專(zhuān)利名稱(chēng)：小麥糖原合成酶激酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是小麥糖原合成酶激酶TaGSK1(Triticum asetivum Glycogen SynthaseKinase1)基因，屬于生命科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
研究表明，影響農(nóng)作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的最主要因素是環(huán)境脅迫，其中又以鹽脅迫和干旱脅迫最為嚴(yán)重。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1939～1978年間，影響作物產(chǎn)量的各種環(huán)境因素中干旱和鹽堿造成的減產(chǎn)高達(dá)40％以上。我國(guó)的鹽漬土壤約5億畝，其中鹽漬耕地1億多畝，還有3億多畝鹽漬荒地有待開(kāi)墾利用，次生鹽堿化土壤面積還在繼續(xù)擴(kuò)大，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大損失。如何減輕鹽脅迫對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的影響，從而使大面積的鹽堿地、荒漠化土地和豐富的鹽水資源可以為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所利用，這是未來(lái)農(nóng)業(yè)發(fā)展所面臨的一個(gè)重要課題。早在1980年Embi et al和1990年Woodgett發(fā)現(xiàn)酵母甘油合成酶激酶GSK3是一種糖原合成酶激酶以來(lái)，1999年P(guān)iao.H.L發(fā)現(xiàn)GSK3參與了植物的一系列發(fā)育過(guò)程，他通過(guò)功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)從擬南芥的cDNA中克隆了AtGSK1(編碼GSK3/shaggy-like蛋白激酶)這一激酶受NaCl和ABA誘導(dǎo)，其活性與鹽脅迫呈正相關(guān)。之后在植物中發(fā)現(xiàn)的蛋白激酶多為信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中的重要組成部分，其作用也表現(xiàn)在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的許多方面。大量研究表明蛋白激酶廣泛參與了植物對(duì)干旱、鹽脅迫、ABA誘導(dǎo)、光誘導(dǎo)等的應(yīng)答反應(yīng)。2000年Zhu J-K利用擬南芥敏鹽突變體，經(jīng)研究提出鹽脅迫下的SOS信號(hào)傳遞途徑，指出蛋白激酶參與了鹽脅迫信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，提高了植物的耐鹽性。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于目前對(duì)糖原合成酶激酶的研究證明GSK3與鹽脅迫下的信號(hào)傳導(dǎo)密切相關(guān)，本發(fā)明的目的在于從小麥耐鹽突變體中分離、克隆該基因，為進(jìn)一步研究小麥耐鹽機(jī)理，擴(kuò)大作物在鹽堿地的種植面積打下基礎(chǔ)。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，我們從1987年開(kāi)始利用濮農(nóng)3665與百農(nóng)3039雜交后的F1花藥培養(yǎng)，EMS誘變、耐鹽性反復(fù)篩選，從同一單粒的后代中得到小麥耐鹽突變體RH8706-49(耐鹽指數(shù)≥1.3)和敏鹽突變體H8706-34(耐鹽指數(shù)≤0.5)，已穩(wěn)定遺傳12代。最初我們從小麥耐鹽突變體中獲得糖原合成酶激酶基因經(jīng)過(guò)如下步驟①利用這兩個(gè)材料，分別在一定條件下水培至二葉一心，而后移入1/2Hoagland溶液，每一品系分別加入0％的NaCl和1％的NaCl脅迫處理72小時(shí)，以每一品系0％NaCl處理為對(duì)照，屆時(shí)分別取4個(gè)處理的第二葉迅速液氮冷凍提取總RNA。
②分別用上述4個(gè)處理的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈，用SMART cDNA LibraryConstruction kit(Clontech，USA)合成cDNA第2條鏈。
