專利名稱：聚－3－羥基鏈烷酸的分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從微生物細(xì)胞中分離精制聚-3-羥基鏈烷酸的方法。
背景技術(shù)：
聚-3-羥基鏈烷酸(以下稱作PHA)是大多數(shù)微生物細(xì)胞中作為能量?jī)?chǔ)備物質(zhì)生成、蓄積的熱塑性聚酯，具有生物分解性?，F(xiàn)在，塑料廢棄物通過(guò)焚燒、掩埋進(jìn)行處理，但是這些處理方法存在地球溫室化和掩埋地的土地松弛等問(wèn)題。因此，隨著對(duì)塑料循環(huán)利用的社會(huì)意識(shí)的提高，正在進(jìn)行循環(huán)利用系統(tǒng)化。然而，可循環(huán)利用的用途有限，實(shí)際上，作為塑料廢棄處理方法，僅僅焚燒、掩埋和循環(huán)利用還不能應(yīng)付，目前原封不動(dòng)放置在自然界的塑料很多。因此，廢棄后進(jìn)入自然界的物質(zhì)循環(huán)中、且分解產(chǎn)物無(wú)害的PHA等生物分解性塑料受到關(guān)注，并熱切希望其實(shí)用化。特別是，微生物在細(xì)胞內(nèi)生成蓄積的PHA由于進(jìn)入自然界的碳循環(huán)過(guò)程中，所以可以預(yù)想到對(duì)于生態(tài)系統(tǒng)幾乎沒(méi)有不良影響。另外，在醫(yī)療領(lǐng)域，也可以作為不需回收的醫(yī)用生物材料、藥物載體的利用可能性。
微生物生成的PHA，通常形成顆粒體蓄積在該微生物細(xì)胞內(nèi)，所以為了將PHA作為塑料利用，必須進(jìn)行從微生物細(xì)胞內(nèi)分離提取PHA的工序。作為從微生物細(xì)胞內(nèi)分離精制PHA的已知方法，大致分為采用可以溶解PHA的有機(jī)溶劑從細(xì)胞內(nèi)提取PHA的方法和通過(guò)破碎或溶解除去PHA以外的細(xì)胞組成成分得到PHA的方法。
在通過(guò)有機(jī)溶劑提取的PHA的分離精制方法中，例如有使用1，2-二氯乙烷或氯仿等含鹵烴作為可溶解PHA的溶劑進(jìn)行提取的方法(特開昭55-118394號(hào)、特開昭57-65193號(hào))。然而，這些含鹵烴是疏水性溶劑，所以在提取前必須預(yù)先進(jìn)行細(xì)胞干燥等使溶劑能與細(xì)胞中的PHA接觸的工序。另外，這些方法中，當(dāng)將PHA溶解到值得實(shí)用的濃度(例如5％)或更高時(shí)，提取液變得極粘稠，未溶解的細(xì)胞殘?jiān)c含PHA的溶劑層的分離非常困難。而且，為了以高回收率從溶劑層中再沉淀出PHA，必需溶劑層的4～5倍體積的甲醇或己烷等PHA的不良溶劑等，所以在再沉淀工序中必須要大容量的容器。而且由于溶劑的用量龐大，所以溶劑的回收成本和損失溶劑的成本增大。另外近年來(lái)，從環(huán)境保護(hù)的觀點(diǎn)考慮，有機(jī)鹵化合物的使用有受到限制的趨勢(shì)，故對(duì)該方法而言其現(xiàn)狀是工業(yè)化困難。
另外，也有人提出采用例如二噁烷(特開昭63-198991號(hào))或丙二醇(特開平02-69187號(hào))或四氫呋喃(特開平07-79788號(hào))等親水性溶劑作為可解溶PHA且又與水混合的溶劑的提取方法。這些方法無(wú)論從即使由干燥細(xì)胞或濕細(xì)胞提取PHA的可能性方面看，還是從僅冷卻與細(xì)胞殘?jiān)蛛x的溶劑層獲得PHA的沉淀物方面看都認(rèn)為是合適的。然而，采用這些方法都沒(méi)有解決PHA溶解的溶劑層的粘稠問(wèn)題，另外還存在為了提高提取效率必需加熱、由于在水存在下進(jìn)行加熱而不可避免PHA的水解導(dǎo)致的低分子化以及回收率差等問(wèn)題。
