xiàng)有益功效。
此外，利用雙歧桿菌作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，通過提高宿主的免疫力還可以開展對(duì)系列性疑難病癥如類風(fēng)濕、強(qiáng)直性脊髓炎乃至癌癥等的防治。大連醫(yī)科大學(xué)康白等人的研究報(bào)道也驗(yàn)證了雙歧桿菌可通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤的作用。
近代世界各國(guó)都開始研究如何將活性雙歧桿菌作為食品添加劑，用人工方法將這類活菌制成食品的問題。而達(dá)到提高人體免疫機(jī)能，改善維生素代謝的目的，增強(qiáng)人體健康作用的關(guān)鍵是要確保有足夠數(shù)量的活性雙歧桿菌，但是由于雙歧桿菌生長(zhǎng)條件苛刻，其適宜生長(zhǎng)溫度為35～40℃，pH值為6.5～7.0，且專性厭氧。因此缺少一種適合于工業(yè)化食品生產(chǎn)的可以確保高活菌量的雙歧桿菌凍干粉及其生產(chǎn)方法。

發(fā)明內(nèi)容所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種活性雙歧桿菌凍干粉的制備方法，用于克服上述現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)。本發(fā)明另一目的是提供一種用上述方法制備的雙歧桿菌凍干粉，本發(fā)明的再一目的是提供上述雙歧桿菌凍干粉作為為食品或飲料添加劑的用途。
技術(shù)方案本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明雙歧桿菌凍干粉的制備方法包括如下步驟(1)菌種活化選用具有改善腸道菌群和提高免疫力的雙歧桿菌，例如可以是嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)、長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)、青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)中的一種或多種的混合物。優(yōu)選采用嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)，更優(yōu)選為例如菌株編號(hào)為BI 002，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.0997，保藏日期為2003年9月1日的嬰兒雙歧桿菌(Bifidobactefium infantis)，或優(yōu)選為長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)，更優(yōu)選為例如菌株編號(hào)為BL 003，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.0998，保藏日期為2003年9月1日的長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)。
將低溫保存的菌種在室溫下放置例如12-36小時(shí)，優(yōu)選24小時(shí)，之后在無菌室無菌取少量例如0.2mL液體培養(yǎng)基1加入玻管內(nèi)，取菌物接種于液體培養(yǎng)基1和瓊脂平板上，35-37℃條件下厭氧培養(yǎng)48～72小時(shí)，再連續(xù)活化三代，以提高菌株活力，作為母培養(yǎng)物。
其中所用的培養(yǎng)基1為TPY培養(yǎng)基，它是由胰酶水解酪蛋白12g、多胨3g、大豆蛋白胨5g、葡萄糖5g、低聚果糖5g、酵母粉5g、吐溫-80 1g、肝浸液200mL、混合鹽溶液10mL、西紅柿汁100mL和L-半胱氨酸鹽酸0.5g，再加蒸餾水675mL在pH為7.2，溫度為例如115℃的條件下滅菌例如20分鐘后加入混合維生素制得，其中混合鹽溶液是由K2HPO420.0g、MgCl2·6H2O5.0g、ZnSO4·7H2O2.5g、CaCl21.5g和FeCl30.5g加蒸餾水100mL制得，混合維生素是由維生素B1100mg，維生素B2100mg，維生素B6100mg，泛酸鈉10mg和生物素1mg加蒸餾水100mL濾過滅菌制得。
