專利名稱：通過3-羥基烷酸的酶促脫羧制備烯的制作方法
通過3-羥基烷酸的酶促脫羧制備烯簡(jiǎn)介本發(fā)明涉及經(jīng)生物學(xué)過程生成烯的方法。更具體的，本發(fā)明涉及從3-羥基烷酸型 分子制備末端烯(特別是丙烯、乙烯、1-丁烯、異丁烯或異戊烯)的方法。
背景技術(shù)：
目前許多化學(xué)化合物來(lái)源于石油化學(xué)產(chǎn)品。烯(例如乙烯、丙烯、不同的丁烯或戊 烯)應(yīng)用于塑料工業(yè)(例如生產(chǎn)聚丙烯或聚乙烯)及化工和燃料的其他領(lǐng)域。最簡(jiǎn)單的烯即乙烯處于工業(yè)有機(jī)化學(xué)的核心它是世界上生產(chǎn)最廣泛的有機(jī)化合 物。特別是用于生產(chǎn)聚乙烯，一種主要的塑料。乙烯可通過(氧化、鹵化)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為許多 工業(yè)上有用的產(chǎn)品。丙烯具有類似的重要作用它的聚合產(chǎn)生塑料材料聚丙烯。此產(chǎn)品在抗力、密度、 堅(jiān)固性、可變形性和透明度方面的技術(shù)特性是無(wú)以倫比的。從1%4年被發(fā)明之后，世界范 圍的聚丙烯市場(chǎng)就持續(xù)發(fā)展。丁烯以4種形式存在，其中之一異丁烯是甲基叔丁基醚(MTBE)的組成部分，MTBE 是汽車燃料的抗爆添加劑。異丁烯還可用于生產(chǎn)異辛烯，其之后可被還原為異辛烷(2，2， 4-三甲基戊烷)；異辛烷的極高燃燒/爆炸比率使其成為用于所謂“汽油”發(fā)動(dòng)機(jī)的最佳燃 料。戊烯、己烯和庚烯根據(jù)雙鍵的位置和構(gòu)型以多種形式存在。這些產(chǎn)品有實(shí)際的工 業(yè)應(yīng)用，但沒有乙烯、丙烯或丁烯重要。目前所有這些烯通過石油產(chǎn)品的催化裂解制備(或從煤或汽油中通過 Fisher-Tropsch法的衍生物制備，例如己烯)。因此其成本天然的根據(jù)石油價(jià)格調(diào)整。此 外，催化裂解有時(shí)伴隨相當(dāng)?shù)募夹g(shù)困難，從而提高過程復(fù)雜性和生產(chǎn)成本。除了以上考慮之外，塑料的生物制備是正在繁榮的領(lǐng)域。石油價(jià)格相關(guān)的經(jīng)濟(jì)擔(dān) 憂和全球(碳中和(carbon-neutral)產(chǎn)品)和地方性(廢物管理)二者的環(huán)境考慮驅(qū)動(dòng) 了生物制備的迅速發(fā)展。生物塑料的主要家族是聚羥基烷酸酯(PHA)。這些聚合物由同時(shí)包含酸基和醇基 的分子縮合得到?？s合通過酸對(duì)下一個(gè)單體的醇的酯化反應(yīng)進(jìn)行。這種酯鍵沒有在傳統(tǒng)塑 料聚合物中存在的直接碳-碳鍵穩(wěn)定，這解釋了為什么PHA具有幾周至幾個(gè)月的生物可降 解性。PHA家族具體包括聚3-羥基丁酸酯(PHB)，3_羥基丁酸酯的聚合物和聚羥基丁酸 戊酯(PHBV)，3-羥基丁酸酯和3-羥基戊酸酯的交替聚合物。PHB由幾種細(xì)菌菌株例如富養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligenes eutrophus)和巨大芽胞桿菌 (Bacillus megaterium)天然生成。已經(jīng)構(gòu)建了大體上整合了導(dǎo)向PHB或PBA的合成途徑 的實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌，例如大腸桿菌。該化合物或其聚合物在一些實(shí)驗(yàn)室條件下可占細(xì)菌重量的 高達(dá)80% (Wong MS等人，Biotech. Bioeng.，2008)。在20世紀(jì)80年代嘗試了 PHB的工業(yè) 規(guī)模生產(chǎn)，但當(dāng)時(shí)認(rèn)為通過發(fā)酵制備該化合物的成本太高。在遺傳修飾的植物(整合了在 生產(chǎn)者細(xì)菌中存在的PHB合成途徑的關(guān)鍵酶)中有關(guān)這些化合物的直接制備的項(xiàng)目正在進(jìn)行并可能只需要較低的經(jīng)營(yíng)成本。在與地球化學(xué)循環(huán)協(xié)調(diào)的可持續(xù)發(fā)展工業(yè)經(jīng)營(yíng)的大環(huán)境下，需要通過生物途徑生 產(chǎn)可用于燃料或合成樹脂前體的烷或其他有機(jī)分子。第一代生物燃料以乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)為 主，因?yàn)榘l(fā)酵和蒸餾過程已經(jīng)存在于食品加工工業(yè)。第二代生物燃料的生產(chǎn)正處于探索期， 具體包含長(zhǎng)鏈醇(丁醇和戊醇)、萜、線性烷和脂肪酸的生產(chǎn)。最近的2篇綜述提供了此領(lǐng) 域研究的一般概述Ladygina N 等人，Process Biochemistry, 2006,41 :1001 ；和 Wackett LP, Current Opinions in Chemical Biology, 2008, 21 :187。在烯的化學(xué)家族中，異戊二烯O-甲基-1，3_ 丁二烯)是在聚合中生成橡膠的 萜基序。其他萜可能通過化學(xué)、生物或混合途徑生成，作為可用產(chǎn)品例如生物燃料或用于 制造塑料。最近的文獻(xiàn)顯示甲羥戊酸途徑(在很多生物的類固醇生物合成中的關(guān)鍵中間 體)可能用于從萜家族以工業(yè)產(chǎn)量有效的生產(chǎn)產(chǎn)品(Withers ST等人，Appl. Environ. Microbiol. ，2007，73 :6277)。末端烯[2位是單或雙取代的乙烯H2C = C(Rj) (R2)]的生產(chǎn)明顯研究的較少。 在小紅酵母(Rhodotorula minuta)中檢測(cè)到從異戊酸到異丁烯的產(chǎn)生(Fujii T.等人， Appl. Environ. Microbiol.，1988，54 583)，但此轉(zhuǎn)化的效率低于每分鐘百萬(wàn)分之一或約每 天一千分之一，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到工業(yè)應(yīng)用。Fukuda H.等人(BBRC，1994，201(2) :516)闡明了反 應(yīng)機(jī)制，其中涉及細(xì)胞色素P450酶，其通過還原氧合鐵(oxoferryl)基Fev = 0對(duì)異戊酸 脫羧。反應(yīng)中不涉及異戊酸的羥基化。異戊酸也是亮氨酸分解代謝中的中間體。通過此途 徑大規(guī)模生物合成異丁烯似乎非常不合適，因?yàn)槠湫枰铣珊徒到?分子亮氨酸以形成1 分子異丁烯。并且，催化反應(yīng)的酶使用血紅素作為輔助因子，不適合在細(xì)菌中重組表達(dá)和改 進(jìn)酶參數(shù)。由于所有這些原因，在現(xiàn)有技術(shù)下此途徑似乎非常不可能作為工業(yè)開發(fā)的基礎(chǔ)。 能夠少量的從異戊酸天然產(chǎn)生異丁烯的其他微生物也有描述，但是得到的產(chǎn)量甚至比小紅 酵母的產(chǎn)量更低(Fukuda H.等人，Agric. Biol. Chem.，1984,48 :1679)。這些相同的研究也描述了丙烯的天然產(chǎn)生很多微生物能夠產(chǎn)生丙烯，但產(chǎn)量仍 然極低。早就知道植物可以產(chǎn)生乙烯(Meigh等人，1960，Nature，186 :902)。根據(jù)已闡明的 代謝途徑，甲硫氨酸是乙烯的前體(Adams和Yang，PNAS, 1979，76 :170)。2-酮戊二酸的轉(zhuǎn) 化也有描述(Ladygina N.等人，Process Biochemistry 2006,41 :1001)。因?yàn)閱为?dú)的乙烯 分子需要之前產(chǎn)生的4-或5-碳鏈，所有這些途徑所需要的設(shè)備和能量是不合適的，不利于 其用于生物生產(chǎn)烯的工業(yè)應(yīng)用。在鑒定出植物中乙烯的真實(shí)代謝前體S-腺苷甲硫氨酸(SAM)通過形成1-氨基 環(huán)丙烷-1羧化物(ACC) (Adams和Yang, PNAS, 1979,76 :170)轉(zhuǎn)化為乙烯的酶步驟之前， 在科學(xué)文獻(xiàn)中曾提出其他幾種假說解釋乙烯的產(chǎn)生，其中包括3-羥基丙酸脫水產(chǎn)生的丙 烯酸(H2C = CH-C02H)的脫羧。