專利名稱：α-1，4-葡聚糖裂解酶在制備1，5-D-脫水果糖中的應(yīng)用的制作方法
本申請(qǐng)系1994年10月15日提交的、申請(qǐng)?zhí)枮?4194430。1、發(fā)明名稱與本申請(qǐng)相同的申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及一種酶，特別是α-1，4-葡聚糖裂解酶(“GL”)在從以α-1，4-葡聚糖為基礎(chǔ)的底物中制備1，5-D-脫水果糖(“AF”)中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及糖，特別是1，5-D-脫水果糖(“AF”)作為抗氧化劑，特別是作為食料和飲料的抗氧化劑的應(yīng)用。
本發(fā)明涉及1，5-D-脫水果糖(“AF”)作為增甜劑，特別是作為食料和飲料，優(yōu)選人類食料和飲料中的增甜劑的應(yīng)用。
FR-A-2617502和Baute等在PhytochemistryVol.27No.11 pp3401-3403中報(bào)道了以明顯的酶促反應(yīng)在普通羊肚菌中生產(chǎn)AF。AF的產(chǎn)量相當(dāng)?shù)?。盡管提到了可能的酶促反應(yīng)，但兩篇文獻(xiàn)都沒有提供任何酶的氨基酸序列資料，更不用說任何核苷酸序列資料。這些文獻(xiàn)認(rèn)為AF可能是制備抗生素吡喃酮羥基羥甲基吡喃酮(microthecin)的前體。
Yu等在Biophysica Acta(Vol 1156 pp313-320)中報(bào)道了從紅海藻中制備GL并用它降解α-1，4-葡聚糖以生產(chǎn)AF。AF的產(chǎn)量相當(dāng)?shù)?。盡管提到了酶GL，但該文獻(xiàn)未提供任何該酶的氨基酸序列，更不用說編碼該酶的任何核苷酸序列。該文獻(xiàn)還認(rèn)為GL的來源就是藻類。
典型的以α-1，4-葡聚糖為基礎(chǔ)的底物是淀粉。現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)淀粉在工業(yè)上的廣泛用途主要是因?yàn)樗鼈兪橇畠r(jià)的天然物質(zhì)。
淀粉降低酶可分成不同類。淀粉水解酶產(chǎn)生葡萄糖或葡萄糖寡聚物。第二組淀粉降解酶是磷酸化酶，它在無機(jī)磷酸鹽存在的條件下從淀粉產(chǎn)生葡萄糖-1-磷酸。
AF也可經(jīng)化學(xué)合成(見Lichtenthaler在Tetrahedron LettersVol 22 pp1429-1432中的工作)。然而，該化學(xué)合成涉及許多步驟而且并不產(chǎn)生大量的AF。
因此生產(chǎn)AF的化學(xué)合成途徑非常昂貴。
于是需要一種以廉價(jià)和簡(jiǎn)便的方式且還能大量產(chǎn)生AF的方式制備AF的方法。
另外，通常用抗氧化劑抑制諸如食品的物質(zhì)具有有害影響的氧。兩種通常使用的抗氧化劑是GRINDOX 142和GRINDOX 1029。這些抗氧化劑含有許多成份且生產(chǎn)相當(dāng)昂貴。
因此需要具有簡(jiǎn)單和廉價(jià)形式的抗氧化劑。
此外，在食品和飲料制備中通常使用增甜劑。然而許多增甜劑制備昂貴且復(fù)雜。
因此，需要具有簡(jiǎn)單和廉價(jià)形式的增甜劑。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種制備糖1，5-D脫水果糖的方法，包括用酶α-1，4-葡聚糖裂解酶處理α-1，4-葡聚糖，其特征在于該酶以基本純的形式使用。
如果葡聚糖除了α-1，4-鍵外還含有不同于該鍵的其它鍵時(shí)，優(yōu)選的是將α-1，4-葡聚糖裂解酶與能打開這類其它鍵的合適試劑(如水解酶，優(yōu)選葡聚糖水解酶)結(jié)合使用。
優(yōu)選地，葡聚糖是淀粉或以化學(xué)或酶促法制備的淀粉片段。如果以酶促法制備，該反應(yīng)可在加入α-1，4-葡聚糖裂解酶前進(jìn)行或可同時(shí)進(jìn)行該反應(yīng)。合適的試劑可以是輔助酶。優(yōu)選的輔助酶是α-或β-淀粉酶。優(yōu)選使用脫支酶。更優(yōu)選的輔助酶是至少一種支鏈淀粉酶(pullanase)或異淀粉酶(isoamylase)。
優(yōu)選地，α-1，4-葡聚糖裂解酶結(jié)合到支持物上，或更優(yōu)選的是以溶解的形式。
優(yōu)選地，該酶從真菌，優(yōu)選Morchella costata，或普通羊肚菌，或從真菌感染的藻類，優(yōu)選Gracilariopsis lemaneiformis或僅從藻類優(yōu)選的從Gracilariopsis lemaneiformis中分離。
優(yōu)選地，使用未被該酶降解的凝膠從真菌或從真菌感染的藻類或僅從藻類中分離和/或進(jìn)一步純化該酶。
優(yōu)選地，該凝膠以糊精或其衍生物為基礎(chǔ)。
優(yōu)選地，該凝膠是環(huán)糊精，更優(yōu)選β-環(huán)糊精。
優(yōu)選地，該酶包含氨基酸序列SEQ.ID.No.1的氨基酸序列SEQ.ID.No.2或氨基酸序列SEQ.ID.No.5或氨基酸序列SEQ.ID.No.6，或其任何變異體。
在另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，該酶包含在SEQ.ID.No.s 9-11中所示的任何一個(gè)氨基酸序列或其任何變異體。
術(shù)語“其任何變異體”是指在所得的酶具有裂解酶活性的前提下對(duì)該序列進(jìn)行一個(gè)氨基酸的任意取代，改變，修飾，置換，缺失或增加。
優(yōu)選的是該酶與支鏈淀粉或糊精結(jié)合使用。
優(yōu)選的是從編碼該酶的核苷酸序列中表達(dá)來獲得該酶。
優(yōu)選的是所述核苷酸序列是DNA序列。
優(yōu)選的是所述DNA序列包含與SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.4或SEQ.ID.No.7或SEQ.ID.No.8中的任何序列相同，或互補(bǔ)，或基本上同源，或含任何合適的密碼子取代的序列。
在另外的優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNA序列包含與SEQ.ID.No.s12-14所示的序列相同，或互補(bǔ)，或基本上同源，或含任何合適的密碼子取代的任何一個(gè)序列。
術(shù)語“基本上同源”包括有關(guān)結(jié)構(gòu)和/或核苷酸成份和/或生物學(xué)活性的同源性。
術(shù)語“含任何合適的密碼子取代”包含在所得的酶具有裂解酶活性的前提下用編碼相同氨基酸的另一密碼子進(jìn)行任何密碼子置換或取代或?qū)ζ溥M(jìn)行的任何增加或缺失。
換句話說，本發(fā)明還包括修飾的DNA序列，其中至少一個(gè)核苷酸缺失，取代或修飾或其中至少插入一個(gè)增加的核苷酸以便編碼具有葡聚糖裂解酶活性的多肽，優(yōu)選具有增加的裂解酶活性。
優(yōu)選使用高濃度-例如最高至25％溶液濃度的淀粉。
優(yōu)選在緩沖液存在的條件用該酶處理底物。
優(yōu)選在基本上純的水存在的條件下用該酶處理底物。
優(yōu)選在不存在輔助因子的條件下用該酶處理底物。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了制備糖1，5-D-脫水果糖的方法，包括用酶α-1，4-葡聚糖裂解酶處理α-1，4-葡聚糖，其特征在于該酶含有氨基酸序列SEQ.ID.No.1或氨基酸序列SEQ.ID.No.2或氨基酸序列SEQ.ID.No.5或氨基酸序列SEQ.ID.No.6，或氨基酸序列SEQ.ID.No.s 9-11中的任何一個(gè)序列，或其任何變異體。
根據(jù)本發(fā)明還提供了以本發(fā)明的方法制備的糖1，5-D-脫水果糖。
以13C NMR證實(shí)和表征了以本方法制備的AF。
本方法的一個(gè)關(guān)鍵的優(yōu)勢(shì)是可以比以前大得多的數(shù)量制備糖1，5-D-脫水果糖且該方法比已知方法相對(duì)更簡(jiǎn)便和更廉價(jià)。例如現(xiàn)在該糖的制備量可以是例如大于100g，如500g，與此相比，背景技術(shù)的方法僅生產(chǎn)更少的量，如微克量。
GL可催化的典型反應(yīng)可概括如下1).支鏈淀粉→AF+有限糊精2).直鏈淀粉→AF+有限糊精3).糊精→AF+葡萄糖在反應(yīng)1)中，兩種產(chǎn)物的比率取決于支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)或α-1，6-糖苷鍵在支鏈淀粉分子中的分布。
在反應(yīng)2)和3)中，產(chǎn)物比率取決于底物聚合度(DP)數(shù)值。在反應(yīng)3中，AF與葡萄糖之間的比率取決于DP。例如，如果糊精含10個(gè)葡萄糖單元，則AF∶葡萄糖的比率是9∶1。
本發(fā)明的另一優(yōu)勢(shì)是可基本上降低含不同于α-1，4-鍵之鍵的葡聚糖，而以前僅達(dá)到部分降解。1，5-D-脫水果糖前體的基本上降解是導(dǎo)致增加1，5-D-脫水果糖產(chǎn)量的因素之一。
其它優(yōu)選是，AF是天然存在的物質(zhì)，因此從人類的角度看具有潛力。例如，它可由AF脫水酶轉(zhuǎn)變成抗生素羥基羥甲基吡喃酮。已知抗生素在食品生物防腐中的用途，它是食品技術(shù)的重要方面。然而，到現(xiàn)在為止，AF及還有羥基羥甲基吡喃酮的制備具有許多缺陷。例如僅可少量生產(chǎn)。另外，方法昂貴。
本發(fā)明通過提供AF及還有其它產(chǎn)品如羥基羥甲基吡喃酮的更大量生產(chǎn)和更廉價(jià)的生產(chǎn)克服了這些問題。以這一方式可制備克到千克量的AF。
進(jìn)一步的優(yōu)勢(shì)是裂解酶在4℃至少穩(wěn)定1年并能凍干而不損失活性。
另一優(yōu)勢(shì)是裂解酶直接從淀粉產(chǎn)生AF而不需要任何輔助因子存在。
另一優(yōu)勢(shì)是酶可在純水中使用。這一結(jié)果是非常驚人的。
根據(jù)本發(fā)明裂解酶的簡(jiǎn)單特性，可期望AF的生產(chǎn)成本可與葡萄糖的成本相提并論。本發(fā)明的裂解酶不必需要一般非常昂貴的任何輔助因子存在，這一點(diǎn)特別具有優(yōu)勢(shì)。
一般來說，α-1，4-葡聚糖可用作該酶的底物。
可使用淀粉作為優(yōu)選的底物。
在優(yōu)選的方法中，可使用可溶的或胺化的淀粉或淀粉水解產(chǎn)物?？山?jīng)過化學(xué)或酶促方法制備淀粉水解產(chǎn)物。
如果使用部分降解淀粉的酶，該酶可在加入裂解酶或任何其它額外的淀粉降解試劑，如葡聚糖水解酶之前加入，它們也可同時(shí)加入。
裂解酶可將葡聚糖轉(zhuǎn)變?yōu)锳F。該酶可從非還原端附著到底物上并僅僅不轉(zhuǎn)化還原糖。可用本文已描述的一些已知方法去掉殘留的葡萄糖。
使用本文描述的反應(yīng)可大量生產(chǎn)純的AF。
在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)過在β-環(huán)糊精Sepharose上進(jìn)行親和色譜，在Mono Q HR 5/5上進(jìn)行離子交換色譜和在Superose 12柱上進(jìn)行凝膠過濾從真菌感染的藻類(如Gracilariopsis lemaneiformis)純化α-1，4-葡聚糖裂解酶。純化的酶從α-1，4-葡聚糖中產(chǎn)生1，5-脫水-D-果糖。
從真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis中分離的真菌裂解酶的特征在于當(dāng)使用支鏈淀粉時(shí)，最適pH為3.5-7.5，最適溫度為50℃，pI為3.9。
在另一實(shí)施方案中，經(jīng)過在β-環(huán)糊精Sepharose上進(jìn)行親和色譜，在Mono Q HR 5/5上進(jìn)行離子交換色譜和在Superose 12柱上進(jìn)行凝膠過濾從真菌Morchella costata中純化α-1，4-葡聚糖裂解酶。純化的酶從α-1，4-葡聚糖產(chǎn)生1，5-脫水-D-果糖。
經(jīng)過在pH梯度為3至9的凝膠上進(jìn)行等電聚焦測(cè)定真菌裂解酶顯示pI大約為5.4。經(jīng)過在8-25％梯度凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE測(cè)定分子量為110kDa。酶表現(xiàn)出pH最佳范圍為pH5-7。發(fā)現(xiàn)最適溫度在30-45℃之間。
在另一實(shí)施方案中，經(jīng)過在β-環(huán)糊精Sepharose上進(jìn)行親和色譜，在Mono Q HR 5/5上進(jìn)行離子交換色譜和在Superose 12柱上進(jìn)行凝膠過濾從普通羊肚菌真菌中純化α-1，4-葡聚糖裂解酶。純化的酶從α-1，4-葡聚糖中產(chǎn)生1，5-脫水-D-果糖。
在另一實(shí)施方案中，經(jīng)過在β-環(huán)糊精Sepharose上進(jìn)行親和色譜，在Mono Q HR 5/5上進(jìn)行離子交換色譜和在Superose 12柱上進(jìn)行凝膠過濾從藻類如Gracilariopsis lemaneiformis純化α-1，4-葡聚糖裂解酶。純化的酶從α-1，4-葡聚糖中產(chǎn)生1，5-脫水-D-果糖。
對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的幾個(gè)GL酶，裂解酶催化反應(yīng)的典型pH和溫度最適值如下
GL來源 最適pH 最適pH范圍 最適溫度M.costata 6.55.5-7.5 37℃；40℃a普通羊肚菌 6.45.9-7.6 43℃；48℃a真菌感染的Gracilariopsislemaneiformis 3.83.7-4.1 40℃；45℃aa使用糖原作底物測(cè)定的參數(shù)；使用支鏈淀粉作底物測(cè)定其它參數(shù)。
本發(fā)明的酶將直鏈淀粉和支鏈淀粉轉(zhuǎn)變成1，5-脫水果糖。
在試驗(yàn)的麥芽糖類中，發(fā)現(xiàn)裂解酶對(duì)麥芽糖表現(xiàn)出較低活性，對(duì)麥芽三糖和麥芽七糖活性更低，對(duì)麥芽四糖和麥芽五糖活性最高。在這些麥芽糖中，酶對(duì)高達(dá)10mg/ml的濃度不表現(xiàn)底物抑制。
已測(cè)序了各個(gè)優(yōu)選來源的酶并隨后提供了其氨基酸序列。后面還提供了編碼該酶的DNA序列。
因此，本發(fā)明描述了一種新的淀粉降低酶，稱為新的α-1，4-葡聚糖裂解酶。這是首次純化和表征的一種酶。
如上所述，本發(fā)明還涉及AF的一些特殊用途。
特別是本發(fā)明涉及1，5-D-脫水果糖(“AF”)作為一種抗氧化劑，特別是作為食品和飲料的抗氧化劑的應(yīng)用。
因此根據(jù)本發(fā)明，提供了1，5-D-脫水果糖(AF)作為抗氧化劑的應(yīng)用。
優(yōu)選AF作為或用于食用物質(zhì)。
優(yōu)選AF用于或作為食品或飲料。
優(yōu)選AF與其它抗氧化劑結(jié)合使用。
優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的方法制備AF。
AF用作抗氧化劑的主要優(yōu)勢(shì)是它是天然產(chǎn)物，不可代謝，易于生產(chǎn)，水溶性且一般無毒性。
因此在優(yōu)選的實(shí)施方案中本發(fā)明涉及純AF的酶促制備法，純的AF作方有吸引力的水溶性抗氧化劑可用于食品和非食品用途。在本申請(qǐng)的實(shí)施例中給出了在食品配方中AF作為抗氧化劑的應(yīng)用。
在所附實(shí)施例中可見AF可與已知高質(zhì)量的商品食物抗氧化劑相比。
非食品例子包括在聚合物化學(xué)中用作聚合物合成過程中的氧清除劑。另外，AF還可用于生物可降解性塑料的合成。
實(shí)驗(yàn)表明，AF可作為有效的還原劑(抗氧化劑)，因?yàn)樗子趯?，5-二硝基水楊酸還原成3-氨基-5-硝基水楊酸。
AF是天然存在的物質(zhì)，因此它在用作可接受的抗氧化劑時(shí)有巨大潛力。AF也可經(jīng)AF脫水酶轉(zhuǎn)變成抗生素羥基羥甲基吡喃酮。已知抗生素在食品生物保護(hù)中的應(yīng)用，它是食品生物技術(shù)的一個(gè)重要方面。
另一方面，本發(fā)明還涉及1，5-D-脫水果糖作為增甜劑的應(yīng)用，特別是作為食品和飲料優(yōu)選人類食品和飲料的增甜劑。
因此根據(jù)本發(fā)明的該方面提供了1，5-D-脫水果糖作為增甜劑的應(yīng)用。
優(yōu)選AF用作或用于人類食品或飲料。
可以任意所需的量，如5％的溶液或100mg/kg到500mg/kg使用AF 。
使用AF作為增甜劑的優(yōu)勢(shì)在于它是天然產(chǎn)物，一般無毒性，水溶性，不可代謝并易于生產(chǎn)。
因此本發(fā)明還涉及AF作為增甜劑的新應(yīng)用。
優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的方法制備AF。
本發(fā)明的其它方面包括一種制備α-1，4-葡聚糖裂解酶(GL)的方法，包括從真菌感染的藻類，真菌或藻類本身中分離該酶；一種包含氨基酸序列SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.2或SEQ.ID.No.5或SEQ.ID.No.6或其任何變異體的酶；一種包含氨基酸序列SEQ.ID.No.9或SEQ.ID.No.10或SEQ.ID.No.11或其任何變異體的酶；一種編碼α-1，4-葡聚糖裂解酶的核苷酸序列，其中優(yōu)選該序列不在其天然環(huán)境中(即，它不形成能表達(dá)該酶的細(xì)胞生物體的部分天然基因組)，其中優(yōu)選該核苷酸序列是DNA序列；一種核苷酸序列，其中的DNA序列包含至少一種與SEQ.ID.No.3或SEQ.ID.No.4或SEQ.ID.No.7或SEQ.ID.No.8中的任何一種相同，或互補(bǔ)，或基本同源，或含任何合適的密碼子取代的序列，其中優(yōu)選該序列以分離的形式存在。
一種核苷酸序列，其中DNA序列包含至少一種與SEQ.ID.No.12或SEQ.ID.No.13或SEQ.ID.No.14中任何一種相同，或互補(bǔ)，或基本同源，或含任何合適的密碼子取代的序列，其中優(yōu)選該序列是分離的形式。
β-環(huán)糊精在純化一種酶，優(yōu)選GL中的應(yīng)用。
本發(fā)明其它優(yōu)選的實(shí)施方案包括下列任意一個(gè)作為導(dǎo)入本文所述的DNA序列的結(jié)果而具有產(chǎn)生AF之能力的轉(zhuǎn)化宿主生物；這種轉(zhuǎn)化的宿主生物是一種微生物，其中優(yōu)選該宿主生物選自細(xì)菌，霉菌，真菌和酵母；優(yōu)選該宿主生物選自糖酵母屬，克魯維氏酵母屬，曲霉屬，木霉屬，漢遜氏酵母屬，畢赤氏酵母屬，芽孢桿菌屬，鏈霉菌屬，埃希氏桿菌屬，如米曲霉，啤酒糖酵母，枯草芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，大腸桿菌；一種制備1，5-D-脫水果糖的方法，包括使用表達(dá)編碼α-1，4-葡聚糖裂解酶的核苷酸序列的轉(zhuǎn)化宿主生物，其中優(yōu)選該核苷酸序列是DNA序列，其中優(yōu)選該DNA序列是上文描述的序列之一；一種摻入了上文所述的核苷酸序列的載體，其中優(yōu)選該載體是一種復(fù)制型載體，其中優(yōu)選該載體是含有啟動(dòng)子序列下游之核苷酸序列的表達(dá)載體，優(yōu)選該載體包含一種標(biāo)記(如抗性標(biāo)記)；用這種載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生物體或細(xì)胞系。一種生產(chǎn)α-1，4-葡聚糖裂解酶或編碼該酶的任意核苷酸序列或其部分之產(chǎn)物的方法，包含培養(yǎng)用該載體轉(zhuǎn)染的生物體(或細(xì)胞系的細(xì)胞)并回收該產(chǎn)物。
特別是在表達(dá)系統(tǒng)中，優(yōu)選分泌該酶以簡(jiǎn)化其純化。為做到這點(diǎn)，將編碼成熟酶的DNA與來自選定生物的信號(hào)序列啟動(dòng)子和終止子融合。
為了在黑色曲霉中表達(dá)，將gpdA(來自構(gòu)巢曲霉的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因)啟動(dòng)子和信號(hào)序列與編碼成熟的裂解酶DNA 5′端融合。來自黑色曲霉trpC基因的終止子序列放到該基因的3′端(Punt，P.J.et al.1991-(1991)J.Biotech.17，19-34)。將該構(gòu)建體插入到含有大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)和選擇起點(diǎn)和黑色曲霉選擇標(biāo)記的載體中。黑色曲霉選擇標(biāo)記的例子是amdS基因，argB基因，pyrG基因，hygB基因，BmlR基因，它們都曾用于轉(zhuǎn)化子的選擇。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)黑色曲霉并以轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)基中回收成熟的裂解酶。最終該構(gòu)建體可轉(zhuǎn)化進(jìn)蛋白酶缺陷型菌株中以減少培養(yǎng)基中該裂解酶的蛋白裂解性降解(Archer D.B.et al.1992-Biotechnol.Lett.14，357-362)。
除了黑色曲霉作宿主之外，可使用已知其好表達(dá)系統(tǒng)的其它工業(yè)重要微生物，如米曲霉，曲霉屬種類，木霉屬種類，啤酒糖酵母，克魯維氏酵母屬種類，漢遜氏酵母屬種類，畢赤氏酵母屬種類，枯草芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，芽孢桿菌屬種類，鏈霉屬種類或大腸桿菌。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約于1994年6月20日將下列樣品保藏于認(rèn)可的保藏單位(The National Collections of Industrial andMarine Bacteria Limited at 23 St.Machar Drive，Aberdeen，Scotland，United Kingdom)含質(zhì)粒pGL 1的大腸桿菌(NCIMB 40652)-[參考DH 5α-pGL 1]；和含質(zhì)粒pGL 2的大腸桿菌(NCIMB 40653)-[參考DH 5α-pGL 2]。
下列樣品根據(jù)布達(dá)佩斯條約于1994年10月11日作為保藏品被認(rèn)可的保藏單位(The Culture Collection of Algae andProtozoa(CCAP)at Dunstaffnage Marine Laboratory PO Box 3，Oban，Argyll，Scotland，United Kingdom，PA34 4AD)接受真菌感染的Gracilariops is lemane iformis(CCAP 1373/1)-[參考GLQ-1(青島)]。
因此，本發(fā)明高度優(yōu)選的實(shí)施方案包括可從存在于質(zhì)粒中的GL編碼序列表達(dá)獲得的GL酶，該質(zhì)粒是保藏物NCIMB 40652或保藏物NCIMB 40653的主體；可從作為保藏物CCAP 1373/1主體的真菌感染的藻類中獲得的GL酶。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約，下列樣品于1994年10月3日保藏在認(rèn)可的保藏單位(The National Collections of Industrial andMarine Bacteria Limited(NCIMB) at 23 St.Machar Drive，Aberdeen，Scotland，United Kingdom，AB 2 1 RY)含質(zhì)粒pMC的大腸桿菌(NCIMB 40687)-[參考DH 5α-pMC]；含質(zhì)粒pMV 1的大腸桿菌(NCIMB 40688)-[參考DH 5α-pMV 1]；含質(zhì)粒pMV 2的大腸桿菌(NCIMB 40689)-[參考DH 5α-pMV 2]。
質(zhì)粒pMC是含從Morchella costata構(gòu)建的基因組文庫(kù)中分離的4.1kb片段的pBluescript II KS。該片段含編碼α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因。