(2)一級(jí)培養(yǎng)物的制備將母培養(yǎng)物接入培養(yǎng)基1(采用與上述步驟中相同的培養(yǎng)基1)，接菌量為2～3％，在35～37℃條件下厭氧培養(yǎng)10-16個(gè)小時(shí)，作為一級(jí)培養(yǎng)物。
(3)二級(jí)培養(yǎng)物的制備將一級(jí)培養(yǎng)物接入培養(yǎng)基2，接菌量為2～3％，在35～37℃條件下厭氧培養(yǎng)10-14個(gè)小時(shí)，作為二級(jí)培養(yǎng)物。
其中所用的培養(yǎng)基2是由大豆蛋白胨16.67g、酪蛋白胨8.33g、乳糖5.0～10.0g、酵母浸提物5.0g、L-半胱氨酸鹽酸0.5g、低聚糖5～7g、吐溫-80 1.0g、混合鹽溶液5mL、肝浸液或胡蘿卜汁150mL和水845mL在pH為7.2，溫度為115℃的條件下滅菌20分鐘制得，其中混合鹽溶液是由K2HPO420.0g、MgCl2·6H2O5.0g、ZnSO4·7H2O2.5g、CaCl21.5g、FeCl30.5g和蒸餾水100mL組成。
當(dāng)選用菌種為嬰兒雙歧桿菌時(shí)，上述培養(yǎng)基2組分中優(yōu)選用肝浸液；當(dāng)選用菌種為長(zhǎng)雙歧桿菌時(shí)，上述培養(yǎng)基2組分中優(yōu)選用胡蘿卜汁。
(4)增菌培養(yǎng)將二級(jí)培養(yǎng)物接入培養(yǎng)基2(采用與上述步驟中相同的培養(yǎng)基2)，接菌量為2～3％，在溫度為35～37℃，Ph值在7.0～7.2，攪拌條件下，例如攪拌速度在300-500rpm，發(fā)酵8～12小時(shí)后得到雙歧桿菌發(fā)酵液。
(5)離心分離在4℃條件下將上述雙歧桿菌發(fā)酵液離心15～20分鐘，例如采用離心轉(zhuǎn)速6000～8000rpm，取下層沉淀備用。
(6)添加凍干保護(hù)劑凍干將沉淀與凍干保護(hù)劑充分混合后，在真空度6Pa，冷凍溫度-40℃，凍干時(shí)間為7～10小時(shí)的條件下凍干即可獲得雙歧桿菌凍干粉，其中凍干保護(hù)劑的用量為發(fā)酵液體積的1/4～1/2，優(yōu)選采用1/3。
所述的凍干保護(hù)劑是由脫脂乳粉100g、甘油10g、低聚果糖25g、乳糖12.5g、胱氨酸1g、維生素C3g、水1000g組成。其中胱氨酸、維生素C采用過濾除菌，其他成分采用在105℃滅菌30分鐘。
本發(fā)明雙歧桿菌凍干粉是采用上述方法制備的。
采用上述方法制得的雙歧桿菌凍干粉，其中每克雙歧桿菌凍干粉中含雙歧桿菌活菌數(shù)大于1010cfu，水分含量小于5％。
本發(fā)明產(chǎn)品可單獨(dú)食用，也可以作為食品添加劑應(yīng)用于食品或飲料的生產(chǎn)中。例如可以與豆粉、米粉、奶粉、花粉、藥粉等可食用品粉末按比例直接混合作為保健食品。或者與蔬菜汁或果汁等液體飲料按比例混合，并根據(jù)需要添加適量甜味劑等添加劑，攪拌均勻后灌裝做成含活性雙歧桿菌的飲料。
有益效果本發(fā)明雙歧桿菌凍干粉每克含雙歧桿菌活菌數(shù)大于1010cfu，水分含量小于5％，此外還具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，用途廣泛等優(yōu)點(diǎn)，可單獨(dú)食用，也可作為食品添加劑，具有良好的市場(chǎng)前景和經(jīng)濟(jì)效益。

圖1為本發(fā)明雙歧桿菌凍干粉的制備工藝過程圖。
具體實(shí)施例實(shí)施例1嬰兒雙歧桿菌凍干粉的制備a)菌種活化將低溫保存的嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacteriuminfantis，菌種編號(hào)為BI 002，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.0997，保藏日期為2003年9月1日)在室溫下放置24小時(shí)，在無菌室將菌種安瓶管用70％酒精棉擦拭表面消毒，然后用酒精燈將其上部烤熱，滴加冷的滅菌蒸餾水，使玻管開裂，用鑷子敲掉上部，無菌取0.2mL液體培養(yǎng)基(1)加入玻管內(nèi)，用滅菌鉑金耳插入玻管取菌物接種于液體培養(yǎng)基(1)和瓊脂平板上，35-37℃條件下厭氧培養(yǎng)60小時(shí)，再連續(xù)活化三代，以提高菌株活力，作為母培養(yǎng)物。