另一方面，作為通過(guò)溶解并除去PHA以外的細(xì)胞構(gòu)成成分獲得PHA的方法，J.Gen.Microbiology，19，198-208頁(yè)(1958)中記載用次氯酸鈉處理細(xì)胞懸浮液使PHA以外的細(xì)胞構(gòu)成成分溶解獲得PHA的方法。這些方法，過(guò)程雖然簡(jiǎn)單，但是由于必須使用大量的次氯酸鈉，所以成本提高。另外，從可能引起PHA的顯著低分子化或在得到的PHA內(nèi)殘存有不可忽視量的氯的方面看，被認(rèn)為不適于實(shí)際應(yīng)用。在特公平04-61638號(hào)中記載有通過(guò)在100℃或100℃以上對(duì)含PHA的微生物細(xì)胞懸浮液進(jìn)行熱處理來(lái)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，然后組合進(jìn)行蛋白質(zhì)分解酶處理和磷脂分解酶處理或過(guò)氧化氫處理，使PHA以外的細(xì)胞構(gòu)成成分溶解，從而獲得PHA的方法。該方法存在的缺點(diǎn)是，由于熱處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、難溶，故在下面的蛋白質(zhì)分解酶處理工序中的負(fù)荷增大，而且處理工序大多復(fù)雜等問(wèn)題。
另外，作為破壞含PHA的微生物細(xì)胞的方法，曾有人提出，用表面活性劑處理之后，將從細(xì)胞放出的核酸進(jìn)行過(guò)氧化氫處理和分解，然后分離PHA的方法(特表平08-502415號(hào))，但是含表面活性劑的廢液激烈發(fā)泡，并且具有高的BOD負(fù)荷值。從這樣的觀點(diǎn)看，表面活性劑的使用在工業(yè)規(guī)模中是不理想的。
另外，一種提案是采用高壓均化器破碎含PHA的微生物細(xì)胞來(lái)分離PHA的方法(特開平07-177894號(hào)、特開平07-31488號(hào))。然而，這些方法的缺點(diǎn)在于至少對(duì)微生物細(xì)胞懸浮液進(jìn)行3次，根據(jù)情況加熱進(jìn)行10次高壓處理，并且得到的PHA的純度低，為65～89％左右。另外有一種提案是，向含PHA的微生物懸浮液中添加堿并加熱，然后破碎細(xì)胞并分離PHA的方法(特開平07-31487號(hào))。但是，該方法存在的缺點(diǎn)是，所得聚合物的純度低，為75.1～80.5％，而在為提高收度增加堿添加量時(shí)又引起聚合物的低分子化等。還有一些提案是添加堿后進(jìn)行物理破碎的方法(Bioseparation，2，95-105項(xiàng)，1991，特開平07-31489號(hào))，但是這些方法存在的缺點(diǎn)是，僅僅用堿處理，細(xì)胞構(gòu)成成分只有少量被提取到細(xì)胞外，即使繼續(xù)高壓破碎處理之后細(xì)胞構(gòu)成成分還是殘存在PHA級(jí)分中，所以效果不好，因此如不對(duì)微生物細(xì)胞懸浮液進(jìn)行至少5次高壓處理，則得不到純度高的PHA，而且所得PHA的純度低，為75～85％左右。還有，在添加堿的方法中，通常，從微生物細(xì)胞流出的細(xì)胞成分，特別是核酸，使細(xì)胞懸浮液的濃度上升，故有使其后的處理變難等問(wèn)題。
另外一種方案是，將含PHA的微生物懸浮液調(diào)節(jié)到pH低于2的酸性并在50度或50度以上分離PHA的方法(特開平11-266891號(hào))。然而，該方法存在的缺點(diǎn)是，由于該方法是在pH低于2的強(qiáng)酸性條件下進(jìn)行處理，所以在工業(yè)規(guī)模上是不優(yōu)選的，并且為了提高純度還需要在酸處理后調(diào)節(jié)成堿性，從而產(chǎn)生大量的鹽，另外，所得的PHA的分子量從247萬(wàn)下降到100萬(wàn)左右等。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問(wèn)題，提供一種PHA的分離精制方法，該方法可以高效地從含PHA的微生物細(xì)胞中除去PHA以外的細(xì)胞構(gòu)成成分，通過(guò)少量的工序即可高收率地獲得高純度的PHA，并且不引起嚴(yán)重的分子量下降。
