專利名稱：吳茱萸堿在制備抗對(duì)蝦白斑綜合癥的制劑中的應(yīng)用的制作方法
吳茱萸堿在制備抗對(duì)蝦白斑綜合癥的制劑中的應(yīng)用
(-)技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及吳茱萸堿(Evodiamine)在制備抗對(duì)蝦白斑綜合癥的制劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
對(duì)蝦是熱帶亞熱帶淺海最占優(yōu)勢的甲殼動(dòng)物。由于其種類多，種群數(shù)量大，繁殖力 強(qiáng)，生長迅速，肉味鮮美，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由于環(huán)境污染、養(yǎng)殖技術(shù)、疾病控制等方面 的原因，對(duì)蝦，特別是斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)、南美白對(duì)蝦(Penaeus vannamei)、中國 )(寸蟲下(Penaeuschinensis)禾口 寸蟲下(Marsupenaeus japonicus)等，t及易;S至[|病_侵害， 并造成大量損失。對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(White spot syndrome virus，WSSV)，是對(duì)蝦養(yǎng)殖 中為害最烈的最主要病原。充分利用對(duì)蝦的先天性免疫系統(tǒng)和免疫機(jī)制，通過有針對(duì)性地 刺激對(duì)蝦的抗病機(jī)制來抵抗病毒，對(duì)于對(duì)蝦病害的預(yù)防、治療，提高對(duì)蝦養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益具 有重要的意義。對(duì)蝦是最重要的海水養(yǎng)殖產(chǎn)品之一，但是自從1990年代以來，一直受到病害的嚴(yán) 重威脅，尤其是對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(white spot syndromevirus, WSSV)是危害對(duì)蝦養(yǎng)殖 的最主要病原，其致病能力強(qiáng)，傳播范圍廣，給世界對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失，然而至 今仍無有效的防治方法。許多針對(duì)對(duì)蝦病害的研究由于其僅僅停留在應(yīng)用層面，并沒有對(duì)所得到藥物的抗 病機(jī)制進(jìn)行更加深入的探討，因此其藥物的應(yīng)用受到了一定的限制。同時(shí)由于無法針對(duì)其 作用機(jī)理進(jìn)行分析，這些藥物使用過程中產(chǎn)生的問題也得不到解答，進(jìn)而無法有效解決。因 此，研究已知藥理的抗病藥物十分必要。對(duì)蝦作為無脊椎動(dòng)物的一員，主要通過其物理屏障、應(yīng)激反應(yīng)、先天性體液免疫、 細(xì)胞生理調(diào)節(jié)等過程抵御病害。細(xì)胞凋亡作為清除衰老和異常細(xì)胞的主要機(jī)制，在對(duì)蝦染 病細(xì)胞的清除及防止病毒擴(kuò)散中具有重要作用，是對(duì)蝦抗病害的重要手段。并且是能夠抵 御病毒性侵害的重要武器。Caspase蛋白家族中的兩個(gè)亞家族分別在細(xì)胞凋亡中擔(dān)任起始和效應(yīng)蛋白，是細(xì) 胞凋亡的關(guān)鍵蛋白。擔(dān)任起始作用的CaSpaSe-8、9等，收到凋亡信號(hào)后，能通過自剪接而激 活，然后引起caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)；擔(dān)任效應(yīng)作用的CaSpaSe-3、6、7等可直接降解胞內(nèi)的結(jié)構(gòu) 蛋白和功能蛋白，引起凋亡。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供吳茱萸堿(Evodiamine)在制備抗對(duì)蝦白斑綜合癥的制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是吳茱萸堿(Evodiamine)在制備抗對(duì)蝦白斑綜合癥的制劑中的應(yīng)用。吳茱萸堿，提取自蕓香科植物吳茱萸[Evodia rutaecarpa(Juss.) Benth.]及同 Μ^Ι^ ^ [Ε. rutaecarpa(Juss. )Benth. var. off icinalis (Dode) Huang]的胃$，CAS 518-17-2，結(jié)構(gòu)式如下