一些文章具體推測(cè)了經(jīng)丙烯酸從3-羥基丙酸轉(zhuǎn)化為乙烯 的代謝途徑，以解釋乙烯產(chǎn)生的放射性示蹤劑研究，其中在植物組織制備物中應(yīng)用mC標(biāo)記 的底物大豆子葉提取物中應(yīng)用β-丙氨酸-2-14C (Stinson和Spencer，Plant Physiol., 1969,44 1217 ；Thompson 和 Spencer, Nature, 1966,210 :5036)，和香蕉果肉勻漿中應(yīng)用丙 酸-2-14C(Shimokawa 和 Kasai，Agr. Biol. Chem. , 1970,34(11) :1640)。所有這些假說在代 謝的乙烯產(chǎn)生中涉及3-羥基丙酸和丙烯酸，而沒有鑒定酶活性，在發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸、SAM和ACC 后(Hanson 和 Kende,Plant Physiology, 1976,57 :528 ；Adams 和 Yang，PNAS，1979，76 170)，這些假說就從科學(xué)文獻(xiàn)中消失了。因此，就我所知，目前沒有通過微生物合成生產(chǎn)末端烯例如乙烯、丙烯、1-丁烯、異 丁烯、1-戊烯或異戊烯的有效方法。這些方法可能避免使用石油產(chǎn)品并降低生產(chǎn)塑料和燃 料的成本。最后，這些方法能夠?qū)⑻家怨腆w形式貯存，可能具有可觀的全球環(huán)境影響。發(fā)明概述本發(fā)明描述了經(jīng)生物過程進(jìn)行烯化合物合成的方法。本發(fā)明基于末端烯化合物的新型合成途徑的設(shè)計(jì)，所述途徑基于3-羥基烷酸的 轉(zhuǎn)化。本發(fā)明還基于對(duì)所述轉(zhuǎn)化可以以生物方式進(jìn)行的證明，通過使用脫羧酶類型的酶或 其變體。本發(fā)明可在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中體外實(shí)現(xiàn)，或通過使用微生物實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明還涉及從碳 源中制備烯，所述碳源特別為碳水化合物(特別是葡萄糖)、多元醇(特別是甘油)、可生物 降解的聚合物(特別是淀粉、纖維素、聚-3-羥基烷酸)；碳源由微生物轉(zhuǎn)化為屬于3-羥基 烷酸家族的代謝中間物，之后再轉(zhuǎn)化為末端烯。更具體的，本發(fā)明的目的是提供制備末端烯的方法，其特征在于所述方法包含以 下步驟在具有脫羧酶活性的酶的存在下轉(zhuǎn)化3-羥基烷酸。本發(fā)明的另一個(gè)目的是基于3-羥基烷酸化合物作為前體或底物用于制備末端烯 化合物的用途。在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中-3-羥基丙酸轉(zhuǎn)化為乙烯；或-3-羥基丁酸轉(zhuǎn)化為丙烯；或-3-羥基戊酸轉(zhuǎn)化為I- 丁烯；或-3-羥基3-甲基丁酸(或3-羥基異戊酸)轉(zhuǎn)化為異丁烯；或-3-羥基3-甲基戊酸轉(zhuǎn)化為異戊烯。本發(fā)明還涉及脫羧酶或產(chǎn)生脫羧酶的微生物在從3-羥基烷酸制備末端烯化合物 中的用途。本發(fā)明還涉及組合物，其包含產(chǎn)生脫羧酶的微生物、合適的培養(yǎng)基和3-羥基烷酸 化合物或可由微生物轉(zhuǎn)化為3-羥基烷酸化合物的碳源。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及生物催化劑，其包含將3-羥基烷酸化合物脫羧為末端 烯的脫羧酶或制備脫羧酶的微生物。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及由如本發(fā)明描述的方法得到的末端烯化合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是分離的或純化的具有脫羧酶活性并包含SEQ ID NO :6的全 部或部分的酶，或與其具有至少15%序列同源性的酶。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及具有脫羧酶活性并包含SEQ ID NO :6的全部或部分的 酶，或與其具有至少15%序列同源性的酶在制備末端烯中的用途。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及制備具有脫羧酶活性并包含SEQ ID NO :6的全部或部分 的酶或與其具有至少15%序列同源性的酶的方法，所述方法包含在允許表達(dá)所述序列的條 件下培養(yǎng)包含編碼所述序列的重組核酸的微生物。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及微生物，其包含編碼具有脫羧酶活性并包含SEQ ID NO 6的全部或部分的酶或與其具有至少15%序列同源性的酶的重組核酸。
定義如此處使用的，“3-羥基烷酸”表示包含3-羥基丙酸作為共同基序的任意分子(圖 1)，任選的在3位碳上有1或2個(gè)烷基取代。所述烷基殘基或基團(tuán)可為線性的或分支的。 如此處使用的，術(shù)語(yǔ)“烷基(alkoyl)”和“烷基(alkyl)”具有相同的意思并可互換。類似 的，術(shù)語(yǔ)“殘基”和“基團(tuán)”具有相同的意思并可互換。甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁 基是所述烷基的示例。如果2個(gè)烷基取代不同則3位碳變?yōu)槭中灾行?。本定義包含2種手 性形式，甚至當(dāng)2種形式中的一種，例如R型，為天然產(chǎn)生的主要形式時(shí)亦如此。3-羥基烷 酸的示例見圖3。任選的，烷基取代可加在2位碳上，其之后也可能變?yōu)槭中缘?如果2個(gè) 取代不同)。相同的，本發(fā)明中3-羥基烷酸底物的構(gòu)型包含所有的立體異構(gòu)體。在優(yōu)選的 方式中，3-羥基烷酸對(duì)應(yīng)3-羥基丙酸或3-羥基丙酸的變體或衍生物，其中3位碳上的2個(gè) 氫原子之一或2個(gè)氫原子由僅由碳和氫原子組成的基序取代，所述取代基的碳原子數(shù)范圍 從1至5，優(yōu)選的從1至3，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基或異丁基。如此處使用的，詞 尾“酸(oate)”可互換的表示羧酸離子(C00-)或羧酸(COOH)。其不用于表示酯。在具體 的實(shí)施方案中，3-羥基烷酸用以下通式表示=HO-CO-CH2-C (R1) (R2)-OH或CT-CO-CH2-C (R1) (R2) -OH。根據(jù)本發(fā)明，“末端烯”表示僅由碳和氫(具有通式CnH2n的不飽和碳?xì)浠衔? 組成的分子，其包含乙烯和乙烯衍生的有機(jī)分子，后者通過結(jié)合在2位碳上的2個(gè)氫原子由 線性或分支的烷基單或雙取代。末端烯優(yōu)選的由通式H2C = C(Rj) (R2)表示，其中R1和R2 獨(dú)立的選自氫原子和線性或分支的烷基，所述烷基優(yōu)選的具有1至4個(gè)碳原子，更優(yōu)選的選 自1至3個(gè)碳原子。優(yōu)選的，烯的2位碳上的2個(gè)取代基中的至少1個(gè)為線性或分支的烷 基。末端烯包含分支的異烯化合物，例如異丁烯。根據(jù)本發(fā)明的末端烯化合物的優(yōu)選示例 具體為乙烯、丙烯、異丁烯和異戊烯(圖4)，或1- 丁烯和1-戊烯。如此處使用的，“碳源”表示可用于根據(jù)本發(fā)明生物的底物的任意碳化合物。所 述術(shù)語(yǔ)包括葡萄糖或任意其他己醣、木糖或任意其他戊糖，多元醇例如甘油、山梨醇或甘露 醇，或聚合物例如淀粉、纖維素或半纖維素，或聚3-羥基烷酸例如聚3-羥基丁酸。其可為 允許微生物生長(zhǎng)的任意底物，例如甲酸。其也可為CO2，如果該生物能夠進(jìn)行光合作用。如此處使用的，“重組”表示生物的人工遺傳修飾，通過對(duì)染色體或染色體外基因 或調(diào)控基序例如啟動(dòng)子的添加、去除或修飾，或通過生物的融合，或通過添加任意類型的載 體，例如質(zhì)粒。術(shù)語(yǔ)“重組表達(dá)”表示涉及基因修飾的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，優(yōu)選的為了制備對(duì)其 宿主而言外源或異源的蛋白質(zhì)，即所述蛋白質(zhì)不天然存在于制備宿主中，或?yàn)榱酥苽湫揎?的或突變的內(nèi)源蛋白質(zhì)。如此處使用的，“過表達(dá)(overexpression) ” 或“過表達(dá)(overexpressing) ” 表 示蛋白質(zhì)的重組表達(dá)與所述蛋白質(zhì)的天然表達(dá)相比提高至少10%，優(yōu)選的20%，50%， 100%，500%和可能更多，優(yōu)選的所述蛋白質(zhì)所來(lái)源的微生物和表達(dá)其的微生物不同。此定 義也包含不存在所述蛋白質(zhì)的天然表達(dá)的情況。“輔被用物(co-substrate) ”是添加至酶反應(yīng)的產(chǎn)物，用于改進(jìn)其特定參數(shù)，最重 要的是改進(jìn)其活性，所述產(chǎn)物和主要底物以相同量消耗。因此輔被用物必須以和主要底物 相當(dāng)?shù)臐舛燃尤敕磻?yīng)。取決于酶，輔被用物的存在可能是酶反應(yīng)所需要的?！拜o助因子”是添加至酶反應(yīng)的產(chǎn)物，用于改進(jìn)其特定參數(shù)，最重要的是改進(jìn)其活性，所述產(chǎn)物在反應(yīng)中不消耗，因此僅需要以與酶的量成比例的低濃度加入，所述濃度因此 被稱為“催化(濃度)”。氨基酸序列的“部分”表示包含至少10，優(yōu)選的至少20，30，40或50連續(xù)的所述序
