專利名稱：對蝦白斑桿狀病毒wp486基因及其編碼的多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對蝦白斑桿狀病毒基因的核苷酸序列。具體地說，本發(fā)明涉及對蝦白斑桿狀病毒極早期調(diào)控基因WP486的核苷酸序列，還涉及由該核苷酸序列編碼的一種具有基因調(diào)控活性的多肽。本發(fā)明這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和活性多肽的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
對蝦白斑桿狀病毒(white spot bacilliform virus，WSBV)又稱為對蝦白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus，WSSV)是近年來危害我國及亞洲太平洋地區(qū)人工養(yǎng)殖對蝦的主要病毒病原之一，它能高致死率地侵染絕大多數(shù)種類的對蝦，此外還可侵染淡水及海洋生態(tài)系統(tǒng)中多種蟹類、龍蝦類、端足類、水蠅類等甲殼綱動物，具有較廣泛的宿主范圍，因此它不僅嚴重危害對蝦養(yǎng)殖，還對海洋生態(tài)造成了影響。WSBV是雙鏈DNA病毒，基因組全長305kb，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最大的動物病毒(J.Virol.2001，7511811-11820)?；蚪M序列遺傳分析及形態(tài)學(xué)特征都表明WSBV是一種新病毒，它不屬于目前已知的任一種病毒家族。目前還難以對WSBV進行預(yù)防和控制，一方面由于WSBV能在自然環(huán)境中存活較長時間，更重要的是人們對此病毒分子水平的了解還很少。基因組Microarray分析表明WSBV編碼一種病毒感染極早期的基因，可能調(diào)控蛋白(其中預(yù)測的WP486可能編碼WP486蛋白)，在WSBV的感染、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯過程中具有重要的調(diào)控功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明中的編碼WP486活性多肽的核苷酸序列是如此獲得的。以純化的WSBV基因組DNA構(gòu)建文庫，測定病毒基因組全序列，根據(jù)序列合成SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的序列作為引物，經(jīng)PCR擴增獲得了SEQ ID No.1的序列。然后通過重組表達WP486基因，純化WP486基因的表達產(chǎn)物，預(yù)測具有基因調(diào)控功能。在本發(fā)明被公布之前，尚沒有任何人公開過本申請中涉及的WP486蛋白序列。本發(fā)明將可能為WSBV的防治提供新的途徑。
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該核苷酸編碼一種新的WSBV蛋白，此蛋白被命名為WP486。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種新的WSBV蛋白，該蛋白被命名為WP486。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的WSBV蛋白的方法。
本發(fā)明還提供了這種WSBV基因序列和多肽的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼WP486蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID No.1中1-1458的核苷酸序列有至少70％的相似性；或者所述核苷酸序列能在中等嚴謹條件下與SEQ ID No.1中1-1458的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID No.2所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID No.1中1-1458位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的WP486蛋白多肽，它包括具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽、或者其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID No.2序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有WP486蛋白活性的多肽的方法。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明中分離的多核苷酸全長為1458個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID No.1，其中開放閱讀框位于1-1458位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“WP486蛋白(和多肽)編碼序列”是指編碼具有WP486蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID No.1中的1-1458位序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID No.1序列的編碼框1-1458位核苷酸中，由一個和多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID No.1中1-1458位核苷酸相似性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID No.2所述的序列。