③用PstI/Mse1酶切、加接頭預(yù)擴(kuò)增后，將其稀釋作為cDNA-AFLP的模板，然后用r32-dATP標(biāo)記Pst1引物，經(jīng)各種不同引物組合(Pst1+3/Mse1+2)PCR擴(kuò)增，采用6％測(cè)序膠分離產(chǎn)物，X光片曝光(圖1)，從膠上切取差異表達(dá)的基因片段，再用相同的引物進(jìn)行二次擴(kuò)增，所得產(chǎn)物克隆到T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Ecoli)DH5α，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)CEQ1000-DNA序列測(cè)定儀測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果通過(guò)Intrnet進(jìn)行Blast檢索，發(fā)現(xiàn)第25號(hào)片段是小麥耐鹽突變體RH8706-49鹽脅迫下特異表達(dá)的片段，并與玉米(Maize)、苜蓿(Alfalfa)、三葉草(Trifolium)糖原合成酶激酶GSK3相應(yīng)部分相比，同源性分別達(dá)到80％、72％、72％，見(jiàn)圖2所示。
④提取RH8706-49總RNA，然后轉(zhuǎn)膜，用放射性同位素標(biāo)記的25號(hào)片段(TaGSK1)作探針，進(jìn)行Northern雜交驗(yàn)證。
⑤以上述25號(hào)片段為基礎(chǔ)，采用5′RACE和3′RACE得到了TaGSK1兩端序列，經(jīng)Northern雜交驗(yàn)證后，據(jù)此設(shè)計(jì)引物5′端引物I 5′-CGTCTAGAGTTGGTGTGGTGCGTCCTTCC-3′3′端引物II 5′-CGCCCGGGGGGGGCCTCGATCCATGAAC-3′由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成該特異引物，采用上海生物工程公司生產(chǎn)的Pfu酶，按照常規(guī)方法在美國(guó)MJ Research，Inc，PTC-100TMPCR擴(kuò)增儀上，以小麥耐鹽突變體RH8706-49的雙鏈cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增94℃預(yù)變性3min，而后94℃ 30s，60℃ 1min，72℃ 1min30s，30個(gè)循環(huán)后，72℃保溫10min。經(jīng)1％Agarose電泳后，將該擴(kuò)增片段(1.56Kb)回收加A尾，連接重組于PGEM-T質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過(guò)快速PCR法篩選出陽(yáng)性克隆，得到重組子pD-T23，經(jīng)質(zhì)粒DNA電泳和酶切電泳鑒定后菌液送往日本TaKaRa生物技術(shù)公司測(cè)序，結(jié)果見(jiàn)圖3。
該基因全長(zhǎng)1573bp，其中開(kāi)放閱讀框(ORF)含1143bp，編碼381個(gè)氨基酸，該蛋白的分子量為43.6KD，pI為8.66。我們將其命名為T(mén)aGSK1(Triticum asetivum GlycogenSynthase Kinas1)并在Gen Bank進(jìn)行了登錄，登錄號(hào)為AF525086。說(shuō)明該基因?yàn)樾←溨行掳l(fā)現(xiàn)的一個(gè)基因。該基因的核苷酸序列及相應(yīng)的氨基酸序列如圖3所示。
該基因的分離方法如下(1)按照常規(guī)方法提取小麥耐鹽突變體RH8706-49的基因組DNA(2)根據(jù)TaGSK1兩端序列設(shè)計(jì)特異引物5′端引物I5′-CGTCTAGAGTTGGTGTGGTGCGTCCTTCC-3′3′端引物II5′-CGCCCGGGGGGGGCCTCGATCCATGAAC-3′(3)PCR擴(kuò)增采用上海生物工程公司生產(chǎn)的Pfu酶，以小麥耐鹽材料RH8706-49的基因組DNA(用時(shí)稀釋50×)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
①反應(yīng)體系(在0.5ml EP管中依次加入以下成份)SDW(無(wú)菌去離子水)22μl10×Pfu buffer 5μldNTP 4μl引物I4μl引物II 4μldscDNA 10μlPfu酶1μlTotal volume 50μl②輕彈管底混合樣品，稍事離心。
③在美國(guó)MJ Research，Inc，PTC-100TMPCR擴(kuò)增儀上按下列程序進(jìn)行擴(kuò)增94℃預(yù)變性3min，[94℃ 30s，60℃ 1min，72℃ 1min30s]×30個(gè)循環(huán)后，72℃保溫10min。
(4)將上述50μl PCR產(chǎn)物在1％Agarose/EB膠上電泳，結(jié)果見(jiàn)圖4。照相后將特異擴(kuò)增片段(1.56Kb)在紫外燈下切下，產(chǎn)物回收按回收試劑盒提供的步驟進(jìn)行。
(5)擴(kuò)增產(chǎn)物的加(A)尾反應(yīng)(在0.5mlEP管中依次加入以下成份)PCR回收產(chǎn)物 6μl10×buffer(with Mgcl2) 1μldATP1μlTaq酶 2μlTotal volume10μl將混合物輕彈、混勻后，于70℃水浴15-30min。
