專利名稱：使用腫瘤－衍生的樹突細胞抑制因子拮抗劑和Toll類受體激動劑的組合治療癌癥的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及在治療疾病狀態(tài)，特別是癌癥中操作和活化樹突細胞(DC)的方法。
現(xiàn)有技術(shù)樹突細胞(DC)在啟動和調(diào)節(jié)先天性及適應性免疫反應上扮演重要角色(Banchereau等人，1998，Nature 392245-252)。關(guān)于癌癥，樹突細胞可取樣并呈現(xiàn)腫瘤抗原和激發(fā)腫瘤特異性細胞毒性T細胞(Chiodoni等人，1999，J.Exp.Med.190125-133)。此外，樹突細胞可以是細胞因子白細胞介素-12(IL-12)的重要來源。腫瘤壞死因子α(TNFα)，和干擾素α(IFNα)在抗腫瘤免疫反應中起作用(Banchereau等人，1998，Nature 392245-252)。因此，近年來，研究者已嘗試將DC活性運用在癌癥治療中(參見，例如Mehta-Damani等人，1994，J.Immunology 153996-1003；Hsu等人，1996，NatureMedicine 252；Murphy等人，1996，The Prostate 29371；Mehta-Damani等人，1994，J.Immunology 153996-1003；Dallal等人，2000，Curr.Opin.Immunol.12583-588；Zeid等人，1993，Pathology 25338；Furihaton等人，1992，61409；Tsujitani等人，1990，Cancer 662012；Gianni等人，1991，Pathol.Res.Pract.187496；Murphy等人，1993，J.Inv.Dermatol.1003358)。
為了誘導適當?shù)拿庖叻磻?，必需在抗原表達位置補充樹突細胞，攝入抗原，并在接收通過病原體傳遞的活化信號時遷移至二級淋巴器官，正在死亡的細胞和/或T細胞。很多研究已提出在人類腫瘤中DC的情況并已發(fā)表在腫瘤或在癌癥患者中減弱的DC功能(Bell等人，1999，J.Exp.Med.1901417-1426；Scarpino等人，2000，Am.J.Pathol.156831-837；Lespagnard等人，1999，Int.J.Cancer 84309-314；Enk等人，1997，Int.J.Cancer 73309-316)。此外，在一些研究中觀察到活化DC是正(positive)預后因子(Enk等人，1997，Int.J.Cancer 73309-316)。因此，提高在腫瘤中的樹突細胞活性可能是治療癌癥的有效方法。
腫瘤可通過干擾DC的運行或通過不提供必要的活化信號而逃過免疫系統(tǒng)(Vicari等人，2001，Seminars in Cancer Biology，出版中)。尤其，腫瘤似乎不表達許多病原體相關(guān)性分子模式(PathogenAssociated Molecular Patterns)(PAMPs)(Medzhitov等人，2000，Sem.Immunol.12185-188)，其可引發(fā)DC活化(Reis等人，2001，Immunity 14495-498)。
近年來，Toll類受體(Toll-like receptor)(TLR)分子已被確認為PAMPs的受體的重要種類。Toll類受體(TLRs)識別特異于微生物病原體的分子模式(Aderem等人，2000，Nature 406782-787)。在人類中已描述十種不同的TLR分子。1999年11月12日公開的專利WO98/50547中公開了TLRs2-10。值得注意的是，現(xiàn)在公開的命名包括在人類中十種不同的TLRs，其中九種相當于WO 98/50547的TLR-2至TLR-10，但其編號不吻合(Kadowaki等人，2001，J.Exp.Med.194863-869)。
通過微生物分子引發(fā)的TLRs發(fā)信號強烈地活化DCs以上升調(diào)節(jié)共刺激分子(CD80和CD86)(Hertz等人，2001，J.Immunol.1662444-2450)并產(chǎn)生前炎性(proinflammatory)的細胞因子(TNF-α，IL-6和IL-12)(Thoma-Uszynski等人，2001，J.Immunol.1543804-3810)。許多研究目前已鑒別出廣泛種類的化學多樣性(chemically-diverse)細菌產(chǎn)物，其可作為TLR蛋白質(zhì)的配體，包括細菌性脂聚醣(TLR-4)，鞭毛蛋白(TLR-5)，脂磷壁酸(TLR-2)和聚IC(TLR-3)。更特殊地，TLR-9已顯示為免疫刺激性細菌CpG DNA的配體(Hemmi等人，2000，Nature 408740-745；Wagner，2001，Immunity14499-502)。