質(zhì)粒pMV 1是含從普通羊肚菌構(gòu)建的基因組文庫(kù)中分離的2.45kb片段的pBluescript II KS。該片段含編碼α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因5′端。
質(zhì)粒MV 2是含從普通羊肚菌構(gòu)建的基因組文庫(kù)中分離的3.1kb片段的pPUC 19。該片段含編碼α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因3′端。
在下面討論中，MC代表Morchella costata，MV代表普通羊肚菌。
如上所述，普通羊肚菌的GL編碼序列包含在兩個(gè)質(zhì)粒中。參考

圖15，pMV 1含從位置454到位置2902的核苷酸，pMV 2含從位置2897(包括該位置)下游的核苷酸。參考圖12和13，為了連接編碼序列，可用限制性酶EcoRI和BamHI消化pMV 2，然后將有關(guān)片段插入用限制性酶EcoRI和BamHI消化的pMV 1中。
因此本發(fā)明高度優(yōu)選的實(shí)施方案包括可從存在于質(zhì)粒中的GL編碼序列的表達(dá)獲得的GL酶，該質(zhì)粒是保藏物NCIMB 40689或保藏物NCIMB 40688和保藏物NCIMB 40689的主體。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約，下列樣品于1994年10月11日被認(rèn)可的保藏單位(The Culture Collection of Algae and Protozoa(CCAP)at Dunstaffnage Marine Laboratory PO Box 3，Oban，Argyll，Scotland，United Kingdom，PA34 4AD)作為保藏物接受真菌感染的Gracilariopsis lemaneiform is(CCAP 1373/2)-[參考GLSC-1(California)]。
因此本發(fā)明高度優(yōu)選的實(shí)施方案包括可從作為保藏品CCAP 13732主體的藻類獲得的GL酶。
本發(fā)明將僅以實(shí)施例的方式進(jìn)行描述。
在下面實(shí)施例中，以附圖作參考，其中圖1顯示了染色的真菌感染的藻類；圖2顯示了染色的真菌感染的藻類；圖3顯示了真菌菌絲切片；圖4顯示了真菌感染的藻類切片；圖5顯示了真菌感染的藻類切片；圖6顯示了pGL 1的質(zhì)粒圖譜；圖7顯示了pGL 2的質(zhì)粒圖譜；圖8顯示了SEQ.I.D.No.3的氨基酸序列，表明了測(cè)序的肽片段的位置；圖9顯示了SEQ.I.D.No.1與SEQ.I.D.No.2的序列比較；圖10是顯微照片；圖11顯示了pMC的質(zhì)粒圖譜；圖12顯示了pMV 1的質(zhì)粒圖譜；圖13顯示了pMV 2的質(zhì)粒圖譜；圖14顯示了從Morchella costata獲得的基因組DNA的GL編碼序列和部分5′和3′非翻譯區(qū)；圖15顯示了從普通羊肚菌獲得的基因組DNA的GL編碼序列和部分5′和3′非翻譯區(qū)；圖16顯示了來自Morchella costata和普通羊肚菌的GL編碼序列和非翻譯區(qū)的比較；
圖17列出了SEQ.I.D.No.5的氨基酸序列，顯示測(cè)序的肽片段的位置；圖18列出了SEQ.I.D.No.6的氨基酸序列，顯示了測(cè)序的肽片段的位置；圖19顯示了存在和缺乏AF時(shí)的耗氧圖；圖20顯示了TLC板。
更詳細(xì)地說，圖1顯示了鈣粉白染色，顯示了Gracilariopsislemaneiformis上部和下部的真菌(108×和294×)。
圖2顯示了帶有真菌的Gracilariopsis lemaneiformis的PAS/苯胺藍(lán)黑染色。真菌具有明顯更高含量的碳水化合物。
圖3顯示了顯微照片，顯示了生長(zhǎng)于藻類細(xì)胞原壁(w)之間的含兩薄壁的真菌菌絲(f)的縱切和橫切切片。注意在藻類葉綠體中的類囊體膜(箭頭)。
圖4顯示了用克隆2探針的反義檢測(cè)(上排)，似乎局限于以鈣粉白染色的連續(xù)切片所示的真菌(下排)處(46×和108×)。
圖5顯示了發(fā)現(xiàn)用克隆2探針的強(qiáng)烈反義檢測(cè)信號(hào)在Gracilariopsis lemaneiformis的真菌上(294×)。
圖6顯示了質(zhì)粒pGL 1的圖譜，它是含有從真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis構(gòu)建的基因組文庫(kù)中分離的3.8kb片段的pBluescript II KS。該片段含有編碼α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因。
圖7顯示了質(zhì)粒pGL 2的圖譜，它是含有從真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis構(gòu)建的基因組文庫(kù)中分離的3.6kb片段的pBluescript II KS。該片段含編碼α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因。
圖9顯示了SEQ.I.D.No.1(GL 1)與SEQ.I.D.No.2(GL 2)的序列比較。GL 1的殘基總數(shù)是1088，GL 2的殘基總數(shù)是1091。在所做的比較中，使用結(jié)構(gòu)-遺傳模型(打開缺口花費(fèi)10；連接缺口花費(fèi)2)。在圖9中顯示兩個(gè)對(duì)比的殘基相同的符號(hào)是“∶”；顯示兩個(gè)對(duì)比的殘基相似的符號(hào)是“.”。說成是“相似”的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W?？偟膩碚f有845個(gè)氨基酸相同(即77.67％)；60個(gè)氨基酸相似(5.51％)。 GL 1中插入的缺口數(shù)為3，GL 2中插入的缺口數(shù)是2。
圖10是顯示在藻類細(xì)胞壁(w)之間生長(zhǎng)的真菌菌絲(f)的顯微照片。注意藻類細(xì)胞中的紅藻淀粉粒(s)和類囊體(箭頭)。線段＝2μm。
在圖14中，堿基總數(shù)是4726，DNA序列組成是1336A；1070C；1051G；1269T。ATG起始密碼子以黑體字表示。內(nèi)含子下面劃線。終止密碼子以斜體字表示。
在圖15中，堿基總數(shù)是4670，DNA序列組成是1253A；1072C；1080G；1265T。ATG起始密碼子以黑體字表示。內(nèi)含子下面劃線。終止密碼子以斜體字表示。
在圖16中，兩個(gè)對(duì)比的序列是從MC(殘基總數(shù)1066)和MV(殘基總數(shù)1070)獲得的序列。使用的比較模型是結(jié)構(gòu)-遺傳模型(打開缺口花費(fèi)10；連接缺口花費(fèi)2)。在本圖中，表示兩對(duì)比的殘基相同的符號(hào)是“∶”。表示兩對(duì)比的殘基相似的符號(hào)是“.”。說成是“相似”的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W 。總的來說，相同920(86.30％)；相似51(4.78％)。在MC中插入的缺口數(shù)為1，在MV中插入的缺口數(shù)是1。
在所述的序列表中SEQ.I.D.No.5是從Morchella costata獲得的GL的氨基酸序列；SEQ.I.D.No.6是從普通羊肚菌獲得的GL的氨基酸序列；SEQ.I.D.No.7是從Morche lla costata獲得的GL的核苷酸編碼序列；SEQ.I.D.No.8是從普通羊肚菌獲得的GL的核苷酸編碼序列。
在SEQ.I.D.No.5中，殘基總數(shù)是1066。GL酶的氨基酸組成為46 Ala 13 Cys 25 His 18 Met 73 Thr50 Arg 37 Gln 54 Ile 43 Phe 23 Trp56 Asn 55 Glu 70 Leu 56 Pro 71 Tyr75 Asp 89 Gly 71 Lys 63 Ser 78 Val在SEQ.I.D.No.6中，殘基總數(shù)是1070。GL酶的氨基酸組成為51 Ala 13 Cys 22 His 17 Met 71 Thr50 Arg 40 Gln 57 Ile 45 Phe 24 Trp62 Asn 58 Glu 74 Leu 62 Pro 69 Tyr74 Asp 87 Gly 61 Lys 55 Ser 78 Val實(shí)驗(yàn)1.可溶性酶系統(tǒng)1.1.pH對(duì)從真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis中分離的裂解酶的穩(wěn)定性和活性的影響。
在37℃試驗(yàn)了兩種緩沖系統(tǒng)，命名為濃度為5 mM的HOAc-NaOAc和檸檬酸鈉-檸檬酸。試驗(yàn)的pH范圍為從pH 3到pH 5.2。裂解酶在3.6到4.2的pH范圍內(nèi)顯示最大活性。在pH 3時(shí)，酶的穩(wěn)定性和活性減少大約90％。在pH 5.2時(shí)，活性減少大約64％。然而在此pH下酶比在pH 3下更穩(wěn)定，而在pH 5.2下獲得的AF產(chǎn)量是pH 3.8下獲得的AF產(chǎn)量的75％。在HOAc-NaOAc緩沖液中獲得的AF產(chǎn)量比在檸檬酸緩沖液中略高。這不是由于在AF試驗(yàn)方法中兩種緩沖液(在AF試驗(yàn)混合物中終濃度是125μM)的任何偏差影響。
1.2.溫度對(duì)裂解酶的活性和穩(wěn)定性的影響本實(shí)驗(yàn)在最適pH范圍內(nèi)進(jìn)行。在25℃下AF生產(chǎn)線型增長(zhǎng)到至少9天。這表明在9天內(nèi)裂解酶無活性和穩(wěn)定性損失。隨著溫度的升高，酶穩(wěn)定性減小。
在下列溫度下酶活性的半壽期為30℃5天37℃2.5天40℃不超過1天50℃不超過1天1.3.底物濃度對(duì)裂解酶穩(wěn)定性和AF產(chǎn)量的影響觀察到支鏈淀粉和糊精對(duì)裂解酶具有穩(wěn)定效應(yīng)，而最小的底物麥芽糖沒有。這一點(diǎn)以可溶性酶系統(tǒng)和固相酶系統(tǒng)來證實(shí)。
隨著支鏈淀粉濃度增加到高達(dá)25％，AF產(chǎn)量也增加。至于糊精，當(dāng)濃度超過30％(試驗(yàn)了30％，40％和50％)時(shí)AF產(chǎn)量減少。
1.4.裂解酶的活化和滅活未發(fā)現(xiàn)金屬離子為活性所必需，令人驚奇的是該酶催化的反應(yīng)可在純水中進(jìn)行。向反應(yīng)混合物中加入高達(dá)20mM的EDTA對(duì)活性很少有影響的事實(shí)清楚地證實(shí)對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的裂解酶的活性來說，金屬離子是不必要的。
這意味著在AF純化步驟中，從反應(yīng)系統(tǒng)中去掉鹽的離子交換色譜步驟可省去，如果水用作反應(yīng)介質(zhì)的話。然而，反應(yīng)混合物包含濃度為0.85％(0.1 45M)的NaCl時(shí)可將AF產(chǎn)量增加1倍。
1.5.底物特異性當(dāng)?shù)矸蹪舛茸兏邥r(shí)，溶解后冷卻的淀粉傾向于形成堅(jiān)硬的凝體。因此，使用部分降解的淀粉作為1，4-葡聚糖裂解酶的底物具有優(yōu)勢(shì)。
試驗(yàn)了從M.costata分離的α-1，4-葡聚糖裂解酶對(duì)不同寡聚糖的特異性。這些寡聚糖是麥芽糖(G2)，麥芽三糖(G3)，麥芽四糖(G4)，麥芽五糖(G5)，麥芽六糖(G6)和麥芽七糖(G7)。寡聚糖以8mg/ml的濃度溶于水。酶試驗(yàn)含150μl底物G2/G3/G4/G5/G6/G7，120μl 0.1M MES pH 6.3和30μl純化的酶。反應(yīng)混合物在30℃培養(yǎng)60分鐘。隨后經(jīng)煮沸3分鐘終止反應(yīng)并加入900μl無水乙醇進(jìn)行沉淀。4℃以20,000×g離心5分鐘后將上清液轉(zhuǎn)移到新的eppendorf管中并凍干。
冷凍干燥的樣品溶于1000μl H2O中并通過0.22μm Millipore濾膜過濾，隨后加樣25μl到Dranex HPLC上。
1.7HPLC分析程序在由GPM-2泵和用于脈沖安培計(jì)檢測(cè)方式的PED檢測(cè)器組成的Dionex 4500i色譜系統(tǒng)中進(jìn)行分析。
陰離子交換柱是Dionex的CarboPac PA-100(4×250mm)和CarboPac PA-100保護(hù)柱。
洗脫液是200mM氫氧化鈉(A)，500mM乙酸鈉(B)和18M歐姆去離子水(C)。泵以2種不同的方式(方法1和方法2)運(yùn)行
方法1
方法2
標(biāo)準(zhǔn)品葡萄糖，麥芽糖，麥芽三糖，麥芽四糖，麥芽五糖，麥芽六糖和麥芽七糖(都來自Sigma)和1，5-脫水果糖用作標(biāo)準(zhǔn)品。所有化合物均溶于18M歐姆的去離子水中，用前通過0.22μm Millipore濾膜過濾。
1.7.結(jié)果分析表明從M.costata分離的純化酶確實(shí)能使用麥芽寡聚糖作底物形成1，5-脫水果糖。
當(dāng)使用麥芽糖作底物時(shí)，幾乎不形成1，5-脫水果糖，但當(dāng)使用其它麥芽寡聚糖(G3-G7)時(shí)，產(chǎn)生高產(chǎn)量的該化合物。
很清楚當(dāng)使用更長(zhǎng)的麥芽寡聚糖時(shí)可獲得更高產(chǎn)量的1，5-脫水果糖。
這一觀察結(jié)果與裂解酶從底物非還原端形成1，5-脫水果糖而葡萄糖分子末端未變化的理論非常吻合。
1.8.AF的形成M.costata的α-1，4-葡聚糖裂解酶將淀粉水解成終產(chǎn)物1，5-脫水果糖。終產(chǎn)物經(jīng)HPLC，方法2顯示。酶試驗(yàn)含500μl支鏈淀粉(20mg/ml，溶于H2O)、400μl 0.1M MES pH 6.3和100μl純化酶。在30℃保溫反應(yīng)混合物，保溫30或120分鐘后經(jīng)煮沸終止反應(yīng)。加入3體積的無水乙醇沉淀高分子寡聚糖類，按上面所述離心和凍干樣品。樣品溶于125μl H2O中并取25μl上樣到HPLC柱上。
HPLC洗脫圖清楚地表明M.costata的α-1，4-葡聚糖裂解酶經(jīng)水解淀粉產(chǎn)生1，5-脫水果糖。保溫30和120分鐘后發(fā)現(xiàn)相當(dāng)量的1，5-脫水果糖，表明酶活性不受終產(chǎn)物1，5-脫水果糖的抑制。
以這種方式制備的AF13C NMR光譜(水)表明它采取產(chǎn)生下列信號(hào)的一個(gè)主要形式δ93.5(夸脫，C-2)，81.5(CH，C-5)，77.7(CH，C-3)，72.6(CH2，C-1)，69.8(CH，C-4)，62.0(CH2，C-6)。根據(jù)H-H C-H和C-H 2D相關(guān)光譜進(jìn)行排列。
1.6.裂解酶與支鏈淀粉酶和異淀粉酶的協(xié)同效應(yīng)。
從表1可見，在反應(yīng)混合物中包含支鏈淀粉酶的是增加AF的產(chǎn)量大約15-23％，這一增加值取決于使用的底物是可溶性淀粉還是支鏈淀粉。
表1 在AF生產(chǎn)中支鏈淀粉酶和裂解酶的協(xié)同作用底物裂解酶支鏈淀粉酶AF產(chǎn)率 (％) Glc 產(chǎn)率 (％)可溶性淀粉 +-510-+0 0.37++66.0 3.9支鏈淀粉 +-48.0 0-+0 0.33++71.3 3.7+，加入的酶，-，省去的酶。
反應(yīng)混合物含0.3ml 2％馬鈴薯支鏈淀粉(Sigma)/水或0.3ml 2％可溶性淀粉(Merch)，2μl裂解酶和0.36單位的所示支鏈淀粉酶(BM)。
在30℃反應(yīng)進(jìn)行1天。在反應(yīng)終止時(shí)，取樣進(jìn)行AF和GLc分析。
至于異淀粉酶，其優(yōu)勢(shì)在于裂解酶的最適pH與假單胞菌屬異淀粉酶的最適pH(pH 3.0-4.5)重疊。然而問題是異淀粉酶產(chǎn)生的過量的長(zhǎng)鏈直鏈淀粉會(huì)從溶液中沉淀出來而不再適合于作為裂解酶的底物。如果直鏈淀粉的鏈不太長(zhǎng)，可期望裂解酶與異淀粉酶會(huì)產(chǎn)生有效的協(xié)同作用。
2.固相酶系統(tǒng)經(jīng)過使用琥珀酰胺活化的Sepharose(Afigel 15凝膠，Bio-Rad)和戊二醛活化的Silica凝膠(BM)完成裂解酶的固相化。在Affigel 15凝膠上固相化后酶活性的恢復(fù)率在40％到50％之間。固相化后可能仍有一些酶較活躍，但由于位阻底物不能進(jìn)入，特別是對(duì)于象淀粉一樣的大分子。工業(yè)上使用的固相酶通?；钚曰謴?fù)率為大約50％。
對(duì)于Affigel 15凝膠固相化的裂解酶，最令人感興趣的事是在pH 5.5下其穩(wěn)定性有很大的改進(jìn)。當(dāng)柱在這一pH下進(jìn)行操作時(shí)，穩(wěn)定性至少有16天長(zhǎng)?？紤]到支鏈淀粉酶的最適pH為大約pH 5.5，pH改變?cè)诜€(wěn)定性中非常重要。這是裂解酶和支鏈淀粉酶在具有相同物理-化學(xué)環(huán)境的相同反應(yīng)器中發(fā)生有效的協(xié)同作用的前提條件。可溶性裂解酶的最適pH在3.6和4.2之間，在該pH范圍內(nèi)，支鏈淀粉酶表現(xiàn)出很小的活性或無活性。
使用硅膠固相裂解酶的活性恢復(fù)率非常高，大約80-100％。然而當(dāng)柱不在pH 3.8和pH 5.5下操作時(shí)硅膠固相酶不穩(wěn)定。可能有些裂解酶吸附到硅膠珠表面并在每次洗柱后緩慢從硅膠上釋放。因此可能是吸附的裂解酶造成了高恢復(fù)率和柱活性的減少。
3.AF的純化3.1.裂解酶-支鏈淀粉/可溶淀粉系統(tǒng)在該系統(tǒng)中，反應(yīng)終止時(shí)反應(yīng)系統(tǒng)含AF，極限糊精，裂解酶和緩沖鹽。經(jīng)乙醇(終濃度50％)沉淀從大分子(極限糊精和裂解酶)中分離AF。使用Amicon YM 3膜(截下3,000D的分子量)經(jīng)超濾分離未沉淀的低分子量支鏈淀粉。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中經(jīng)在40℃蒸發(fā)去掉乙醇。經(jīng)過混合的離子交換劑從AF中去掉緩沖鹽。經(jīng)冷凍干燥獲得純化的固體AF。
3.2.裂解酶-支鏈淀粉酶/支鏈淀粉/可溶性淀粉系統(tǒng)在該系統(tǒng)中終產(chǎn)物是AF和葡萄糖。如果制備至少基本上純的AF樣品，必須去掉副產(chǎn)物葡萄糖。這可經(jīng)過酶方法完成。首先經(jīng)葡萄糖氧化酶將葡萄糖轉(zhuǎn)變成葡萄糖酸和過氧化氫。
需要過氧化氫酶消除形成的H2O2。H2O2可將AF氧化成目前結(jié)構(gòu)未知的2種新化合物。在AF制品中的其它雜質(zhì)是AF的氧化產(chǎn)物。觀察到經(jīng)空氣水平的氧，特別是在高溫，高AF濃度和長(zhǎng)時(shí)間暴露下AF可被緩慢氧化。
葡萄糖酸可與緩沖鹽一起經(jīng)離子交換色譜去掉。
在該系統(tǒng)中，作為選擇可用淀粉轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶水解低分子量的支鏈淀粉分子來代替使用超濾法。
3.3.AF的純度檢查。
經(jīng)TLC，Dionex和NMR證實(shí)AF制品的純度。
3.4.脫水果糖抗氧化活性分析。
電化學(xué)氧消耗方法在Jorgensen和Skibsted(Z.Lebensm.Unters.Forsch.(1993)196423-429)描述的甲基亞油酸乳劑中研究AF的活性，對(duì)該乳劑作了輕微的修改向作為乳化劑的5.00ml溶于具有pH＝5.8且含0.2w/w％Tween 20的5.0mM磷酸鹽緩沖水溶液的1.33mM甲基亞油酸乳劑中加入下列濃度的AF0，15，146和680μM。經(jīng)過加入50μl 0.26M甲基肌紅蛋白(MMb)至終濃度為0.26mM起動(dòng)該系統(tǒng)的氧化。起動(dòng)反應(yīng)后立即將樣品注射到恒溫(25.0±0.1℃)的70μl密封電池中，有效地排除氧向系統(tǒng)的擴(kuò)散。經(jīng)Clark電級(jí)(與PC資料收集程序相連)測(cè)量氧的消費(fèi)。每30秒登記相對(duì)氧濃度(％)。
結(jié)果與不同樣品的氧消耗相對(duì)應(yīng)的曲線如圖19所示。對(duì)于未加AF的樣品，在樣品注射后立即可見氧濃度的相對(duì)減少。對(duì)于含AF的樣品，在曲線結(jié)束前觀察到對(duì)數(shù)期且氧濃度減少。與未加AF的樣品相比在對(duì)數(shù)期后僅觀察到氧消耗率的微量減少。對(duì)具有最高量AF的樣品，觀察到最長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期。對(duì)這些樣品還觀察到耗氧率更低，這經(jīng)過與對(duì)照(0μM)斜率相比這些曲線斜率更小來觀察。
ESR分析方法經(jīng)過與H2O2(0.17mM)和FeSO4(4.8μM)的Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基。產(chǎn)生的基團(tuán)以5，5-二甲基-1-二氫吡咯N-氧化物(DMPO，9.7mM)捕獲。以1.3mM和6.3mM的濃度加入AF。以濃度為0.25mg/ml(克數(shù)相當(dāng)于1.26mM AF)分析迷迭香(Rosmarinusofficinalis L.)的水溶性提取物。120秒后在室溫(20±1℃)下進(jìn)行測(cè)量并在300秒后對(duì)相同的反應(yīng)混合物重復(fù)測(cè)量，使用下面分光計(jì)裝置中心場(chǎng)3475.60G；清除寬度55G；微波功率20mW；調(diào)節(jié)頻率100KHz；調(diào)節(jié)距離1.01G；接受器放大1.00·105；轉(zhuǎn)變時(shí)間81.92毫秒，恒定時(shí)間163.84毫秒，清除時(shí)間83.89秒。
結(jié)果以DMPO捕獲產(chǎn)生的羥基。自旋加合物產(chǎn)生特征性的1∶2∶2∶1ESR光譜。光譜峰高與產(chǎn)生的自旋加合物量成比例。DMPO和AF的加入在自旋陷阱和AF之間形成競(jìng)爭(zhēng)。峰高的降低表明AF較好的清除活性。
表ESR-光譜的峰高。H2O2＝0.17mM，F(xiàn)e2+＝4.8μM。
可見在1.3mM AF濃度時(shí)無羥基清除活性，在6.3mM AF時(shí)峰高減小，表明產(chǎn)生的部分羥基被AF清除。
4.AF作為抗氧化劑的應(yīng)用實(shí)施例4.1AF作抗氧化劑在50％蛋黃醬中的應(yīng)用在飲食供應(yīng)和零售交易中，50％蛋黃醬用于色拉，打開的夾心面包片等。50％蛋黃醬油含量低使其適于低熱量應(yīng)用。
典型的蛋黃醬組合物如下大豆油 50.0％龍蒿醋(10％) 4.0％蛋黃 3.5％糖 3.0％鹽 1.0％山梨酸鉀 0.1％水 35.2％MAYODAN 602 3.0％檸檬調(diào)味品1025 10.2％MAYODAN 602可保證良好的穩(wěn)定的油分散和所需的粘度，從而使50％蛋黃醬具有較長(zhǎng)的貨架壽命。
調(diào)味品10251是天然檸檬調(diào)味品，它使蛋黃醬具有新鮮的檸檬口味。
典型的蛋黃醬以下列方法制備1)干燥混合MAYODAN 602，糖和鹽。以1份粉末2份油的比例分散于油中。
2)向水中加入調(diào)味品和山梨酸鉀并注入Koruma混合器中。加入1)。
3)加入蛋黃醬。
4)在真空中連續(xù)加油。
5)已(緩慢)加入2/3的油后，將剩下的1/3的油與龍蒿醋混合并加入。
下面資料表明，當(dāng)將AF作為抗氧化劑加入蛋黃醬中時(shí)，結(jié)果可比得上已知的食品抗氧化劑GRINDOX 142和GRINDOX 1029。
GRINDOX142抗壞血酸棕櫚酸酯 10％丙基沒食子酸 20％檸檬酸 10％食品級(jí)乳化劑 60％25℃的形態(tài) 膏狀顏色 灰色至淺棕色密度 1.1g/ml(所有百分?jǐn)?shù)均是重量百分?jǐn)?shù))。
GRINDOX 1029抗壞血酸棕櫚酸酯 20％天然生育酚 20％食品級(jí)乳化劑 60％在25℃的形態(tài) 膏狀顏色 亮棕色在25℃的密度 1.0g/ml(所有百分?jǐn)?shù)均是重量百分比)。
在試驗(yàn)程序中，向蛋黃醬中加入抗氧化劑使抗氧化劑濃度大約為500ppm。然后將蛋黃醬放入80℃含純O2的彈型量熱計(jì)中。再測(cè)量產(chǎn)品發(fā)生大量氧化的潛伏期。