列氨基酸殘基的片段?！巴葱浴北硎?條序列之間存在的相似性，通過所述2條序列的百分比同一性測(cè)量?；衔锝?jīng)常以幾種名字為人所知，正式的或普通的。這里，優(yōu)選分子的普通名。因 此- “乙烯(ethylene) ”用于表示乙烯(ethene)-“丙烯(propylene) ”用于表示丙烯(propene)- “丁烯(butylene) ”用于表示丁烯(butene)-“異丁烯(isobutylene) ”用于表示2_甲基丙烯或異丁烯(isobutene)-“戊烯(amylene) ” 用于表示戊烯(pentene)-“異戊烯(isoamylene) ”用于表示2_甲基丁烯或異戊烯(isopentene)-“丙酸(propionate) ”用于表示丙酸(propanoic acid)或丙酸離子- “丁酸(butyrate)” 用于表示丁酸(butanoic acid)或丁酸離子-“戊酸(valerate)”用于表示戊酸(pentanoic acid)或戊酸離子。發(fā)明詳述具體來(lái)說，本發(fā)明提供了制備末端烯的方法，其包含3-羥基烷酸化合物的酶促脫 羧步驟。本發(fā)明還涉及催化此反應(yīng)的脫羧酶，具體的是甲羥戊酸二磷酸脫羧酶類型的酶，和 底物例如3-羥基丁酸、3-羥基戊酸、3-羥基-3-甲基丁酸(或3-羥基異戊酸)和3-羥基 丙酸的用途。本發(fā)明描述了輔助因子的用途，所述輔助因子包括乙基二磷酸、丙基二磷酸、 甲基二磷酸、所述分子的類似物和焦磷酸。本發(fā)明還描述了輔被用物的用途，例如ATP或其 他包含磷酸酐鍵的化合物。本發(fā)明還涉及碳源，例如葡萄糖，在從全細(xì)胞中通過3-羥基烷酸進(jìn)行的合成途徑 直接制備末端烯的用途。本發(fā)明還涉及天然或修飾的生物，其內(nèi)源產(chǎn)生3-羥基烷酸并也表達(dá)將所述3-羥 基烷酸轉(zhuǎn)化為末端烯的脫羧酶。所制備的烯化合物，特別是丙烯、乙烯和異丁烯，是塑料和燃料工業(yè)中的關(guān)鍵分 子，其通過生物途徑從可再生資源中的工業(yè)制備代表了重大創(chuàng)新。因此本發(fā)明是根據(jù)末端烯類型化合物的新型合成途徑的設(shè)計(jì)得到，所述途徑基于 3-羥基烷酸類型化合物的轉(zhuǎn)化。本發(fā)明證明所述轉(zhuǎn)化可通過生物學(xué)進(jìn)行，通過使用脫羧酶 類型的酶，所述酶可將3-羥基烷酸轉(zhuǎn)化為末端烯。如圖2中所示，所述轉(zhuǎn)化通過具有3-磷 酸-羥基烷酸結(jié)構(gòu)的反應(yīng)中間體進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化步驟可在分離的酶(或另外包含一種或多種輔助因子的酶系 統(tǒng))存在下在體外進(jìn)行，或在產(chǎn)生酶的微生物存在下在培養(yǎng)物中進(jìn)行。如在此處的實(shí)施例5中所描述的，在一些條件下可觀察到轉(zhuǎn)化產(chǎn)量的約100倍的 信噪比(在不存在酶時(shí)測(cè)量)。測(cè)量了對(duì)3-羥基異戊酸(HIV)的親和力為約40mM。目前 尚不清楚這樣顯著的酶活性是如何得到的事實(shí)上，熟悉酶學(xué)理論和實(shí)踐的生化學(xué)家清楚地知道，酶活性位點(diǎn)包含可識(shí)別、結(jié)合和化學(xué)轉(zhuǎn)化一些特異性底物的結(jié)構(gòu)元件?？茖W(xué)文獻(xiàn)和 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)指示，大小或電荷的改變，甚至微小改變可導(dǎo)致底物的排斥。具體來(lái)說，沒有科學(xué) 預(yù)測(cè)可以預(yù)料到MDP脫羧酶可使用3-羥基烷酸型的一般分子特別是3-羥基異戊酸作為底 物，后者與甲羥戊酸二磷酸的差別不僅在大小上(分子量118，甲羥戊酸二磷酸為308)，而 且在天然底物甲羥戊酸二磷酸中存在的二磷酸基團(tuán)的電荷上。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，在反應(yīng)中加入輔助因子以在催化裂縫中提供空間或電 子互補(bǔ)。輔助因子有利地選自焦磷酸離子、甲基二磷酸、乙基二磷酸或丙基二磷酸。更一般 的，輔助因子是包含磷酸酐基序的化合物，其具有通式R-O-PO2H-O-PO3H2，其中R具體代表 氫原子，線性、分支或環(huán)狀的烷基，優(yōu)選的具有從1至10或從1至5個(gè)碳原子，或任意其他單 價(jià)有機(jī)基團(tuán)。本發(fā)明也包括對(duì)應(yīng)亞甲基二磷酸單酯的類似基序，由通式R-O-PO2H-CH2-PO3H2 代表，其中磷酸酐由亞甲基橋替換，其優(yōu)勢(shì)在于不被水解。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化在輔被用物存在下進(jìn)行，所述輔被用物優(yōu)選的為包含 磷酸酐的化合物，優(yōu)選的為ATP、rNTP、NTP或幾種這些分子的混合物、多磷酸或焦磷酸。輔 被用物一般存在于宿主中。然而，在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，可將輔被用物添加至反應(yīng) 中，其優(yōu)選的選自ATP、rNTP、NTP、一些rNTP或dNTP的混合物、多磷酸和優(yōu)選的焦磷酸，或 包含磷酸酐的化合物(由圖2中的通式X-PO3H2代表)。在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中使用了產(chǎn)生脫羧酶的微生物。在優(yōu)選的實(shí)施方 案中，微生物是重組的，其產(chǎn)生相對(duì)生產(chǎn)宿主異源的脫羧酶。因此所述方法可直接在培養(yǎng)基 中進(jìn)行，不需要分離或純化酶系統(tǒng)。在一種特別有優(yōu)勢(shì)的方式中，使用如下的微生物其具 有內(nèi)源產(chǎn)生一種或多種3-羥基烷酸的天然或人工性能，并還表達(dá)或過表達(dá)天然或經(jīng)修飾 的脫羧酶，從而從溶液中存在的碳源直接制備末端烯。本發(fā)明使用的微生物可為原核生物或真核生物，具體是細(xì)菌、酵母、植物細(xì)胞、真 菌和霉菌、動(dòng)物細(xì)胞。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，微生物為細(xì)菌，具體的為富養(yǎng)產(chǎn)堿菌和巨 大芽胞桿菌菌株。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，微生物為重組的大腸桿菌(Escherichia coli)菌 株，其被修飾以內(nèi)源產(chǎn)生一種或多種3-羥基烷酸，并將它們轉(zhuǎn)化為末端烯。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，微生物為重組的酵母，其產(chǎn)生3-羥基烷酸并將它們 轉(zhuǎn)化為末端烯。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用微生物一方面產(chǎn)生一種或多種3-羥基烷酸，另 一方面使用脫羧酶，任選的由第二種微生物表達(dá)脫羧酶。任選的，根據(jù)本發(fā)明的方法培養(yǎng)和 同時(shí)使用2種微生物。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用全植物或動(dòng)物(任選的通過轉(zhuǎn)基因修飾)從 3-羥基烷酸制備末端烯，無(wú)論它們是內(nèi)源產(chǎn)生的或是外源供應(yīng)的。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用如下光合微生物其具有內(nèi)源產(chǎn)生一種或多種 3-羥基烷酸的天然或人工性能，并也過表達(dá)天然或經(jīng)修飾的脫羧酶，從而從溶液中存在的 CO2直接制備末端烯。