該術(shù)語還包括能在嚴謹條件下，更佳地在高度嚴謹條件下，與SEQ ID No.1中從核苷酸1-1458位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID No.1中1-1458的核苷酸序列的相似性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與WP486相同功能的蛋白的、SEQ IDNo.1序列的變異形式。這些形式包括若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5′和/或3′添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地10個以內(nèi)，最佳地5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少50％，較佳地至少75％，更佳地至少90％(按干重或濕重計)。純化可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC測量多肽的純度。
在本發(fā)明中，術(shù)語“WP486蛋白多肽”指具有基因調(diào)控活性的SEQID No.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有基因調(diào)控功能的、SEQ IDNo.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括WP486蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、修飾形式、在高或低的嚴謹度條件下能與WP486 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗WP486多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其它多肽，如包含WP486多肽或者其片段的融合蛋白。
本發(fā)明還提供WP486蛋白或多肽的類似物，這些類似物與天然WP486多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳突變體，誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生的隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知的分子生物學(xué)技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述列舉的代表性多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基的序列，還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。
另一方面，本發(fā)明還包括對WP486 DNA或是其片段編碼的多肽能特異性相互作用的多克隆抗體、單克隆抗體及其它能夠抑制WP486蛋白功能的分子。這里，“特異性”是指能相互作用并結(jié)合于WP486基因產(chǎn)物或片段。


圖1重組WP486表達純化的SDS-PAGE圖譜；具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的實驗條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1 WP486基因片段的克隆和測序以WSBV基因組DNA為模板，用引物P1、P2擴增WP486基因。
P15′-CGTGGATCCGACACAGACGATTTTGAGCC-3′(SEQ IDNo.3)；P25′-GAGCGGCCGCAGCTAGCTTGGCTGGACAATAAAT-3′(SEQ IDNo.4)；劃線部分GGATCC為BamH I酶切位點，GCGGCCGC為NotI酶切位點，GCTAGC為NheI酶切位點。
PCR反應(yīng)條件為94℃ 60秒55℃ 60秒72℃ 1.5分鐘(30圈)瓊脂糖凝膠電泳純化擴增片段后，克隆到原核表達質(zhì)粒載體pGEX4T-1，獲得重組表達質(zhì)粒pGEX-WP486，進行測序，測序所得WP486基因序列詳見SEQ ID No.1。
根據(jù)得到的核苷酸序列推導(dǎo)出的WP486的氨基酸序列，共486個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID No.2。