結(jié)果如下樣品 IP(小時(shí))1.空白 28,02.+500ppm GRINDOX 14235,03.+500ppm GRINDOX 1029 33,34.+550ppm GRINDOX 1029 34,35.+500ppm 1，5脫水果糖-D-32,0(IP小時(shí)＝潛伏期)這些結(jié)果表明AF是優(yōu)良的食品抗氧化劑并可比得上已知的食品抗氧化劑GRINDOX 142或GRINDOX 1029。
實(shí)施例4.2AF作為抗氧化劑在色拉調(diào)味汁中的應(yīng)用含50％油的酸乳酪色拉調(diào)味汁含50％油的酸乳酪色拉調(diào)味汁用于色拉，馬鈴薯，生蔬菜色拉，肉，魚和煮過的蔬菜。
組成大豆油 50.0％酸乳酪(普通) 39.0％醋(10％) 3.5％糖 3.0％蛋黃 2.0％鹽 1.0％山梨酸鉀 0.1％MAYODAN 5251.4％掩蓋酸味的調(diào)味品2072 0.02％
MAYODAN 525提供了極好的乳劑穩(wěn)定性，防止凝固，確保均勻的油分散和粘度，改善了生產(chǎn)過程的耐受性并保證其貨架壽命長(zhǎng)。
調(diào)味品2072是特性相同，掩蓋了酸味的調(diào)味品，它減小了酸味而不影響其pH值。
加工過程1.將干燥的MAYODAN 525，糖和鹽混合。以1份粉末比2份油的比例分散于油中。
2.將調(diào)味品，山梨酸鉀和酸乳酪加入Koruma混合器中。加入1)。
3.加入蛋黃。
4.在真空中連續(xù)加油。
5.加入2/3的油(緩慢)后，將醋與剩余的1/3的油混合并加入。
6.如果需要就加入香料。
試驗(yàn)結(jié)果樣品 IP小時(shí) PF1.空白 37.2 1.002.500ppm脫水果糖 39.5 1.063.800ppm GRINDOX 1032 43.2 1.07(IP-潛伏期)；(PF-保護(hù)系數(shù))保護(hù)系數(shù)(PF)對(duì)于每個(gè)溫度下的AF定義為PF＝加入了抗氧化劑的油的IP/未加入抗氧化劑的相同油的IP。
壽命延長(zhǎng)(LE)％LE＝(PF-1.0)×1006.α-1，4-葡聚糖裂解酶的制備前言
至于本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案，用于制備AF的α-1，4-葡聚糖裂解酶可從真菌感染的藻類中分離，優(yōu)選真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis，更優(yōu)選來自青島(中國(guó))的真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis。
作為選擇，可從真菌中獲得該酶。例如，真菌可以是Discinaperlata，Discina parma，Gyromitra gigas，Gyromitra infula，Mitrophora hybrida，尖頂羊肚菌，Morchella costata彈絲羊肚菌，Morchella hortensis，Morchella rotunda普通羊肚菌，疣孢褐盤菌，Sarcosphaera eximia，Disciotis venosa，可食鹿花菌，卷曲馬鞍菌，空隙馬鞍菌，Leptopodia elastica，指狀鐘菌和羊肚菌屬的其它種類中任意一種。優(yōu)選該真菌是Morchella costata或普通羊肚菌。
至于本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案，用于制備AF的α-1，4-葡聚糖裂解酶可僅從藻類中分離，優(yōu)選Gracilariopsis lemaneiformis，更優(yōu)選來自Santa Cruz(加利福利亞)的Gracilariopsislemaneiformis。
最初的酶純化可按Yu等(出處同上)描述的方法進(jìn)行。然而，優(yōu)選的是最初的酶純化包括一種最優(yōu)化的程序，其中所用的固相支持物在純化步驟中不分解。該凝膠支持物還具有的優(yōu)勢(shì)是它與標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室蛋白質(zhì)純化裝置相配伍。這種最優(yōu)化的純化方法的細(xì)節(jié)在下文描述。用已知的蛋白質(zhì)純化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)終止純化。
使用互補(bǔ)電泳技術(shù)易于確定酶的純度。
A.來源＝真菌感染的藻類下面序列資料用于產(chǎn)生下述PCR反應(yīng)的引物并用于檢查以各自的核苷酸序列產(chǎn)生的氨基酸序列。
來自真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis的肽集合的氨基酸序列Tyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn AlaAla Phe Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asn AsnAsp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu GlyGly His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp GluAsn Ser Thr Glu Arg Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln TrpTyr Lys Phe Gly Pro Asp Phe Asp Thr Lys Pro Leu Glu Gly Ala用于產(chǎn)生引物A和B的氨基酸序列(27-34)(Met Tyr Asn AsnAsp Ser Asn Val)引物AATG TA(TC) AA(CT) AA(CT) GA(CT) TC(GATC) AA(CT) GT 128種混合引物BATG TA(TC) AA(CT) AA(CT) GA(CT) AG(CT) AA(CT) GT 64種混合用于生產(chǎn)引物C的氨基酸序列(40-50)(Gly Gly His Asp GlyTyr)引物CTA(GATC)CC(GA)TC(GA)TG(GATC)CC(GATC)CC 256種混合[該序列與互補(bǔ)鏈相對(duì)應(yīng)]。
用于生產(chǎn)引物E的氨基酸序列(74-79)(Gln Trp Tyr Lys PheGly)引物EGG(GATC) CC(GA) AA(CT) TT(GA) TAC CA(CT) TG 64種混合[該序列與互補(bǔ)鏈相對(duì)應(yīng)]。
用于產(chǎn)生引物F1和F2的氨基酸序列(1-6)(Tyr Arg Trp GlnGlu Val)引物F1TA(TC) CG(GATC) TGG CA(GA) GA(GA) GT 32種混合引物F2TA(TC) AG(GA) TGG CA(GA) GA(GA) GT16種混合首次PCR擴(kuò)增獲得的序列(克隆1)ATGTACAACA ACGACTCGAA CGTTCGCAGG GCGCAGAACG ATCATTTCCTTCTTGGCGGC CACGACGGTT AMet Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu GlyGly His Asp Gly第二次PCR擴(kuò)增獲得的序列(克隆1)ATGTACAACA ACGACTCGAA CGTTCGCAGG GCGCAGAACG ATCATTTCCTTCTTGGTGGA CATGATGGAT ATCGCATTCT GTGCGCGCCT GTTGTGTGGGAGAATTCGAC CGAACGNGAA TTGTACTTGC CCGTGCTGAC CCAATGGTACAAATTCGGCC CMet Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val Arg Arg Ala GlnAsn Asp His Phe Leu Leu GlyGly His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Ser Thr GluArg Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln Trp Tyr Lys Phe Gly Pro第三次PCR擴(kuò)增獲得的序列(克隆2)TACAGGTGGC AGGAGGTGTT GTACACTGCT ATGTACCAGAATGCGGCTTT CGGGAAACCG ATTATCAAGG CA6CTTCCATGTACGACAAC GACAGAAACG TTCGCGGCGC ACAGGATGACCACTTCCTTC TCGGCGGACA CGATGGATAT CGTATTTTGTGTGCACCTGT TGTGTGGGAG AATACAACCA GTCGCGATCTGTACTTGCCT GTGCTGACCA GTGGTACAAA TTCGGCCC
Tyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala Ala Phe Gly LysPro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asp Asn Asp Arg Asn Val Arg Gly Ala Gln AspAsp His Phe Leu Leu Gly Gly His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val ValTrp Glu Asn Thr Thr Ser Arg Asp Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Lys Trp Tyr LysPhe GlyA.1.Gracilariopsis lemaneiformis的細(xì)胞學(xué)研究A.1.1.1.Gracilariopsis lemaneiformis中真菌感染的檢測(cè)對(duì)在中國(guó)收集的Gracilariopsis lemaneiformis進(jìn)行徒手切片或石蠟包埋材料切片。以光學(xué)顯微鏡檢術(shù)仔細(xì)研究切片材料。在Gracilariopsis lemaneiformis中清楚地檢測(cè)到真菌菌絲。
Gracilariopsis lemaneiformis的葉狀體由以高度有序且?guī)缀跻詫?duì)稱方式存在的細(xì)胞組成。G.lemarneiformis的管狀葉狀體由大型無色中央細(xì)胞被延長(zhǎng)的、纖細(xì)的橢圓形細(xì)和小而圓的帶紅色色素的外周細(xì)胞包圍組成。所有藻類細(xì)胞類型的特征在于有厚的細(xì)胞壁。大多數(shù)真菌菌絲發(fā)現(xiàn)在大型細(xì)胞的中央層和外周層之間的界面上。這些細(xì)胞可清楚地從藻類細(xì)胞中區(qū)分，因?yàn)樗鼈兪情L(zhǎng)圓柱形。觀察到菌絲的生長(zhǎng)是在高度有序的藻類細(xì)胞之間無規(guī)則生長(zhǎng)。菌絲最通常的方向是沿藻類葉狀體的主軸方向。偶爾也檢測(cè)到向中央和外周的側(cè)向分枝。菌絲不會(huì)與藻類內(nèi)生/附生的第二世代混淆。
已知鈣粉白染色含幾丁質(zhì)和纖維素的組織。與幾丁質(zhì)的反應(yīng)需要4個(gè)共價(jià)連接的末端N-2酰葡糖胺殘基。普遍接受纖維素幾乎局限于高等植物，盡管在有些藻類中可能存在微量纖維素。還已知在江蘺屬中不存在幾丁質(zhì)。
發(fā)現(xiàn)鈣粉白染色區(qū)與切片的Gracilariopsis lemaneiformis材料中的真菌菌絲細(xì)胞壁相對(duì)應(yīng)。
當(dāng)在紫外燈下觀察時(shí)，相對(duì)于江蘺屬組織淡藍(lán)色的背景菌絲呈現(xiàn)清楚的白色(見圖1)。幾丁質(zhì)是大多數(shù)真菌的主要細(xì)胞壁成份，但在江蘺屬中缺失。根據(jù)這些觀察結(jié)果，我們得出結(jié)論，所研究的藻類被真菌感染。發(fā)現(xiàn)研究的Gracilariopsis lemaneiformis切片中40％的下部被真菌菌絲感染。發(fā)現(xiàn)研究的Gracilariopsis lemaneiformis切片中25％的藻類頂端被感染。
用過碘酸希夫氏(PAS)染料和苯胺蘭黑染色切片的Gracilariopsis lemaneiformis揭示了與藻類細(xì)胞相比真菌細(xì)胞內(nèi)的碳水化合物含量明顯更高(見圖2)。番紅O和孔雀綠染色表現(xiàn)出與在真菌感染的高等植物中所發(fā)現(xiàn)的真菌細(xì)胞相同的顏色反應(yīng)。
吖啶橙與切片的Gracilariopsis lemaneiformis的反應(yīng)顯示出真菌清楚的無規(guī)則生長(zhǎng)。
A.1.1.2.電子顯微鏡檢術(shù)用鈣粉白檢測(cè)到真菌的帶有15μm厚切片的載玻片在2％ OsO4中固定，用水洗滌并在二甲氧基丙烷和無水乙醇中脫水。在玻璃片的每個(gè)切片上加一滴丙酮與Sparr樹脂1∶1的混合物，1小時(shí)后用1滴純樹脂代替。樹脂填充的明膠包埋膠囊面朝下放在切片上并4℃放置過夜。在55℃聚合8小時(shí)后，經(jīng)過浸入液氨可從載玻片上分離附著于樹脂塊上的厚切片。
修塊并用切片機(jī)上的鉆石刀片切成100nM厚的切片。切片在醋酸鈾水溶液和在檸檬酸鉛中染色。在電子顯微鏡下以80KV檢查切片。
研究證實(shí)了光學(xué)顯微鏡的觀察結(jié)果并提供了產(chǎn)生裂解酶的G.lamneiformis中國(guó)品種被真菌性寄生物或共生物感染的進(jìn)一步證據(jù)。
真菌菌絲由50至100μm長(zhǎng)，直徑僅幾微米的管狀細(xì)胞構(gòu)成。細(xì)胞依次排列，相鄰細(xì)胞之間有隔膜壁。偶爾也見分枝。菌絲在藻類葉狀體厚細(xì)胞壁之間生長(zhǎng)而不穿透細(xì)胞壁或損傷細(xì)胞。已知這種稱為真菌藻類共生體的共生關(guān)系也發(fā)生于一些絲狀海洋真菌和大型海洋藻類之間(DonK and Bruning，1992-Ecology of aquatic fungi inand on algae。In Reisser，W.(ed)Algae and SymbiosesPlants，Animals，F(xiàn)ungi，Viruses，Interactions Explored.Biopress Ltd.，Bristol.)。
檢查圖10的顯微照片，可注意到藻類和真菌細(xì)胞之間的一些區(qū)別。與藻類幾個(gè)μm厚的細(xì)胞壁相反，真菌細(xì)胞壁僅100-200nm厚。在藻類細(xì)胞中可見植物典型的細(xì)胞器，如具有類囊體膜的葉綠體以及紅藻淀粉粒，但在真菌中未發(fā)現(xiàn)。
紅藻細(xì)胞間連接的特征在于稱為紋孔栓或紋孔連接的特殊結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)是凸出的電子致密核心且它們是藻類分類學(xué)中的重要特征(Pueschel，C.M.An expanded survey of the Ultrastructureof Red algal pit plugs，J.Phycot.25，625，(1989))。在我們的材料中，在藻類葉狀體中常觀察到這種連接，但在真菌細(xì)胞間從未發(fā)現(xiàn)。
A.1.2.原位雜交實(shí)驗(yàn)原位雜交技術(shù)是根據(jù)對(duì)mRNA的反義核糖核苷酸序列的雜交的原理進(jìn)行的。該技術(shù)用于顯示顯微切片中存在所說的mRNA的區(qū)域。在本發(fā)明的特定情況下，該技術(shù)用于定位Gracilariopsislemaneiformis切片中的α-1，4-葡聚糖裂解酶。
A.1.2.1.用于原位雜交的35S標(biāo)記的探針的制備將第三次PCR擴(kuò)增的2386p的PCR片段(稱為克隆2(見上面))克隆進(jìn)pGEM-32f(+)載體(Promega)。以SP6啟動(dòng)子趨動(dòng)反義RNA的轉(zhuǎn)錄，以T7啟動(dòng)子趨動(dòng)有意義RNA的轉(zhuǎn)錄。使用具有下列修改的核糖核酸酶保護(hù)試驗(yàn)試劑盒(Ambion)。將轉(zhuǎn)錄子通過6％測(cè)序凝膠以去掉未摻入的核苷酸并用含有體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ambion)中的T7RNA聚合酶的洗脫緩沖液洗脫。反義轉(zhuǎn)錄子含23個(gè)非編碼的核苷酸，而有意義轉(zhuǎn)錄子含39個(gè)核苷酸。為進(jìn)行雜交，使用107cpm/ml的35S標(biāo)記的探針。
基本上按照Langedale等(1988)所述進(jìn)行原位雜交。發(fā)現(xiàn)最適的雜交溫度為45℃。45℃洗滌后用Kodak K-5照相乳膠覆蓋切片并在5℃黑暗中放置3天(參考文獻(xiàn)Langedale，J.A.，Rothermel，B.A.and Nelson，7，(1988)。Genes and deve lopment 2106-115，Cold Spring Harbour Laboratory)。
在使用針對(duì)α-1，4-葡聚糖裂解酶mRNA的核糖核苷酸探針的原位雜交實(shí)驗(yàn)中，在Gracilariopsis lemaneiformis中檢測(cè)到的真菌菌絲上和周圍顯示出強(qiáng)烈的雜交信號(hào)(見圖4和5)。認(rèn)為這有力地表明產(chǎn)生了α-1，4-葡聚糖裂解酶。在兩種Gracilariopsislemaneiformis藻類組織中檢測(cè)到微弱的隨機(jī)背景反應(yīng)。用有意義和反義探針都觀察到這種反應(yīng)。僅用反義探針獲得了對(duì)真菌菌絲的強(qiáng)烈染色。
以在45℃雜交的標(biāo)準(zhǔn)雜交條件和洗滌步驟獲得這些結(jié)果。在50℃觀察不到對(duì)真菌的染色，而背景染色仍相同。對(duì)于有意義和反義探針而言，將溫度升高到55℃明顯地且同等地減小了背景染色。
根據(jù)使用互補(bǔ)染色程序的細(xì)胞學(xué)研究，可得出結(jié)論Gracilariopsis lemaneiformis被真空感染。在藻類組織的下部感染最顯著。
在切片的Gracilariopsis lemaneiformis材料上原位雜交結(jié)果清楚地表明雜交局限于發(fā)現(xiàn)真菌感染的區(qū)域(見圖4)。結(jié)果表明α-1，4-葡聚糖裂解酶mRNA似乎局限于Gracilariopsislemaneiformis上真菌感染的區(qū)域。根據(jù)這些觀察結(jié)果，我們得出結(jié)論在真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis上檢測(cè)到α-1，4-葡聚糖裂解酶活性。
A.2.酶的純化和表征按下面方法進(jìn)行從真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis材料中純化α-1，4-葡聚糖裂解酶。
A.2.1.材料和方法經(jīng)過濾收獲藻類并用0.9％ NaCl洗滌。經(jīng)勻漿破碎細(xì)胞，接著在50mM檸檬酸-NaOH pH 6.2(緩沖液A)中在冰上超聲處理6×3分鐘。以25,000×g離心40分鐘去掉細(xì)胞碎片。在該程序中獲得的上清液認(rèn)為是無細(xì)胞提取物并在8-25％梯度凝膠上分離后用于活性染色和Western印跡。
A.2.2.以β-環(huán)糊精Sepharose凝膠分離無細(xì)胞提取物直接上樣到預(yù)先用緩沖液A平衡的β-環(huán)糊精Sepharose凝膠4B柱(2.6×18cm)上。用3體積的緩沖液A和2體積含1M NaCl的緩沖液A洗柱。用含2％糊精的緩沖液A洗脫α-1，4-葡聚糖裂解酶。匯集活性餾分并將緩沖液換成20mM雙-tris丙烷-HCl(pH 7.0，緩沖液B)。
將活性組分上樣到預(yù)先用緩沖液B平衡的Mono Q HR 5/5柱上。用緩沖液B以0.3M線性梯度洗脫真菌裂解酶。
作為選擇可將β-環(huán)糊精Sepharose色譜后獲得的裂解酶制備濃縮到150μl并上樣到Superose 12柱上，在FPLC條件下操作。A.2.3.α-1，4-葡聚糖裂解酶活性和測(cè)定底物特異性，pH和溫度最適值的條件。
試驗(yàn)α-1，4-葡聚糖裂解酶活性的反應(yīng)混合物含10mg/ml支鏈淀粉和25mM Mes-NaOH(pH 6.0)。反應(yīng)在30℃下進(jìn)行30分鐘并經(jīng)過加入3，5-二硝基水楊酸試劑終止反應(yīng)。室溫靜置10分鐘后在550nm下測(cè)光密度。
A.3.來自真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis α-1，4-葡聚糖裂解酶的氨基酸測(cè)序A.3.1.裂解酶的氨基酸測(cè)序用來自溶組織梭狀芽孢桿菌的內(nèi)切蛋白酶Arg-C或來自Lysobacter enzymogenes的內(nèi)切蛋白酶Lys-C(兩者都是測(cè)序級(jí)，購(gòu)自Boehringer Mannheim，德國(guó))消化裂解酶。為了用內(nèi)切酶Arg-C消化，將冷凍干燥的裂解酶(0.1mg)溶于50μl 10M尿素，50mM甲胺，0.1M Tris-HCl，pH 7.6中。用N2覆蓋后將加入10μl 50mMDTT和5 mM EDTA的蛋白質(zhì)變性并在N2中50℃下還原10分鐘。隨后加入1μg溶于10μl 50mM Tris-HCl，pH 8.0中的內(nèi)切蛋白酶Arg-C，用N2覆蓋并在37℃進(jìn)行消化6小時(shí)。為了進(jìn)行隨后的半胱氨酸誘導(dǎo)，加入12.5μl 100mM碘乙酰胺，將溶液在室溫黑暗中及N2存在的條件下保溫15分鐘。
為了用內(nèi)切蛋白酶Lys-C消化，將凍干的裂解酶(0.1 mg)溶于50μl 8M尿素，0.4M NH4HCO3，pH 8.4中。用N2覆蓋并加入5μl 45mM DTT后，將蛋白質(zhì)變性并在50℃和N2存在的條件下還原15分鐘。冷卻到室溫后，加入5μl 100mM碘乙酰胺以便在黑暗中N2存在的條件下室溫誘導(dǎo)半胱氨酸15分鐘。
隨后，加入90μl水和5μg溶于50μl 50mM麥黃酮和10mMEDTA，pH 8.0的內(nèi)切蛋白酶Lys-C并在N2存在的條件下37℃消化24小時(shí)。
使用溶劑A0.1％TFA的水溶液和溶劑B溶于乙腈的0.1％TFA經(jīng)過在VYDAC C18柱(0.46×15cm；10μm；The SeparationsGroup；California)上進(jìn)行反相HPLC分離所得的多肽。在使用脈沖液體快速循環(huán)在Applied Biosystems 476A測(cè)序儀上測(cè)序前使用相同的溶劑系統(tǒng)在Develosil C18柱(0.46×10cm；3μM；Dr.OleSchou，Novo Nordisk，Denmark)上對(duì)選擇的肽進(jìn)行再次色譜。
來自真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis的酶的氨基酸序列資料在下面，特別是以SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2顯示。
SEQ.ID.No.1具有殘基數(shù)1088氨基酸組成(包括信號(hào)序列)＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝61 Ala 15 Cys 19 His 34 Met 78 Thr51 Arg 42 Gln 43 Ile 53 Phe 24 Trp88 Asn 53 Glu 63 Leu 51 Pro 58 Tyr79 Asp 100 Gly 37 Lys 62 Ser 77 ValSEQ.ID.No.2具有殘基數(shù)1091氨基酸組成(包括信號(hào)序列)＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝58 Ala 16 Cys 14 His 34 Met 68 Thr57 Arg 40 Gln 44 Ile 56 Phe 23 Trp84 Asn 47 Glu 69 Leu 51 Pro 61 Tyr81 Asp 102 Gly 50 Lys 60 Ser 76 ValA.3.2.N-末端分析研究表明天然葡聚糖裂解酶1的N端序列被封閉?；旧习碙eGendre等(1993)[Purification of proteins and peptidesby SDS-PAGE；InMatsudaira，P.(ed.)A.practical guide toprotein and peptide purification for microsequencing，2 ndedition；Academic Press In c.，San Diego；pp.74-101]所述用無水TFA在40℃處理印跡到PVDF膜上的葡聚糖裂解酶30分鐘完成去封閉。得到的序列是TALSDKQTA，它與來自葡聚糖裂解酶1的克隆的序列(SEQ.ID.No.1上從51到59位置的序列)相匹配且表明葡聚糖裂解酶1的N-端殘基是N-乙酰蘇氨酸。SEQ.ID.No.1的序列位置1到50代表信號(hào)序列。