優(yōu)選的，所述微生物為光合作用菌或微藻。本發(fā)明還涉及在上文中描述的微生物和它們制備末端烯化合物的用途。如以下描述，本發(fā)明的方法可在微需氧的條件下進(jìn)行。此外，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，方法在收集從反應(yīng)中脫氣的末端烯氣體的系統(tǒng)的存在下進(jìn)行。如此處使用的，脫羧酶表示能夠?qū)⒕哂笑莻€(gè)碳原子的3-羥基烷酸轉(zhuǎn)化為具有η-1 個(gè)碳原子的末端烯的任意酶。如在圖2中所示，本發(fā)明的方法優(yōu)選的經(jīng)3-磷酸羥基烷酸反 應(yīng)中間體進(jìn)行，并且使用的酶有利地具有脫羧酶活性和磷酸化酶活性。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，脫羧酶為甲羥戊酸二磷酸(MDP)脫羧酶(酶命名EC 4. 1. 1.33)的系統(tǒng)發(fā)生上的超家族中的成員，也就是說，由天然或合成基因編碼的，任選的 能夠催化圖2中所示的反應(yīng)的天然或人工酶。MDP脫羧酶是參與膽固醇生物合成的酶。已經(jīng)從許多生物包括動(dòng)物、真菌、酵母和 一些細(xì)菌中分離出所述酶。其也可由一些植物表達(dá)(Lalitha等人，1985)。已經(jīng)克隆和測(cè) 序了許多編碼此酶的基因。這些酶一般由300至400氨基酸組成，使用ATP作為輔被用物， ATP在反應(yīng)中轉(zhuǎn)化為ADP和無(wú)機(jī)磷酸。磷酸基團(tuán)從ATP分子轉(zhuǎn)移至甲羥戊酸二磷酸的叔醇， 釋放ADP。在3-羥基基團(tuán)磷酸化的反應(yīng)中間體之后消去磷酸基，在生理?xiàng)l件下釋放異戊烯 焦磷酸(圖2)。已經(jīng)解析了此家族一些酶的三維結(jié)構(gòu)。到目前為止，對(duì)此家族酶進(jìn)行的研究相對(duì) 較少，僅在精確描述膽固醇的生物合成途徑中研究了這些酶。另一方面，就我所知，還沒有 研究將此酶從其天然功能中轉(zhuǎn)換并將其變?yōu)楣I(yè)催化劑。在SEQ ID NO 1到SEQ ID NO 16的序列中給出了來(lái)自不同生物的MDP脫羧酶的
若干實(shí)例。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用的酶為脫羧酶，其優(yōu)選的包含選自SEQ ID NO 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16的氨基酸序列，或與所述序列之一具有至 少15%序列同源性并保留脫羧酶活性的序列。優(yōu)選的酶有利地與SEQ ID N0:l，2，3，4， 5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或16的基本(primary)序列之一具有至少50%序列同源 性，優(yōu)選的至少80%，更優(yōu)選的至少85%，甚至更優(yōu)選的至少90，95，96，97，98或99%同源 性。確定序列同源性百分比可通過不同方法和通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的軟件程序例如 CLUSTAL方法或BLAST，及其衍生軟件，或使用序列比較算法例如Needleman和^msch (J. Mol. Biol. , 1970,48 :443)或 Smith 和 Waterman (J. Mol. Biol.，1981，147 :195)所描述的。本發(fā)明優(yōu)選的脫羧酶的代表是具有SEQ ID NO :6序列的酶和與其具有顯著的序列 同源性的任意酶。優(yōu)選的酶有利地與SEQ ID NO :6的基本序列具有至少50%序列同源性， 優(yōu)選的至少80%，更優(yōu)選的至少85%，甚至更優(yōu)選的至少90，95，96，97，98或99%同源性。 所述酶從嗜苦古菌(Picrophilus torridus)中克隆并由本發(fā)明范圍內(nèi)的重組方法制備。如 在實(shí)施例中所示，此酶特別有效的制備根據(jù)本發(fā)明的末端烯化合物。此酶及其制備和其作 為催化劑的用途也是本發(fā)明的目的。具體的，本發(fā)明的一個(gè)目的是包含SEQ ID N0:6全部 或部分的脫羧酶或與SEQ ID NO :6具有顯著的序列同源性、優(yōu)選的至少15%同源性的酶在 制備末端烯化合物中的用途。顯著的序列同源性是指使用上述算法可檢測(cè)的序列同源性， 優(yōu)選的高于15%的序列同源性。與嗜苦古菌具有最近的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的生物能夠制備與 SEQ ID NO :6最相似的MDP脫羧酶，所述生物為例如i^erroplasma acidarmanus，嗜酸熱原 體(Thermoplasma acidophilum)，火山熱原體(Thermoplasma volcanium)禾口 Picrophilus Oshimae0例如，嗜酸熱原體(AC號(hào)Q9HIN1)的MDP脫羧酶與SEQ ID NO :6具有38%序列 同源性；火山熱原體0197BY2)的MDP脫羧酶與SEQ ID NO :6具有約42%序列同源性。在本發(fā)明中更具體的考慮了這些MDP脫羧酶的用途?？筛鶕?jù)酶制備根據(jù)本發(fā)明的末端烯的能力選擇天然或合成的其他脫羧酶類型的 酶。因此，選擇試驗(yàn)包含將純化的酶或產(chǎn)生酶的微生物與反應(yīng)底物接觸，并測(cè)量末端烯化合 物的產(chǎn)生。這些試驗(yàn)在實(shí)施例部分描述，其中檢測(cè)了超過60種不同的酶。使用的酶可為天然的、制備的或人工優(yōu)化的任意脫羧酶。具體的，有利地使用對(duì)一 種或多種3-羥基烷酸具有優(yōu)化活性的脫羧酶。可從參考脫羧酶(天然的或自身已經(jīng)是合成或優(yōu)化的)制備或選擇酶，通過蛋白 質(zhì)工程技術(shù)例如隨機(jī)誘變、大量誘變、定點(diǎn)誘變、DNA改組、合成改組、體內(nèi)進(jìn)化或完整合成基因。就此而言，本發(fā)明的一個(gè)目的還涉及制備針對(duì)3-羥基烷酸底物具有脫羧酶活性 的酶的方法，所述方法包含以下步驟對(duì)酶來(lái)源進(jìn)行處理，并選擇與未處理的酶相比針對(duì)所 述底物具有增強(qiáng)性能的酶。在本發(fā)明中使用的酶因此可為天然或合成的，通過化學(xué)、生物學(xué)或遺傳方法制備。 其也可為化學(xué)修飾的，例如以改進(jìn)其活性、抗性、特異性、純化或?qū)⑵涔潭ㄔ谥С治锷?。本發(fā)明的特征在于脫羧酶、特別是天然或修飾的MDP脫羧酶在將3-羥基烷酸轉(zhuǎn)化 為末端烯中的用途。MDP脫羧酶的天然底物是甲羥戊酸二磷酸，其不屬于3-羥基烷酸的定義范圍。圖2B中描述了 MDP脫羧酶使用多種3_羥基烷酸進(jìn)行的通用反應(yīng)。認(rèn)為這些反應(yīng) 直接和一步得到末端烯。在第一個(gè)實(shí)施方案中，使用天然或重組的、純化或未經(jīng)純化的酶將3-羥基烷酸轉(zhuǎn) 化為末端烯。為此，在底物存在下在允許酶有活性的物理化學(xué)條件下孵育酶制劑，允許孵育 進(jìn)行足夠長(zhǎng)的時(shí)間。在孵育結(jié)束后，任選的測(cè)量末端烯的存在，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的 任意檢測(cè)系統(tǒng)例如氣相層析或比色試驗(yàn)測(cè)量烯產(chǎn)物或游離磷酸的形成，或測(cè)量3-羥基烷 酸底物或ATP的消失。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，添加輔助因子以最佳的模擬天然反應(yīng)。事實(shí)上，3-羥基烷酸 的結(jié)構(gòu)一般對(duì)應(yīng)MDP片段，因此在酶-底物結(jié)合中在催化裂縫里留出空的巨大空間。用輔助 因子填充此空間以代替底物的缺失部分，目的在于最接近地模擬MDP分子。因?yàn)檩o助因子 在反應(yīng)中不經(jīng)修飾，因此其僅以催化量加入。在反應(yīng)底物是3-羥基丙酸的情況下，互補(bǔ)的 輔助因子為丙基二磷酸。在反應(yīng)底物是3-羥基丁酸或3-羥基-3-甲基丁酸的情況下，互補(bǔ) 的輔助因子為乙基二磷酸。在反應(yīng)底物是3-羥基戊酸或3-羥基-3-甲基戊酸的情況下，互 補(bǔ)的輔助因子為甲基二磷酸。這些不同的分子顯示于圖5。有時(shí)候，一個(gè)反應(yīng)的互補(bǔ)輔助因 子可能對(duì)另一個(gè)底物的反應(yīng)有積極作用。