專利名稱：轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)移雙重控制的甲胎蛋白增強型表皮生長因子受體介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及乙肝病毒相關肝細胞肝癌基因，具體涉及由表皮生長因子受體和肝癌特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列介導的可在轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)錄水平雙重控制的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移載體。
質(zhì)粒型載體進入受體細胞，必須借助有效的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。自1987年首先利用偶聯(lián)了脫唾液酸人血清類粘蛋白的多聚賴氨酸與質(zhì)粒形成復合物將質(zhì)粒特異性導入肝細胞表達。之后，以細胞受體介導的肝臟的靶向基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)受到普遍關注。1998年，上海腫瘤研究所田培坤、顧健人教授等建立了一種新的細胞表面受體為靶向的高效基因?qū)胂到y(tǒng)，參見田培坤，顧建人等，一種新的以細胞表面受體為靶向的基因?qū)胂到y(tǒng)，中國科學C輯，28(6)554-558。設計針對表皮生長因子受體(EGFR)的16肽GE7作為配體寡肽(Ligandoligopeptide，LOP)，建立受體介導的四元復合體，將β-gal基因特異性導入多種腫瘤細胞，顯示了其在基因治療中的優(yōu)勢和潛在應用價值。但是，必須考慮到受體的表達并非腫瘤專一。有些正常組織同樣可有一定數(shù)量的某種在腫瘤細胞高表達的受體，如表皮生長因子受體EGFR即具有這種特性。田培坤等利用含針對EGFR的GE7配體寡肽的四元復合體導入β-gal基因時，發(fā)現(xiàn)β-gal雖然在心、肝、腎、肺、脾等重要臟器不表達，但可表達于皮膚表皮、胃及精細管上皮細胞。這些結果提示四元復合體介導的基因轉(zhuǎn)染其靶向性受EGFR表達的非特異性而具有一定局限性。
(二)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，提供一類可在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)移水平雙重控制的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移載體，此類載體是甲胎蛋白(AFP)介導的外源DNA-配體寡肽-多聚陽離子多肽-內(nèi)吞小體釋放寡肽組成的甲胎蛋白(AFP)增強型表皮生長因子受體(EGFR)介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移表達。本發(fā)明的另一個內(nèi)容是提出甲胎蛋白(AFP)增強型表皮生長因子受體介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移載體在體內(nèi)外對肝癌的抑制作用。
本發(fā)明的第一方面提供甲胎蛋白(AFP)增強型表皮生長因子受體(EGFR)介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移表達載體，包括甲胎蛋白(AFP)介導的外源DNA、配體寡肽、多聚陽離子多肽和內(nèi)吞小體釋放寡肽。
上述配體寡肽是針對表皮生長因子受體的多肽；多聚陽離子多肽為多聚賴氨酸或多聚精氨酸；內(nèi)吞小體釋放寡肽是流感病毒血凝素HA氨基端的20肽；外源DNA為含肝癌特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列及HBV反義基因片段的真核型表達載體。
上述的多聚賴氨酸或多聚精氨酸的分子量范圍為12萬～80萬。
AFP增強型外源DNA為含肝癌特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列及HBV反義基因的真核型表達載體，包括攜帶有肝癌特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列AFP啟動子及增強子的腺病毒載體、腺相關病毒載體及其他以AFP啟動子及增強子為順式調(diào)控序列的真核表達載體；HBV反義基因包括HBV各亞型全基因及HBV各種不同片段的反義基因。配體寡肽是針對表皮生長因子受體的多肽；陽離子多肽為多聚賴氨酸或多聚精氨酸；內(nèi)吞小體釋放寡肽是流感病毒血凝素HA氨基端的20肽。本發(fā)明借助AFP啟動子和表皮生長因子受體介導外源基因在AFP陽性表達的肝癌中特異性靶向表達，是一種新型的肝癌基因轉(zhuǎn)移技術。
轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)移雙重控制的甲胎蛋白增強型表皮生長因子受體介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移載體的制備方法如下以美國ABI多肽合成儀合成針對表皮生長因子受體(EGFR)的16肽GE7、流感病毒血凝素功能域20肽HA20，按操作說明完成。通過混合配體寡肽GE7、多聚陽離子多肽和內(nèi)吞小體釋放寡肽HA20，實現(xiàn)共價連接，將GE7、HA20分別與-多聚賴氨酸連接形成共價連接物。將此共價連接物與肝癌特異性表達質(zhì)粒pEBAF-as-preS2(AFP啟動子控制的含HBV preS2反義基因的真核表達載體)混合，籍靜電作用結合為pEBAF-as-preS2-配體寡肽-陽離子多肽-內(nèi)吞小體釋放寡肽的AFP增強型EGFR介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移載體。

圖1為此轉(zhuǎn)移載體的1％瓊脂糖凝膠電泳圖。以此轉(zhuǎn)移載體尾靜脈注射，轉(zhuǎn)染荷瘤鼠，3天后，抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR證實HBpreS2反義RNA僅表達于腫瘤組織，在其它重要臟器，包括胃粘膜上皮細胞和精細管上皮細胞中沒有表達。圖2是荷瘤鼠組織逆轉(zhuǎn)錄PCR電泳結果圖。
本發(fā)明的第二方面是甲胎蛋白(AFP)增強型表皮生長因子受體介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移表達載體應用于體內(nèi)外抑制肝癌生長。
體外實驗將含有pre2反義RNA的AFP增強型EGFR介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移載體體外轉(zhuǎn)染肝癌細胞，3天后，取上清，酶聯(lián)免疫吸附法測定HBV表面抗原和核心抗原表達量；同時，熒光定量PCR測定HNV DNA量。結果表明針對preS2的反義RNA可顯著抑制HBV表面抗原和核心抗原表達，分別為33.4％和58.5％；對HBV DNA復制的抑制率為86％。
體內(nèi)實驗1×107肝癌細胞腋窩皮下注射，制備荷瘤動物模型，當瘤體直徑＞＝0.5cm時，同上制備包裹反義RNA載體的AFP增強型EGFR介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移載體，瘤內(nèi)皮下注射含0.2μg DNA的AFP增強型EGFR介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移表達系統(tǒng)，每周1次，共4次，注射完成1周后，瘤體直徑0.995cm±0.35，顯著低于生理鹽水對照組。
優(yōu)良效果轉(zhuǎn)移載體尾靜脈注射，轉(zhuǎn)染荷瘤鼠，3天后，抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR證實HBpreS2反義RNA僅表達于腫瘤組織，在其它重要臟器，包括胃粘膜上皮細胞和精細管上皮細胞中沒有表達。
將含有pre2反義RNA的AFP增強型EGFR介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移載體體外轉(zhuǎn)染肝癌細胞，3天后，取上清，酶聯(lián)免疫吸附法測定HBV表面抗原和核心抗原表達量；同時，熒光定量PCR測定HNV DNA量。結果表明針對preS2的反義RNA對抗原的抑制作用最強，HBsAg、HBeAg分泌量分別降低了33.4％和58.5％。熒光定量PCR結果表明針對preS2的反義RNA對HBV DNA復制的抑制率為86％。
將含有pre2反義RNA的AFP增強型EGFR介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移載體對荷瘤鼠行瘤內(nèi)皮下注射，4次注射后，裸鼠腫瘤直徑為0.995cm±0.35，顯著低于生理鹽水對照組(2.125cm±0.25)，P＜0.05。
圖2是荷瘤鼠組織逆轉(zhuǎn)錄PCR電泳結果圖。其中，8、輸精管上皮中逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物9、胃組織中逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物，10、肝組織中逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物，11、脾組織中逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物，12、心組織中逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物，13、腫瘤組織中逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物，14、腫瘤組織中逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物，15、DNA分子量，從上至下依次為2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，125bp。
實施例2針對preS2反義RNA肝癌靶向性表達載體的構建preS2 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳后，切下含目的基因片段的凝膠，按DNA純化回收試劑盒操作步驟回收擴增產(chǎn)物。Xbal分別酶切PCR產(chǎn)物和pEBAF質(zhì)粒DNA，T4連接酶室溫連接過夜。次日取連接產(chǎn)物10μl轉(zhuǎn)化DH5α，獲得重組陽性單克隆。