本發(fā)明人對(duì)PHA在工業(yè)上有利的生產(chǎn)方法進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，(i)一邊對(duì)含PHA的微生物細(xì)胞懸浮液進(jìn)行物理破碎處理，一邊連續(xù)或間歇性地往該懸浮液中加入堿，由此防止從微生物細(xì)胞泄漏的PHA以外的細(xì)胞構(gòu)成成分導(dǎo)致懸浮液的粘度上升；(ii)通過(guò)防止細(xì)胞懸浮液的粘度上升可以控制懸浮液的pH；(iii)進(jìn)而通過(guò)懸浮液的pH控制，可在低堿濃度下進(jìn)行處理，所以不引起顯著的分子量下降，并且能夠分離出高純度的PHA，從而完成本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及聚-3-羥基鏈烷酸的制備方法，該方法包括一邊對(duì)含聚-3-羥基鏈烷酸的微生物細(xì)胞懸浮液進(jìn)行物理破碎處理，一邊連續(xù)或間歇性地往該懸浮液中添加堿，然后分離聚-3-羥基鏈烷酸。
作為其優(yōu)選的實(shí)施方案，是關(guān)于邊控制上述懸浮液的pH邊進(jìn)行上述堿的添加的上述制備方法。更優(yōu)選的是關(guān)于將上述懸浮液的pH控制在9～13.5之間的上述制備方法。另外，上述懸浮液的物理破碎處理優(yōu)選在上述懸浮液的攪拌下進(jìn)行。還有，上述懸浮液的物理破碎處理優(yōu)選在20℃～低于40℃的溫度下進(jìn)行。
作為另一優(yōu)選實(shí)施方案，則是關(guān)于聚-3-羥基鏈烷酸是D-3-羥基己酸酯(3HH)與其他3-羥基鏈烷酸的共聚物的上述制備方法，更優(yōu)選的是關(guān)于聚-3-羥基鏈烷酸是D-3-羥基丁酸酯(3HB)和D-3-羥基己酸酯(3HH)的二元共聚物、或是D-3-羥基丁酸酯(3HB)和D-3-羥基戊酸酯(3HV)以及D-3-羥基己酸酯(3HH)的三元共聚物的上述制備方法。
作為另一更優(yōu)選實(shí)施方案，則是關(guān)于含有聚-3-羥基鏈烷酸的微生物是豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)，或者是導(dǎo)入了來(lái)自豚鼠氣單胞菌的聚-3-羥基鏈烷酸合成酶組基因的菌株的上述制備方法。
下面詳述本發(fā)明。
發(fā)明詳述本發(fā)明所用的微生物沒(méi)有特別的限制，只要是細(xì)胞內(nèi)蓄積有PHA的微生物即可。可以列舉A.lipolytica、真氧產(chǎn)堿桿菌(A.eutrophus)、廣泛產(chǎn)堿桿菌(A.latus)等產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、固氮菌屬(Azotobacter)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、氣單胞菌屬(Aeromonas)等。特別是，A.caviae等的菌株，尤其是，導(dǎo)入了PHA合成酶組的基因的真氧產(chǎn)堿桿菌AC32(根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏，國(guó)際保藏局獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(茨城縣つくば市東1丁目1番3號(hào))、保藏日1997年8月7日、保藏號(hào)FERM BP-6038，從1996年8月12日保藏的FERM P-15786號(hào)轉(zhuǎn)保藏)(J.Bacteriol.，179，4821-4830頁(yè)(1997))更為優(yōu)選。在本發(fā)明中，可以使用在適當(dāng)條件下培養(yǎng)使細(xì)胞內(nèi)蓄積PHA的微生物細(xì)胞。對(duì)所述培養(yǎng)方法沒(méi)有特別限制，可以使用例如在特開平05-93049等中列舉的公知方法。