一般的，輔助因子可為任意包含磷酸酐的分子，因 此具有通式R-PO2H-O-PO3H2，其中R具體是H、線性、分支或環(huán)狀烷基，或任意其他單價(jià)有機(jī) 基團(tuán)。本發(fā)明也包括對(duì)應(yīng)亞甲基二磷酸單酯的類似基序，其具有通式R-O-PO2H-CH2-PO3H2， 其中磷酸酐由亞甲基橋替換，其優(yōu)勢(shì)在于不被水解。更一般的，輔助因子可為單磷酸或甚至是以上分子的無(wú)磷酸類似物，或通過在酶 催化位點(diǎn)提供空間或電荷互補(bǔ)可改進(jìn)反應(yīng)產(chǎn)量的任意其他分子。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，在反應(yīng)中加入輔被用物。所述輔被用物可為ATPdP MDP脫羧酶的天然輔被用物，或任意rNTP (核糖核苷三磷酸)或dNTP (脫氧核糖核苷三磷酸)或rNTP或dNTP的任意混合物，或焦磷酸，或其他多磷酸，或其他包含磷酸酐基團(tuán)的任 意分子(圖2中的X-PO3H2)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，為了將3-羥基烷酸轉(zhuǎn)化為末端烯，使用了與具有脫羧酶活 性的天然酶、特別是與對(duì)應(yīng)SEQ ID NO :1至16序列的酶之一具有至少15%序列同源性，優(yōu) 選的至少30%，50%和甚至更優(yōu)選的至少80，90，95，96，97，98或99%序列同源性的酶。具 體的，酶可經(jīng)修飾，通過對(duì)SEQ ID NO :1至16的酶之一或其他來(lái)源鑒定的任意其他脫羧酶 進(jìn)行改造得到。這些酶可能失去了其MDP脫羧酶活性，特別是在實(shí)驗(yàn)室的遺傳改造中，也可 能在自然進(jìn)化中(在這種情況下可稱為退化的MDP脫羧酶)，但保留或提高了針對(duì)一種或多 種3-羥基烷酸類型分子的活性。對(duì)所述底物活性更高的這些酶的變體的產(chǎn)生有可能改進(jìn) 根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)產(chǎn)量。例如，野生型MDP脫羧酶針對(duì)3-羥基烷酸的反應(yīng)性不一定是最佳 的?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意方法制備和選擇這些變體，所述方法例如隨機(jī)誘變、 定點(diǎn)誘變、大量誘變、DNA改組、或體內(nèi)進(jìn)化。本發(fā)明的特征還在于完全的人工酶在將3-羥基烷酸轉(zhuǎn)化為末端烯中的用途，所 述酶通過設(shè)計(jì)和制備編碼全新酶的合成基因得到，通過使用或不使用MDP脫羧酶的已知數(shù) 據(jù)設(shè)計(jì)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是具有脫羧酶活性和包含SEQ ID NO :6全部或部分的分離的 或純化的酶。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及具有脫羧酶活性和包含SEQ ID NO 6全部或部分的酶、 或具有如上述序列同源性的酶在制備末端烯中的用途。在一個(gè)變體中，序列可進(jìn)一步包含 另外的殘基，例如在N-末端的組氨酸標(biāo)簽。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及制備具有脫羧酶活性和包含SEQ ID NO :6全部或部分的 酶、或與上述序列具有同源性的酶的方法，所述方法包含在允許表達(dá)所述序列的條件下培 養(yǎng)包含編碼所述序列的重組核酸的微生物。在這一點(diǎn)上，本發(fā)明描述了除天然核酸(SEQ ID NO 19)以外的核酸，其具有為了在細(xì)菌中，特別是在大腸桿菌中，表達(dá)SEQ ID NO :6的酶而 優(yōu)化的序列(SEQ ID N0:17)。此核酸和任意優(yōu)化的核酸(即與野生型序列相比能夠在表 達(dá)中獲得至少30%的改進(jìn))是本發(fā)明的一個(gè)目的。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及包含編碼具有脫羧酶活性和包含SEQ ID NO :6全部或部 分的酶、或具有如上述序列同源性的酶的重組核酸的微生物。微生物優(yōu)選的為細(xì)菌、酵母或 真菌。本發(fā)明還涉及包含編碼根據(jù)本發(fā)明的脫羧酶的重組核酸的任意植物或非人動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，MDP脫羧酶以純化的形式使用以將3-羥基烷酸轉(zhuǎn)化為末端 烯。然而，此方法代價(jià)高，因?yàn)槊负偷孜锏闹苽浜图兓杀竞芨?。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MDP脫羧酶以非純化的提取物存在于反應(yīng)中，或以非裂解細(xì) 菌的形式，從而節(jié)省了蛋白質(zhì)純化的成本。然而，此方法相關(guān)的成本仍然很高，因?yàn)橹苽浜?純化底物的成本高。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，方法使用活的生物制備酶，通過酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化。因此 所述發(fā)明的特征在于制備一種或多種3-羥基烷酸的細(xì)菌菌株[例如經(jīng)實(shí)驗(yàn)室修飾以產(chǎn)生 所述產(chǎn)物的富養(yǎng)產(chǎn)堿菌和巨大芽胞桿菌，或大腸桿菌菌株]的遺傳工程修飾，從而使所述 細(xì)菌菌株過表達(dá)脫羧酶，所述酶優(yōu)選的來(lái)源于不同于宿主微生物的生物，并可直接生成一 種或多種末端烯。遺傳修飾可包含將脫羧酶基因整合進(jìn)染色體，表達(dá)質(zhì)粒上的酶，所述質(zhì)粒包含在酶編碼序列上游的啟動(dòng)子，啟動(dòng)子和編碼序列優(yōu)選的來(lái)源于不同生物，或本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的任意其他方法?？蛇x的，可以選擇其他細(xì)菌或酵母，它們可能具有特定優(yōu)勢(shì)。 例如，可使用酵母例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，嗜極端細(xì)菌例如嗜熱棲熱 菌(Thermus thermophilus)，或來(lái)自例如梭菌(Clostridiae)家族的厭氧菌，微藻或光合 細(xì)菌。為了最優(yōu)的制備3-羥基烷酸，其之后被轉(zhuǎn)化為末端烯，菌株也可經(jīng)遺傳工程修飾，即 通過體外重組或定向體內(nèi)進(jìn)化。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法的特征在于碳源例如葡萄糖至3-羥基烷酸的轉(zhuǎn) 化，之后所述初級(jí)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為次級(jí)產(chǎn)物，即末端烯。所述方法的不同步驟在圖6中顯示。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的特征在于聚羥基烷酸至3-羥基烷酸的轉(zhuǎn)化， 通過使用酶或合適的物理化學(xué)方法，之后所述初級(jí)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為次級(jí)產(chǎn)物，即末端烯。任選 的，聚羥基烷酸已由植物產(chǎn)生，所述植物的代謝途徑已經(jīng)修飾以使其產(chǎn)生高產(chǎn)量的聚羥基 烷酸。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明包含從大氣中的(X)2或人工添加至培養(yǎng)基的(X)2 制備產(chǎn)物的完整方法。所述發(fā)明的方法在能夠進(jìn)行光合作用的生物例如微藻中實(shí)施。在這些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法的另外特征在于從培養(yǎng)中脫氣的產(chǎn)物的回收模 式。事實(shí)上，短的末端烯，特別是乙烯、丙烯、丁烯異構(gòu)體在室溫和大氣壓下以氣態(tài)存在。本 發(fā)明的方法因此不需要將產(chǎn)物從液體培養(yǎng)基中抽提，此步驟通常當(dāng)以工業(yè)規(guī)模進(jìn)行時(shí)代價(jià) 很高。