其中所用的培養(yǎng)基(1)為TPY培養(yǎng)基，它是由胰酶水解酪蛋白12g、多胨3g、大豆蛋白胨5g、葡萄糖5g、低聚果糖5g、酵母粉5g、吐溫-80 1g、肝浸液200mL、混合鹽溶液10mL、西紅柿汁100mL和L-半胱氨酸鹽酸0.5g，再加蒸餾水675mL在pH為7.2，溫度為115℃的條件下滅菌20分鐘后加入混合維生素制得，其中混合鹽溶液是由K2HPO420.0g、MgCl2·6H2O5.0g、ZnSO4·7H2O2.5g、CaCl21.5g和FeCl30.5g加蒸餾水100mL制得，混合維生素是由維生素B1100mg，維生素B2100mg，維生素B6100mg，泛酸鈉10mg和生物素1mg加蒸餾水100mL濾過滅菌制得。
b)一級(jí)培養(yǎng)物的制備將母培養(yǎng)物接入培養(yǎng)基(1)(采用與上述步驟中相同的培養(yǎng)基(1))，接菌量為2.5％，在35～37℃條件下厭氧培養(yǎng)14個(gè)小時(shí)，作為一級(jí)培養(yǎng)物。
c)二級(jí)培養(yǎng)物的制備將一級(jí)培養(yǎng)物接入培養(yǎng)基(2)，接菌量為2.5％，在35～37℃條件下厭氧培養(yǎng)12個(gè)小時(shí)，作為二級(jí)培養(yǎng)物。
其中所用的培養(yǎng)基(2)是由大豆蛋白胨16.67g、酪蛋白胨8.33g、乳糖5.0～10.0g、酵母浸提物5.0g、L-半胱氨酸鹽酸0.5g、低聚糖5～7g、吐溫-801.0g、混合鹽溶液5mL、肝浸液150mL和水845mL在pH為7.2，溫度為115℃的條件下滅菌20分鐘制得，其中混合鹽溶液是由K2HPO420.0g、MgCl2·6H2O5.0g、ZnSO4·7H2O2.5g、CaCl21.5g、FeCl30.5g和蒸餾水100mL組成。
d)增菌培養(yǎng)將二級(jí)培養(yǎng)物接入培養(yǎng)基(2)(采用與上述步驟中相同的培養(yǎng)基(2))，接菌量為2.5％，在溫度為35～37℃，Ph值在7.1，攪拌速度在400rpm的條件下發(fā)酵10小時(shí)后得到雙歧桿菌發(fā)酵液；e)離心分離在4℃，離心轉(zhuǎn)速7000rpm的條件下將上述雙歧桿菌發(fā)酵液離心18分鐘，取下層沉淀備用；f)添加凍干保護(hù)劑凍干將沉淀與凍干保護(hù)劑充分混合后，在真空度6Pa，冷凍溫度-40℃，凍干時(shí)間為9小時(shí)的條件下凍干即可獲得嬰兒雙歧桿菌凍干粉，其中凍干保護(hù)劑的用量為發(fā)酵液體積的1/3。所述的凍干保護(hù)劑是由脫脂乳粉100g、甘油10g、低聚果糖25g、乳糖12.5g、胱氨酸1g、維生素C3g、水1000g組成。其中胱氨酸、維生素C采用過濾除菌，其他成分采用在105℃滅菌30分鐘，得嬰兒雙歧桿菌凍干粉。
實(shí)施例2雙歧桿菌凍干粉的制備類似于實(shí)施例1，選用菌株編號(hào)為BL 003，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.0998，保藏日期為2003年9月1日的長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)作為活性雙歧桿菌；培養(yǎng)基2組分中采用胡蘿卜汁替代肝浸液，制備出長(zhǎng)雙歧桿菌凍干粉。
實(shí)施例3含本發(fā)明雙歧桿菌凍干粉的食品將實(shí)施例1制備的雙歧桿菌凍干粉，與奶粉按重量1∶5000的比例混合均勻，稱量后分裝做成含活性雙歧桿菌的奶粉，奶粉的包裝形式可以是袋裝、盒裝或罐裝。
實(shí)施例3含本發(fā)明雙歧桿菌凍干粉的飲料將實(shí)施例1制備的雙歧桿菌凍干粉，與蔬菜汁按1∶6000比例混合，添加適量甜味劑，攪拌均勻后灌裝做成含活性雙歧桿菌的蔬菜汁。