吳茱萸堿有健胃、鎮(zhèn)痛、止干嘔和止噯酸等功效；有利尿作用；對(duì)大腸桿菌有強(qiáng)力 的抑制作用；對(duì)豬蛔蟲有顯著殺蟲作用；還有收縮子宮及升壓作用；治療早老性癡呆癥及 中風(fēng)有一定療效。本申請(qǐng)發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該小分子可作用于對(duì)蝦凋亡途徑關(guān)鍵蛋白，因此可利 用該小分子制備抗對(duì)蝦白斑綜合癥的制劑，可極大地增強(qiáng)對(duì)蝦對(duì)對(duì)蝦白斑綜合癥(WSSV) 的抵抗力，降低致死率。所述吳茱萸堿可用于制備誘導(dǎo)PjCaspase蛋白活化的制劑。優(yōu)選的，所述制劑為肌肉注射劑，其中Evodiamine的注射劑量為1 5 μ g/g蝦 (優(yōu)選3.5yg/g蝦左右)。本發(fā)明所述Evodiamine即作用于對(duì)蝦凋亡途徑關(guān)鍵蛋白PjCaspase的對(duì)蝦抗白 斑綜合癥相關(guān)小分子。通過直接注射Evodiamine或進(jìn)行喂食可以通過激活PjCaspase蛋 白的活性，加強(qiáng)對(duì)蝦對(duì)病毒的抵抗，極大地增強(qiáng)對(duì)蝦對(duì)對(duì)蝦白斑綜合癥(WSSV)的抵抗力， 降低致死率。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明所述Evodiamine可以有效誘導(dǎo)PjCaspase 蛋白的活化，極大地增強(qiáng)對(duì)蝦對(duì)對(duì)蝦白斑綜合癥(WSSV)的抵抗力，降低致死率；由于 Evodiamine是在人體中廣泛使用的提高免疫力的藥物，對(duì)人體沒有毒性，使用Evodiamine 的對(duì)蝦，無論其是否將藥物代謝完全都可以放心食用。


圖1為Evodiamine在細(xì)胞內(nèi)與Caspase蛋白結(jié)合能力的驗(yàn)證；圖2為Evodiamine對(duì)凋亡活性的影響；a為凋亡指標(biāo)效應(yīng)酶Caspasd的活性檢 測；b為凋亡指標(biāo)TUNEL活性；圖3為Evodiamine對(duì)病毒復(fù)制的影響；圖4為Evodiamine對(duì)感染W(wǎng)SSV對(duì)蝦的死亡率的影響；橫坐標(biāo)表示天數(shù)，縱坐標(biāo)表
示死亡率。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此實(shí)施例1 1、Evodiamine 與 PjCaspase 的結(jié)合能力的驗(yàn)證1. 1 擴(kuò)增 PjCaspase 基因。1.1.1對(duì)蝦組織cDNA合成1. 1. 1. 1對(duì)蝦組織總RNA的提取1)取對(duì)蝦鮮活組織200mg(日本對(duì)蝦，購自浙江省杭州市某菜市場)，在800 μ LTrizoKBBI公司)中迅速研碎。2)冰上放 5min。
3)加入200 μ L酚/氯仿溶液(酚和氯仿等體積混合后用0. lmol/LTris. HCl (pH7. 6)抽提幾次以平衡這一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆蓋等體積的0. Olmol/1 Tris. HCl (pH7. 6)液層，保存于4°C ；使用時(shí)以吸管吸取下層溶液)，振蕩混勻后12，OOOrpm 離心IOmin04)移取上清至等量異丙醇。5)振蕩混勻后 12，OOOrpm 離心 lOmin。6)沉淀用 50 μ L 無 RNA 酶雙蒸水溶解后加入 1 μ LDNase I (RNaseFree) (TaKaRa)， 消化1小時(shí)。7)重復(fù)步驟3) 5)。8)沉淀用300yL80% (ν/ν)乙醇洗兩遍。9) 12000rpm, 2min甩干酒精后，50 μ L無RNA酶雙蒸水溶解。