此外，腫瘤啟動抑制DC分化或功能的因子的分泌。一種可在癌癥中抑制DC功能的腫瘤相關(guān)性因子是IL-10。已報導多種人類原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移分泌白細胞介素-10(IL-10)(Chouaib等人，1997，Immunol.Today 18493-497)。該因子已被描述是DC功能的強調(diào)節(jié)劑。實際上，IL-10可負向調(diào)節(jié)IL-12的產(chǎn)生并抑制DC的T-細胞共刺激潛力(co-stimulatory potential)(DeSmedt等人，1997，Eur.J.Immunol.271229-1235；Caux等人，1994，Int.Immunol.61177-1185)。拮抗性DC抑制信號例如IL-10，對改善DC活化和因而產(chǎn)生的宿主對抗癌癥的免疫反應的作用仍是未知的。
目前有效的癌癥的治療方法例如外科療法，放射療法，化療法和免疫生物法，具有有限的成功率或產(chǎn)生嚴重且不希望的副作用。在許多臨床診斷的實性腫瘤中(其中該腫瘤是局部生長)，外科切除被認為是首選治療方式。然而，常常在手術(shù)后和一段時間后，發(fā)現(xiàn)原始腫瘤已轉(zhuǎn)移，使得第二部位的癌侵襲已遍布全身且患者隨后死于第二次癌癥生長。雖然化療廣泛用于癌癥的治療，它是一種通?；陬A防細胞增生的系統(tǒng)性療法。因此，化療是為非特異性治療形式，其影響所有增生細胞，包括正常細胞，導致不希望的且通常是嚴重的副作用。
因此，需要新方法以治療由異常免疫反應而產(chǎn)生的疾病，特別是癌癥。特別地，闡明促進腫瘤-浸潤的樹突細胞活化的因子將允許操作樹突細胞以提高腫瘤特異性免疫反應。通過操作樹突細胞而調(diào)節(jié)免疫反應的方法和療法將可應用于這些疾病的治療。
發(fā)明概述本發(fā)明通過提供用于疾病例如癌癥的免疫療法的材料和方法，通過促進腫瘤-浸潤的樹突細胞的活化而實現(xiàn)上述需求。已發(fā)現(xiàn)聯(lián)合給予IL-10拮抗劑和TLR-9激動劑是一種有效的癌癥療法。因此，本發(fā)明提供治療癌癥的方法，其包含對需要的個體給予有效量的腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑與有效量的TLR激動劑聯(lián)合使用。
在優(yōu)選實施例中，腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑可是下列任一種已知的抑制樹突細胞功能的腫瘤相關(guān)因子的拮抗劑IL-6，VEGF，CTLA-4，OX-40，TGF-β，前列腺素，神經(jīng)節(jié)苷脂，M-CSF和IL-10。較優(yōu)選，該腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑是IL-10拮抗劑。最優(yōu)選，該IL-10拮抗劑是IL-10細胞因子的直接拮抗劑或IL-10受體的拮抗劑。在某些具體實施例中，腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑是一種抗體或抗體片段，一種小分子或反義核苷酸序列。最優(yōu)選，該腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑是一種抗-IL-10受體抗體。
在某些具體實施例中，TLR激動劑是一種小分子，重組蛋白質(zhì)，抗體或抗體片段，核苷酸序列或蛋白質(zhì)-核酸序列。在優(yōu)選具體實施例中，TLR激動劑是TLR-9的激動劑。較優(yōu)選，該TLR激動劑是免疫刺激性核苷酸序列。仍較優(yōu)選，該免疫刺激性核苷酸序列含有一個CpG基序。最優(yōu)選，該免疫刺激性核苷酸序列選自CpG 2006(表2和SEQID NO1)；CpG 2216(表2和SEQ ID NO2)；AAC-30(表2和SEQ IDNO3)；和GAC-30(表2和SEQ ID NO4)。該免疫刺激性核苷酸序列可通過構(gòu)造修飾例如硫代磷酸酯(phosphorotioate)修飾被穩(wěn)定或可裝入陽離子微脂體膠囊中以改善活體內(nèi)藥物動力學和腫瘤導向。
在某些具體實施例中，腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑和/或TLR激動劑是靜脈內(nèi)、腫瘤內(nèi)、皮內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或局部給予。