氣態(tài)碳?xì)浠衔锏某榭蘸唾A藏及其可能的后續(xù)物理分離和化學(xué)轉(zhuǎn)化可通過本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的任意方法進(jìn)行。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包含檢測(cè)存在于氣相中的烯(特別是 丙烯、乙烯和異丁烯)。目的化合物在空氣或其他氣體環(huán)境中的存在，甚至小量存在，可通過 多種技術(shù)檢測(cè)，特別是通過氣相層析系統(tǒng)使用紅外線或火焰電離檢測(cè)，或與質(zhì)譜聯(lián)用。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，得到的末端烯為縮合的，之后任選的使用本領(lǐng)域技術(shù) 人員已知的技術(shù)經(jīng)還原以制備更長(zhǎng)鏈的烯或更長(zhǎng)鏈的烷。具體的，異丁烯可用于合成異辛 烷成功進(jìn)行此反應(yīng)的催化方法已詳細(xì)的描述。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，方法涉及在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下(30_37°C于1個(gè)大氣壓 下，在允許細(xì)菌需氧生長(zhǎng)的發(fā)酵罐中)或非標(biāo)準(zhǔn)條件下(例如，對(duì)應(yīng)嗜熱生物的培養(yǎng)條件的 更高的溫度)培養(yǎng)微生物。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，微生物在微需氧的條件下培養(yǎng)，限制注入的空氣量以 最小化包含烯烴的氣體流出物中殘留的氧氣濃度。本發(fā)明的其他方面和優(yōu)勢(shì)將在以下實(shí)施例中描述，實(shí)施例是為了說明的目的而給 出的，而不是為了限制。


圖1:3-羥基丙酸基序圖2 甲羥戊酸二磷酸經(jīng)MDP脫羧酶的脫羧——通用活性圖3 :3-羥基烷酸的示例圖4 =MDP脫羧酶在制備末端烯中的用途圖5 在反應(yīng)中為了催化位點(diǎn)中的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)目的可使用的輔助因子
圖6 從葡萄糖制備烯的完整方法圖7 在實(shí)施例4的1號(hào)條件中進(jìn)行的酶反應(yīng)的層析圖8:SEQ ID NO :6酶的過表達(dá)和純化步驟的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電 泳(SDS-PAG^1.標(biāo)記2.誘導(dǎo)前的培養(yǎng)物3.裂解液4.未被柱吸收的組分5.柱的清洗組分6.純化的酶，分子量36. 8kDa圖9 =HIV至IBN轉(zhuǎn)化的氣相層析/質(zhì)譜(GC/MS)層析分析1和2 對(duì)應(yīng)不含酶的背景噪音的陰性對(duì)照。3和4 在SEQ ID NO 6酶存在下的反應(yīng)圖10 在存在和不存在ATP的情況下IBN產(chǎn)生的比率圖11 在存在和不存在Mg2+的情況下IBN產(chǎn)生的比率圖12 根據(jù)溫度的酶活性。比率在存在酶的情況下相對(duì)背景的IBN形成量圖13 根據(jù)HIV底物濃度的IBN的產(chǎn)生圖14 最優(yōu)反應(yīng)的測(cè)量和與背景的比較。通過氣相層析用火焰電離檢測(cè)測(cè)量。圖15 通過編碼SEQ ID NO 6的核苷酸序列的優(yōu)化改進(jìn)的表達(dá)水平M道分子量標(biāo)記1、2、3道天然的核苷酸序列(1)在純化柱上樣的細(xì)胞裂解液，可溶組分(2)不保留在純化柱上的裂解液組分(3)洗脫組分10 μ g純化酶4、5、6道優(yōu)化的核苷酸序列(4)在純化柱上樣的細(xì)胞裂解液，可溶組分(5)不保留在純化柱上的裂解液組分(6)洗脫組分10 μ g純化酶
實(shí)施例實(shí)施例1 幾種MDP脫羧酶的克隆和表達(dá)編碼釀酒酵母MDP脫羧酶的基因通過重疊的寡核苷酸合成并克隆至能夠在 細(xì)菌中表達(dá)的PET質(zhì)粒(Novagen)中。所述質(zhì)粒之后通過電穿孔轉(zhuǎn)化至細(xì)菌菌株 BL21 (Invitrogen)。在包含氨芐青霉素的培養(yǎng)皿上劃線細(xì)菌并于37°C培養(yǎng)。第二天，隨機(jī) 選擇一個(gè)細(xì)菌菌落并接種于50ml包含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物培養(yǎng)M小時(shí)同 時(shí)搖晃，之后離心培養(yǎng)物，通過超聲波處理裂解細(xì)菌，制備總蛋白質(zhì)提取物。在電泳凝膠中 上樣等分試樣的提取物和未經(jīng)轉(zhuǎn)化的相同菌株的蛋白質(zhì)提取物，及分子量標(biāo)記。對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)化 菌株的道含有約30kD的單獨(dú)條帶，其對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)的預(yù)期大小，在上樣未經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)菌的道 中沒有所述條帶。
實(shí)施例2 測(cè)量蛋白質(zhì)提取物對(duì)3-羥基-3-甲基丁酸的活性3-羥基-3-甲基丁酸(Sigma，編號(hào)55453，名為β-羥異戊酸)以10g/l濃度懸 浮。甲羥戊酸二磷酸由甲羥戊酸內(nèi)酯和其他試劑(Sigma)通過傳統(tǒng)方法合成并以10g/l濃
度重懸。準(zhǔn)備6個(gè)層析小管。在每個(gè)小管中加入含有50mM Bistris/HCl、ImM 二硫蘇糖醇、 IOmM MgCl2 禾口 5mM ATP 的 50 μ L 緩沖液。小管1和4 加入5 μ 1 7jC (無(wú)底物)。小管2和5 加入5 μ 1甲羥戊酸二磷酸制劑(陽(yáng)性對(duì)照)。小管3和6 加入5μ 1 3-羥基_3_甲基丁酸(HIV)制劑。小管1、2和3 加入5μ 1水(無(wú)酶)。小管4、5和6 力口入5μ 1實(shí)施例1中描述的酶制劑。小管用隔膜密封和壓褶。所有小管在37°C孵育4小時(shí)至3天。孵育后，使用氣體注射器收集各個(gè)小管中的氣體，通過氣相層析測(cè)量樣品中的CO2 濃度。小管5具有非常高的(X)2濃度，小管6中也檢測(cè)到較低濃度的C02，指示酶制劑對(duì)3-羥 基-3-甲基丁酸的顯著反應(yīng)。之后通過氣相層析用紅外線或火焰電離檢測(cè)測(cè)量小管6氣體樣品中的異丁烯的存在。實(shí)施例3 使用輔助因子優(yōu)化反應(yīng)條件進(jìn)行了如前面實(shí)施例的小管6中描述的相同反應(yīng)，但在一個(gè)樣品中加入了根據(jù)要 求合成的(synthesized to order)乙基二磷酸作為輔助因子。在此實(shí)施例中使用3個(gè)小管。第一個(gè)包含前面實(shí)施例中所描述的量的緩沖液、ATP 和酶提取物。第二個(gè)小管包含相同的成分，但另外包含前面實(shí)施例中所描述的量的3-羥 基-3-甲基丁酸。在第三個(gè)小管中，除了 3-羥基-3-甲基丁酸，還包含10μ 1 10mg/l的乙