1. 1. 1. 2總RNA的逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA 將下述成分放入一 RNase-free的Eppendolf管中總 RNA4gOligo (dT) (500 μ g/mL) 1 μ L75°C變性5min，立即冰浴，隨后加入 5 X逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液4 μ L各10mmol/L 的 4 種 dNTPs 混合液2 μ LM-MLV RT(RNase H-)(200U/μ L)(TaKaRa) 1 μ L水補(bǔ)足至20 μ L25°C反應(yīng) 10min，42°C反應(yīng) 30min 后，70°C加熱 15min 終止反應(yīng)。1.1.2PCR 擴(kuò)增根據(jù)已經(jīng)確定的基因閱讀框序列合成下列引物(括號(hào)內(nèi)所示為引入的劃線部分 的酶切位點(diǎn))5， -ATCCCGGGATGGACGAGGTAATCCAG-3’ (SmaI)5， -TTCTCGAGTCACTGTGGGGCGGAG-3’ (XhoI)以對(duì)蝦cDNA為模板，PCR擴(kuò)增特異的基因片段。在0. 5mL的Eppendorf管中加入10XPCR 反應(yīng)液5yLdNTP(2. 5mmol/L each)4μ L模板(約1 μ g/ μ L)2 μ L20mol/L基因特異性引物各 1 μ LTaq 酶(TaKaRa)IU加H2O至總體積50 μ L按以下方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增95°C5min ；94°C 30s，58°C 30s, 72°C 1. 5min，35 個(gè)循環(huán)； 72°C延伸 lOmin。1· 1· 3片段回收按常規(guī)方法從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段，以omega生產(chǎn)的膠回收試劑盒為例
1)割下含DNA的瓊脂糖塊，使它盡可能小，放入1. 5mL離心管中。如果瓊脂糖重量 小于lOOmg，用雙蒸水補(bǔ)至lOOmg，以確保體系總體積不至太小；2)按每IOOmg瓊脂糖加入300 μ L Sl液的比例加Sl液(試劑盒自帶)，置50°C水 浴lOmin，使瓊脂糖塊完全溶化，每2min顛倒混勻一次；3)將溶化后的瓊脂糖溶液移入吸附柱，7000rpm離心30s，倒掉收集管中的液體， 再將吸附柱放入同一個(gè)收集管中；4)在吸附柱中加入500 μ L Wl液(試劑盒自帶)，7000rpm離心15s，倒掉收集管 中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管；5)在吸附柱中加入500 μ L Wl液，靜置lmin，7000rpm離心15s，倒掉收集管中的 液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中； 7) 7000rpm 離心 Imin ；8)將吸附柱放入一個(gè)干凈的1. 5mL的離心管中，在吸附膜中央加入10 μ L無菌水， 靜置 lmin，IOOOOrpm 離心 lmin，將 EP 管C存于 _20°C。1. 2克隆到PIZ改造載體1. 2. 1酶切反應(yīng)在0. 5mL Eppendorf管中依次加入內(nèi)切酶緩沖液(10X)(TaKaRa) 2μ LDNA約 0.5yg內(nèi)切酶(TaKaRa)0. 5 μ L加水至總體積20 μ L37°C水浴 2 3h。70°C 15min 失活。按常規(guī)方法回收1. 2. 2連接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞1) 6 μ L目的片段+1. 5 μ L同酶雙酶切的改造pIZ/V5_His載體(原始pIZ/ V5-His載體購自Invitrogen，預(yù)連入EGFP蛋白加以改造。EGFP片段可以通過購 買 pEGFP(BD Biosciences Clontech)獲得)+lyL T4buffer (TaKaRa) +0. 25 μ L T4Ligase (TaKaRa)+1. 5 μ LH2O 16°C連接過夜。