在一些具體實施例中，腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑和TLR激動劑是以融合蛋白質(zhì)或其它彼此連結(jié)的形式給予。
本發(fā)明方法可進一步包含給予至少一種腫瘤相關(guān)性抗原。該腫瘤抗原可以融合蛋白質(zhì)的形式傳送或可連結(jié)TLR激動劑和/或腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑。
在本發(fā)明另一方面中，還給予活化劑，例如TNF-α，IFN-α，RANK-L或RANK激動劑，CD40-L或CD40的激動劑，41BBL或41BB的激動劑或其它TNF/CD40受體家族成員的其它推測的配體/激動劑。
在本發(fā)明的另一方面中，細胞因子是在之前或同時與腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑和/或TLR激動劑聯(lián)合給予。在一個優(yōu)選方面中，細胞因子是GM-CSF或G-CSF或FLT-3L，其可作為重組蛋白質(zhì)或重組融合蛋白質(zhì)或傳送載體。給予這些因子刺激某些DC的亞組由前體生成，因而增加由腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑和TLR激動劑組合活化的腫瘤-浸潤的樹突細胞數(shù)目。
本發(fā)明的另一方面中，選用的趨化因子是在之前或同時與腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑和/或TLR激動劑一起給予。在一優(yōu)選方面中，趨化因子選自CCL13，CCL16，CCL7，CCL19，CCL20，CCL21，CXCL9，CXCL10，CXCL11，CXCL12，其可作為重組蛋白質(zhì)或重組融合蛋白質(zhì)或傳送載體。在一最佳方面，趨化因子是在腫瘤內(nèi)注射后直接，或經(jīng)由導向構(gòu)建物(targeting construct)，例如重組抗體，或經(jīng)由膠囊化，在特別可有利地傳送至腫瘤內(nèi)的媒介物傳送至腫瘤。給予趨化因子可促進某些DC亞組(subset)補充至腫瘤內(nèi)，因而增加由腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑和TLR激動劑組合活化的腫瘤-浸潤的樹突細胞數(shù)目。
附圖簡要說明

圖1顯示C26-6CK腫瘤-浸潤的樹突細胞與骨髓-衍生的樹突細胞相比較，對LPS+抗-CD40+IFNγ組合無反應。圖1A表示通過FACS分析MHCII類，CD40和CD86的表面表達的結(jié)果(門控(gated)在CD11c陽性細胞)。圖1B表示通過CD11c+細胞在20小時，包括與BrefeldinA溫育2.5小時后的IL-12p40的細胞內(nèi)表達。圖1C表示混合的白血球反應。圖1D中，以LPS+IFNγ+抗-CD40活化后通過特異性ELISA在培養(yǎng)上清液中測定IL-12p70。
圖2.CpG1668+抗-IL-10R在C26-6CK腫瘤-浸潤的樹突細胞內(nèi)組合復原的IL-12和TNFα。使用抗-CD11c磁珠富集來自C26-6CK的TIDC并在GM-CSF和各種組合的LPS、IFNγ、抗-CD40、抗-IL10R和CpG1668存在下培養(yǎng)過夜。通過特異性ELISA在培養(yǎng)上清液中測定IL-12p70和TNFα水平。
圖3.CpG1668+抗-IL-10R組合復原的DC浸潤的C26-6CK腫瘤的MLR刺激能力。使用抗-CD11c磁珠富集來自C26-6CK的TIDC并在GM-CSF和各種組合的LPS、IFN-γ、抗CD40、抗-IL10R和CpG1668存在下培養(yǎng)過夜。再將細胞照射并以不同數(shù)目在固定數(shù)目的富集的同種異體的T細胞(3×105T細胞)存在下培養(yǎng)5天。通過在培養(yǎng)的最后18小時期間引入放射性胸苷測定其增殖。
圖4來自親代C26腫瘤的腫瘤-浸潤的樹突細胞和來自不同組織學起源的腫瘤對于LPS+IFNγ+抗-CD40組合無反應，但對CpG1668+抗-IL-10R反應生成IL-12。將來自指定腫瘤的TIDC以抗-CD11c磁珠富集并在GM-CSF、LPS+IFNγ+抗-CD40或抗-IL-10R+CpG1668存在下培養(yǎng)過夜。圖4表示培養(yǎng)的細胞經(jīng)20小時，包括與Brefeldin A溫育2.5小時后的IL-12p40的細胞內(nèi)表達和CD11c的表面表達。