基二磷酸。如前面的實(shí)施例，通過氣相層析用紅外線或火焰電離檢測(cè)測(cè)量異丁烯的形成。發(fā) 現(xiàn)當(dāng)乙基二磷酸存在時(shí)，產(chǎn)生的異丁烯量隨著時(shí)間明顯更高。實(shí)施例4:篩選酶文庫(kù)得到編碼來(lái)自MDP脫羧酶家族的酶的63個(gè)基因的文庫(kù)并檢測(cè)其對(duì)HIV作為底物 的活性?？寺　⒓?xì)菌培養(yǎng)和蛋白質(zhì)表達(dá)克隆編碼甲羥戊酸二磷酸(MDP)脫羧酶家族EC 4. 1. 1. 33的基因，真核基因克隆 至pET 2 載體(Novagen)，原核來(lái)源的基因克隆至pET 2 載體(Novagen)，在N-末端緊 接甲硫氨酸起始密碼子之后添加6-組氨酸標(biāo)簽。通過熱休克用這些載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸 桿菌BL21(DE!3)細(xì)胞(Novagen)。細(xì)胞于30°C在包含0. 5M山梨醇、5mM甜菜堿、100 μ g/ml 氨芐青霉素的TB培養(yǎng)基中搖晃(160rpm)培養(yǎng)直至600nm的OD達(dá)到0. 8和1之間。之后 加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度ImM，在20°C過夜(約16小時(shí))繼續(xù)蛋 白質(zhì)表達(dá)。通過4°C，10，OOOrpm離心20分鐘收集細(xì)胞，沉淀冷凍于_80°C。細(xì)胞裂解1. 6g細(xì)胞在冰上解凍并重懸于5ml包含300mM NaCl、5mMMgCl2、ImM DTT的50mMNa2HPO4 pH 8。加入20微升Iysonase(Novagen)。細(xì)胞于室溫孵育10分鐘，之后放回冰上 20分鐘。通過在0°C超聲水浴中用超聲波處理3x 5分鐘完全的裂解細(xì)胞；在脈沖間隔攪勻 樣品。之后通過4°C，10，OOOrpm離心20分鐘澄清細(xì)菌提取物。蛋白質(zhì)純化和濃縮(PR0TIN0試劑盒)澄清的細(xì)菌裂解液上樣至PR0TIN0-1000 Ni-IDA柱(Macherey-Nagel)以進(jìn)行 6-組氨酸標(biāo)記蛋白的吸附。清洗柱并用鈿1包含300mM NaCl, 5mM MgCl2, ImM DTT,250mM 咪唑的50mM Na2HPO4 pH 8洗脫目的酶。洗脫液之后在Amicon Ultra_410kDa管(cell) (Millipore)中濃縮至250 μ 1的終體積。通過Bradford法定量蛋白質(zhì)。酶反應(yīng)在緩沖液和反應(yīng)pH不同的2種試驗(yàn)條件下檢測(cè)期望的酶反應(yīng)(3-羥基-3-甲基 丁酸，或3-羥基異戊酸或HIV的轉(zhuǎn)化)。1號(hào)試驗(yàn)條件IOOmM 檸檬酸IOmM MgCl2IOmM ATP20mM KCl200mM HIV最終pH調(diào)節(jié)至5.52號(hào)試驗(yàn)條件IOOmM Tris-HCl pH 7.0IOmM MgCl2IOmM ATP20mM KCl200mM HIV最終pH調(diào)節(jié)至7.0將酶加入反應(yīng)混合物。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)產(chǎn)量不同，在不同樣品中加入范圍在0.01至 lmg/ml的酶量。平行進(jìn)行不含酶的對(duì)照反應(yīng)。在2ml小管anterchim)中進(jìn)行Iml反應(yīng)，并用特氟隆/ 二氧化硅/特氟隆隔膜 (Interchim)密封。反應(yīng)在37°C孵育72小時(shí)，無(wú)需搖晃。反應(yīng)的分析用裝備不可回復(fù)(no-return)裝置的注射器收集反應(yīng)中存在的氣體。通過氣相層 析(GC)聯(lián)合質(zhì)譜(MQ分析氣體樣品。儀器事先用一系列異丁烯濃度校準(zhǔn)。柱BPX5(SGE)GC/MS =MSD 5973 (HP)對(duì)每次層析得到3個(gè)主峰，第一個(gè)對(duì)應(yīng)空氣，第二個(gè)對(duì)應(yīng)水，第三個(gè)對(duì)應(yīng)異丁烯。 在制備和檢測(cè)的63個(gè)酶中，在初篩中鑒定出11個(gè)潛在的候選酶。這些候選酶中的一些在 圖7中用箭頭標(biāo)示出。它們的鑒定顯示如下，它們的序列為SEQ ID N0:6至16(未顯示組 氨酸標(biāo)簽)。候選酶1 SEQ ID NO 7
Genebank 編號(hào)CAI97800. 1Swissprot/TrEMBL 編號(hào)Q1GAB2微生物戴耳布呂克氏乳桿菌保加利亞亞種(LactcAacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)(菌株 ATCC 11842/DSM 20081)候選酶2 SEQ ID NO 8Genebank 編號(hào)CAJ51653Swissprot/TrEMBL 編號(hào)Q18K00微生物=Haloquadratum walsbyi DSM 16790候選酶3 :SEQ ID NO 9Genebank 編號(hào)ABD99494. 1Swissprot/TrEMBL 編號(hào)Q1WU41微生物唾液乳桿菌唾液亞種(Lactobacillus salivarius subsp. Salivarius) (菌株UCCl 18)候選酶4 :SEQ ID NO :10Genebank 編號(hào)ABJ57000. 1Swissprot/TrEMBL 編號(hào)Q04EX2微生物酒類酒球菌(Oenococcusoeni)(菌株 BAA-331/PSU-1)候選酶5 :SEQ ID NO :11Genebank 編號(hào)ABJ67984. 1Swissprot/TrEMBL 編號(hào)Q03FN8微生物戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus) ATCC 25745候選酶6:SEQ ID NO :12Genebank 編號(hào)ABV09606. 1Swissprot/TrEMBL 編號(hào)A8AUU9微生物格登鏈球菌(Streptococcusgordonii)(菌株 Challis/ATCC 35105/ CH1/DL1/V288)候選酶7 :SEQ ID NO :13Genebank 編號(hào)ABQ14154. 1Swissprot/TrEMBL 編號(hào)A5EVP2微生物節(jié)瘤偶蹄形菌(Dichelobacternodosus) VCS1703A候選酶8 :SEQ ID NO :14Genebank 編號(hào)EDT95457. 1Swissprot/TrEMBL 編號(hào)B2DRT0微生物肺炎鏈球菌(Sti^ptococcuspneumoniae) CDC0288-04候選酶9:SEQ ID NO :15Genebank 編號(hào)AAT86835Swissprot/TrEMBL 編號(hào)Q5XCM8微生物化膿性鏈球菌(Sti^ptococcuspyogenes)血清型 M6 (ATCC BAA-946/ MGAS10394)
候選酶10 :SEQ ID NO 6Genebank 編號(hào)AAT43941Swissprot/TrEMBL 編號(hào)Q6KZB1微生物嗜苦古菌(Picrophilustorridus)DSM 9790候選酶11 :SEQ ID NO :16Genebank 編號(hào)AAV43007. 1Swissprot/TrEMBL 編號(hào)Q5FJW7微生物嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)NCFM在候選酶10中觀察到最高水平的異丁烯(IBN)產(chǎn)生，即純化的來(lái)自嗜苦古菌的 SEQ ID NO :6脫羧酶。保留此酶用于進(jìn)一步表征。實(shí)施例5 =SEQ ID NO 6酶的表征如實(shí)施例4中所描述的純化重組酶。圖8中展示的結(jié)果顯示在最終蛋白質(zhì)樣品中 的酶的純度為約90%。確認(rèn)了分離的酶的活性。反應(yīng)在以下條件中進(jìn)行IOOmM Tris-HCl pH 7. 0IOmM MgCl2IOmM ATP20mM KCl250mM HIV最終pH調(diào)節(jié)至6. 03mg/ml 酶在30°C孵育72小時(shí)后，通過GC/MS測(cè)量信號(hào)。結(jié)果顯示于圖9。在酶存在下，相對(duì) 背景噪音此處的IBN的產(chǎn)生提高了約2. 3倍。觀察到的此處的背景噪音與有機(jī)化學(xué)文獻(xiàn)中 的一致，顯示在水溶液中和約100°C的溫度下，3-羥基異戊酸緩慢的脫羧為叔丁醇，其部分 脫水為異丁烯，遵照有利于叔丁醇形成的平衡(Pressman和Luca，J. Am. Chem. Soc. 1940)。ATP輔被用物的作用
檢測(cè)條件
IOOmM檸檬酸
50mM KCl
IOmM MgCl2
200mM HIV (待指定)
lmg/ml純化的酶
pH 5. 5
在30°C孵育72小時(shí)
權(quán)利要求
1.制備末端烯的方法，其特征在于包含用具有脫羧酶活性的酶轉(zhuǎn)化3-羥基烷酸的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于在烯的2位碳上的2個(gè)取代基中的至少1個(gè)或 為線性或分支的烷基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其包含將3-羥基丁酸轉(zhuǎn)化為丙烯的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其包含將3-羥基戊酸轉(zhuǎn)化為1-丁烯的步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其包含將3-羥基-3-甲基丁酸轉(zhuǎn)化為異丁烯的步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其包含將3-羥基-3-甲基戊酸轉(zhuǎn)化為異戊烯的步驟。