試驗(yàn)例1本發(fā)明雙歧桿菌凍干粉活菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)活菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)樣品1g按照實(shí)施例1制備的雙歧桿菌凍干粉。
活菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)方法將上述樣品用稀釋液進(jìn)行10倍梯度遞減稀釋，取適宜稀釋液傾倒BS平板，37℃厭氧培養(yǎng)36小時(shí)后計(jì)數(shù)活菌數(shù)，在換算為原始菌數(shù)。
其中稀釋液由Na2HPO46g、KH2PO44.5g、L-半胱氨酸鹽酸0.5g、瓊脂1g、吐溫-80 0.5g，加蒸餾水至1000mL，在115℃下滅菌20分鐘制得；BS培養(yǎng)基由西紅柿汁200mL、蛋白胨7g、酵母粉6g、胰酶水解酪蛋白5g、植物蛋白胨3g、多胨3g、葡萄糖10g、可溶性淀粉0.5g、吐溫80 1g、溶液A 10mL、溶液B 5mL、瓊脂20g組成。BS培養(yǎng)基用到的溶液A由KH2PO425g、K2HPO425g、水250g組成；溶液B由MgSO4·7H2O10g、FeSO4·7H2O0.5g、NaCl0.5g、MnSO40.337g水250g組成；BS添加液由丙酸鈉30g加入滅菌燒瓶中，加滅菌蒸餾水80mL，待溶解后加硫酸新霉素400毫克，巴龍霉素100毫克，LiCl6g，再加滅菌蒸餾水至100mL制得。
活菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)結(jié)果樣品含雙歧桿菌活菌數(shù)大于1010cfu。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及技術(shù)實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基本上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種雙歧桿菌凍干粉的制備方法，其特征在于它包括如下步驟(1)菌種活化選用具有改善腸道菌群和提高免疫力的凍干菌種，將低溫保存的菌種在室溫下放置12-36小時(shí)，在無菌室無菌取液體培養(yǎng)基1加入玻管內(nèi)，取菌物接種于液體培養(yǎng)基1和瓊脂平板上，35-37℃條件下厭氧培養(yǎng)48～72小時(shí)，再連續(xù)活化三代，作為母培養(yǎng)物；(2)一級(jí)培養(yǎng)物的制備將母培養(yǎng)物接入培養(yǎng)基1，接菌量為2～3％，在35～37℃條件下厭氧培養(yǎng)10-16個(gè)小時(shí)，作為一級(jí)培養(yǎng)物；(3)二級(jí)培養(yǎng)物的制備將一級(jí)培養(yǎng)物接入培養(yǎng)基2，接菌量為2～3％，在35～37℃條件下厭氧培養(yǎng)10-14個(gè)小時(shí)，作為二級(jí)培養(yǎng)物；(4)增菌培養(yǎng)將二級(jí)培養(yǎng)物接入培養(yǎng)基2，接菌量為2～3％，在溫度為35～37℃，Ph值在7.0～7.2，在攪拌條件下發(fā)酵8～12小時(shí)后得到雙歧桿菌發(fā)酵液；(5)離心分離在4℃條件下將上述雙歧桿菌發(fā)酵液離心15～20分鐘，取下層沉淀備用；(6)添加凍干保護(hù)劑凍干將沉淀與凍干保護(hù)劑充分混合后，在真空度6Pa，冷凍溫度-40℃，凍干時(shí)間為7～10小時(shí)的條件下凍干即可獲得雙歧桿菌凍干粉，其中凍干保護(hù)劑的用量為發(fā)酵液體積的1/4～1/2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中的雙歧桿菌是嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)、長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)、青春雙歧桿菌(Bifidobacterium