圖5表示C26-6CK腫瘤模型中的CpG 1668+抗-IL10R抗體的療效。將7周大的雌BALB/c小鼠的組皮下注射5×104個C26-6CK細胞并以每周兩次腹膜內(nèi)注射250微克純化的抗-IL10R抗體和每周一次在腫瘤內(nèi)注射10微克CpG1668的組合處理，在腫瘤接種第7天開始治療三周。
圖6表示C26腫瘤模型中的CpG1668+抗-IL10R抗體的療效。將7周大的雌BALB/c小鼠的組皮下注射5×104個C26細胞并以每周一次腹膜內(nèi)注射250微克純化的抗-IL10R抗體和在腫瘤內(nèi)注射5微克CpG1668的組合處理，在腫瘤接種第7天開始治療三周。
圖7表示B1F0黑色素瘤腫瘤模型中的CpG1668+抗-IL10R抗體的療效。將7周大的雌C57BL/6小鼠的組皮下注射5×104個B16F0細胞并以每周一次腹膜內(nèi)注射250微克純化的抗-IL10R抗體和在腫瘤內(nèi)注射5微克CpG1668的組合處理，在腫瘤接種第7天開始治療三周。
圖8表示另一種IL-10拮抗劑，單克隆抗-IL10抗體，其與TLR-9激動劑CpG1668組合，可誘導DC浸潤的C26-6CK腫瘤的IL-12的生成。使用抗-CD11c磁珠富集來自C26-6CK的TIDC并在GM-CSF或抗-IL10R+CpG1668或抗-IL10+CpG1668存在下培養(yǎng)過夜。圖8表示培養(yǎng)的細胞經(jīng)20小時，包括與Brefeldin A溫育2.5小時后的IL-12p40的細胞內(nèi)表達和CD11c的表面表達。
圖9表示另一種腫瘤-衍生的DC抑制因子，PGE2，其可被拮抗以使DC活化。在含有(吲哚美辛處理的)PGE2的腫瘤上清液存在或缺乏下培養(yǎng)骨髓-衍生的DC。不同DC經(jīng)LPS、IFNγ和抗-CD40抗體的組合在抗-IL10R抗體存在或缺乏下活化后，測定其成熟標記物的表達和IL-12的產(chǎn)生。
圖10表示C26-6CK結(jié)腸癌腫瘤模型中的CpG1668+吲哚美辛的療效。將8周大的雌BALB/c小鼠的組皮下注射5×104個C26-6CK細胞并以每周一次在腫瘤內(nèi)注射5微克CpG1668，在腫瘤接種第7天開始三周，和/或自第5至第28天給予吲哚美辛5微克/毫升在飲水中的組合處理治療的。
發(fā)明的詳細說明本文中所列的參考文獻均全文引入作為參考。
本發(fā)明是部分基于驚奇發(fā)現(xiàn)聯(lián)合給予腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑與TLR激動劑在數(shù)種活體內(nèi)腫瘤發(fā)展的模型中，包括C26-6CK，C26和B16F0具有強療效活性?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)IL-10拮抗劑和TLR-9激動劑的聯(lián)合給予可使腫瘤-浸潤的樹突細胞反而可不應(refractory)活化、生成IL-12和TNFα并誘導改善的腫瘤抗原特異性免疫反應。此外，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)對帶有腫瘤的動物給予IL-10拮抗劑和TLR-9激動劑可誘導腫瘤的排斥作用。
許多報告已提出腫瘤內(nèi)部DC的活化狀態(tài)。在其中一篇報告中，經(jīng)轉(zhuǎn)導以表達GM-CSF和CD40L的老鼠C26結(jié)腸癌腫瘤可被具有成熟表型的DC重度滲透，且一部分腫瘤在開始生長后退化(Chiodoni等人，1999，J.Exp.Med.190125-133)。相同的C26細胞經(jīng)改造以表達6Ckine可被未成熟DC滲透(Vicari等人，2000，J.Immunol.1651992-2000)。因為DC的活化和隨后的成熟對于免疫反應起動是重要活動，所以認為C26-6CK腫瘤-浸潤的樹突細胞的活化可導致腫瘤排斥作用。出乎意料地，已發(fā)現(xiàn)對于那些腫瘤-浸潤的DC無法通過抗-CD40激動劑抗體通過CD40的刺激作用進行反應，用作讀出共同刺激分子的上升調(diào)節(jié)，在混合白血球反應中刺激T細胞的能力和生成IL-12和TNFα的能力。它們對于細菌刺激LPS-一種TLR-4的配體，對于細胞因子IFNγ或?qū)τ贚PS、IFNγ和抗-CD40抗體的任何組合均無反應。