A.4.編碼真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis的α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因之DNA測(cè)序A.4.1.分子生物學(xué)方法按Saunders(1993)所述并進(jìn)行下列修改來分離DNA經(jīng)ELUTIP-d(Schleicher & Schuell)純化代替凝膠純化從DNA中去掉多糖(參考文獻(xiàn)Saunders，G.W.(1993)，Gel purification of redalgal genomic DNAAn inexpensive and rapid method for theisolation of PCR-friendly DNA。Journal of Phycology 29(2)251-254 and Scheleicher & SchuellELUTIP-d.Rapid Methodfor Purification and Concentration of DNA.)A.4.2 PCR有關(guān)DNA分子的制備經(jīng)過使用Gene Amp DNA擴(kuò)增試劑盒(PerkinElmer Cetus，USA)并根據(jù)廠家說明書進(jìn)行，除了Taq聚合酶在后來加入(見PCR循環(huán))且溫度循環(huán)變成如下
PCR循環(huán)循環(huán)次數(shù) ℃ 時(shí)間(分)1 98 560 5加入Taq聚合酶和油3594 147 272 31 72 20A.4.3 PCR片段的克隆按供應(yīng)者的說明書將PCR片段克隆進(jìn)pT 7 Blue(來自Novagen)。
A.4.4 DNA測(cè)序使用自動(dòng)閱讀測(cè)序試劑盒(Pharmacia)和Pharmacia LKB A.L.F.DNA測(cè)序儀，基本上根據(jù)Sanger等(1979)的雙脫氧方法測(cè)序雙鏈DNA。(參考文獻(xiàn)Sanger.F.，Nicklen，S.and Coulson，A.R.(1979)。DNA sequencing with chain-determinating inhibitors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463-5467.)。
序列如SEQ.ID.No.s1和2所示。簡(jiǎn)單地說SEQ.ID.No.3具有堿基總數(shù)3267DNA序列組成850A；761C；871G；785T。
SEQ.ID.No.4具有堿基總數(shù)3276DNA序列組成889A；702C；856G；829T。
A.4.5文庫(kù)的篩選按照廠家說明書對(duì)從Stratagene獲得的λ Zap文庫(kù)進(jìn)行篩選，除了預(yù)雜交和雜交在2×SSC，0.1％ SDS，10×Denhardt′s和100μg/ml變性魚精DNA中進(jìn)行。向雜交溶液中加入32P標(biāo)記的變性探針。在55℃進(jìn)行雜交過夜。濾膜在2×SSC，0.1％ SDS中洗兩次并在1×SSC，0.1％ SDS中洗兩次。
A.4.6探針經(jīng)過用合適的限制性酶消化從pT 7 blue載體中分離克隆的PCR片段。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳從載體中分離片段并以Agarase(Boehr ingerMannheim)從瓊脂糖中純化該片段。由于該片段僅90-240bp長(zhǎng)，在使用Prime-It隨機(jī)引物試劑盒(Stratagene)或Ready to Go DNA標(biāo)記試劑盒(Pharmacia)以32P-dCTP標(biāo)記前，對(duì)分離的片段進(jìn)行連接反應(yīng)。
A.4.7結(jié)果A.4.7.1編碼α-1，4-葡聚糖裂解酶的PCR DNA片段的產(chǎn)生來自α-1，4-葡聚糖裂解酶的三個(gè)重疊的胰酶肽氨基酸序列用于產(chǎn)生混合的寡核苷酸，它可用作PCR引物(見上面給出的序列)。
在第一次PCR擴(kuò)增中，引物A/B(見上面)用作上游引物，引物C(見上面)用作下游引物。預(yù)期PCR產(chǎn)物的大小為71個(gè)堿基對(duì)。
在第二次PCR擴(kuò)增中，引物A/B用作上游引物，E用作下游引物。預(yù)期PCR產(chǎn)物的大小是161個(gè)堿基對(duì)。
在第三次PCR擴(kuò)增中，引物F1(見上面)和F2(見上面)用作上游引物，E用作下游引物。預(yù)期PCR產(chǎn)物的大小為238個(gè)堿基對(duì)。
在2％LMT瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物并從凝膠上切下預(yù)期大小的片段，用Agarase(Boehringer Mannheim)處理，克隆進(jìn)pT 7blue載體(Novagen)中并測(cè)序。
從第一次和第二次PCR擴(kuò)增克隆的片段編碼與測(cè)序的肽相對(duì)應(yīng)的氨基酸(見上面)。第三次擴(kuò)增的克隆(見上面)與測(cè)序的肽僅具有大約87％的同源性。
A.4.7.2用克隆的PCR片段對(duì)基因組文庫(kù)的篩選用上述克隆進(jìn)行的文庫(kù)篩選產(chǎn)生2個(gè)克隆。一個(gè)克隆含SEQ.ID.No.4的核苷酸序列(基因2)。另一克隆含SEQ.ID.No.3的一些序列(從堿基對(duì)1065下游)(基因1)。
以RACE(cDNA末端的迅速擴(kuò)增)程序(Michael，A.F.，Michael，K.D. & Martin，G.R.(1988).Rroc.Natl.Acad.Sci.USA 858998-99002)使用Gibco BRL的5′race系統(tǒng)獲得SEQ.ID.No.3的5′端。根據(jù)Collinge等(Collinge，D.B.，Milligan D.E.，Dow，J.M.，Scofield，G. & Daniels，M.J.(1987).Plant Mol Biol 8405-414)的方法分離總RNA。根據(jù)廠商方案，使用1μg總RNA進(jìn)行5′race。根據(jù)廠商方案將第二次擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)pT 7 blue載體。測(cè)序3個(gè)獨(dú)立的PCR克隆以彌補(bǔ)PCR錯(cuò)誤。
使用下面的寡核苷酸作為上游引物GCTCTAGAGCATGTTTTCAACCCTTGCG，含序列GL 1(即SEQ.ID.No.3)bp 1573-1593的互補(bǔ)序列之引物用作下游引物再進(jìn)行PCR以便在上述克隆緊接ATG起始密碼子之前加入XbaI和NdeI限制性位點(diǎn)。
基因1(即SEQ.ID.No.3)的完整序列的產(chǎn)生經(jīng)過將該基因的3′端以來自基因組克隆的BamHI-HindIII片段克隆進(jìn)StratagenepBluescript II KS+載體中并將PCR產(chǎn)生的該基因的5′端以XbaI-BamHI片段克隆到3′端前來完成。
將基因2以HindIII鈍端片段克隆進(jìn)Stratagene pBluescriptII SK+載體EcoRV位點(diǎn)。經(jīng)SacI消化，接著重新連接去掉部分3′非翻譯序列。經(jīng)過用HindIII和Nar I消化并在下面退火寡核苷酸存在的條件下重新連接在緊靠起始ATG之前導(dǎo)入HindIII和HpaI限制性位點(diǎn)AGCTTGTTAACATGTATCCAACCCTCACCTTCGTGGACAATTGTACATAGGTTGGGAGTGGAAGCACCGC在測(cè)序的克隆中發(fā)現(xiàn)沒有內(nèi)含子。
將克隆1型(SEQ.ID.No.3)與所有10個(gè)肽序列進(jìn)行序列對(duì)比顯示出100％的相同性。從真菌感染的藻類Gracilariopsislemaneiformis分離的基因編碼的兩個(gè)蛋白質(zhì)序列的序列對(duì)比表現(xiàn)出大約78％的相同性，表明兩個(gè)基因都編碼α-1，4-葡聚糖裂解酶。
A.5GL基因在微生物中的表達(dá)(例如畢赤氏酵母屬裂解酶轉(zhuǎn)化子和曲霉屬裂解酶轉(zhuǎn)化子的分析)將編碼GL的DNA序列導(dǎo)入微生物以生產(chǎn)高比活及高產(chǎn)量的酶。
關(guān)于這點(diǎn)，將基因1(即SEQ.ID.No.3)以NotI-HindIII鈍端片段(使用Amersham International DNA鈍端試劑盒)克隆進(jìn)用EcoRI消化且鈍端化(使用Amersham International DNA鈍端試劑盒)的畢赤氏酵母表達(dá)載體pHIL-D 2(含AOX 1啟動(dòng)子)中以便在巴斯德畢赤氏酵母中表達(dá)(根據(jù)Invitrogen提供的畢赤氏酵母表達(dá)試劑盒中記載的方案)。
在另一實(shí)施方案中，將基因1(即SEQ.ID.No.3)以NotI-HindIII鈍端片段(使用Amersham International DNA鈍端試劑盒)克隆進(jìn)用SmaI消化的曲霉屬表達(dá)載體pBARMTE 1(含Neuroperacrassa的甲基色氨酸抗性啟動(dòng)子)中以便在黑色曲霉中表達(dá)(Pallet al(1993)Fungal Genet Newslett.Vol 40 Pages.59-62)。根據(jù)Daboussi等(Curr Genet(1989)Vol 15 pp453-456)的方法使用融胞酶Sigma L-2773和融胞酶Sigma L-8012制備原生質(zhì)體。原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化按照Buxton等(Gene(1985)Vol 37 pp207-214)記載的方案進(jìn)行，除了在涂布轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體時(shí)按照Punt等(Methodsin Enzymology(1992)Vol 216 pp447-457)闡述的方案但使用0.6％滲壓穩(wěn)定的頂級(jí)瓊脂糖。
結(jié)果表明在轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤氏酵母和黑色曲霉中觀察到了裂解酶活性。
A.5.1.一般方法無細(xì)胞提取物的制備以9000rpm離心5分鐘收獲細(xì)胞，用0.9％NaCl洗滌并重懸于破碎緩沖液(50mM磷酸鉀，pH 7.5，含1mM EDTA，和5％甘油)中。使用玻璃珠和Vortex處理破碎細(xì)胞。破碎緩沖液含1mM PMSF(蛋白酶抑制劑)。以9000rpm離心5分鐘后再以20,000×g離心5分鐘獲得裂解酶提取物(上清液)。
以堿性3，5-二硝基水楊酸試劑(DNS)試驗(yàn)裂解酶的活性。
將1體積的裂解酶提取物與等體積的4％支鏈淀粉溶液混合。然后在控制的溫度下保溫反應(yīng)混合物，以特定的間隔取樣并分析AF。
還使用放射活性方法分析了裂解酶活性。
反應(yīng)混合物含10μl14C-淀粉溶液(1μCi；Sigma ChemicalsCo.)和10μl裂解酶提取物。反應(yīng)混合物在25℃靜置過夜，然后在通常的TLC系統(tǒng)中分析。使用Instant Imager(Pachard InstrumentCo.，Inc，Meriden，CT)檢測(cè)產(chǎn)生的放射活性AF。
電泳和Western印跡。
使用8-25％梯度凝膠和PhastSystem(Pharmacia)進(jìn)行SDS-PAGE。還在PhastSystem半干燥轉(zhuǎn)移單位上進(jìn)行Western印跡。
產(chǎn)生的抗從青島(中國(guó))收集的紅海藻中純化的裂解酶之第一抗體以1∶100稀釋使用。與堿性磷酸酶連接的豬抗兔IgG(Dako A/S，Glostrup，Denmark)用作第二抗體并以1∶1000稀釋使用。
I部分含上述構(gòu)建體的畢赤氏酵母屬轉(zhuǎn)化子的分析結(jié)果1.培養(yǎng)5天后測(cè)定裂解酶活性(根據(jù)手冊(cè))并證明B系列的所有樣品中的活性在細(xì)胞內(nèi)。
B系列樣品11 12 13 15 26 27 28 29 30比活性 139 81 122 192 151 253 199 198 150*比活定義為在含2％(w/v)糖原，1％(w/v)甘油，溶于10mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.5)的反應(yīng)混合物中每mg蛋白質(zhì)每分鐘釋放的AF nmol值。反應(yīng)溫度為45℃；反應(yīng)時(shí)間為60分鐘。
樣品B 27的時(shí)間過程如下。圖1中也提供了該數(shù)據(jù)。
時(shí)間(分)0 10 20 30 40 50 60比活性 0 18 54 90 147 179 253試驗(yàn)條件同上，除了時(shí)間進(jìn)行變動(dòng)。
2.Western-印跡分析。
全部樣品的CFE顯示出具有與天然裂解酶相對(duì)應(yīng)的分子量的帶型。
在巴斯德畢赤氏酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的MC-裂解酶培養(yǎng)物名稱 比活性*A1810A2032A218A228A246II部分，曲霉屬轉(zhuǎn)化子結(jié)果I.培養(yǎng)5天后測(cè)定裂解酶活性(基礎(chǔ)培養(yǎng)基含0.2％酪蛋白酶促水解產(chǎn)物)，以堿基3，5-二硝基水楊酸試劑分析。
1)培養(yǎng)基的裂解酶活性分析在生長(zhǎng)于含0.2％支鏈淀粉的培養(yǎng)基中的35個(gè)培養(yǎng)物中。5.4+和5.9+的培養(yǎng)基中分別含0.13g AF/升和0.44g/升。結(jié)果表明從細(xì)胞中分泌了活性裂解酶。在無細(xì)胞提取物中也可測(cè)量出裂解酶活性。
2)無細(xì)胞提取物中的裂解酶活性分析。
培養(yǎng)物名稱 比活性*5.4+ 515.9+ 1485.13 995.15 255.19 37*比活性定義為在25℃時(shí)每mg蛋白質(zhì)每分鐘產(chǎn)生的AF nmol數(shù)。
+表示加入0.2％的支鏈淀粉。
結(jié)果表明GL的基因1在黑色曲霉細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
用轉(zhuǎn)化的E.coli進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(使用Qiagen的Qia表達(dá)載體試劑盒中的克隆載體pQE30)顯示了酶的表達(dá)，該酶可被抗從真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis純化的酶的抗體識(shí)別。
B.來源＝真菌B.1.來自真菌Morchella costata的α-1，4-葡聚糖裂解酶的酶純化和表征B.1.1.材料和方法真菌Morchella costata從美國(guó)典型培養(yǎng)物收集中心(ATCC)獲得。使用ATCC推薦的培養(yǎng)基在搖床中25℃生長(zhǎng)真菌。經(jīng)過濾收獲菌絲并用0.9％NaCl洗滌。
經(jīng)過勻漿并隨后在50mM檸檬酸-NaOH pH 6.2(緩沖液A)中在冰上聲處理6×3分鐘破碎真菌細(xì)胞。經(jīng)過以25,000×g離心40分鐘去掉細(xì)胞碎片。在該程序中獲得的上清液當(dāng)作無細(xì)胞提取物，在8-25％梯度凝膠上分離后用于活性染色和Western印跡。
B.1.2.在β-環(huán)糊精Sepharose凝膠分離將無細(xì)胞提取物直接上樣到預(yù)先用緩沖液A平衡的β-環(huán)糊精Sepharose凝膠4B柱(2.6×18cm)上。用3體積的緩沖液A和2體積含1M NaCl的緩沖液A洗柱。用含2％糊精的緩沖液A洗脫α-1，4-葡聚糖裂解酶。匯集活性組分并將緩沖液換成20mM雙-tris丙烷-HCl(pH 7.0，緩沖液B)。
將活性餾分上樣到預(yù)先用緩沖液B平衡的Mono Q HR 5/5柱上。用緩沖液B以0.3M NaCl的線型梯度洗脫真菌裂解酶。作為選擇，可將β-環(huán)糊精Sepharose色譜后獲得的裂解酶制品濃縮到150μl并上樣到Sepharose 12柱上，在FPLC條件下操作。
B.1.3.α-1，4-葡聚糖裂解酶活性試驗(yàn)和測(cè)定底物特異性，pH和溫度最適值的條件試驗(yàn)α-1，4-葡聚糖裂解酶活性的反應(yīng)混合物含10mg/ml支鏈淀粉和25mM Mes-NaOH(pH 6.0)。
反應(yīng)在30℃進(jìn)行30分鐘并經(jīng)過加入3，5-二硝基水楊酸試劑終止反應(yīng)。室溫靜置10分鐘后在550nm處測(cè)定密度。當(dāng)使用無細(xì)胞提取物時(shí)向試驗(yàn)混合物中加入10mM EDTA。
試驗(yàn)混合物中的底物支鏈淀粉可用其它底物取代，反應(yīng)溫度可按說明書中的限定進(jìn)行變動(dòng)。
在pH最適值研究中，反應(yīng)混合物含以10mg/ml溶于40mM緩沖液中的支鏈淀粉或麥芽四糖。所用的緩沖液是甘氨酸-NaOH(pH 2.0-3.5)，HoAc-NaoAc(pH 3.5-5.5)，Mes-NaOH(pH 5.5-6.7)，Mops-NaOH(6.0-8.0)和N-二(羥乙基)甘氨酸-NaOH(7.6-9.0)。反應(yīng)在30℃進(jìn)行30分鐘。在溫度最適值研究中，反應(yīng)條件與上面相同，除了在所有實(shí)驗(yàn)中均使用緩沖液Mops-NaOH(pH 6.0)。反應(yīng)溫度如說明書所示進(jìn)行變動(dòng)。
分別使用8-25％梯度凝膠和pH梯度為3-9的凝膠在PhastSystem(Pharmacia，Sweden)上進(jìn)行SDS-PAGE，天然-PAGE和等電聚焦。電泳后，根據(jù)廠家(Pharmacia)推薦的程序以銀染染色凝膠。糖蛋白被適于PhastSystem的PAS染色。為進(jìn)行活性染色，在自然條件下6℃進(jìn)行電泳。
電泳后，在1％可溶性淀粉存在的條件下30℃將凝膠保溫過夜。經(jīng)過用I2/KI溶液染色顯示真菌裂解酶的活性帶。
B.1.4.結(jié)果B.1.4.1.α-1，4-葡聚糖裂解酶的純化，分子量和等電點(diǎn)。
發(fā)現(xiàn)真菌裂解酶吸附到用β-環(huán)糊精Sepharose，淀粉和RedSepharose填充的柱子上。以β-環(huán)糊精Sepharose 4B凝膠和淀粉填充的柱用于純化目的。
以該步驟獲得的裂解酶制品僅含微量分子量高于真菌裂解酶的污染蛋白質(zhì)?？山?jīng)過在Mono Q HR 5/5上進(jìn)行離子交換色譜或更高效地經(jīng)過在Superose 12上凝膠過濾去掉雜質(zhì)。
純化酶表現(xiàn)為無色且在可見光區(qū)不顯示光吸收。在SDS-PAGE上估測(cè)時(shí)測(cè)定的分子量是110kDa。
經(jīng)過在具有pH梯度為3-9的凝膠上等電聚焦測(cè)定時(shí)純化的真菌裂解酶顯示出等電點(diǎn)為pI 5.4。在自然凝膠電泳中，酶表現(xiàn)為一條單一的帶。經(jīng)活性染色檢測(cè)時(shí)，該帶表現(xiàn)為淀粉降解活性。根據(jù)從中提取酶的培養(yǎng)物的時(shí)間，該酶在自然和等電聚焦凝膠中顯示出要么是一條清晰的帶，要么是具有相同遷移率和pI的更分散的帶。
B.1.4.2.真菌裂解酶催化反應(yīng)的pH和溫度最適值發(fā)現(xiàn)真菌裂解酶催化反應(yīng)的pH最適值的pH范圍在pH 5到pH 7之間。
B.1.4.3.底物特異性純化的真菌裂解酶降解從麥芽糖到第七糖的麥芽糖類。然而，降解率不同。對(duì)麥芽四糖具有最高活性(活性為100％)，接著是麥芽六糖(97％)，麥芽七糖(76％)，麥芽三糖(56％)，對(duì)麥芽糖觀察到最低活性(2％)。
真菌裂解酶也降解支鏈淀粉，直鏈淀粉和糖原(將測(cè)定基％)。真菌裂解酶是外切裂解酶而不是內(nèi)切裂解酶，因?yàn)樗到鈱?duì)硝基苯基α-D-麥芽七糖但不降低還原端封閉的對(duì)硝基苯基α-D-麥芽七糖。
B.1.5.普通羊肚菌用于普通羊肚菌α-1，4-葡聚糖裂解酶的酶純化和鑒定的方案與上面用于Morchella costata的方案相同(結(jié)果相似)。
B.2.真菌α-1，4-葡聚糖裂解酶的氨基酸測(cè)序B.2.1.裂解酶的氨基酸測(cè)序用溶組織梭狀芽孢桿菌內(nèi)切蛋白酶Arg-C或Lysobacterenzymogenes內(nèi)切蛋白酶Lys-C(兩者都是測(cè)序級(jí)，購(gòu)自Boehr ingerMannheim，德國(guó))消化裂解酶。為了用內(nèi)切蛋白酶Arg-C進(jìn)行消化，將凍干的裂解酶(0.1mg)溶于50μl 10M尿素，50mM甲胺，0.1MTris-HCl，pH 7.6中。用N2覆蓋并加入10μl 50mM DTT和5mMEDTA后，變性蛋白質(zhì)并在N2條件下50℃還原10分鐘。隨后加入溶于10μl 50mM Tris-HCl，pH 8.0中的1μg內(nèi)切蛋白酶Arg-C并在37℃進(jìn)行消化6小時(shí)。為了隨后的半胱氨酸誘導(dǎo)，加入12.5μl100mM碘乙酰胺并將溶液在N2條件下黑暗中室溫保溫15分鐘。
為了用內(nèi)切蛋白酶Lys-C消化，將凍干的裂解酶(0.1mg)溶于50μl 8M尿素，0.4M NH4HCO3，pH 8.4中。用N2覆蓋并加入5μl 45mM DTT后，變性蛋白質(zhì)并在N2條件下50℃還原15分鐘。冷卻到室溫后，加入5μl 100mM碘乙酰胺以便在N2條件下黑暗中室溫誘導(dǎo)半胱氨酸15分鐘。隨后加入90μl水和溶于50μl 50mM麥黃酮和10mM EDTA，pH 8.0中的5μg內(nèi)切蛋白酶Lys-C并在N2條件下37℃消化24小時(shí)。
使用溶劑A0.1％TFA水溶液和溶劑B0.1％TFA的乙腈溶液在VYDAC Cl8柱(0.46×15cm；10μm；The Separations Group；California)上以反相HPLC分離所得的肽。在使用脈沖液體快速循環(huán)在Applied Biosystems 476A測(cè)序儀上測(cè)序前使用相同的溶劑系統(tǒng)在Develosil C18柱(Q.46×10cm；3μm；Dr.Ole Schou，NovoNordisk，Denmark)上對(duì)選擇的肽進(jìn)行再次色譜。
來自真菌Morchella costata的酶的氨基酸序列資料如圖17所示。
來自真菌普通羊肚菌的酶的氨基酸序列資料如圖18所示。
B.3.編碼真菌α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因之DNA測(cè)序B.3.1.分子生物學(xué)方法按Dellaporte等(1983-Plant MolBiol Rep Vol 1 pp 19-21)所述分離DNA。
B.3.2.PCR經(jīng)過使用Gene Amp DNA擴(kuò)增試劑盒(Perkin Elmer Cetus，USA)并根據(jù)廠家說明書進(jìn)行有關(guān)DNA分子的制備，除了Taq聚合酶在后來加入(見PCR循環(huán))且將溫度循環(huán)改成如下
PCR循環(huán)循環(huán)次數(shù) C 時(shí)間(分)1 98 560 5加入Taq聚合酶和油35 94 147 272 31 72 20B.3.3 PCR片段的克隆按照提供者的說明將PCR片段克隆進(jìn)pT 7 Blue(來自Novagen)。