實施例2 重組WP486片段的表達與純化將含有WP486基因的重組表達質(zhì)粒pGEX-WP486轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，選取陽性克隆在含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃搖培至A600＝0.6時，加入IPTG至終濃度0.1mmol/L，37℃誘導(dǎo)6h后收集菌體。加入冰冷的裂解緩沖液(1×PBS，10mM NaHPO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，1.8mM KH2HPO4)，超聲裂解細菌(300W×10s×10次)，4℃ 15,000rpm離心20min；上清與預(yù)先用裂解緩沖液平衡的Glutathione Sepharose 4B混勻，4℃反應(yīng)10min，裝柱；用5-10個柱床體積的洗滌緩沖液(1×PBS)洗去雜蛋白；洗脫緩沖液(50mM Tris-HCl，10mM還原型谷胱甘肽，pH8.0)洗脫目的蛋白。用SDS-PAGE鑒定純化的融合蛋白的分子量約為64.5kD，純度達90％以上。結(jié)果見圖1。
圖1重組WP486表達純化的SDS-PAGE圖譜；圖1說明如下VIPTG誘導(dǎo)的空載質(zhì)粒菌株；IIPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒菌株；N未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒菌株；S誘導(dǎo)細胞的可溶性蛋白；P誘導(dǎo)細胞的不可溶性蛋白；E經(jīng)Glutathione Sepharose 4B柱純化所得的目的蛋白實施例3 重組WP486片段的抗體制備將實施例2中獲得的純化的重組蛋白用等體積的完全Freund’s佐劑乳化，用0.25-0.5mg/mL乳化過的蛋白對小鼠進行皮下注射，每只0.2mL。2周后用不完全Freund’s佐劑乳化的同樣劑量的相同抗原再注射以加強免疫產(chǎn)生抗體，之后每隔7天加強免疫一次，至少進行2次。分析所獲抗血清的滴度和特異性。
在閱讀了本發(fā)明的上述講述內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動和修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表1.SEQ ID No.1的信息1)序列特征A)長度1458bpB)類型核酸C)鏈性雙鏈D)拓撲結(jié)構(gòu)線性2)分子類型DNA3)序列描述SEQ ID No.11 ATGTTCGTCA TAAGCATAGC TACGTCATTG GTGTTATTCT TCTTCCTTCT TTTCGTCTCA61 ATAACAATTT TAGATGGTGC AAAAACAATC GACTCTCAAC CTTTTAGGAA AAGGAGGAAG121AGGAAGAGAT ATCGTACCAG TGAGAGTGGT GACGGCATAG ACGGAGGAAC TGGAACAACA181AACGGAGGAG GAGGAGGTGG AGGAGAAGGA GGTGGTGGTG GAACAAATGG AAATGGAACT241GGAACAACAA ACGGAGGAGG AGGTGGAGGA GAAGGAGGTG GTGGTGGAAC AAATGGAAAT301GGTTCTGGAA CAACAAACGG AGGAGGAGGT GGAGGAGAAG GAGGTGGTGG TGGAACAAAT361GGAGGAGGAA ATGGAAATGG AGGAGGAAAT GGAAATGGAA ATGGAAATGG AGGGGATACA421GACACAGACG ATTTTGAGCC TACGCCAGCC CTTCTAAAAG AACGTCTACT TAATTCCATA481TCTTCAAAAC CTAAAGAATA CTATGAAGCA TTCGTATCTG CAGAGGTAGA AACTGCCTTA541CAATTATCTC GAGATGATTC TACCCAAACT ATAATAATTG ATGACGACCA ATTAGAATTG601GACGCCTCAG ACACTCTACA AGGAAAACCA AGGGATTATT TGTTCAAGCT CGCAGGTGTT661TCATCGGCCT TTTTAGAAGG TACCACTATC CGCAAAGCGG AAGACCGTGC CCGTAATATA721AATGAGGAAG AAATTGCACA AACAATATTA AGTCAACTAA GAGAAAAACA CATCAACGAT781GAATACGATG GAAAATATGC CACACCCGAG GAAAGAGCTG ATTTTTCCAA TAGTCTTAAT841CTTGTTACTA AATACACAAA CCATGAAGTG GGTCTTTTAG TAGGAGAAAC TATTGAAAAG901GCTTTCCCTC ATGAGATTGA GTTTGAGAGA TGCATAATTC TAGTAGAGGA TTTTAATAGT961GGAACTATTA CTTCAAACAC TATGCAGTAC AGGTCCAACG CTTACAAAAT CAGAGTAGTA1021 GAAGGATCAA CAACAGATCC AGGGGAAGTT GTCCCTGATG ATTGTTTGGT TTTTGCCGTA1081 GTAGTAAATA AGGAACAACA TTCTCTAGAA ATATCTGCAA CTAACAGATG CCAAGACATA1141 TGCTTTGTAA TTATTCCTCG TTTATCCGCA ATAGGAAAAA ATGCTACCAT GGTAATAAGG1201 AAAGGTGATG AAATTAAACA AGAAACCTAT CTGTTTGTGG CCAATAAGAA TGACACTACT1261 CATTTTTCAA TCATCACAGA CAAGGATGAA TCTGTTGGAA TAGAATTAAA CATGCTCATT1321 TTCTCAGAAA GAATTCTCCC CACTTTGAGT GACCCTGCAA CCGTTCCAAG ACCTTTGACT1381 GACGCCAACG TACTGTCAGC CTACGGAAAG CGCCTAGGTG TTGGTGCCTT TACAGACAAA1441 AATTTATTGT CCAGCCAA2.SEQ ID No.2的信息1)序列特征A)長度486個氨基酸B)類型氨基酸C)拓撲結(jié)構(gòu)線性