本發(fā)明中所說(shuō)的PHA，是羥基鏈烷酸聚合物的總稱，對(duì)羥基鏈烷酸成分沒(méi)有特別限定，具體地可以列舉D-3-羥基丁酸酯(3HB)的均聚物、3HB與其他的3-羥基鏈烷酸的共聚物、或者含D-3-羥基己酸酯(3HH)的3-羥基鏈烷酸的共聚物等。其中作為單體成分，從所得聚酯的物性方面考慮，更優(yōu)選含3HH的聚合物，例如，3HB與3HH的2元共聚物(Macromolecules，28，4822-4828(1995))、或者3HB與D-3-羥基戊酸酯(3HV)以及3HH的3元共聚物(特許第277757號(hào)、特開平08-289797號(hào))。這里對(duì)于構(gòu)成3HB與3HH的2元共聚物的各單體單元的組成比沒(méi)有特別限制，但使3HH單元為1～99mol％的組成比是合適的。另外，對(duì)于構(gòu)成3HB與3HV與3HH的3元共聚物的各單體單元的組成比沒(méi)有特別限制，但優(yōu)選的范圍是例如3HB單元的含量為1～95mol％、3HV單元的含量為1～96mol％、3HH單元的含量為1～30mol％。
被處理的微生物細(xì)胞內(nèi)的PHA含量當(dāng)然是越高越好，且工業(yè)水平的使用中優(yōu)選干燥細(xì)胞中含PHA為20重量％或20重量％以上者，而考慮到堿處理、物理破碎處理、分離操作、分離聚合物的純度等時(shí)，特別優(yōu)選含PHA為50重量％或50重量％以上者。
本發(fā)明中的微生物細(xì)胞的懸浮液是培養(yǎng)結(jié)束后原封未動(dòng)的培養(yǎng)懸浮液、或?qū)⑼ㄟ^(guò)離心分離等從培養(yǎng)液中分離出的細(xì)胞懸浮在水中的水性懸浮液。這里的細(xì)胞懸浮濃度，按干燥細(xì)胞換算，優(yōu)選500g/l或500g/l以下，更優(yōu)選300g/l或300g/l以下。
本發(fā)明中使用的堿沒(méi)有特別限定，只要能將pH調(diào)至所規(guī)定的范圍即可，可以列舉氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋰等堿金屬氫氧化物，碳酸鈉、碳酸鉀等堿金屬碳酸鹽，碳酸氫鈉、碳酸氫鉀等堿金屬碳酸氫鹽，醋酸鈉、醋酸鉀等有機(jī)酸堿金屬鹽，硼砂等堿金屬硼酸鹽，磷酸三鈉、磷酸氫二鈉、磷酸三鉀、磷酸氫二鉀等堿金屬磷酸鹽以及氨水等。其中，從適于工業(yè)生產(chǎn)，且從價(jià)格方面考慮，優(yōu)選氫氧化鈉、碳酸鈉、氫氧化鉀等。堿可以直接添加，但優(yōu)選以水溶液形式添加。
本發(fā)明中的物理破碎處理可以列舉通過(guò)超聲波的破碎，采用乳化分散機(jī)、高壓均化器或磨機(jī)等的破碎。對(duì)上述高壓均化器沒(méi)有特別限定，可以使用例如德國(guó)APV·ゴ-リン公司的マントンゴ-リン、丹麥APVラニ-公司的ミニラボ、美國(guó)Microfluidics公司的マイクロフルイタイザ-等。上述磨機(jī)沒(méi)有特別的限定，例如可以使用瑞士Willy A.Bachofen公司的ダイノ-ミル等。上述乳化分散機(jī)沒(méi)有特別限定，例如可以使用英國(guó)シルバ-ソン公司的シルバ-ソンミキサ-、日本エムテック公司的クリア-ミックス、日本エバラ公司的エバラマイルダ-等。對(duì)于這些機(jī)器只要通過(guò)堿處理能從細(xì)胞內(nèi)溶出，并能更有效地破碎主要構(gòu)成粘度上升原因的核酸，而且，能充分分散細(xì)胞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜以及不溶性蛋白質(zhì)等聚合物以外的不溶性物質(zhì)則沒(méi)有限定。另外，通過(guò)將這些破碎機(jī)中的2種或2種以上同時(shí)或依次使用則可以進(jìn)一步提高聚合物的純度。
上述物理破碎處理也可以邊攪拌上述懸浮液邊進(jìn)行。對(duì)攪拌裝置沒(méi)有特別限定，只要是能進(jìn)行通常機(jī)械攪拌的裝置即可。