(6)與T-載體(PGEM-T)的連接反應(yīng)(見(jiàn)圖5)Buffer(2×) 5μlT-vecter 0.8μlPCR產(chǎn)物(加A尾) 3.2μlT4DNA ligase1μlTotal volume 10μl混勻后離心，4℃反應(yīng)過(guò)夜。
(7)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(按1989 Sambrook et al.CaCl2方法制備)(8)用上述載有特異擴(kuò)增產(chǎn)物TaGSK1的T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞。
(9)通過(guò)蘭白斑篩選鑒定轉(zhuǎn)化子(重組子)提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA，用原初設(shè)計(jì)的特異引物進(jìn)行PCR鑒定，挑選陽(yáng)性克隆(見(jiàn)圖6)。
(10)將陽(yáng)性克隆擴(kuò)培后的菌液送往上海博亞公司測(cè)序，將結(jié)果與最初由小麥耐鹽突變體RH8706-49雙鏈cDNA中得到的序列進(jìn)行比較，結(jié)果完全一致，既說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的可靠性又說(shuō)明該基因在小麥的DNA中無(wú)內(nèi)含子。


圖1是典型的cDNA-AFLP選擴(kuò)結(jié)果圖。
圖2給出的是小麥糖原合成酶激酶基因的部分氨基酸序列與玉米(Maize)、苜蓿(Alfalfa)、三葉草(Trifolium)糖原合成酶激酶GSK3相應(yīng)氨基酸序列的比較圖。
圖3是小麥糖原合成酶激酶基因的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列圖。
圖4是小麥糖原合成酶激酶基因DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果圖。
圖5是小麥糖原合成酶激酶基因的克隆過(guò)程圖。
圖6為重組子的擴(kuò)增鑒定結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
下列實(shí)施例用以說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例本發(fā)明提供的小麥糖原合成酶激酶基因全長(zhǎng)1573bp，其中開(kāi)放閱讀框(ORF)含1143bp，編碼381個(gè)氨基酸，它編碼的蛋白，廣泛參與了植物對(duì)干旱、鹽脅迫、ABA誘導(dǎo)、光誘導(dǎo)等的應(yīng)答反應(yīng)，特別是其參與了鹽脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。將該基因克隆入原核表達(dá)載體，可以在大腸桿菌中表達(dá)出一種分子量為43.6KD的原核表達(dá)產(chǎn)物即糖原合成酶激酶蛋白。
上述糖原合成酶激酶基因及其表達(dá)產(chǎn)物，可由以下步驟獲得利用濮農(nóng)3665與百農(nóng)3039雜交后的F1花藥培養(yǎng)，EMS誘變、耐鹽性反復(fù)篩選從同一單粒的后代中得到小麥耐鹽突變體RH8706-49(耐鹽指數(shù)≥1.3)和敏鹽突變體H8706-34(耐鹽指數(shù)≤0.5)，經(jīng)過(guò)如下步驟①利用這兩個(gè)材料，分別在一定條件下水培至二葉一心，而后移入1/2Hoagland溶液，每一品系分別取4個(gè)處理的第二葉迅速液氮冷凍提取總RNA。
②分別用上述4個(gè)處理的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈，用SMART cDNA LibraryConstruction kit(Clontech，USA)合成cDNA第2條鏈。
③用PstI/Mse1酶切、加接頭預(yù)擴(kuò)增后，將其稀釋作為cDNA-AFLP的模板，然后用r32-dATP標(biāo)記Pst1引物，經(jīng)各種不同引物組合(Pst1+3/Mse1+2)PCR擴(kuò)增，采用6％測(cè)序膠分離產(chǎn)物，X光片曝光(見(jiàn)圖1)，從膠上切取差異表達(dá)的基因片段，再用相同的引物進(jìn)行二次擴(kuò)增，所得產(chǎn)物克隆到T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Ecoli)DH5α，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)CEQ1000-DNA序列測(cè)定儀測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果通過(guò)Intrnet進(jìn)行Blast檢索，發(fā)現(xiàn)第25號(hào)片段是小麥耐鹽突變體RH8706-49鹽脅迫下特異表達(dá)的片段，并與與玉米(Maize)、苜蓿(Alfalfa)、三葉草(Trifolium)糖原合成酶激酶GSK3相應(yīng)部分相比，同源性分別達(dá)到80％、72％、72％，見(jiàn)圖2所示。