2)分子類型蛋白質(zhì)3)序列描述SEQ ID No.21 MFVISIATSL VLFFFLLFVS ITILDGAKTI DSQPFRKRRK RKRYRTSESG DGIDGGTGTT61 NGGGGGGGEG GGGGTNGNGT GTTNGGGGGG EGGGGGTNGN GSGTTNGGGG GGEGGGGGTN121GGGNGNGGGN GNGNGNGGDT DTDDFEPTPA LLKERLLNSI SSKPKEYYEA FVSAEVETAL181QLSRDDSTQT IIIDDDQLEL DASDTLQGKP RDYLFKLAGV SSAFLEGTTI RKAEDRARNI241NEEEIAQTIL SQLREKHIND EYDGKYATPE ERADFSNSLN LVTKYTNHEV GLLVGETIEK301AFPHEIEFER CIILVEDFNS GTITSNTMQY RSNAYKIRVV EGSTTDPGEV VPDDCLVFAV361VVNKEQHSLE ISATNRCQDI CFVIIPRLSA IGKNATMVIR KGDEIKQETY LFVANKNDTT421HFSIITDKDE SVGIELNMLI FSERILPTLS DPATVPRPLT DANVLSAYGK RLGVGAFTDK481NLLSSQ3.SEQ ID No.3的信息1)序列特征A)長度29bpB)類型核酸C)鏈性單鏈D)拓撲結(jié)構(gòu)線性2)分子類型寡核苷酸3)序列描述SEQ ID No.3CGTGGATCCGACACAGACGATTTTGAGCC4.SEQ ID No.4的信息1)序列特征A)長度34bpB)類型核酸C)鏈性單鏈D)拓撲結(jié)構(gòu)線性2)分子類型寡核苷酸3)序列描述SEQ ID No.4GAGCGGCCGCAGCTAGCTTGGCTGGACAATAAAT
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼WP486活性多肽的核苷酸序列，或者所述核苷酸序列與SEQ ID NO.1中1-1458位的核苷酸序列有至少70％的相似性，或者所述核苷酸序列能在中等嚴謹條件下與SEQ ID No.1中1-1458位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)力要求1中所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID No.2所示的序列。
3.如權(quán)力要求1中所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQID No.1中從核苷酸1-1458的核苷酸序列。
4.一種分離的WP486多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ IDNo.2序列的多肽。
6.一種產(chǎn)生具有WP486蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括1)將編碼WP486活性多肽的核苷酸序列可操作地連接于表達調(diào)控序列，形成WP486基因表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID No.1中從核苷酸1-1458位的核苷酸序列有至少70％的相似性；2)將步驟1)中的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞，形成表達WP486活性多肽的重組細胞；3)在適合表達WP486活性多肽的條件下，培養(yǎng)步驟2)中的重組細胞；4)分離出WP486活性多肽。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，該重組的編碼多肽的核苷酸序列為SEQ ID No.1中從核苷酸1-1458位。
8.一種能與權(quán)利要求4所述的WP486活性多肽特異性結(jié)合的抗體。
全文摘要
本發(fā)明利用對蝦白斑桿狀病毒(WSBV)基因組微陣列(Microarray)技術(shù)，獲得病毒感染后6小時和深度感染的基因轉(zhuǎn)錄圖譜。從對蝦白斑桿狀病毒(WSBV)基因組中發(fā)現(xiàn)一個與病毒基因調(diào)控相關(guān)的基因WP486，該基因的核苷酸序列編碼一種具有基因調(diào)控功能的多肽。本發(fā)明還涉及WP486基因及其編碼多肽的應(yīng)用，以及所述活性多肽的生產(chǎn)方法。本發(fā)明首次通過生物學(xué)方法鑒定了WSBV病毒W(wǎng)P486基因的功能，WP486是WSBV早期關(guān)鍵調(diào)控基因之一，對該基因極其表達產(chǎn)物的抑制可能是防治對蝦白斑病的有效途徑之一，有望運用于對蝦白斑病的防治。
文檔編號C12N15/63GK1576367SQ03143909
公開日2005年2月9日 申請日期2003年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月28日
發(fā)明者楊豐, 蘭永勝 申請人:國家海洋局第三海洋研究所