在本發(fā)明中，一面連續(xù)或間歇性地往含PHA的微生物細(xì)胞懸浮液中添加堿一面對(duì)該懸浮液進(jìn)行物理破碎處理。通過(guò)堿處理，核酸和細(xì)胞細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、不溶性蛋白質(zhì)等不溶性物質(zhì)與PHA一起從微生物細(xì)胞流出。此時(shí)，通過(guò)進(jìn)行物理破碎處理使細(xì)胞完全破碎，并使流出成分細(xì)分化，防止粘度上升，同時(shí)還能進(jìn)一步使不溶性物質(zhì)堿溶解，從而可以提高PHA的收率。
在本發(fā)明中，物理破碎處理和堿添加可以同時(shí)進(jìn)行，也可以只開始物理破碎處理，然后開始?jí)A添加，或交替進(jìn)行物理破碎處理和堿添加，或者在進(jìn)行物理破碎處理和堿添加之后，再只繼續(xù)進(jìn)行物理破碎處理。
在本發(fā)明中，優(yōu)選在上述加堿時(shí)控制上述懸浮液的pH，更優(yōu)選控制pH為9或9以上，進(jìn)一步優(yōu)選控制pH為10或10以上。另外，更優(yōu)選控制在13.5或13.5以下，進(jìn)一步優(yōu)選控制在13或13以下。pH超過(guò)13.5時(shí)PHA的分解有時(shí)激烈，pH低于9時(shí)PHA的分解效果有時(shí)變低。對(duì)于pH的上下波動(dòng)幅度，優(yōu)選設(shè)定值的上下分別在1以內(nèi)，更優(yōu)選上下分別在0.5以內(nèi)。
在本發(fā)明中，優(yōu)選一邊控制上述懸浮液的pH一邊連續(xù)或間歇性地添加堿。
本發(fā)明人通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在從微生物細(xì)胞分離精制PHA的過(guò)程中，在對(duì)微生物細(xì)胞加一次堿的現(xiàn)有方法中，剛添加之后一旦高濃度的堿與PHA接觸則引起PHA的低分子化，或伴隨反應(yīng)進(jìn)行而消耗堿使pH下降從而不可能將有效的提取進(jìn)行到最后。另外，經(jīng)試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在對(duì)微生物細(xì)胞添加規(guī)定量的堿的方法中，微生物細(xì)胞懸浮液中所含的培養(yǎng)液成分等在酸性物質(zhì)的情況下或與其進(jìn)行反應(yīng)，或成為緩沖狀態(tài)，故不能達(dá)到目地。與此相反，在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，為了將pH控制成堿性，連續(xù)或間歇性地添加堿，所以可將不溶物有效地溶解且可進(jìn)行有效的PHA的分離。另外，由于不是堿的絕對(duì)量而是通過(guò)pH調(diào)節(jié)適宜的堿添加量，所以可以不受微生物的培養(yǎng)條件和從培養(yǎng)后到細(xì)胞破碎經(jīng)過(guò)的時(shí)間、或該微生物細(xì)胞懸浮液中的副成分的影響，從而能獲得有重現(xiàn)性的結(jié)果。
在pH控制這一點(diǎn)上，也必須一邊向上述懸浮液中添加堿一邊進(jìn)行上述懸浮液的物理破碎處理。在物理破碎處理時(shí)不進(jìn)行堿添加的情況下，如上所述，細(xì)胞的粘度上升、攪拌困難，并且不能進(jìn)行pH的控制。因此，添加的堿發(fā)生濃度分布，由于存在堿濃度高的部分，從而引起PHA的低分子化。
本發(fā)明中，在從含PHA的微生物細(xì)胞中分離PHA的工序中，不須要像以前那樣在高溫下實(shí)施物理破碎處理和堿的添加，因?yàn)閴A狀態(tài)下的高溫處理是引起PHA低分子化的主要原因，所以不好。本發(fā)明的物理破碎處理和堿添加的優(yōu)選溫度條件是50℃或50℃以下，更優(yōu)選40℃或40℃以下，進(jìn)一步優(yōu)選低于40℃。下限優(yōu)選20℃或20℃以上，更優(yōu)選25℃或25℃以上。