④提取RH8706-49總RNA，然后轉(zhuǎn)膜，用放射性同位素標(biāo)記的25號(hào)片段(TaGSK1)作探針，進(jìn)行Northern雜交驗(yàn)證。
⑤以上述25號(hào)片段為基礎(chǔ)，采用5′RACE和3′RACE得到了TaGSK1兩端序列，經(jīng)Northern驗(yàn)證后，據(jù)此設(shè)計(jì)引物5′端引物I 5′-CGTCTAGAGTTGGTGTGGTGCGTCCTTCC-3′3′端引物II 5′-CGCCCGGGGGGGGCCTCGATCCATGAAC-3′由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成該特異引物，采用上海生物工程公司生產(chǎn)的Pfu酶，按照常規(guī)方法在美國(guó)MJ Research，Inc，PTC-100TMPCR擴(kuò)增儀上，以小麥耐鹽突變體974915(RH8706-49)的雙鏈cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增94℃預(yù)變性3min，而后94℃ 30s，60℃ 1min，72℃ 1min30s，30個(gè)循環(huán)后，72℃保溫10min。經(jīng)1％Agarose電泳后，將該擴(kuò)增片段(1.56Kb)回收加A尾，連接重組于PGEM-T質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過(guò)快速PCR法篩選出陽(yáng)性克隆，得到重組子PD-T23，經(jīng)質(zhì)粒DNA電泳和酶切電泳鑒定后菌液送往日本TaKaRa生物技術(shù)公司測(cè)序，結(jié)果見(jiàn)圖3。
上述糖原合成酶激酶基因及其表達(dá)產(chǎn)物，還可由以下簡(jiǎn)單步驟獲得(1)按照常規(guī)方法提取小麥耐鹽突變體RH8706-49的基因組DNA(2)根據(jù)TaGSK1兩端序列設(shè)計(jì)特異引物5′端引物I5′-CGTCTAGAGTTGGTGTGGTGCGTCCTTCC-3′3′端引物II5′-CGCCCGGGGGGGGCCTCGATCCATGAAC-3′(3)PCR擴(kuò)增采用上海生物工程公司生產(chǎn)的Pfu酶，以小麥耐鹽材料RH8706-49的基因組DNA(用時(shí)稀釋50×)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
(4)將上述PCR產(chǎn)物在1％Agarose/EB膠上電泳回收完整的擴(kuò)增產(chǎn)物。
(5)擴(kuò)增產(chǎn)物的加(A)尾反應(yīng)(6)與T-載體(PGEM-T)的連接反應(yīng)(7)制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。
(8)用上述載有特異擴(kuò)增產(chǎn)物TaGSK1的T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞。
(9)通過(guò)蘭白斑篩選鑒定轉(zhuǎn)化子(重組子)提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA，用原初設(shè)計(jì)的特異引物進(jìn)行PCR鑒定，挑選陽(yáng)性克隆(10)將陽(yáng)性克隆擴(kuò)培后的菌液送往上海博亞公司測(cè)序，將結(jié)果與最初由小麥耐鹽突變體RH8706-49雙鏈cDNA中得到的序列進(jìn)行比較，
權(quán)利要求
1.一種小麥糖原合成酶激酶基因，其特征是其可以編碼糖原合成酶激酶、參與植物鹽脅迫信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程的蛋白質(zhì)的功能，該基因的核苷酸序列及相應(yīng)的氨基酸序列如下1 GTT GGT GTG GTG CGT CCT TCC TCG CGC TTT CAG AAC GAG ACG AGT ACT AGT GGT GAT GCC 6061 GAC CGA CTT CCG AAC GAG ATG GGC AAT ATG AGC ATA AGG GAT GAG AGG GAC CCT GAG GAT 1201 M G N M S I R D D R D P E D 14121 ATA GTA GTC AAC GGC AAT GGG ACG GAA CCA GGC CAT ATT ATA GTC ACA AGC ATT GAG GGA 18015 I V V N G N G T E P G H I I V T S I E G 34181 AGA AAT GGG CAA GCA AAA CAG ACC ATT AGC TAC ATG GCT GAG CGT GTG GTT GGT AAT GGG 24035 R N G Q A K Q T I S Y M A E R VV G N G54241 TCA TTT GGA ACT GTT TTC CAG GCT AAG TGT CTT