B.3.4 DNA測(cè)序基本上按照Sanger等(1977)的雙脫氧方法，使用自動(dòng)閱讀測(cè)序試劑盒(Pharmacia)和Pharmacia LKB A.L.F.DNA測(cè)序儀測(cè)序雙鏈DNA。(參考文獻(xiàn)Sanger.F.，Nicklen，S.and Coulson，A.R.(1979)。DNA sequencing with chain-determinatinginhibitors。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463-5467)。
B.3.5文庫(kù)的篩選根據(jù)廠家說明書對(duì)從Stratagene獲得的λZap文庫(kù)進(jìn)行篩選，除了預(yù)雜交和雜交在2×SSC，0.1％SDS，10×Denhardt′s和100μg/ml變性魚精DNA中進(jìn)行。
向雜交溶液中加入32P標(biāo)記的變性探針。在55℃進(jìn)行雜交過夜。濾膜在2×SSC，0.1％SDS中洗兩次，在1×SSC，0.1％SDS中洗兩次。
B.3.6探針經(jīng)過用合適的限制性酶消化從pT 7 blue載體中分離克隆的PCR片段。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳從載體中分離片段并以Agarase(BoehringerMannheim)從瓊脂糖中純化該片段。由于該片段僅90-240bp長(zhǎng)，在使用32P-dCTP，使用Prime-It隨機(jī)引物試劑盒(Stratagene)或Ready to Go DNA標(biāo)記試劑盒(Pharmacia)標(biāo)記前，對(duì)分離的片段進(jìn)行連接反應(yīng)。
B.3.7.結(jié)果B.3.7.1.編碼α-1，4-葡聚糖裂解酶的PCR DNA片段的產(chǎn)生。
α-1，4-葡聚糖裂解酶的3個(gè)重迭的胰酶肽的氨基酸序列(如下面所示)用于產(chǎn)生混合的寡核苷酸，它用作從MC和MV分離的DNA之?dāng)U增的PCR引物。
Lys Asn Leu His Pro Gln His Lys Met Leu Lys Asp Thr Val Leu Asp Ile Val LysPro Gly His Gly Glu Tyr Val Gly Trp Gly Glu Met Gly Gly Ile Gln Phe Met LysGlu Pro Thr Phe Met Asn Tyr Phe Asn Phe Asp Asn Met Gln Tyr Gln Gln Val TyrAla Gln Gly Ala Leu Asp Ser Arg Glu Pro Leu Tyr His Ser Asp Pro Phe Tyr在第一次PCR擴(kuò)增中，引物A1/A2(見下面)用作上游引物，引物B1/B2(見下面)用作下游引物。
引物A1CA(GA)CA(CT)AA(GA)ATGCT(GATC)AA(GA)GA(CT)AC引物A2CA(GA)CA(CT)AA(GA)ATGTT(GA)AA(GA)GA(CT)AC引物B1TA(GA)AA(GATC)GG(GA)TC(GA)CT(GA)TG(GA)TA引物B2TA(GA)AA(GATC)GG(GA)TC(GATC)GA(GA)TG(GA)TA在2％LMT瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物，從凝膠上切下預(yù)期大小的片段并用Agarase(Boehringer Mannheim)處理，克隆進(jìn)pT 7 blue載體(Novagen)中并測(cè)序。
從PCR擴(kuò)增克隆的片段編碼與測(cè)序的肽(見上面)相對(duì)應(yīng)的氨基酸并在每個(gè)例子中增加了2個(gè)內(nèi)含子序列。對(duì)于MC，PCR擴(kuò)增的DNA序列與參照?qǐng)D14從位置1202到位置1522所示的序列相對(duì)應(yīng)。對(duì)于MV，PCR擴(kuò)增的DNA序列與參照?qǐng)D15中從位置1218到位置1535所示的序列相對(duì)應(yīng)。
B.3.7.2用克隆的PCR片段對(duì)基因組文庫(kù)進(jìn)行篩選。
對(duì)于每種來源，用上述克隆對(duì)文庫(kù)的篩選產(chǎn)生2個(gè)克隆。對(duì)于MC，兩個(gè)克隆接合形成圖14所示的序列(見下面)。對(duì)于MV，以上面描述的方式可結(jié)合兩個(gè)克隆形成圖15所示的序列。
為了在MC克隆中緊接ATG起始密碼子之前加入PstI，Pvu II，AscI和NcoI限制性位點(diǎn)，使用下面的寡核苷酸作為上游引物AAACTGCAGCTGGCGCGCCATGGCAGGATTTTCTGAT含圖4 bp 1297-1318的互補(bǔ)序列的引物作為下游引物再進(jìn)行一次PCR。
經(jīng)過將基因5′端以來自基因組克隆之一(第一克隆)的Bgl II-EcoRI片段克隆進(jìn)Stratagene pBluescript II KS+載體的BamHI-EcoRI位點(diǎn)產(chǎn)生MC的完整序列。用EcoRI和EcoRV消化修飾的pBluescript II KS+載體后經(jīng)過連接來自另一基因組克隆(第二克隆)的NspV(已鈍端化，使用Amersham Internatiornal DNA鈍端試劑盒)-EcoRI片段將該基因的3′端克隆進(jìn)修飾的pBluescript IIKS+載體中。然后，將該基因的中間部分片段以來自第一克隆的EcoRI片段的形式克隆進(jìn)進(jìn)一步修飾的pBluescript II KS+載體中，這經(jīng)過將該片段連接到用EcoRI消化的進(jìn)一步修飾的pBluescript IIKS+載體中實(shí)現(xiàn)。
B.4.GL基因在微生物中的表達(dá)可將編碼GL的DNA序列導(dǎo)入微生物中以便生產(chǎn)高比活和高產(chǎn)量的該酶。
關(guān)于這點(diǎn)，將MC基因(圖14)以XbaI-XhoI鈍端化(使用Amersham International DNA鈍端試劑盒)片段克隆進(jìn)用EcoRI消化且鈍端化(使用Amersham International的DNA鈍端試劑盒)的畢赤氏酵母屬表達(dá)載體pHIL-D2(含AOX1啟動(dòng)子)中以便在巴斯德 畢赤氏酵母中表達(dá)(根據(jù)Invitrogen提供的畢赤氏酵母屬表達(dá)試劑盒中記載的方案)。
在另一實(shí)施方案中，將MC基因1(與圖14相同，除了按上述經(jīng)PCR導(dǎo)入限制性位點(diǎn)進(jìn)行修飾)以Pvu II-XhoI鈍端化片段(使用Amersham International DNA鈍端試劑盒)克隆進(jìn)用SmaI消化的曲霉屬表達(dá)載體pBARMTE1(含來自Neuropera crassa的甲基色氨酸抗性啟動(dòng)子)中以便在黑色曲霉中表達(dá)(Pallet al(1993)FungalGenet Newslett.Vol 40 pages 59-62)。根據(jù)Daboussi等(CurrGenet(1989)Vol 15 pp453-456)使用溶胞酶Sigma L-2773和溶胞酶Sigma L-8012制備原生質(zhì)體。接著根據(jù)Buxton等(Gene(1985)Vol 37 pp207-214)記載的方案進(jìn)行原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，除了涂布轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體按照Punt等(Methods in Enzymology(1992)Vol 216 pp447-457)闡述的方案進(jìn)行但使用0.6％等滲穩(wěn)定的頂級(jí)瓊脂糖。
結(jié)果表明在轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤氏酵母和黑色曲霉中觀察到裂解酶活性。
畢赤氏酵母屬裂解酶轉(zhuǎn)化子和曲霉屬裂解酶轉(zhuǎn)化子的分析一般方法無細(xì)胞提取物的制備以9000rpm離心5分鐘收獲細(xì)胞，用0.9％ NaCl洗滌并重懸于破碎緩沖液(50mM磷酸鉀，pH 7.5，含1mM EDTA和5％甘油)中。使用玻璃珠和vortex處理破碎細(xì)胞。破碎緩沖液含1mM PMSF(蛋白酶抑制劑)。以9000rpm離心5分鐘，接著以20,000×g離心5分鐘獲得裂解酶提取物(上清液)。
以堿性3，5-二硝基水楊酸試劑(DNS)試驗(yàn)裂解酶活性。
將1體積的裂解酶提取物與等體積4％支鏈淀粉溶液混合。然后在控制的溫度下保溫反應(yīng)混合物，以限定的時(shí)間間隔取樣并分析AF。
也使用放射活性方法分析了裂解酶活性。
反應(yīng)混合物含10μl14C-淀粉溶液(1μCi；Sigma ChemicalsCo.)和10μl裂解酶提取物。反應(yīng)混合物在25℃靜置過夜，然后在通常的TLC系統(tǒng)中分析。使用Instant Imager(Pachard InstrumentCo.，Inc.，Meriden，CT)檢測(cè)產(chǎn)生的放射活性AF。
電泳和Western印跡使用8-25％梯度凝膠和PhastSystem(Pharmacia)進(jìn)行SDS-PAGE。也在PhastSystem的半干燥轉(zhuǎn)移單位上進(jìn)行了Western印跡。產(chǎn)生的抗從青島(中國(guó))收集的紅海藻中純化的裂解酶之第一抗體以1∶100稀釋使用。與堿性磷酸酶連接的豬抗兔IgG(Dako A/S，Glostrup，Denmark)用作第二抗體并以1∶1000稀釋使用。
I部分，含上述構(gòu)建體的畢赤氏酵母屬轉(zhuǎn)化子的分析在巴斯德畢赤氏酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的MC-裂解酶培養(yǎng)物名稱 比活性*A18 10A20 32A21 8A22 8A24 6*比活性定義為在25℃下每mg蛋白質(zhì)每分鐘產(chǎn)生的AF nmol值。
II部分曲霉屬轉(zhuǎn)化子結(jié)果I.培養(yǎng)5天后(含0.2％酪蛋白酶促水解產(chǎn)物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基)以堿性3，5-二硝基水楊酸試劑分析來測(cè)定裂解酶活性無細(xì)胞提取物中的裂解酶活性分析
培養(yǎng)物名稱比活性*8.13 118.16 5388.19 37*比活性定義為在25℃下每mg蛋白質(zhì)每分鐘產(chǎn)生的AF nmol值。
結(jié)果表明在黑色曲霉細(xì)胞內(nèi)表達(dá)MC-裂解酶。II，以放射活性方法試驗(yàn)裂解酶活性下列培養(yǎng)物的無細(xì)胞提取物含14C標(biāo)記的AF。51+，54+，55+，59+，512，513，514，515，516，518，519。
使用14C-淀粉作底物的α-1，4-葡聚糖裂解酶反應(yīng)之降解產(chǎn)物的TLC如圖20所示。將反應(yīng)混合物上樣到TLC上。泳道號(hào)與培養(yǎng)物名稱相對(duì)應(yīng)1，512；2，513；3，514；4，515；5，516；6，517；7，518；8，519；9，520?？焖僖苿?dòng)點(diǎn)是AF。
C.來源＝藻類本身用于酶純化和從Gracilariopsis lemaneiformis(從Santa Cruz獲得)獲得的α-1，4-葡聚糖裂解酶的鑒定之方案基本上與上面所述的方案(例如，用于Morchella costata的方案)相同(結(jié)果相似)。
1.從加利福利亞收集的無寄生物的紅海藻Gracilariopsislemaneiformis的α-1，4-葡聚糖裂解酶的鑒定裂解酶的氨基酸組成在下表中給出氨基酸殘基 每種殘基的mol％Asx15.42Thr5.24Ser6.85Glx9.46Pro5.46Gly9.08Ala5.381/2Cys 1.57Val6.60Met2.90Ile3.66Leu6.00Tyr6.00Phe4.37His1.65Lys4.44Arg4.17Trp1.75總計(jì) 100.002.序列分析比較來自加利福利亞藻類的肽序列與來自中國(guó)真菌感染的藻類的氨基酸序列表明兩蛋白質(zhì)序列之間顯示出高度同源性(從PCR片段產(chǎn)生的氨基酸序列與中國(guó)藻類GL的相應(yīng)序列之間有78％到80％的相同性)。
從加利福利亞藻類的兩個(gè)序列產(chǎn)生了3個(gè)寡核苷酸以產(chǎn)生大約970bp的PCR片段。
引物1ATGAC(GATC)AA(CT)TA(CT)AA(CT)TA(T)GA(CT)AA引物2(AG)TG(GATC)GGCATCAT(GATC)GC(GATC)GG(GATC)AC引物3GTCAT(GA)TC(CT)TGCCA(GATC)AC(GA)AA(GA)TC在第一次PCR擴(kuò)增中引物1用作上游引物，引物2用作下游引物。在第二次PCR擴(kuò)增中，引物1用作上游引物，引物3用作下游引物。產(chǎn)生了一個(gè)預(yù)期大小的PCR片段并將它克隆進(jìn)Novagen pT 7 blue載體中。測(cè)序了含PCR片段的3個(gè)獨(dú)立的質(zhì)粒，可見這三個(gè)克隆的PCR片段含來自3個(gè)不同蛋白質(zhì)的肽序列的密碼子。這表明在加利福利亞藻類中至少有3種不同的編碼α-1，4-葡聚糖裂解酶的基因。
3.在達(dá)到最大速度一半時(shí)的底濃度對(duì)支鏈淀粉是3.76mg/ml，對(duì)糖原是3.37mg/ml。
4.下面給出了裂解酶對(duì)各種底物的降解率底物釋放的AF(nmol)麥芽糖 657麥芽三糖654麥芽四糖670麥芽五糖674麥芽六糖826麥芽七糖865糊精20 775糊精15 775糊精10 844支鏈淀粉732糖原592反應(yīng)條件反應(yīng)混合物含10mM HOAc-NaOAc(pH 3.8)。底物濃度是10mg/ml。加入裂解酶和水后的終體積是100μl。在45℃下的反應(yīng)時(shí)間為40分鐘。
裂解酶不能降解出芽短梗孢糖，黑曲霉四糖，海藻糖，異麥芽糖，葡萄糖，α-，β-和γ-環(huán)糊精。裂解酶降解6-α-葡糖基麥芽糖和nigerose，盡管其降解速率緩慢。
5.當(dāng)使用支鏈淀粉作底物時(shí)裂解酶的溫度最適值為48℃，當(dāng)使用糖原作底物時(shí)為50℃。在50℃時(shí)，糖原反應(yīng)性與支鏈淀粉相似；在50℃以下，支鏈淀粉是比糖原更好的底物。
6.裂解酶的pH最適值范圍在pH 3.5和pH 7.0之間；最適pH為3.8。在pH試驗(yàn)中所用的緩沖液是甘氨酸-HCl(pH 2.2-3.6)；NaOAc-HOAc(pH 3.5-5.5)；Mes-NaOH(pH 5.5-6.7)；Mops-NaOH(pH 6.0-8.0)和N-二(羥乙基)甘氨酸-NaOH(pH 7.6-9.0)。所用的全部緩沖液是40mM。
7.終濃度為2 mM時(shí)，對(duì)氯汞苯甲酸(PCMB)抑制96％的裂解酶活性，表明-SH基團(tuán)對(duì)酶活性是必需的。
7.進(jìn)一步的研究7.1醇類在增加從真菌感染的藻類中純化的裂解酶活性和穩(wěn)定性中的影響。
以下面濃度(0％，1％，5％和10％)試驗(yàn)了1-丙醇，2-丙醇和1-丁醇。1-丙醇的最佳濃度為5％，保溫6天后可增加34％的AF產(chǎn)率；2-丙醇的最佳濃度1％，保溫10天后可增加20％的AF產(chǎn)率；1-丁醇的最佳濃度5％，保溫3天后增加52％的AF產(chǎn)率。
以下列濃度(0，1，3，5，7，9，11，13，15％)試驗(yàn)了乙醇。保溫7天后的最佳濃度為5％，它能增加12％的AF產(chǎn)率。對(duì)于10天保溫，最佳濃度為3％，它能增加16％的AF產(chǎn)率。
1-丙醇的影響1-丙醇濃度 反應(yīng)時(shí)間(天)(v/v) 0 1 36 10AF產(chǎn)量(μmol)0％0 84 261 4516891％0 80 280 5308035％0 115 367 60585310％ 0 107 307 4565837.2.不同反應(yīng)介質(zhì)對(duì)真菌感染的藻類純化的裂解酶和M.costata及普通羊肚菌的真菌裂解酶產(chǎn)生AF的影響。
2.1.來自真菌感染的藻類的裂解酶結(jié)果(見下表)表明最佳反應(yīng)介質(zhì)是5 mM的HOAc-NaOAc(pH 3.9)(BACE for short)和含mM濃度的Na2-EDTA。使用純水或0.85％ NaCl作反應(yīng)介質(zhì)的AF生產(chǎn)減小了產(chǎn)率。在BACE中含有0.85％ NaCl時(shí)也減少AF產(chǎn)率。
反應(yīng)介質(zhì) 反應(yīng)時(shí)間(天)0 1 3 8AF產(chǎn)量(μmol)BACE 0 229498 575水 0 46 128 217NaCl(0.85％) 0 123239 249BACE+NaCl(0.85％)0 153281 3032.2.下列緩沖液Mes-NaOH，Mops-NaOH，Hepes-NaOH，和N-二(羥乙基)甘氨酸-NaOH是M.costata和普通羊肚菌裂解酶的最適反應(yīng)介質(zhì)。在HOAc-NaOAc緩沖液中，裂解酶不穩(wěn)定，因此使用該緩沖系統(tǒng)引起AF產(chǎn)率減少。
7.3.內(nèi)切淀粉酶和脫支酶對(duì)AF生產(chǎn)的影響3.1.內(nèi)切淀粉酶的影響用于AF生產(chǎn)的淀粉可首先經(jīng)內(nèi)切淀粉酶或經(jīng)酸水解液化。
與天然淀粉相比，內(nèi)切淀粉酶降解的淀粉更適于作裂解酶的底物。在用于裂解酶催化的反應(yīng)的溫度下，淀粉具有有限的溶解力。用內(nèi)切淀粉酶處理淀粉導(dǎo)致葡萄糖產(chǎn)量增加。關(guān)于AF生產(chǎn)，發(fā)現(xiàn)還原物質(zhì)為大約10-15％(根據(jù)干物質(zhì))時(shí)最適于作為裂解酶底物，而用內(nèi)切淀粉酶進(jìn)一步處理成19％的還原物質(zhì)時(shí)不再適合于裂解酶。
3.2.支鏈淀粉酶和異淀粉酶的影響。
從下面結(jié)果可見，在pH 4.5和5.0時(shí)異淀粉酶和支鏈淀粉酶都增加AF產(chǎn)率達(dá)50％。反應(yīng)系統(tǒng)由加入或不加異淀粉酶或支鏈淀粉酶(MegaZyme Ltd.)的真菌感染的紅藻裂解酶組成。支鏈淀粉用作底物。在僅有裂解酶存在的條件下產(chǎn)生的AF表達(dá)為100％反應(yīng)介質(zhì)的pH加入的酶 3.5 4.5 5.0僅有裂解酶 100 100 100裂解酶+異淀粉酶 136 152 150裂解酶+支鏈淀粉酶132 158 155
4.真菌裂解酶對(duì)各種底物的有關(guān)降解率4.1.M.costata裂解酶用麥芽四糖觀察到的活性表達(dá)為100％。
底物濃度2mg/ml 4mg/ml 10mg/ml麥芽糖 0.5 1.62.2麥芽三糖40.6 58.6 56.0麥芽四糖100 100100麥芽五糖107.1100.1 99.7麥芽六糖86.6 98.2 95.9麥芽七糖82.2 81.5 75.7糊精10*-**- 68.3糊精15*-- 61.1糊精20*-- 46.6可溶性淀粉 -- 92.9支鏈淀粉-- 106.5糖原-- 128.5*數(shù)字表示還原物質(zhì)的干重含量。
**，未檢測(cè)到。
4.2.普通羊肚菌裂解酶用麥芽四糖觀察到的活性處理為100％。全部底物的終濃度為10mg ml-1。
底物 活性(％)麥芽糖10.1麥芽三糖 49.8麥芽四糖 100.0麥芽五糖 79.3麥芽六糖 92.4麥芽七糖 73.9糊精1062糊精1545糊精2037可溶淀粉 100.5支鏈淀粉 139.9糖原 183.3
來自M.costata和普通羊肚菌的裂解酶不能降解下列糖類。
對(duì)于海藻糖，6-α-葡糖基麥芽糖，nigerose，黑曲霉四糖，葡萄糖，異麥芽糖，α-，β-和γ-環(huán)糊精，出芽短梗孢糖和非還原端封閉的對(duì)硝基苯基α-D-麥芽七糖，將這些底物與真菌裂解酶保溫48小時(shí)后，在TLC板上檢測(cè)不到AF。
7.5.裂解酶催化反應(yīng)的pH和溫度最適值GL來源 最適pH 最適pH范圍 最適溫度M.costata 6.5 5.5-7.5 37℃；40℃a普通羊肚菌 6.4 5.9-7.6 43℃；48℃a真菌感染的Gracilariopsislemaneiformis 3.8 3.7-4.1 40℃；45℃aa使用糖原作底物測(cè)定的參數(shù)；使用支鏈淀粉作底物測(cè)定其它參數(shù)。
7.6.糖原對(duì)真菌感染的Gracilariopsis lemaneiformis的裂解酶的穩(wěn)定影響。
結(jié)果表明當(dāng)使用糖原作底物代替支鏈淀粉時(shí)，溫度越高，反應(yīng)率越高。
反應(yīng)溫度底物 25℃ 30℃ 45℃支鏈淀粉 0.818a1.133a1.171a糖原 0.592a0.904a1.861a糖原和支鏈淀粉之間相對(duì)反應(yīng)率的比率(％)72.4 79.8 158.9a，相對(duì)反應(yīng)率7.7.裂解酶的分子量和pI值使用SDS-PAGE在梯度凝膠(8-25％)上估測(cè)真菌感染的G.lemaneiformis裂解酶，明顯無真菌的G.lemaneiformis裂解酶的兩種形式，M.costata和普通羊肚菌裂解酶的分子量為110,000±10,000道爾頓。
真菌感染的G.lemaneiformis裂解酶的pI為大約3.9。對(duì)于普通羊肚菌裂解酶，pI為大約pH 4.6，M.costata裂解酶的pI為大約5.0。這些值經(jīng)過在具有pH梯度從3到9的凝膠上等電聚焦獲得。
從氨基酸組成推斷的pI值真菌感染的G.lemaneiformis裂解酶為4.58，M.costata裂解酶為6.30。
7.8.經(jīng)Western印跡對(duì)裂解酶進(jìn)行免疫學(xué)試驗(yàn)。
結(jié)果表明以Western印跡揭示了抗藻類裂解酶的抗體可識(shí)別無細(xì)胞提取物中和純化形式的真菌裂解酶?？箯闹袊?guó)收集的藻類的藻類裂解酶純化形式的抗體也識(shí)別從加利福利亞Sant Cruz收集的藻類的裂解酶。
GL來源 與抗真菌感染的G.lemaneiformisGL抗體的反應(yīng)性真菌感染的G.lemaneiformis強(qiáng)烈加利福利亞G.lemaneiformis的GL兩種形式 強(qiáng)烈M.costata中等普通羊肚菌 中等7.9.真菌裂解酶的可逆的和不可逆的抑制劑9.1.可逆的抑制劑，葡萄糖和麥芽糖。
當(dāng)使用支鏈淀粉作底物時(shí)，在10mg/ml的底物濃度下，當(dāng)存在0.1M葡萄糖時(shí)，M.costata裂解酶活性減小19.3％；當(dāng)使用糖原作底物時(shí)，活性不受影響。在0.1M麥芽糖存在的條件下對(duì)糖原和支鏈淀粉基活性分別減小48.8％和73.4％。
底物濃度 抑制劑葡萄糖麥芽糖支鏈淀粉1％(2％)19.3％(7％) 73.4％(67.2％)糖原1％(2％)0.000(-) 48.8％(49.7％)似乎0.1M葡萄糖的抑制是競(jìng)爭(zhēng)性的，因?yàn)殡S著底物從1％增加到2％，抑制從19.3％減小到7％，而0.1M麥芽糖的抑制是非競(jìng)爭(zhēng)性的，因?yàn)榈孜锏脑黾硬幻黠@影響抑制程度。
對(duì)于普通羊肚菌裂解酶，當(dāng)使用支鏈淀粉或糖原作底物時(shí)，0.1M葡萄糖和麥芽糖不抑制反應(yīng)。
底物 葡萄糖 麥芽糖支鏈淀粉(1％)28％80％糖原(1％)5％ 57％9.2.可逆的抑制劑deoxyjirimycin使用支鏈淀粉作底物，在最終底物濃度為2％時(shí)，25μMdeoxyjirimycin的存在使藻類裂解酶和M.costata裂解酶活性減小10.4％。在100μM時(shí)，兩種裂解酶的活性完全喪失。
9.3.不可逆抑制劑PCMB在相同的試驗(yàn)條件下，當(dāng)存在2 mM PCMB時(shí)，M.costata裂解酶活性減小60％，真菌感染的紅藻裂解酶減小98％。這意味著真菌裂解酶對(duì)重金屬抑制的敏感性小得多。