圖1(a)和(b)是實(shí)施本發(fā)明的PHA分離精制用的微生物細(xì)胞破碎裝置之一例簡(jiǎn)圖。當(dāng)然本發(fā)明并不限于這些裝置的例子。
符號(hào)1整體表示本發(fā)明的細(xì)胞破碎裝置。圖1(a)和(b)中的符號(hào)6是貯存堿試劑用的pH調(diào)節(jié)劑貯存槽，該pH調(diào)節(jié)劑貯存槽6內(nèi)的試劑通過(guò)泵4經(jīng)管路5供給到細(xì)胞破碎槽11，調(diào)節(jié)細(xì)胞破碎槽11內(nèi)的微生物懸浮液的pH。另外，細(xì)胞破碎槽11還設(shè)置攪拌裝置2，該攪拌裝置2用于將從pH調(diào)節(jié)劑貯存槽6供給的pH調(diào)節(jié)劑均勻地?cái)嚢杌旌系郊?xì)胞破碎槽11內(nèi)的細(xì)胞懸浮液中。另外，在細(xì)胞破碎槽11內(nèi)還設(shè)置有由pH計(jì)7和pH檢測(cè)控制裝置構(gòu)成的pH檢測(cè)控制設(shè)備，用來(lái)進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞破碎槽11內(nèi)的細(xì)胞懸浮液的pH，以便按規(guī)定的pH控制來(lái)自泵4的供給量。
在圖1(a)中，細(xì)胞破碎槽11內(nèi)的細(xì)胞懸浮液通過(guò)泵10供給到破碎裝置9，通過(guò)該破碎裝置9高效地破碎從微生物細(xì)胞溶出的成為粘度上升原因的核酸，并通過(guò)管路8供給到細(xì)胞破碎槽11內(nèi)，由此使細(xì)胞破碎槽11內(nèi)的細(xì)胞懸浮液的粘度下降，通過(guò)攪拌裝置2使細(xì)胞懸浮液均勻，從而可以嚴(yán)密地調(diào)節(jié)細(xì)胞懸浮液的pH。
在圖1(b)中，破碎裝置12安裝在細(xì)胞破碎槽11內(nèi)，在該破碎槽11內(nèi)通過(guò)該破碎裝置12高效地破碎從微生物細(xì)胞溶出的成為粘度上升原因的核酸。另外，破碎裝置12進(jìn)行核酸破碎的同時(shí)，若是具有均勻攪拌該細(xì)胞懸浮液的能力，則可以省略(b)中的攪拌裝置2。
按照本發(fā)明的制備方法得到的PHA，即使原封不動(dòng)也是高純度的，但根據(jù)目的，通過(guò)公知的精制方法，例如，使溶菌酶(特公平4-61638號(hào))、胰蛋白酶或鏈霉蛋白酶等蛋白質(zhì)分解酶(特開平5-336982號(hào))、過(guò)氧化氫等過(guò)氧化物(特表平8-502415號(hào))等起作用的方法，可更進(jìn)一步提高聚合物純度。
附圖簡(jiǎn)述圖1(a)和(b)是破碎用于實(shí)施本發(fā)明PHA制備方法的微生物細(xì)胞的裝置之一例的簡(jiǎn)圖。
發(fā)明的最佳實(shí)施方案本發(fā)明實(shí)施例中使用的微生物是導(dǎo)入了來(lái)自豚鼠氣單胞菌的PHA合成酶組基因的真氧產(chǎn)堿桿菌AC32(保藏參照前面所述)。按照J(rèn).Bacteriol.，179，4821-4830頁(yè)(1997)中記載的方法進(jìn)行培養(yǎng)，得到了含平均分子量為100萬(wàn)的聚(D-3-羥基丁酸酯-共-D-3-羥基己酸酯)[以下簡(jiǎn)稱為p(3HB-co-3HH)]約60重量％的細(xì)胞。接著通過(guò)離心(5000rpm，10分鐘)將其從培養(yǎng)液中分離，并向該漿糊狀細(xì)胞中添加水配制成50g細(xì)胞/l的水性懸浮液。使用該水性懸浮進(jìn)行以下所示的實(shí)施例，但是本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例等。