7.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中酶具有MDP脫羧酶活性，EC4. 1. 1. 33。
8.根據(jù)前面權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中酶包含選自SEQID NO :1-16的氨基 酸序列，或與這些序列之一具有至少15%，優(yōu)選50、80或90%序列同源性的序列。
9.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于酶包含SEQID NO :6序列的全部或 部分，或與其具有至少15%，優(yōu)選的50、80或90%序列同源性的序列。
10.根據(jù)前面權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中酶為突變的脫羧酶，其具有提高的轉(zhuǎn) 化一種或多種3-羥基烷酸至末端烯的活性。
11.制備異丁烯的方法，其特征在于其包含以下步驟通過具有脫羧酶活性的酶，優(yōu)選 的包含SEQ ID NO 6序列的全部或部分，或與其具有至少15%，優(yōu)選的50、80或90%序列 同源性的序列的酶轉(zhuǎn)化3-羥基-3-甲基丁酸。
12.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，根據(jù)所述方法在反應(yīng)中加入輔助因子，輔助因 子優(yōu)選的來(lái)自磷酸酐家族，由通式R-O-PO2H-O-PO3H2表示，其中R優(yōu)選的為氫原子、甲基、乙 基或丙基，并還可為任意線性、分支或環(huán)狀烷基，或任意其他單價(jià)有機(jī)基團(tuán)。
13.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，根據(jù)所述方法在反應(yīng)中加入輔助因子，輔助因 子優(yōu)選的來(lái)自亞甲基二磷酸單酯，具有通式R-O-PO2H-CH2-PO3H2，其中R優(yōu)選的為氫原子、甲 基、乙基或丙基，并還可為任意線性、分支或環(huán)狀烷基，或任意其他單價(jià)有機(jī)基團(tuán)。
14.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，根據(jù)所述方法轉(zhuǎn)化在輔被用物存在下進(jìn)行，所 述輔被用物優(yōu)選的為包含磷酸酐的化合物，優(yōu)選的為ATP、rNTP、dNTP或幾種這些分子的混 合物、多磷酸鹽或焦磷酸。
15.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于轉(zhuǎn)化步驟在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中體外進(jìn)行。
16.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于轉(zhuǎn)化步驟在產(chǎn)生所述脫羧酶的微 生物的存在下，優(yōu)選的在過表達(dá)所述天然或經(jīng)修飾的脫羧酶的微生物存在下進(jìn)行。
17.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于使用具有內(nèi)源產(chǎn)生一種或多種 3-羥基烷酸的天然或人工性能，并進(jìn)一步表達(dá)或過表達(dá)所述天然或經(jīng)修飾的脫羧酶的微生 物，從而從碳源直接制備末端烯。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中微生物為富養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligeneseutrophus)或 巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)菌株的細(xì)菌，或優(yōu)選經(jīng)染色體修飾或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化以過 量產(chǎn)生一種或多種3-羥基烷酸的重組細(xì)菌、酵母或真菌。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其中碳源為葡萄糖或任意其他己醣、木糖或任意其 他戊糖、甘油或任意其他多元醇、或淀粉、纖維素、半纖維素、聚3-羥基烷酸或任意其他聚合物，所述方法之后在將所述聚合物降解為單體的系統(tǒng)，例如合適的酶(淀粉酶、半纖維素 酶、纖維素酶、聚-3-羥基烷酸酶(poly-3-hydroxyalkanoase))存在下和/或特定化學(xué)條 件下進(jìn)行。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其特征在于使用具有內(nèi)源產(chǎn)生一種或多種3-羥基烷酸的 天然或人工性能，并進(jìn)一步過表達(dá)天然或經(jīng)修飾的脫羧酶的光合微生物，特別是藍(lán)藻類細(xì) 菌或微藻，從而從溶液中存在的(X)2直接制備末端烯。
21.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于使用允許碳源轉(zhuǎn)化為3-羥基烷酸 的第一種微生物，和使用分離的或由第二種微生物表達(dá)的脫羧酶，使3-羥基烷酸轉(zhuǎn)化為末 端烯。
22.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其特征在于使用表達(dá)脫羧酶的多細(xì)胞生物例 如植物或非人動(dòng)物，以通過3-羥基烷酸的脫羧制備末端烯。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其特征在于多細(xì)胞生物在某些代謝途徑中進(jìn)一步經(jīng)修 飾，以合成一種或多種3-羥基烷酸。
24.根據(jù)前面權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其包含收集從反應(yīng)中脫氣的末端烯氣體的步馬聚ο
25.根據(jù)前面權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其特征在于方法在微需氧條件下進(jìn)行。
26.脫羧酶或產(chǎn)生脫羧酶的微生物在從3-羥基烷酸制備末端烯化合物中的用途。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈的脫羧酶的用途，其特征在于所述酶包含SEQID NO :6序列的全 部或部分，或與其具有至少15%，優(yōu)選的50、80或90%序列同源性的序列。
28.組合物，其包含產(chǎn)生脫羧酶的微生物、合適的培養(yǎng)基和3-羥基烷酸化合物或可由 微生物轉(zhuǎn)化為3-羥基烷酸化合物的碳源。
29.具有內(nèi)源產(chǎn)生一種或多種3-羥基烷酸的天然或人工性能，并進(jìn)一步表達(dá)或過表達(dá) 天然或經(jīng)修飾的脫羧酶的多細(xì)胞生物或微生物，用于從碳源直接制備末端烯。
30.根據(jù)前面權(quán)利要求中一項(xiàng)或多項(xiàng)合成的末端烯。
31.具有脫羧酶活性并包含SEQID NO :6序列的全部或部分的分離或純化的酶。
32.制備具有脫羧酶活性并包含SEQID NO :6序列的全部或部分的酶的方法，所述方 法包含在允許表達(dá)所述序列的條件下培養(yǎng)包含編碼所述序列的核酸的重組微生物。
33.重組微生物，其包含編碼具有脫羧酶活性并包含SEQID NO :6序列的全部或部分 的酶的核酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過生物學(xué)生成烯的方法。其更具體的涉及通過3-羥基烷酸分子的酶促脫羧制備末端烯的方法。本發(fā)明還涉及酶系統(tǒng)和使用的微生物菌株，以及得到的產(chǎn)物。
文檔編號(hào)C12P5/02GK102083990SQ200980125840
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2009年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月4日
發(fā)明者菲利普·馬利埃 申請(qǐng)人:菲利普·馬利埃