7.10.實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生產(chǎn)AF的實(shí)施例反應(yīng)器含1000g糊精(經(jīng)過用Termamyl將淀粉處理成最終還原物為10％獲得)，終體積為4.6升(HOAC-NaOAc，pH 3.9，含5mMNa2-EDTA)。經(jīng)過加入3mg從真菌感染的藻類純化的裂解酶。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行。在第19天，加入另一批裂解酶(4mg)。
反應(yīng)時(shí)間(天)01 7 13 19 24 31產(chǎn)生的AF(克)01811619526450066810.2.使用14C-淀粉產(chǎn)生14C-AF將不均勻標(biāo)記的14C-淀粉(340μCi，從Sigma獲得)真空干燥以去掉其包含的乙醇，然后溶于2ml水中。經(jīng)過加入20μl從真菌感染的藻類純化的裂解酶和20μl支鏈淀粉酶(MegaZyme Ltd.)起動(dòng)反應(yīng)。反應(yīng)在30℃下進(jìn)行過夜。在反應(yīng)中止時(shí)，使用截留分子量為10,000的濾膜過濾反應(yīng)混合物以去掉酶和未反應(yīng)的淀粉分子。
使用Waters HPLC在Ca2碳水化合物柱(Chrompack)上進(jìn)行過濾。使用水作洗脫液。流速為0.5ml/分。AF可有效地從葡萄糖和麥芽糖中分離出來。合并的AF餾分凍干，獲得總共140μCi14C-AF。
這些發(fā)現(xiàn)涉及本發(fā)明更進(jìn)一步的方面，稱為可增加反應(yīng)介質(zhì)(優(yōu)選醇類)疏水性的試劑在增強(qiáng)根據(jù)本發(fā)明的裂解酶的穩(wěn)定性和活性中的應(yīng)用。這種增強(qiáng)的穩(wěn)定性導(dǎo)致AF產(chǎn)率增加。
對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，不偏離本發(fā)明的范圍而對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的其它修改將是顯而易見的。
序列描述(1)一般資料(i)申請(qǐng)人(A)名稱DANISCO A/S(B)街道Langebrogade 1(C)城市哥本哈根(D)州哥本哈根K(E)國(guó)家丹麥(F)郵編(編碼)DK-1001(ii)發(fā)明題目酶的應(yīng)用(iii)序列數(shù)39(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型Floppy盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(v)當(dāng)前申請(qǐng)資料申請(qǐng)?zhí)朩O PCT/EP94/03397(2)SEQ ID NO1資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1088個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO1
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Met Met Pro His Lys Ile Gly Asp Asp Ile Asn Val Lys Pro Asp Gly610 615 620Asn Trp Pro Asn Ala Asp Asp Pro Ser Asn Gly Gln Tyr Asn Trp Lys625 630 635 640Thr Tyr His Pro Gln Val Leu Val Thr Asp Met Arg Tyr Glu Asn His645 650 655Gly Arg Glu Pro Met Val Thr Gln Arg Asn Ile His Ala Tyr Thr Leu660 665 670Cys Glu Ser Thr Arg Lys Glu Gly Ile Val Glu Asn Ala Asp Thr Leu675 680 685Thr Lys Phe Arg Arg Ser Tyr Ile Ile Ser Arg Gly Gly Tyr Ile Gly690 695 700Asn Gln His Phe Gly Gly Met Trp Val Gly Asp Asn Ser Thr Thr Ser705 710 715 720Asn Tyr Ile Gln Met Met Ile Ala Asn Asn Ile Asn Met Asn Met Ser725 730 735Cys Leu Pro Leu Val Gly Ser Asp Ile Gly Gly Phe Thr Ser Tyr Asp740 745 75oAsn Glu Asn Gln Arg Thr Pro Cys Thr Gly Asp Leu Met Val Arg Tyr755 760 765Val Gln Ala Gly Cys Leu Leu Pro Trp Phe Arg Asn His Tyr Asp Arg770 775 780Trp Ile Glu Ser Lys Asp His Gly Lys Asp Tyr Gln Glu Leu Tyr Met785 790 795 800Tyr Pro Asn Glu Met Asp Thr Leu Arg Lys Phe Val Glu Phe Arg Tyr805 810 815Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala Ala Phe820 825 830Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asn Asn Asp Ser Asn835 840 845Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu Gly Gly His Asp Gly850 855 860Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Ser Thr Glu Arg865 870 875 880Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln Trp Tyr Lys Phe Gly Pro Asp885 890 895Phe Asp Thr Lys Pro Leu Glu Gly Ala Met Asn Gly Gly Asp Arg Ile900 905 910
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(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO3ATGTTTTCAA CCCTTGCGTT TGTCGCACCT AGTGCGCTGG GAGCCAGTAC CTTCGTAGGG 60GCGGAGGTCA GGTCAAATGT TCGTATCCAT TCCGCTTTTC CAGCTGTGCA CACAGCTACT 120CGCAAAACCA ATCGCCTCAA TGTATCCATG ACCGCATTGT CCGACAAACA AACGGCTACT 180GCGGGTAGTA CAGACAATCC GGACGGTATC GACTACAAGA CCTACGATTA CGTCGGAGTA 240TGGGGTTTCA GCCCCCTCTC CAACACGAAC TGGTTTGCTG CCGGCTCTTC TACCCCGGGT 300GGCATCACTG ATTGGACGGC TACAATGAAT GTCAACTTCG ACCGTATCGA CAATCCGTCC 360ATCACTGTCC AGCATCCCGT TCAGGTTCAG GTCACGTCAT ACAACAACAA CAGCTACAGG 420GTTCGCTTCA ACCCTGATGG CCCTATTCGT GATGTGACTC GTGGGCCTAT CCTCAAGCAG 480CAACTAGATT GGATTCGAAC GCAGGAGCTG TCAGAGGGAT GTGATCCCGG AATGACTTTC 540ACATCAGAAG GTTTCTTGAC TTTTGAGACC AAGGATCTAA GCGTCATCAT CTACGGAAAT 600TTCAAGACCA GAGTTACGAG AAAGTCTGAC GGCAAGGTCA TCATGGAAAA TGATGAAGTT 660GGAACTGCAT CGTCCGGGAA CAAGTGCCGG GGATTGATGT TCGTTGATAG ATTATACGGT 720AACGCTATCG CTTCCGTCAA CAAGAACTTC CGCAACGACG CGGTCAAGCA GGAGGGATTC 780TATGGTGCAG GTGAAGTCAA CTGTAAGTAC CAGGACACCT ACATCTTAGA ACGCACTGGA 840ATCGCCATGA CAAATTACAA CTACGATAAC TTGAACTATA ACCAGTGGGA CCTTAGACCT 900CCGCATCATG ATGGTGCCCT CAACCCAGAC TATTATATTC CAATGTACTA CGCAGCACCT 960TGGTTGATCG TTAATGGATG CGCCGGTACT TCGGAGCAGT ACTCGTATGG ATGGTTCATG 1020GACAATGTCT CTCAATCTTA CATGAATACT GGAGATACTA CCTGGAATTC TGGACAAGAG 1080GACCTGGCAT ACATGGGCGC GCAGTATGGA CCATTTGACC AACATTTTGT TTACGGTGCT 1140GGGGGTGGGA TGGAATGTGT GGTCACAGCG TTCTCTCTTC TACAAGGCAA GGAGTTCGAG 1200AACCAAGTTC TCAACAAACG TTCAGTAATG CCTCCGAAAT ACGTCTTTGG TTTCTTCCAG 1260GGTGTTTTCG GGACTTCTTC CTTGTTGAGA GCGCATATGC CAGCAGGTGA GAACAACATC 1320TCAGTCGAAG AAATTGTAGA AGGTTATCAA AACAACAATT TCCCTTTCGA GGGGCTCGCT 1380
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Asn Ala Ser Glu Lys Lys Leu Ala Ile Glu Ser Trp Ala Leu Tyr Ser580 585 590Tyr Asn Leu His Lys Ala Thr Phe His Gly Leu Gly Arg Leu Glu Ser595 600 605Arg Lys Asn Lys Arg Asn Phe Ile Leu Gly Arg Gly Ser Tyr Ala Gly610 615 620Ala Tyr Arg Phe Ala Gly Leu Trp Thr Gly Asp Asn Ala Ser Thr Trp625 630 635 640Glu Phe Trp Lys Ile Ser Val Ser Gln Val Leu Ser Leu Gly Leu Asn645 650 655Gly Val Cys Ile Ala Gly Ser Asp Thr Gly Gly Phe Glu Pro Ala Arg660 665 670Thr Glu Ile Gly Glu Glu Lys Tyr Cys Ser Pro Glu Leu Leu Ile Arg675 680 685Trp Tyr Thr Gly Ser Phe Leu Leu Pro Trp Leu Arg Asn His Tyr Val690 695 700Lys Lys Asp Arg Lys Trp Phe Gln Glu Pro Tyr Ala Tyr Pro Lys His705 710 715 720Leu Glu Thr His Pro Glu Leu Ala Asp Gln Ala Trp Leu Tyr Lys Ser725 730 735Val Leu Glu Ile Cys Ara Tyr Trp Val Glu Leu Arg Tyr Ser Leu Ile740 745 750Gln Leu Leu Tyr Asp Cys Met Phe Gln Asn Val Val Asp Gly Met Pro755 760 765Leu Ala Arg Ser Met Leu Leu Thr Asp Thr Glu Asp Thr Thr Phe Phe770 775 780Asn Glu Ser Gln Lys Phe Leu Asp Asn Gln Tyr Met Ala Gly Asp Asp785 790 795 800Ile Leu Val Ala Pro Ile Leu His Ser Arg Asn Glu Val Pro Gly Glu805 810 815Asn Arg Asp Val Tyr Leu Pro Leu Phe His Thr Trp Tyr Pro Ser Asn820 825 830Leu Arg Pro Trp Asp Asp Gln Gly Val Ala Leu Gly Asn Pro Val Glu835 840 845Gly Gly Ser Val Ile Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Val Ala Pro Glu Asp850 855 860
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(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO7ATGGCAGGAT TTTCTGATCC TCTCAACTTT TGCAAAGCAG AAGACTACTA CAGTGTTGCG 60CTAGACTGGA AGGGCCCTCA AAAAATCATT GGAGTAGACA CTACTCCTCC AAAGAGCACC 120AAGTTCCCCA AAAACTGGCA TGGAGTGAAC TTGAGATTCG ATGATGGGAC TTTAGGTGTG 180GTTCAGTTCA TTAGGCCGTG CGTTTGGAGG GTTAGATACG ACCCTGGTTT CAAGACCTCT 240GACGAGTATG GTGATGAGAA TACGAGGACA ATTGTGCAAG ATTATATGAG TACTCTGAGT 300AATAAATTGG ATACTTATAG AGGTCTTACG TGGGAAACCA AGTGTGAGGA TTCGGGAGAT 360TTCTTTACCT TCTCATCCAA GGTCACCGCC GTTGAAAAAT CCGAGCGGAC CCGCAACAAG 420GTCGGCGATG GCCTCAGAAT TCACCTATGG AAAAGCCCTT TCCGCATCCA AGTAGTGCGC 480ACCTTGACCC CTTTGAAGGA TCCTTACCCC ATTCCAAATG TAGCCGCAGC CGAAGCCCGT 540GTGTCCGACA AGGTCGTTTG GCAAACGTCT CCCAAGACAT TCAGAAAGAA CCTGCATCCG 600CAACACAAGA TGCTAAAGGA TACAGTTCTT GACATTGTCA AACCTGGACA TGGCGAGTAT 660GTGGGGTGGG GAGAGATGGG AGGTATCCAG TTTATGAAGG AGCCAACATT CATGAACTAT 720TTTAACTTCG ACAATATGCA ATACCAGCAA GTCTATGCCC AAGGTGCTCT CGATTCTCGC 780GAGCCACTGT ACCACTCGGA TCCCTTCTAT CTTGATGTGA ACTCCAACCC GGAGCACAAG 840AATATCACGG CAACCTTTAT CGATAACTAC TCTCAAATTG CCATCGACTT TGGAAAGACC 900AACTCAGGCT ACATCAAGCT GGGAACCAGG TATGGTGGTA TCGATTGTTA CGGTATCAGT 960GCGGATACGG TCCCGGAAAT TGTACGACTT TATACAGGTC TTGTTGGACG TTCAAAGTTG 1020AAGCCCAGAT ATATTCTCGG GGCCCATCAA GCCTGTTATG GATACCAACA GGAAAGTGAC 1080TTGTATTCTG TGGTCCAGCA GTACCGTGAC TGTAAATTTC CACTTGACGG GATTCACGTC 1140GATGTCGATG TTCAGGACGG CTTCAGAACT TTCACCACCA ACCCACACAC TTTCCCTAAC 1200CCCAAAGAGA TGTTTACTAA CTTGAGGAAT AATGGAATCA AGTGCTCCAC CAATATCACT 1260CCTGTTATCA GCATTAACAA CAGAGAGGGT GGATACAGTA CCCTCCTTGA GGGAGTTGAC 1320AAAAAATACT TTATCATGGA CGACAGATAT ACCGAGGGAA CAAGTGGGAA TGCGAAGGAT 1380GTTCGGTACA TGTACTACGG TGGTGGTAAT AAGGTTGAGG TCGATCCTAA TGATGTTAAT 1440
GGTCGGCCAG ACTTTAAAGA CAACTATGAC TTCCCCGCGA ACTTCAACAG CAAACAATAC 1500CCCTATCATG GTGGTGTGAG CTACGGTTAT GGGAACGGTA GTGCAGGTTT TTACCCGGAC 1560CTCAACAGAA AGGAGGTTCG TATCTGGTGG GGAATGCAGT ACAAGTATCT CTTCGATATG 1620GGACTGGAAT TTGTGTGGCA AGACATGACT ACCCCAGCAA TCCACACATC ATATGGAGAC 1680ATGAAAGGGT TGCCCACCCG TCTACTCGTC ACCTCAGACT CCGTCACCAA TGCCTCTGAG 1740AAAAAGCTCG CAATTGAAAC TTGGGCTCTC TACTCCTACA ATCTCCACAA AGCAACTTGG 1800CATGGTCTTA GTCGTCTCGA ATCTCGTAAG AACAAACGAA ACTTCATCCT CGGGCGTGGA 1860AGTTATGCCG GAGCCTATCG TTTTGCTGGT CTCTGGACTG GGGATAATGC AAGTAACTGG 1920GAATTCTGGA AGATATCGGT CTCTCAAGTT CTTTCTCTGG GCCTCAATGG TGTGTGCATC 1980GCGGGGTCTG ATACGGGTGG TTTTGAACCC TACCGTGATG CAAATGGGGT CGAGGAGAAA 2040TACTGTAGCC CAGAGCTACT CATCAGGTGG TATACTGGTT CATTCCTCTT GCCGTGGCTC 2100AGGAACCATT ATGTCAAAAA GGACAGGAAA TGGTTCCAGG AACCATACTC GTACCCCAAG 2160CATCTTGAAA CCCATCCAGA ACTCGCAGAC CAAGCATGGC TCTATAAATC CGTTTTGGAG 2220ATCTGTAGGT ACTATGTGGA GCTTAGATAC TCCCTCATCC AACTACTTTA CGACTGCATG 2280TTTCAAAACG TAGTCGACGG TATGCCAATC ACCAGATCTA TGCTCTTGAC CGATACTGAG 2340GATACCACCT TCTTCAACGA GAGCCAAAAG TTCCTCGACA ACCAATATAT GGCTGGTGAC 2400GACATTCTTG TTGCACCCAT CCTCCACAGT CGCAAAGAAA TTCCAGGCGA AAACAGAGAT 2460GTCTATCTCC CTCTTTACCA CACCTGGTAC CCCTCAAATT TGAGACCATG GGACGATCAA 2520GGAGTCGCTT TGGGGAATCC TGTCGAAGGT GGTAGTGTCA TCAATTATAC TGCTAGGATT 2580GTTGCACCCG AGGATTATAA TCTCTTCCAC AGCGTGGTAC CAGTCTACGT TAGAGAGGGT 2640GCCATCATCC CGCAAATCGA AGTACGCCAA TGGACTGGCC AGGGGGGAGC CAACCGCATC 2700AAGTTCAACA TCTACCCTGG AAAGGATAAG GAGTACTGTA CCTATCTTGA TGATGGTGTT 2760AGCCGTGATA GTGCGCCGGA AGACCTCCCA CAGTACAAAG AGACCCACGA ACAGTCGAAG 2820GTTGAAGGCG CGGAAATCGC AAAGCAGATT GGAAAGAAGA CGGGTTACAA CATCTCAGGA 2880ACCGACCCAG AAGCAAAGGG TTATCACCGC AAAGTTGCTG TCACACAAAC GTCAAAAGAC 2940AAGACGCGTA CTGTCACTAT TGAGCCAAAA CACAATGGAT ACGACCCTTC CAAAGAGGTG 3000GGTGATTATT ATACCATCAT TCTTTGGTAC GCACCAGGTT TCGATGGCAG CATCGTCGAT 3060
GTGAGCAAGA CGACTGTGAA TGTTGAGGGT GGGGTGGAGC ACCAAGTTTA TAAGAACTCC 3120GATTTACATA CGGTTGTTAT CGACGTGAAG GAGGTGATCG GTACCACAAA GAGCGTCAAG 3180ATCACATGTA CTGCCGCTTA A 3201(2)SEQ ID NO8資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度3213個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO8ATGGCAGGAT TATCCGACCC TCTCAATTTC TGCAAAGCAG AGGACTACTA CGCTGCTGCC60AAAGGCTGGA GTGGCCCTCA GAAGATCATT CGCTATGACC AGACCCCTCC TCAGGGTACA 120AAAGATCCGA AAAGCTGGCA TGCGGTAAAC CTTCCTTTCG ATGACGGGAC TATGTGTGTA 180GTGCAATTCG TCAGACCCTG TGTTTGGAGG GTTAGATATG ACCCCAGTGT CAAGACTTCT 240GATGAGTACG GCGATGAGAA TACGAGGACT ATTGTACAAG ACTACATGAC TACTCTGGTT 300GGAAACTTGG ACATTTTCAG AGGTCTTACG TGGGTTTCTA CGTTGGAGGA TTCGGGCGAG 360TACTACACCT TCAAGTCCGA AGTCACTGCC GTGGACGAAA CCGAACGGAC TCGAAACAAG 420GTCGGCGACG GCCTCAAGAT TTACCTATGG AAAAATCCCT TTCGCATCCA GGTAGTGCGT 480CTCTTGACCC CCCTGGTGGA CCCTTTCCCC ATTCCCAACG TAGCCAATGC CACAGCCCGT 540GTGGCCGACA AGGTTGTTTG GCAGACGTCC CCGAAGACGT TCAGGAAAAA CTTGCATCCG 600CAGCATAAGA TGTTGAAGGA TACAGTTCTT GATATTATCA AGCCGGGGCA CGGAGAGTAT 660GTGGGTTGGG GAGAGATGGG AGGCATCGAG TTTATGAAGG AGCCAACATT CATGAATTAT 720TTCAACTTTG ACAATATGCA ATATCAGCAG GTCTATGCAC AAGGCGCTCT TGATAGTCGT 780