從細(xì)胞分離得到的p(3HB-co-3HH)的純度如下測(cè)定將從細(xì)胞分離得到的沉淀物10mg溶解在1ml氯仿中，然后添加0.85ml甲醇和0.25ml濃硫酸，在100℃下處理140分鐘。將其冷卻后，加入0.5ml硫酸銨飽和水溶液并進(jìn)行激烈攪拌，然后靜置，采用毛細(xì)管氣相色譜法分析下層部分，并求出分離物中的p(3HB-co-3HH)的純度。
從細(xì)胞分離得到的p(3HB-co-3HH)的分子量如下進(jìn)行分析將從細(xì)胞分離得到的沉淀物10mg溶解在1ml氯仿中，然后通過(guò)過(guò)濾除去不溶物，所得溶液用安裝有東ソ-公司的TSK-GEL GMHXL(7.8×300mm，2根連接)的SHIMADZU公司的GPC系統(tǒng)以氯仿作為流動(dòng)相進(jìn)行分析。
(實(shí)施例1)
制備含有p(3HB-co-3HH)的細(xì)胞的懸浮液500ml，并放入安裝有pH電極和SILVERSON混合器的1升反應(yīng)器中在35℃下保溫。pH電極連接到丸菱バイォエンジ公司的Lab Controller MDL-6C型上，并如下設(shè)定當(dāng)該懸浮液的pH達(dá)到設(shè)定值以下時(shí)，蠕動(dòng)泵啟動(dòng)并把氫氧化鈉水溶液添加到該懸浮液中直至達(dá)到設(shè)定值。這相當(dāng)于圖1的(b)型的細(xì)胞破碎裝置。SILVERSON混合器的旋轉(zhuǎn)數(shù)設(shè)定為3000轉(zhuǎn)，Lab Controller的pH設(shè)定為11.8，攪拌2小時(shí)(此間必需1當(dāng)量的氫氧化鈉水溶液40ml)。將處理后的懸浮液離心分離(3000rpm，10分鐘)得到沉淀物。沉淀物用水洗1次、用甲醇洗2次，并在減壓下進(jìn)行干燥，得到p(3HB-co-3HH)粉末。該p(3HB-co-3HH)粉末達(dá)到92％的高純度，平均分子量是87萬(wàn)。
(實(shí)施例2)除了懸浮液的pH調(diào)節(jié)用碳酸鈉水溶液進(jìn)行，并且將pH的設(shè)定值設(shè)定成11.0以外，與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行操作，結(jié)果得到的p(3HB-co-3HH)粉末達(dá)到91％的高純度，平均分子量是89萬(wàn)。
(實(shí)施例3)與實(shí)施例1同樣地將Lab Controller的pH設(shè)定為11.8進(jìn)行攪拌1小時(shí)。將該處理后的懸浮液通過(guò)德國(guó)APV·ゴ-リン公司的マントンゴ-リン在7000psi下再進(jìn)行物理破碎。將處理后的懸浮液離心分離(3000rpm，10分鐘)得到沉淀物。沉淀物用水洗1次、用甲醇洗2次，并在減壓下進(jìn)行干燥，則得到p(3HB-co-3HH)粉末。該p(3HB-co-3HH)粉末達(dá)到99％的非常高的純度，平均分子量是87萬(wàn)。
(比較例1)除了用機(jī)械攪拌器(100轉(zhuǎn))代替實(shí)施例1中的SILVERSON混合器進(jìn)行攪拌以外，其它操作相同。上述機(jī)械混合器是只進(jìn)行懸浮液攪拌的攪拌器，不能進(jìn)行物理破碎。其結(jié)果，添加堿時(shí)，懸浮液變得過(guò)粘而無(wú)法攪拌，并且不能進(jìn)行正常的pH測(cè)定。對(duì)懸浮液進(jìn)行了離心分離(15000rpm，10分鐘)，但不能得到沉淀物。
(比較例2)除了對(duì)Lab Controller不進(jìn)行pH調(diào)節(jié)而是一次加入1當(dāng)量的氫氧化鈉水溶液(40ml)并用SILVERSON混合器進(jìn)行2小時(shí)攪拌以外，其它與實(shí)施例1進(jìn)行同樣的操作，結(jié)果得到的p(3HB-co-3HH)粉末達(dá)到90％的高純度，但平均分子量是30萬(wàn)，嚴(yán)重低分子化。