實施例3AFP增強型EGFR介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移表達系統(tǒng)的制備針對表皮生長因子受體(EGFR)的16肽GE7、流感病毒血凝素功能域20肽HA20在美國ABI多肽合成儀上，按操作說明完成。將GE7、HA20分別與多聚陽離子多肽。共價連接，制備為GE7-PL、HA20-PL共價連接物。將實施例2中制備的肝癌靶向性質(zhì)粒DNA與共價連接物分別以不同比例均勻混合于10μl滅菌三蒸水中，25℃靜置30min后，將10μl混合物以1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA阻滯情況，以DNA完全被阻滯在加樣孔中的濃度比為最佳配比。按最佳配比，將質(zhì)粒DNA緩慢滴加于GE7-PL、HA20-PL共價連接物中，邊加邊混勻，25℃靜置30min。1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA阻滯情況后立即用于基因轉(zhuǎn)染。實施例4AFP增強型EGFR介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移表達系統(tǒng)體外基因?qū)朐囼灲臃N5×104/孔的細胞于24孔板，24hr后，細胞長滿至60％左右，用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時同上制備AFP增強型EGFR介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移表達系統(tǒng)，去掉培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)液，換上上述制備好的含有0.2μg AFP增強型EGFR介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移表達系統(tǒng)的完全培養(yǎng)基0.5ml，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)染過夜，換為不含AFP增強型EGFR介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移表達系統(tǒng)的新鮮完全MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3天后收集上清測定HBV抗原。未轉(zhuǎn)染的HepG2.2.15細胞為對照。實施例5HBV抗原的檢測以酶聯(lián)免疫吸附法測定上清中HBsAg、HBeAg含量。將微孔條固定于支架上，每孔加入50μl待測樣品，設陰、陽性對照各2孔，50μl/孔，并設空白對照1孔。再每孔加酶標記物50μl(空白對照不加)，充分混勻，37℃孵育30min；棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿各孔，靜置1min，傾去孔內(nèi)液體，扣干。每孔加顯色劑A、B各50μl，振蕩混勻，置37℃孵育15min。陽性孔呈藍色。每孔加入50μl終止液(2MH2SO4)，輕輕混勻，終止反應，用美國產(chǎn)EL312型酶標儀測定各孔OD值。檢測波長495nm，參考波長為630nm。檢測結果以P/N值表示，P/N＝標本A/陰性對照A?？乖种坡剩?實驗孔P/N-對照孔P/N)/(對照孔P/N-2.1)。P/N值＝實驗孔A值/陰性對照A值。實施例6熒光定量PCR檢測HBV DNA(1)標本及對照標準品的處理取轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)上清40μl，分別加等量DNA提取液混勻，沸水浴10min，轉(zhuǎn)至4℃靜置8-12hr以保證病毒顆粒充分裂解。10000rpm離心5min，取上清2μl作PCR反應。另取陽性對照標準品和陰性對照標準品各10μl同上處理。(2)PCR擴增及反應前熒光檢測取單管單人份PCR反應管一管，直接加入處理后樣品或定量標準品2μl，6000rpm離心數(shù)秒，將各反應管放入PCR儀，按下列條件擴增93℃ 2min預變性，然后按93℃ 45秒，55℃120秒，反應10個循環(huán)后置33℃保溫，3min后迅速逐個將反應管放入熒光檢測儀，讀取并記錄讀數(shù)A0，熒光激發(fā)波長為487nm，檢測波長為525nm。最后按93℃ 45秒，55℃120秒，共做30個循環(huán)后，置33℃保溫。(3)PCR反應后熒光檢測待各PCR管充分冷卻置33℃后，迅速迅速逐個將反應管放入熒光檢測儀，讀取并記錄讀數(shù)A1，熒光激發(fā)波長為487nm，檢測波長為525nm。(4)結果判定計算Ax＝A1-A0，并以標準品計算值制作標準曲線，并由此查出待測值。最后計算單位為病毒粒子/ml。實施例7荷瘤動物模型的制備5-6周齡雄性裸鼠6只，1×107/ml對數(shù)生長期HepG2.2.15細胞腋窩皮下注射0.1ml，3周后實體瘤長至0.5cm時用于實驗。實施例8AFP增強型EGFR介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移表達系統(tǒng)體內(nèi)抑瘤實驗同上制備AFP增強型EGFR介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移表達系統(tǒng)。取荷瘤裸鼠，瘤體大于等于0.5cm時，用藥，0.2μg/鼠，每周1次，共4次。生理鹽水注射組為對照，逐日觀察，5周后處死裸鼠，分離瘤體，測量直徑。