GAGCCGTTGT ATCACTCTGA TCCCTTCTAT CTCGACGTGA ACTCCAACCC AGAGCACAAG 840AACATTACGG CAACCTTTAT CGATAACTAC TCTCAGATTG CCATCGACTT TGGGAAGACC 900AACTCAGGCT ACATCAAGCT GGGTACCAGG TATGGCGGTA TCGATTGTTA CGGTATCAGC 960GCGGATACGG TCCCGGAGAT TGTGCGACTT TATACTGGAC TTGTTGGGCG TTCGAAGTTG 1020AAGCCCAGGT ATATTCTCGG AGCCCACCAA GCTTGTTATG GATACCAGCA GGAAAGTGAC 1080TTGCATGCTG TTGTTCAGCA GTACCGTGAC ACCAAGTTTC CGCTTGATGG GTTGCATGTC 1140GATGTCGACT TTCAGGACAA TTTCAGAACG TTTACCACTA ACCCGATTAC GTTCCCTAAT 1200CCCAAAGAAA TGTTTACCAA TCTAAGGAAC AATGGAATCA AGTGTTCCAC CAACATCACC 1260CCTGTTATCA GTATCAGAGA TCGCCCGAAT GGGTACAGTA CCCTCAATGA GGGATATGAT 1320AAAAAGTACT TCATCATGGA TGACAGATAT ACCGAGGGGA CAAGTGGGGA CCCGCAAAAT 1380GTTCGATACT CTTTTTACGG CGGTGGGAAC CCGGTTGAGG TTAACCCTAA TGATGTTTGG 1440GCTCGGCCAG ACTTTGGAGA CAATTATGAC TTCCCTACGA ACTTCAACTG CAAAGACTAC 1500CCCTATCATG GTGGTGTGAG TTACGGATAT GGGAATGGCA CTCCAGGTTA CTACCCTGAC 1560CTTAACAGAG AGGAGGTTCG TATCTGGTGG GGATTGCAGT ACGAGTATCT CTTCAATATG 1620GGACTAGAGT TTGTATGGCA AGATATGACA ACCCCAGCGA TCCATTCATC ATATGGAGAC 1680ATGAAAGGGT TGCCCACCCG TCTGCTCGTC ACCGCCGACT CAGTTACCAA TGCCTCTGAG 1740AAAAAGCTCG CAATTGAAAG TTGGGCTCTT TACTCCTACA ACCTCCATAA AGCAACCTTC 1800CACGGTCTTG GTCGTCTTGA GTCTCGTAAG AACAAACGTA ACTTCATCCT CGGACGTGGT 1860AGTTACGCCG GTGCCTATCG TTTTGCTGGT CTCTGGACTG GAGATAACGC AAGTACGTGG 1920GAATTCTGGA AGATTTCGGT CTCCCAAGTT CTTTCTCTAG GTCTCAATGG TGTGTGTATA 1980GCGGGGTCTG ATACGGGTGG TTTTGAGCCC GCACGTACTG AGATTGGGGA GGAGAAATAT 2040TGCAGTCCGG AGCTACTCAT CAGGTGGTAT ACTGGATCAT TCCTTTTGCC ATGGCTTAGA 2100AACCACTACG TCAAGAAGGA CAGGAAATGG TTCCAGGAAC CATACGCGTA CCCCAAGCAT 2160CTTGAAACCC ATCCAGAGCT CGCAGATCAA GCATGGCTTT ACAAATCTGT TCTAGAAATT 2220TGCAGATACT GGGTAGAGCT AAGATATTCC CTCATCCAGC TCCTTTACGA CTGCATGTTC 2280CAAAACGTGG TCGATGGTAT GCCACTTGCC AGATCTATGC TCTTGACCGA TACTGAGGAT 2340ACGACCTTCT TCAATGAGAG CCAAAAGTTC CTCGATAACC AATATATGGC TGGTGACGAC 2400
ATCCTTGTAG CACCCATCCT CCACAGCCGT AACGAGGTTC CGGGAGAGAA CAGAGATGTC 2460TATCTCCCTC TATTCCACAC CTGGTACCCC TCAAACTTGA GACCGTGGGA CGATCAGGGA 2520GTCGCTTTAG GGAATCCTGT CGAAGGTGGC AGCGTTATCA ACTACACTGC CAGGATTGTT 2580GCCCCAGAGG ATTATAATCT CTTCCACAAC GTGGTGCCGG TCTACATCAG AGAGGGTGCC 2640ATCATTCCGC AAATTCAGGT ACGCCAGTGG ATTGGCGAAG GAGGGCCTAA TCCCATCAAG 2700TTCAATATCT ACCCTGGAAA GGACAAGGAG TATGTGACGT ACCTTGATGA TGGTGTTAGC 2760CGCGATAGTG CACCAGATGA CCTCCCGCAG TACCGCGAGG CCTATGAGCA AGCGAAGGTC 2820GAAGGCAAAG ACGTCCAGAA GCAACTTGCG GTCATTCAAG GGAATAAGAC TAATGACTTC 2880TCCGCCTCCG GGATTGATAA GGAGGCAAAG GGTTATCACC GCAAAGTTTC TATCAAACAG 2940GAGTCAAAAG ACAAGACCCG TACTGTCACC ATTGAGCCAA AACACAACGG ATACGACCCC 3000TCTAAGGAAG TTGGTAATTA TTATACCATC ATTCTTTGGT ACGCACCGGG CTTTGACGGC 3060AGCATCGTCG ATGTGAGCCA GGCGACCGTG AACATCGAGG GCGGGGTGGA ATGCGAAATT 3120TTCAAGAACA CCGGCTTGCA TACGGTTGTA GTCAACGTGA AAGAGGTGAT CGGTACCACA 3180AAGTCCGTCA AGATCACTTG CACTACCGCT TAG 3213(2)SEQ TD NO9資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度317個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵修飾位點(diǎn)(B)位置201(D)其它資料/注＝“X指misc氨基酸”(xi)序列描述SEQ ID NO9
Met Thr Asn Tyr Asn Tyr Asp Asn Leu Asn Tyr Asn Gln Pro Asp Leu1 5 10 15Ile Pro Pro Gly His Asp Ser Asp Pro Asp Tyr Tyr Ile Pro Met Tyr20 25 30Phe Ala Ala Pro Trp Val Ile Ala His Gly Tyr Arg Gly Thr Ser Asp35 40 45Gln Tyr Ser Tyr Gly Trp Phe Leu Asp Asn Val Ser Gln Ser Tyr Thr50 55 60Asn Thr Gly Asp Asp Ala Trp Ala Gly Gln Lys Asp Leu Ala Tyr Met65 70 75 80Gly Ala Gln Cys Gly Pro Phe Asp Gln His Phe Val Tyr Glu Ala Gly85 90 95Asp Gly Leu Glu Asp Val Val Thr Ala Phe Ser Tyr Leu Gln Gly Lys100 105 110Glu Tyr Glu Asn Gln Gly Leu Asn Ile Arg Ser Ala Met Pro Pro Lys115 120 125Tyr Val Phe Gly Phe Phe Gln Gly Val Phe Gly Ala Thr Ser Leu Leu130 135 140Arg Asp Asn Leu Pro Ala Gly Glu Asn Asn Val Ser Leu Glu Glu Ile145 150 155 160Val Glu Gly Tyr Gln Asn Gln Asn Val Pro Phe Glu Gly Leu Ala Val165 170 175Asp Val Asp Met Gln Asp Asp Leu Arg Val Phe Thr Thr Arg Pro Ala180 185 190Phe Trp Thr Ala Asn Lys Val Gly Xaa Gly Gly Asp Pro Asn Asn Lys195 200 205Ser Val Phe Glu Trp Ala His Asp Arg Gly Leu Val Cys Gln Thr Asn210 215 220Val Thr Cys Phe Leu Lys Asn Glu Lys Asn Pro Tyr Glu Val Asn Gln225 230 235 240Ser Leu Arg Glu Lys Gln Leu Tyr Thr Lys Ser Asp Ser Leu Asp Asn245 250 255Ile Asp Phe Gly Thr Thr Pro Asp Gly Pro Ser Asp Ala Tyr Ile Gly260 265 270
His Leu Asp Tyr Gly Gly Gly Val Glu Cys Asp Ala Leu Phe Pro Asp275 280 285Trp Gly Arg Pro Asp Val Ala Gln Trp Trp Gly Asp Asn Tyr Lys Lys290 295 300Leu Phe Ser Ile Gly Leu Asp Phe Val Trp Gln Asp Met305 310 315(2)SEQ ID NO10資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度323個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵修飾的位點(diǎn)(B)位置272(D)其它資料/注＝“X是misc氨基酸”(ix)特征(A)名稱/鍵修飾的位點(diǎn)(B)位置273(D)其它資料/注＝“X是misc氨基酸”(ix)特征(A)名稱/鍵修飾的位點(diǎn)(B)位置274(D)其它資料/注＝“X是misc氨基酸”(xi)序列描述SEQ ID NO10
Met Thr Asn Tyr Asn Tyr Asp Asn Tyr Asn Tyr Asn Gln Ser Asp Leu1 5 10 15Ile Ala Pro Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Asn Phe Tyr Ile Pro Met Tyr20 25 30Phe Ala Ala Pro Trp Val Val Val Lys Gly Cys Ser Gly Asn Ser Asp35 40 45Glu Gln Tyr Ser Tyr Gly Trp Phe Met Asp Asn Val Ser Gln Thr Tyr50 55 60Met Asn Thr Gly Gly Thr Ser Trp Asn Cys Gly Glu Glu Asn Leu Ala65 70 75 80Tyr Met Gly Ala Gln Cys Gly Pro Phe Asp Gln His Phe Val Tyr Gly85 90 95Asp Gly Asp Gly Leu Glu Asp Val Val Gln Ala Phe Ser Leu Leu Gln100 105 110Gly Lys Glu Phe Glu Asn Gln Val Leu Asn Lys Arg Ala Val Met Pro115 120 125Pro Lys Tyr Val Phe Gly Tyr Phe Gln Gly Val Phe Gly Ile Ala Ser130 135 140Leu Leu Arg Glu Gln Arg Pro Glu Gly Gly Asn Asn Ile Ser Val Ser145 150 155 160Glu Ile Val Glu Gly Tyr Gln Ser Asn Asn Phe Pro Leu Glu Gly Leu165 170 175Ala Val Asp Val Asp Met Gln Gln Asp Leu Arg Cys Ser Ser Pro Leu180 185 190Lys Ile Glu Phe Trp Thr Ala Asn Lys Val Gly Thr Gly Gly Asp Ser195 200 205Asn Asn Lys Ser Val Phe Glu Trp Ala His Asp Lys Gly Leu Val Cys210 215 220Gln Thr Asn Val Thr Cys Phe Leu Arg Asn Asp Asn Gly Gly Ala Asp225 230 235 240Tyr Glu Val Asn Gln Thr Leu Arg Glu Lys Gly Leu Tyr Thr Lys Asn245 250 255Asp Ser Leu Thr Asn Thr Asn Phe Gly Thr Thr Asn Asp Gly Pro Xaa260 265 270Xaa Xaa Tyr Ile Gly His Leu Asp Tyr Gly Gly Gly Gly Asn Cys Asp275 280 285
Ala Leu Phe Pro Asp Trp Gly Arg Pro Gly Val Ala Glu Trp Trp Gly290 295 300Asp Asn Tyr Ser Lys Leu Phe Lys Ile Gly Leu Asp Phe Val Trp Gln305310 315 320Asp Met Thr(2)SEQ ID NO11資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度202個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/鍵修飾位點(diǎn)(B)位置43(D)其它資料/注＝“X是misc氨基酸”(ix)特征(A)名稱/鍵修飾位點(diǎn)(B)位置176(D)其它資料/注＝“X是misc氨基酸”(xi)序列描述SEQ ID NO11Met Thr Asn Tyr Asn Tyr Asp Asn Leu Asn Tyr Asn Gln Pro Asp Val1 5 10 15Val Pro Pro Gly Tyr His Asp His Pro Asn Tyr Tyr Ile Pro Met Tyr20 25 30Tyr Ala Ala Pro Trp Leu Val Val Gln Gly Xaa Ala Gly Thr Ser Lys35 40 45Gln Tyr Ser Tyr Gly Trp Phe Met Asp Asn Val Ser Gln Ser Tyr Met50 55 60Asn Thr Gly Asp Thr Ala Trp Asn Cys Gly Gln Glu Asn Leu Ala Tyr65 70 75 80
Met Gly Ala Gln Tyr Gly Pro Phe Asp Gln His Phe Val Tyr Gly Asp85 90 95Gly Asp Gly Leu Glu Asp Val Val Lys Ala Phe Ser Phe Leu Gln Gly100 105 110Lys Glu Phe Glu Asp Lys Lys Leu Asn Lys Arg Ser Val Met Pro Pro115 120 125Lys Tyr Val Phe Gly Phe Phe Gln Gly Val Phe Gly Ala Leu Ser Leu130 135 140Leu Lys Gln Asn Leu Pro Ala Gly Glu Asn Asn Ile Ser Val Gln Glu145 150 155 160Ile Val Glu Gly Tyr Gln Asp Asn Asp Tyr Pro Phe Glu Gly Leu Xaa165 170 175Val Asp Val Asp Met Gln Asp Asp Leu Arg Val Phe Thr Thr Lys Pro180 185 190Glu Tyr Trp Ser Ala Asn Met Val Gly Glu195 200(2)SEQ ID NO12資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度953個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(573，″″)(D)其它資料/注＝“g是misc核酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(601，″″)
(D)其它資料/注＝“g是misc核酸”(xi)序列描述SEQ ID NO12ATGACAAACT ATAATTATGA CAATTTGAAC TACAATCAAC CGGACCTCAT CCCACCTGGC 60CATGATTCAG ATCCTGACTA CTATATTCCG ATGTACTTTG CGGCACCATG GGTGATCGCA 120CATGGATATC GTGGCACCAG CGACCAGTAC TCTTATGGAT GGTTTTTGGA CAATGTATCC 180CAGTCCTACA CAAACACTGG CGATGATGCA TGGGCTGGTC AGAAGGATTT GGCGTACATG 240GGGGCACAAT GTGGGCCTTT CGATCAACAT TTTGTGTATG AGGCTGGAGA TGGACTTGAA 300GACGTTGTGA CCGCATTCTC TTATTTGCAA GGCAAGGAAT ATGAGAACCA GGGACTGAAT 360ATACGTTCTG CAATGCCTCC GAAGTACGTT TTCGGATTTT TCCAAGGCGT ATTCGGAGCC 420ACATCGCTGC TAAGGGACAA CTTACCTGCC GGCGAGAACA ACGTCTCTTT GGAAGAAATT 480GTTGAAGGAT ATCAAAATCA GAACGTGCCA TTTGAAGGTC TTGCTGTGGA TGTTGATATG 540CAAGATGACT TGAGAGTGTT CACTACGAGA CCGGCGTTTT GGACGGCAAA CAAGGTGGGG 600GAAGGCGGTG ATCCAAACAA CAAGTCAGTG TTTGAGTGGG CACATGACAG GGGCCTTGTC 660TGCCAGACGA ATGTAACTTG CTTCTTGAAG AACGAGAAAA ATCCTTACGA AGTGAATCAG 720TCATTGAGGG AGAAGCAGTT GTATACGAAG AGTGATTCCT TGGACAACAT TGATTTTGGA 780ACTACTCCAG ATGGGCCTAG CGATGCGTAC ATTGGACACT TAGACTACGG TGGTGGTGTG 840GAGTGTGATG CACTATTCCC AGACTGGGGT CGACCAGACG TGGCTCAATG GTGGGGCGAT 900AACTACAAGA AACTATTCAG CATTGGTCTC GACTTCGTAT GGCAAGACAT GAC 953(2)SEQ ID NO13資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度969個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征
(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(814..821，″″)(D)其它資料/注＝“每個(gè)在(且包括)814和821之間的g是misc核酸”(xi)序列描述SEQ ID NO13ATGACAAACT ACAACTACGA CAACTATAAC TACAACCAGT CAGATCTTAT TGCTCCAGGA60TATCCTTCCG ACCCGAACTT CTACATTCCC ATGTATTTTG CAGCACCTTG GGTAGTTGTT 120AAGGGATGCA GTGGCAACAG CGATGAACAG TACTCGTACG GATGGTTTAT GGATAATGTC 180TCCCAAACTT ACATGAATAC TGGTGGTACT TCCTGGAACT GTGGAGAGGA GAACTTGGCA 240TACATGGGAG CACAGTGCGG TCCATTTGAC CAACATTTTG TGTATGGTGA TGGAGATGGT 300CTTGAGGATG TTGTCCAAGC GTTCTCTCTT CTGCAAGGCA AAGAGTTTGA GAACCAAGTT 360CTGAACAAAC GTGCCGTAAT GCCTCCGAAA TATGTGTTTG GTTACTTTCA GGGAGTCTTT 420GGGATTGCTT CCTTGTTGAG AGAGCAAAGA CCAGAGGGTG GTAATAACAT CTCTGTTTCA 480GAGATTGTCG AAGGTTACCA AAGCAATAAC TTCCCTTTAG AGGGGTTAGC CGTAGATGTG 540GATATGCAAC AAGATTTGCG GTGTAGTTCA CCACTGAAGA TTGAATTTTG GACGGCAAAT 600AAGGTAGGCA CCGGGGGAGA CTCGAATAAC AAGTCGGTGT TTGAATGGGC ACATGACAAA 660GGCCTTGTAT GTCAGACGAA TGTTACTTGC TTCTTGAGAA ACGACAACGG CGGGGCAGAT 720TACGAAGTCA ATCAGACATT GAGGGAGAAG GGTTTGTACA CGAAGAATGA CTCACTGACG 780AACACTAACT TCGGAACTAC CAACGACGGG CCGGGGGGGG GGTACATTGG ACATCTGGAC 840TATGGTGGCG GAGGGAATTG TGATGCACTT TTCCCAGATT GGGGTCGACC GGGTGTGGCT 900GAATGGTGGG GTGATAACTA CAGCAAGCTC TTCAAAATTG GTCTGGACTT CGTGTGGCAA 960GATATGACA 969(2)SEQ ID NO14資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度607個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(128，″″)(D)其它資料/注＝“g是misc核酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(232，″″)(D)其它資料/注＝“g是misc核酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(249，″″)(D)其它資料/注＝“g是misc核酸”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(526，″″)(D)其它資料/注＝“g是misc核酸”(xi)序列描述SEQ ID NO14ATGACAAACT ACAATTACGA CAACTTGAAC TACAACCAAC CAGACGTCGT TCCTCCAGGT60TATCACGACC ATCCCAACTA CTACATTCCA ATGTACTACG CAGCACCGTG GTTGGTCGTT 120CAGGGATGCG CGGGGACATC GAAGCAATAC TCGTACGGTT GGTTTATGGA CAATGTCTCT 180CAGTCGTACA TGAACACTGG AGATACGGCG TGGAACTGCG GACAGGAAAA CGTGGCATAC 240ATGGGCGCGC AATACGGGCC ATTTGATCAG CACTTTGTGT ATGGTGATGG AGATGGCCTT 300