(比較例3)按照特開平7-31487號(hào)記載的實(shí)施例的條件進(jìn)行堿處理。即，制備該懸浮液500ml，使含p(3HB-co-3HH)的細(xì)胞為40g/l，用0.1M的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)到4mM和8mM并在80℃下攪拌1小時(shí)。將處理后的懸浮液冷卻到室溫后，進(jìn)行離心分離想得到沉淀物，但按實(shí)施例記載的2700rpm卻得不到沉淀物。因此，添加與該懸浮液等的甲醇并以8000rpm進(jìn)行離心分離30分鐘，得到沉淀物。對(duì)沉淀物用水洗1次，用甲醇洗2次并在減壓下進(jìn)行干燥，得到p(3HB-co-3HH)的粉末。該p(3HB-co-3HH)粉末的純度在堿濃度為4mM和8mM時(shí)分別是72％、70％，平均分子量分別是87萬(wàn)、65萬(wàn)。其結(jié)果表明，采用該法得到的p(3HB-co-3HH)粉末的純度低，另外，在8mM的條件下聚合物的低分子化嚴(yán)重。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的PHA的分離精制方法，是采用極簡(jiǎn)便的分離精制方法卻能夠得到高純度的PHA。采用該方法可以精確地控制懸浮液的pH，但卻不引起PHA的分子量的嚴(yán)重下降，而且可以得到高收率高純度的PHA。因此本發(fā)明在由微生物生產(chǎn)PHA的工業(yè)生產(chǎn)效度提高方面和成本降低方面意義重大。
權(quán)利要求
1.聚-3-羥基鏈烷酸的制備方法，其特征在于，邊對(duì)含有聚-3-羥基鏈烷酸的微生物細(xì)胞懸浮液進(jìn)行物理破碎處理，邊往該懸浮液中連續(xù)或間歇性地添加堿，然后分離聚-3-羥基鏈烷酸。
2.權(quán)利要求1所述的制備方法，其中堿的添加是邊控制懸浮液的pH邊進(jìn)行的。
3.權(quán)利要求2所述的制備方法，其中將懸浮液的pH控制在9～13.5之間。
4.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中懸浮液的物理破碎處理是在攪拌上述懸浮液的條件下進(jìn)行的。
5.權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中懸浮液的物理破碎處理是在20℃至低于40℃的溫度下進(jìn)行的。
6.權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中聚-3-羥基鏈烷酸是D-3-羥基己酸酯(3HH)與其他3-羥基鏈烷酸的共聚物。
7.權(quán)利要求6所述的制備方法，其中聚-3-羥基鏈烷酸是D-3-羥基丁酸酯(3HB)和D-3-羥基己酸酯(3HH)的二元共聚物、或是D-3-羥基丁酸酯(3HB)和D-3-羥基戊酸酯(3HV)以及D-3-羥基己酸酯(3HH)的三元共聚物。
8.權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中含有聚-3-羥基鏈烷酸的微生物是豚鼠氣單胞菌。
9.權(quán)利要求1～8中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中含有聚-3-羥基鏈烷酸的微生物是導(dǎo)入了來(lái)自豚鼠氣單胞菌的聚-3-羥基鏈烷酸合成酶組基因的菌株。
全文摘要
本發(fā)明提供一種制備聚－3－羥基鏈烷酸的方法，該方法包括邊連續(xù)或間歇性地往含有聚－3－羥基鏈烷酸的微生物細(xì)胞懸浮液中添加堿邊對(duì)該懸浮液進(jìn)行物理破碎處理，然后分離聚－3－羥基鏈烷酸。
文檔編號(hào)C12P7/62GK1650022SQ03809448
公開日2005年8月3日 申請(qǐng)日期2003年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月26日
發(fā)明者官本憲二, 小川典子, 小坂田史雄, 松本圭司 申請(qǐng)人:株式會(huì)社鐘化