2)取_70°C保存的DH5a感受態(tài)細(xì)胞，用手搓使其融化后用手指輕彈，混勻菌體， 加入適量質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物，冰上放置30min。3) 42°C水浴熱擊90s，迅速冰浴1 2min。4)加入400 μ L LB液體培養(yǎng)基，于37°C搖床上低速(IOOrpm)搖動(dòng)45min。5)吸取菌液100 200 μ L，均勻涂布于LB (含100 μ g/mL Amp)平板上，平板室溫 靜置20 30min，待菌液浸入培養(yǎng)基后，倒置于37°C培養(yǎng)過夜。(6)菌落PCR初篩重組子，酶切鑒定后測序。1. 3 轉(zhuǎn)染進(jìn) High Five 細(xì)胞測序驗(yàn)證插入片段的序列正確(其序列如SEQ ID NO :1所示)后a)混合含有 1 μ g 克隆的 100 μ L ExpressFiveSFM 培養(yǎng)基(Invitrogen)和含有 lug cellinfectin (Invitrgen)白勺 100 μ L ExpressFiveSFMi音養(yǎng)基(Invitrogen) i音養(yǎng)基。b)靜置 45min。
c)加入 800 μ L ExpressFiveSFM 培養(yǎng)基(Invitrogen)，混勻。d)加入到脫血清的HighFive細(xì)胞(Invitrogen)中，室溫靜置4h。e) i^^F^f ExpressFiveSFM(Invitrogen) .#31*。1· 4 在 ExpressFiveSFM 培養(yǎng)基(Invitrogen)中加入 Evodiamine 一起培養(yǎng) 48h 后，以單獨(dú)表達(dá)EGFP蛋白的細(xì)胞作為對(duì)照，表達(dá)PjCaspase與EGFP融合蛋白的細(xì)胞作為實(shí) 驗(yàn)組，用 Flex Station IImicroplate reader (Molecular Devices，USA)檢測熒光強(qiáng)度， 結(jié)果見圖1，橫坐標(biāo)表示Evodiamine的用量，縱軸表示細(xì)胞的熒光強(qiáng)度(即Evodiamine與 PjCaspase的結(jié)合能力)，由圖可知=Evodiamine能在細(xì)胞內(nèi)與Caspase蛋白有效地結(jié)合。2、Evodiamine對(duì)凋亡活性的影響2. 1樣本處理取大小勻稱對(duì)蝦20只一組，分別注射生理鹽水(100 μ L)、WSSV病毒(IO4拷貝)、 WSSV病毒(IO4拷貝)+Evodiamine (劑量為3. 5 μ g/g體重蝦每次，以等量生理鹽水溶解)、 Evodiamine (劑量為3. 5 μ g/g體重蝦每次，以等量生理鹽水溶解)。其中小分子Evodiamine 在WSSV注射前12小時(shí)、注射后O、12、24小時(shí)注射，其他組同時(shí)補(bǔ)注射同等生理鹽水作為對(duì) 照處理。處理后的對(duì)蝦在24、36、48小時(shí)取血樣。2. 2Caspase 活性檢測(1)用500U肝素鈉1 1抽取對(duì)蝦血液。(2)將 caspase3/7 反應(yīng)底物粉末與反應(yīng) Buffer ( Caspase-Glo 3/7assay kit, Promega)混合。(3)將 IOOul 蝦血與 IOOul 反應(yīng)混合液混勻(Caspase-Glo 3/7 assaykit, Promega)。(4) 25 °C下避光溫育3小時(shí)。(5)用化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀檢測化學(xué)發(fā)光2. 3Terminal deoxynucIeotidyl transferase dUTP nick end Iabeling(TUNEL) 法檢測凋亡活性(1)在載玻片上均勻涂布蝦血細(xì)胞。(2)將載玻片浸入4%多聚甲醛(上海生工)溶液中，4°C固定25分鐘。(3)室溫下用PBS洗三遍，每次5分鐘。(4)2% Triton X-100 預(yù)滲 5 分鐘。(5) PBS 洗兩次。(6)用100 μ L平衡緩沖液(TUNEL試劑盒，Promega)平衡。