ado1escentis)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)凍干粉的一種或多種的混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟(1)的雙歧桿菌是嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)或長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium Longum)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其中，步驟(1)中的雙歧桿菌是保藏號(hào)為CGMCC No.0997的嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacteriuminfantis)或保藏號(hào)為CGMCC No.0998的長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之任一所述的制備方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基1為TPY培養(yǎng)基，它是由胰酶水解酪蛋白12g、多胨3g、大豆蛋白胨5g、葡萄糖5g、低聚果糖5g、酵母粉5g、吐溫-801g、肝浸液200mL、混合鹽溶液10mL、西紅柿汁100mL、L-半胱氨酸鹽酸0.5g、蒸餾水675mL和混合維生素10mL組成；其中混合鹽溶液是由K2HPO420.0g、MgCl2·6H2O5.0g、ZnSO4·7H2O2.5g、CaCl21.5g、FeCl30.5g和蒸餾水100mL組成；其中，混合維生素是由維生素B1100mg，維生素B2100mg，維生素B6100mg，泛酸鈉10mg、生物素1mg和蒸餾水100mL組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之任一所述的制備方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基2是由滅菌后的大豆蛋白胨16.67g、酪蛋白胨8.33g、乳糖5.0～10.0g、酵母浸提物5.0g、L-半胱氨酸鹽酸0.5g、低聚糖5～7g、吐溫-801.0g、混合鹽溶液5mL、肝浸液或胡蘿卜汁150mL、水845mL組成；其中混合鹽溶液是由K2HPO420.0g、MgCl2·6H2O5.0g、ZnSO4·7H2O2.5g、CaCl21.5g、FeCl30.5g和蒸餾水100mL組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6之任一所述的制備方法，其特征在于所述的凍干保護(hù)劑是由滅菌后的脫脂乳粉100g、甘油10g、低聚果糖25g、乳糖12.5g、胱氨酸1g、維生素C3g、水1000g組成。
8.一種雙歧桿菌凍干粉，其特征在于它是采用權(quán)利要求1-7之任一的方法制備的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的雙歧桿菌凍干粉作為食品或飲料添加劑的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中所述的食品為奶粉。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種活性雙歧桿菌凍干粉的制備方法及其產(chǎn)品，還涉該方法制備的雙歧桿菌凍干粉在食品或飲料加工領(lǐng)域中的用途。本發(fā)明采用選育出的具有改善腸道菌群和提高免疫力的菌株，然后采用高密度培養(yǎng)、離心和凍干等方法生產(chǎn)出凍干菌粉，可將其作為食品添加劑，用于食品加工領(lǐng)域。雙歧桿菌凍干粉含雙歧桿菌活菌數(shù)大于10
文檔編號(hào)A23L1/30GK1603402SQ20031010323
公開日2005年4月6日 申請(qǐng)日期2003年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月3日
發(fā)明者霍貴成, 孟祥晨, 楊麗杰 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)