權利要求
1.轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)移雙重控制的甲胎蛋白增強型表皮生長因子受體介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移載體，其特征在于，包括甲胎蛋白介導的外源DNA、配體寡肽、多聚陽離子多肽和內(nèi)吞小體釋放寡肽。
2.如權利要求1所述的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)移雙重控制的甲胎蛋白增強型表皮生長因子受體介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移載體，其特征在于，所述配體寡肽是針對表皮生長因子受體的多肽。
3.如權利要求1所述的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)移雙重控制的甲胎蛋白增強型表皮生長因子受體介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移載體，其特征在于，所述多聚陽離子多肽為多聚賴氨酸或多聚精氨酸。
4.如權利要求1所述的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)移雙重控制的甲胎蛋白增強型表皮生長因子受體介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移載體，其特征在于，所述內(nèi)吞小體釋放寡肽是流感病毒血凝素HA氨基端的20肽。
5.如權利要求1所述的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)移雙重控制的甲胎蛋白增強型表皮生長因子受體介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移載體，其特征在于，所述外源DNA為含肝癌特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列及HBV反義基因片段的真核型表達載體。
6.權利要求1所述的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)移雙重控制的甲胎蛋白增強型表皮生長因子受體介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移載體的制備方法，以美國ABI多肽合成儀合成針對表皮生長因子受體的16肽GE7、流感病毒血凝素功能域20肽HA20，通過混合配體寡肽GE7、多聚陽離子多肽和內(nèi)吞小體釋放寡肽HA20，實現(xiàn)共價連接，將GE7、HA20分別與-多聚賴氨酸連接形成共價連接物，將此共價連接物與肝癌特異性表達質(zhì)粒pEBAF-as-preS2混合，籍靜電作用結合為pEBAF-as-preS2-配體寡肽-陽離子多肽-內(nèi)吞小體釋放寡肽的AFP增強型EGFR介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移載體。
7.權利要求1所述的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)移雙重控制的甲胎蛋白增強型表皮生長因子受體介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移載體的應用，其特征在于，應用于體內(nèi)外抑制肝癌生長。
全文摘要
轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)移雙重控制的甲胎蛋白增強型表皮生長因子受體介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移載體，屬于乙肝病毒相關肝細胞肝癌基因技術領域。包括甲胎蛋白介導的外源DNA、配體寡肽、多聚陽離子多肽和內(nèi)吞小體釋放寡肽。配體寡肽是針對表皮生長因子受體的多肽，多聚陽離子多肽為多聚賴氨酸或多聚精氨酸，內(nèi)吞小體釋放寡肽是流感病毒血凝素HA氨基端的20肽，外源DNA為含肝癌特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列及HBV反義基因片段的真核型表達載體。本發(fā)明的甲胎蛋白增強型表皮生長因子受體介導的肝癌靶向性基因轉(zhuǎn)移載體的應用于體內(nèi)外抑制肝癌生長。
文檔編號C12N15/11GK1431310SQ0311172
公開日2003年7月23日 申請日期2003年1月16日 優(yōu)先權日2003年1月16日
發(fā)明者孫汶生, 馬春紅, 劉素俠, 曹英林, 張利寧, 王曉燕, 高立芬 申請人:山東大學