(7)加入50 μ L rTdT (TUNEL試劑盒，Promega)，濕盒(塑料飯盒內(nèi)鋪滿沾水紗布 即可，也可采用上海銳聰產(chǎn)品)中37°C避光溫育1小時(shí)。(8)加入 2 X SSC (TUNEL 試劑盒，Promega)終止反應(yīng)。(9) PBS 洗三次。(10)以lyg/ml PI (上海生工)溶液染色15分鐘。(Il)PBS 洗三次。(12)熒光顯微鏡下鏡檢。圖2為采用生理鹽水、WSSV病毒、WSSV病毒+Evodiamine、Evodiamine處理的對(duì)蝦在24、36、48小時(shí)所檢測到的凋亡活性。由圖可知，Evodiamine極大地提高了凋亡活性。3、Evodiamine對(duì)病毒復(fù)制的影響3.1對(duì)蝦基因組提取以SQ Tissue Kit(Promega)提取按照2. 1方法處理后的對(duì)蝦總DNA。3. 2Real_time PCR測定病毒拷貝數(shù)合成Taqman 探針并以 b-actin 作對(duì)照，50 "C 4min, (95 "C 45s, 52 "C 45s, 72°C 45s)*45個(gè)循環(huán)。標(biāo)準(zhǔn)曲線由已知濃度的WSSV質(zhì)粒做出。圖3為采用WSSV病毒、WSSV病毒+Evodiamine (3. 5 μ g/g，以生理鹽水溶解)、WSSV病毒+Evodiamine (0. 35 μ g/g,以生理鹽水溶解)處理的對(duì)蝦在36、48小時(shí)所檢測到 的WSSV病毒拷貝數(shù)變化。由圖可知，Evodiamine有效抑制了 WSSV在對(duì)蝦體內(nèi)的復(fù)制。3、死亡率測定取大小勻稱對(duì)蝦20只一組，分別注射生理鹽水(100 μ L)、WSSV病毒 (IO4拷貝)、WSSV病毒(IO4拷貝)+Evodiamine (劑量為3. 5 μ g/g體重蝦每次，以等量生理 鹽水溶解)>Evodiamine (劑量為3. 5 μ g/g體重蝦每次，以等量生理鹽水溶解)。其中小分 子在WSSV注射前12小時(shí)、注射后0、12、24小時(shí)注射，其他組同時(shí)補(bǔ)注射同等生理鹽水作為 對(duì)照處理。記錄死亡率。圖4為采用生理鹽水、WSSV病毒、Evodiamine、WSSV病毒+Evodiamine處理的對(duì) 蝦在六天內(nèi)的死亡率變化。由圖可知，Evodiamine有效降低感染W(wǎng)SSV對(duì)蝦的死亡率并且 對(duì)對(duì)蝦沒有毒性，可在對(duì)蝦養(yǎng)殖中廣泛使用。
權(quán)利要求
吳茱萸堿(Evodiamine)在制備抗對(duì)蝦白斑綜合癥的制劑中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述吳茱萸堿用于制備誘導(dǎo)PjCaspase蛋白 活化的制劑。
3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述制劑為肌肉注射劑，其中 Evodiamine的注射劑量為1 5 μ g/g蝦。
全文摘要
本發(fā)明提供了吳茱萸堿(Evodiamine)在制備抗對(duì)蝦白斑綜合癥的制劑中的應(yīng)用。Evodiamine可作用于對(duì)蝦凋亡途徑關(guān)鍵蛋白，因此可利用該小分子制備抗對(duì)蝦白斑綜合癥的制劑，可極大地增強(qiáng)對(duì)蝦對(duì)對(duì)蝦白斑綜合癥(WSSV)的抵抗力，降低致死率。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明所述Evodiamine可以有效誘導(dǎo)PjCaspase蛋白的活化，極大地增強(qiáng)對(duì)蝦對(duì)對(duì)蝦白斑綜合癥(WSSV)的抵抗力，降低致死率；由于Evodiamine是在人體中廣泛使用的提高免疫力的藥物，對(duì)人體沒有毒性，使用Evodiamine的對(duì)蝦，無論其是否將藥物代謝完全都可以放心食用。
文檔編號(hào)A61K31/519GK101862334SQ20101019834
公開日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月11日
發(fā)明者智斌, 章曉波 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)