GAAGATGTCG TCAAAGCGTT CTCCTTTCTT CAAGGAAAGG AGTTCGAAGA CAAAAAACTC 360AACAAGCGTT CTGTAATGCC TCCGAAGTAC GTGTTTGGTT TCTTCCAGGG TGTTTTCGGT 420GCACTTTCAC TGTTGAAGCA GAATCTGCCT GCCGGAGAGA ACAACATCTC AGTGCAAGAG 480ATTGTGGAGG GTTACCAGGA TAACGACTAC CCCTTTGAAG GGCTCGCGGT AGATGTTGAT 540ATGCAAGATG ATCTGCGAGT GTTTACTACC AAACCAGAAT ATTGGTCGGC AAACATGGTA 600GGCGAAG 607(2)SEQ ID NO15資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度90個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO15Tyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala Ala1 5 10 15Phe Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asn Asn Asp Ser20 25 30Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu Gly Gly His Asp35 40 45Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Ser Thr Glu50 55 60Arg Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln Trp Tyr Lys Phe Gly Pro65 70 75 80Asp Phe Asp Thr Lys Pro Leu Glu Gly Ala85 90(2)SEQ ID NO16資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(6，″″)(D)其它資料/注＝“N是T或C”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(9，″″)(D)其它資料/注＝“N是C或T”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(12，″″)(D)其它資料/注＝“N是C或T”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(15，″″)(D)其它資料/注＝“N是C或T”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(18，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A或C”(ix)特征
(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(21，″″)(D)其它資料/注＝“N是C或T”(xi)序列描述SEQ ID NO16ATGTANAANA ANGANTCNAA NGT 23(2)SEQ ID NO17資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(6，″″)(D)其它資料/注＝“N是T或C”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(9，″″)(D)其它資料/注＝“N是C或T”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(12，″″)(D)其它資料/注＝“N是C或T”
(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(15，″″)(D)其它資料/注＝“N是C或T”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(18，″″)(D)其它資料/注＝“N是C或T”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(21，″″)(D)其它資料/注＝“N是C或T”(xi)序列描述SEQ ID NO17ATGTANAANA ANGANAGNAA NGT 23(2)SEQ ID NO18資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(3，″″)
(D)其它資料/注＝“N是G或A或T或C”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(6，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(9，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(12，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A或T或C”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(15，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A或T或C”(xi)序列描述SEQ ID NO18TANCCNTCNT GNCCNCC 17(2)SEQ ID NO19資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(3，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A或T或C”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(6，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(9，″″)(D)其它資料/注＝“N是C或T”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(12，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵mi sc_區(qū)別(B)位置置換(18，″″)(D)其它資料/注＝“N是C或R”(xi)序列描述SEQ ID NO19GGNCCNAANT TNTACCANTG 20
(2)SEQ ID NO20資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(3，″″)(D)其它資料/注＝“N是T或C”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(6，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A或T或C”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(12，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(15，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(xi)序列描述SEQ ID NO20TANCGNTGGC ANGANGT 17
(2)SEQ ID NO21資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(3，″″)(D)其它資料/注＝“N是T或C”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(6，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(12，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(15，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(xi)序列描述SEQ ID NO21TANAGNTGGC ANGANGT 17
(2)SEQ ID NO22資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度71個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO22ATGTACAACA ACGACTCGAA CGTTCGCAGG GCGCAGAACG ATCATTTCCT TCTTGGCGGC 60CACGACGGTT A71(2)SEQ ID NO23資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO22Met Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe1 5 10 15Leu Leu Gly Gly His Asp Gly20(2)SEQ ID NO24資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度160個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO24ATGTACAACA ACGACTCGAA CGTTCGCAGG GCGCAGAACG ATCATTTCCT TCTTGGTGGA 60CATGATGGAT ATCGCATTCT GTGCGCGCCT GTTGTGTGGG AGAATTCGAC CGAACGGAAT120TGTACTTGCC CGTGCTGACC CAATGGTACA AATTCGGCCC 160(2)SEQ ID NO25資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度54個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO25Met Tyr Asn Asn Asp Ser Asn Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe1 5 10 15Leu Leu Gly Gly His Asp Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val20 25 30Trp Glu Asn Ser Thr Glu Arg Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln35 40 45Trp Tyr Lys Phe Gly Pro50(2)SEQ ID NO26資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度238個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO26TACAGGTGGC AGGAGGTGTT GTACACTGCT ATGTACCAGA ATGCGGCTTT CGGGAAACCG 60ATTATCAAGG CAGCTTCCAT GTACGACAAC GACAGAAACG TTCGCGGCGC ACAGGATGAC 120CACTTCCTTC TCGGCGGACA CGATGGATAT CGTATTTTGT GTGCACCTGT TGTGTGGGAG 180AATACAACCA GTCGCGATCT GTACTTGCCT GTGCTGACCA GTGGTACAAA TTCGGCCC 238(2)SEQ ID NO27資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度79個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO27Tyr Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala Ala1 5 10 15Phe Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asp Asn Asp Arg20 25 30Asn Val Arg Gly Ala Gln Asp Asp His Phe Leu Leu Gly Gly His Asp35 40 45Gly Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Thr Thr Ser50 55 60Arg Asp Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Lys Trp Tyr Lys Phe Gly55 70 75
(2)SEQ ID NO28資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO28GCTCTAGAGC ATGTTTTCAA CCCTTGCG28(2)SEQ ID NO29資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO29AGCTTGTTAA CATGTATCCA ACCCTCACCT TCGTGG 36(2)SEQ ID NO30資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈
(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO30ACAATTGTAC ATAGGTTGGG AGTGGAAGCA CCGC 34(2)SEQ ID NO31資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度75個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO31Lys Asn Leu His Pro Gln His Lys Met Leu Lys Asp Thr Val Leu Asp1 5 10 15Ile Val Lys Pro Gly His Gly Glu Tyr Val Gly Trp Gly Glu Met Gly20 25 30Gly Ile Gln Phe Met Lys Glu Pro Thr Phe Met Asn Tyr Phe Asn Phe35 40 45Asp Asn Met Gln Tyr Gln Gln Val Tyr Ala Gln Gly Ala Leu Asp Ser50 55 60Arg Glu Pro Leu Tyr His Ser Asp Pro Phe Tyr65 70 75(2)SEQ ID NO32資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(3，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(6，″″)(D)其它資料/注＝“N是C或T”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(9，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(15，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A或T或C”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(18，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(21，″″)
(D)其它資料/注＝“N是C或T”(xi)序列描述SEQ ID NO32CANCANAANA TGCTNAANGA NAC 23(2)SEQ ID NO33資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(3，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(6，″″)(D)其它資料/注＝“N是C或T”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(9，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別
(B)位置置換(15，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(18，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(21，″″)(D)其它資料/注＝“N是C或T”(xi)序列描述SEQ ID NO33CAN CANAANA TGTTNAANGA NAC 23(2)SEQ ID NO34資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(3，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(ix)特征
(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(6，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A或T或C”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(9，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(12，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(15，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(18，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(xi)序列描述SEQ ID NO34TANAANGGNT CNCTNTGNTA 20(2)SEQ ID NO35資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(3，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(6，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A或T或C”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(9，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(12，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A或T或C”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(15，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(ix)特征
(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(18，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(xi)序列描述SEQ ID NO35TANAANGGNT CNGANTGNTA 20(2)SEQ ID NO36資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO36AAACTGCAGC TGGCGCGCCA TGGCAGGATT TTCTGAT37(2)SEQ ID NO37資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別
(B)位置置換(6，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A或T或C”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(9，″″)(D)其它資料/注＝“N是C或T”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(12，″″)(D)其它資料/注＝“N是C或T”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(15，″″)(D)其它資料/注＝“N是C或T”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(18，″″)(D)其它資料/注＝“N是C或T”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(21，″″)(D)其它資料/注＝“N是C或T”(xi)序列描述SEQ ID NO37ATGACNAANT ANAANTANGA NAA 23
(2)SEQ ID NO38資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(1，″″)(D)其它資料/注＝“N是A或G”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(4，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A或T或C”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(13，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A或T或C”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(16，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A或T或C”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別
(B)位置置換(19，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A或T或C”(xi)序列描述SEQ ID NO38NTGNGGCATC ATNGCNGGNA C 21(2)SEQ ID NO39資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(6，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(9，″″)(D)其它資料/注＝“N是C或T”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(15，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A或T或C”(ix)特征
(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(18，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(ix)特征(A)名稱/鍵misc_區(qū)別(B)位置置換(21，″″)(D)其它資料/注＝“N是G或A”(xi)序列描述SEQ ID NO39GTCATNTCNT GCCANACNAA NTC 23
關(guān)于微生物保藏的說明(PCT Rule 13bis)
關(guān)于微生物保藏的說明(PCT Rule 13bis)
關(guān)于微生物保藏的說明(PCT Rule 13bis)
關(guān)于微生物保藏的說明(PCT Rule 13bis)
關(guān)于微生物保藏的說明(PCT Rule 13bis)
關(guān)于微生物保藏的說明(PCT Rule 13bis)
關(guān)于微生物保藏的說明(PCT Rule 13bis)
權(quán)利要求
1.1，5-D-脫水果糖作為抗氧化劑的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其中1，5-D-脫水果糖被加入到食品或飲料中。
3.權(quán)利要求1的用途，其中1，5-D-脫水果糖被加入到聚合物中。
全文摘要
本發(fā)明描述了制備糖1，5－D－脫水果糖的方法。該方法包含用α－1，4－葡聚糖裂解酶處理α－1，4－葡聚糖，其中所用的酶基本上是純化形式。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，如果葡聚糖除α－1，4－鍵外，還含有不同于該鍵的其它鍵，則將α－1，4－葡聚糖裂解酶與能打開這些其它鍵的合適試劑結(jié)合使用。
文檔編號(hào)C12R1/865GK1510106SQ0314526
公開日2004年7月7日 申請(qǐng)日期1994年10月15日 優(yōu)先權(quán)日1993年10月15日
發(fā)明者于書坤, K·博伊森, K·M·卡拉格赫, M·博伊科, J·尼爾森, J·馬庫(kù)森, T·M·I·E·克里斯藤森, I E 克里斯藤森, 卡拉格赫, 遼, 量, 饃 申請(qǐng)人:丹尼斯科有限公司