GAA ACT GGC GAG ACG GTG GCT ATA AAG 30055S F G T V F Q A K C L E T G E T V A I K74301 AAG GTT CTT CAA GAC AAG AGA TAT AAG AAC CGT GAG CTG CAA ACG ATG CGA GTT CTT GAC 36075KV L Q D K R Y K N R E L Q T M R V L D 94361 CAC CCA AAT GTT GTG GCT TTA AAG CAT TGT TTT TTC TCA AAG ACT GAG AAA GAG GAG CTT 42095 H P N V V A L K H C F F S K T E K E E L 114421 TAC CTC AAC CTG GTG CTT GAG TAT GTG CCG GAG ACT GCT CAT CGT GTC ATT AAG CAT TAT 480115 Y L N L V L E Y V P E T A H R V I K H Y 134481 AAC AAG ATG AAC CAA CGC ATG CCA TTG ATA TAT GCA AAA CTG TAC ATG TAT CAG ATA TGT 540135 N K M N Q R M P L I Y A K L Y M Y Q I C 154541 AGA TCT TTG GCA TAC ATT CAC AAC AGC ATT GGA GTA TGC CAC AGA GAC ATC AAG CCT CAA 600155 R S L A Y I H N S I G V C H R D I K P Q 174601 AAT CTT CTG GTG AAT CCA CAT ACG CAC CAA TTG AAA TTA TGT GAC TTC GGA AGT GCG AAA 660175 N L L V N P H T H Q L K L C D F G S A K 194661 GTG TTG GTA AAA GGA GAA CCA AAT ATT TCC TAT ATC TGT TCA AGG TAC TAT AGA GCC CCA 720195 V L V K G E P N I S Y I C S R Y Y R A P 214721 GAG CTC ATA TTT GGT GCT ACT GAA TAC ACA ACG GCA ATT GAC GTT TGG TCT GCT GGC TGT 780215 E L I F G A T E Y T T A I D V W S A G C 234781 GTT CTT GCT GAA CTC CTT CTA GGA CAG CCT ATA TTC CCT GGC GAC AGT GGT GTT GAT CAG 840235 V L A E L L L G Q P I F P G D S G V D Q 254841 CTT GTT GAA ATC ATC AAG GTT TTA GGT ACC CCT ACA AGA GAA GAA ATT AAG TGC ATG AAT 900255 L V E I I K V L G T P T R E E I K C M N 274901 CCA AAT TAT ACG GAG TTT AAA TTC CCA CAA ATC AAA GCT CAC CCA TGG CAC AAG ATC TTC 960275 P N Y T E F K F P Q I K A H P W H K I F 294961 CAT AAA AGA ATG CCT GCT GAA GCA GTA GAT CTT GTC TCC AGA CTC TTG CAA TAT TCA CCA 1020295 H K R M P A E A V D L V S R L L Q Y S P 3141021 AGC CTG CGT TCA ACT GCT TTG GAA GCA TTA ATT CAT CCA TTC TTC GAT GAA CTC CGG GAC 1080315 S L R S T A L E A L I H P F F D E L R D 3341081 CCA AAC ACC CGT TTG CCG AAC GGC CGT TTT CTT CCT CCC CTC TTT AAC TTT AAG CCC CAT 1140335 P N T R L P N G R F L P P L F N F K P H3541141 GAG TTG AAG GGT GTG CCG ATG GAC ATC CTG GTG AAG CTC ATC CCT GAA CAT GCT CGG AAG 1200355 E L K G V P M D I L V K L I P E H A R K3741201 AAC TGT GCC TTT GTA GGA TGG TGA TCC GCC AGA CGG CTG CTT GAA GTT TAG TTC AGA ACA 1260375 N C A F V G W * 3811261 AAT CCA GTT GTT GTC TAC TAG AAA CCC CAG GAG TTT GAG ATT GTC TGC AGC CAC ACG GGA 13201321 TAT AGG CGA TGA CAC ATG TGA TTA TTA TTC CTT TTC TCG TCC GAG ACC TCG ATG CCA TGT 13801381 ATT CTT TCC CCC TAC TGC CGA TGT AAC AAA CCA CCC ATG ATA CTG TAA GTA GAT GAG AAG 14401441 TGT TTC GAC CGT TTT CCC CTG AGC TCA TGT GCT ATG CAA TGA AGG ATG CAC CCT ATG TAC 15001501 CGC CAA TAT TTG GTC CAG TAT TTG TTC ATG GAT CGA GGC CCC CAA AAA AAA AAA AAA AAA 15601561 AAA AAA AAA AAA A1573上述基因全長(zhǎng)1573bp，其中開(kāi)放閱讀框含1143bp，編碼381個(gè)氨基酸，它編碼的蛋白分子量為43.6KD，pI為8.66。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糖原合成酶激酶基因，其特征在于是從小麥耐鹽突變體中分離得到的與其它植物中該基因序列同源性高于70％的同源基因。
3.含有權(quán)利要求1所述的糖原合成酶激酶基因的重組原核表達(dá)載體，其特征在于將糖原合成酶激酶基因克隆至原核表達(dá)載體后獲得的原核表達(dá)載體。
4.含有權(quán)利要求1所述的糖原合成酶激酶基因編碼的蛋白，其特征在于用原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)出的糖原合成酶激酶蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糖原合成酶激酶基因，其特征在于它導(dǎo)入受體可用于耐鹽作物品系的培育。
6.一種得到權(quán)利要求1所述的糖原合成酶激酶基因、或3所述的原核表達(dá)載體、或4所述的糖原合成酶激酶蛋白、或5所述的該基因的應(yīng)用方法，其特征在于，包括如下步驟(1)按照常規(guī)方法提取小麥耐鹽突變體RH8706-49的基因組DNA(2)根據(jù)TaGSK1基因兩端序列設(shè)計(jì)特異引物5′端引物I5′-CGTCTAGAGTTGGTGTGGTGCGTCCTTCC-3′3′端引物II5′-CGCCCGGGGGGGGCCTCGATCCATGAAC-3′(3)PCR擴(kuò)增采用上海生物工程公司生產(chǎn)的Pfu酶，以小麥耐鹽材料RH8706-49的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。(4)將上述PCR產(chǎn)物在1％Agarose/EB膠上電泳回收完整的擴(kuò)增產(chǎn)物。(5)擴(kuò)增產(chǎn)物的加(A)尾反應(yīng)(6)與T-載體(PGEM-T)的連接反應(yīng)(7)制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。(8)用上述載有特異擴(kuò)增產(chǎn)物TaGSK1的T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞。(9)通過(guò)蘭白斑篩選鑒定轉(zhuǎn)化子提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA，用原初設(shè)計(jì)的特異引物進(jìn)行PCR鑒定，挑選陽(yáng)性克隆(10)將陽(yáng)性克隆擴(kuò)培后的菌液送往上海博亞公司測(cè)序，將結(jié)果與最初由小麥耐鹽突變體RH8706-49雙鏈cDNA中得到的序列進(jìn)行比較。
全文摘要
本發(fā)明通過(guò)利用cDNA－AFLP技術(shù)將小麥耐鹽突變體鹽脅迫下特異表達(dá)片段克隆、序列測(cè)定Blast檢索和RACE方法獲得小麥糖原合成酶激酶基因。該基因全長(zhǎng)1573bp，其中開(kāi)放閱讀框(ORF)含1143bp，編碼381個(gè)氨基酸，它編碼的蛋白廣泛參與了植物對(duì)干旱、ABA誘導(dǎo)、光誘導(dǎo)等的應(yīng)答反應(yīng)，特別是其參與了鹽脅迫信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，將該基因克隆入原核表達(dá)載體，可以在大腸桿菌中表達(dá)出一種分子量為43.6KD的原核表達(dá)產(chǎn)物即糖原合成酶激酶蛋白。本發(fā)明為進(jìn)一步研究小麥耐鹽機(jī)理，提高小麥耐鹽性，擴(kuò)大作物在鹽堿地的種植面積奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1523110SQ0314328
公開(kāi)日2004年8月25日 申請(qǐng)日期2003年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月9日
發(fā)明者沈銀柱, 黃占景, 馬聞師, 陳桂平, 徐濤 申請(qǐng)人:河北師范大學(xué)