因此，本發(fā)明人假設腫瘤-衍生的因子可在考慮使用它們的特定刺激時誘導腫瘤-浸潤的DC中的不應狀態(tài)。因此說明可抑制此不應狀態(tài)的因子可導致有效的癌癥治療。由IL-10的報告來看，DC抑制信號是由許多人類腫瘤分泌(Chouaib等人，1997，Immunol.Today 18493-497；De Smedt等人，1997，Eur.J.Immunol.271229-1235；Caux等人，1994，Int.Immunol.61177-1185)，本發(fā)明人測試拮抗IL-10是否可改善DC活化并因而宿主抗癌癥的免疫反應。然而，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以抗體阻斷的IL-10受體(抗-IL10R)治療小鼠對于C26結(jié)腸癌腫瘤或其C26-6CK變體的發(fā)展效果小(后者是如Vicari等人，2000，J.Immunol.1651992-2000說明經(jīng)改造以表達趨化因子CCL21/SLC/6Ckine(參見實施例IV和圖5))。實際上，如實施例II和III顯示，抗-IL 10R抗體與LPS+IFNγ+抗-CD40對于腫瘤-浸潤的DC的活化無效或效果很小。
接著，本發(fā)明人假設其它活化信號，特別是經(jīng)由異于TLR-4的通行Toll類家族的病原體相關(guān)性分子模式受體介導的信號，可在腫瘤-浸潤的樹突細胞中運作。尤其，其研究CpG1668，一種TLR-9的配體在老鼠中的作用(Hemmi等人，2000，Nature 408740-745)。然而，其觀察到CpG1668在活化腫瘤-浸潤的樹突細胞(實施例II和III)或小鼠內(nèi)建立的皮下腫瘤(實施例V至VII)的治療中具有微小效果。
然而，明顯對比下，本發(fā)明人驚喜發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用CpG1668與抗-IL10R誘導通過C26-6CK腫瘤-浸潤的DC生成IL-12p70和TNFα并大幅提高那些DC在MLR中的刺激能力(參見實施例II和III)。接著，聯(lián)合使用CpG1668加抗-IL10R抗體在帶有C26-6CK腫瘤的小鼠中顯示顯著的抗腫瘤效果(實施例V)。此外，聯(lián)合使用CpG1668和抗-IL10R抗體而不聯(lián)合使用LPS+IFNγ+抗-CD40抗體同樣可在來自親代C26腫瘤和來自其它病史起源的腫瘤B16黑色素瘤和LL2肺癌的腫瘤-浸潤的DC中誘導IL-12生成(參見實施例IV)。聯(lián)合使用CpG1668加抗-IL10R也在C26和B16F0腫瘤模型中顯示抗腫瘤活性(實施例VI和VII)。
本發(fā)明因此提供在哺乳類中通過腫瘤-浸潤的樹突細胞的活化治療癌癥的方法，其包含對該哺乳類給予有效量的腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑聯(lián)合有效量的TLR激動劑。
本文中定義″腫瘤-衍生的樹突細胞(DC)抑制因子拮抗劑″是一種試劑，其在結(jié)合性或功能性分析中顯示阻斷腫瘤細胞分泌的試劑的作用并已知抑制樹突細胞功能。
本文中定義″TLR激動劑″是任何活化Toll類受體(″TLR″)的分子，如Bauer等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 989237-9242中所描述的。在一特別優(yōu)選的具體實施例中，TLR激動劑是TLR9激動劑，例如Hemmi等人，2000，Nature 408740-745和Bauer等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA989237-9242中所描述的。
1.腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑術(shù)語″腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑″包括任何阻斷在腫瘤-浸潤的DC中誘導不應狀態(tài)的腫瘤-衍生的因子的作用的試劑。這些腫瘤-衍生的因子的實例包括，但不限于IL-6、VEGF、CTLA-4、OX-40、TGF-β、前列腺素、神經(jīng)節(jié)糖苷、M-CSF和IL-10(Chouaib等人，1997，Immunol.Today 18493-497)。
腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑可通過分析其在活化刺激物存在下對于腫瘤樹突細胞的影響來辨別。在有效量的腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑存在時，腫瘤-樹突細胞可進行熟化過程，可隨后測定細胞因子，例如IL-12、TNFα、IFNα的生成，或典型通過成熟樹突細胞，例如CD80、CD86、CD83和DC-Lamp表達的分子的表達?；蛘?，腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑的效果可在分析非分離自腫瘤，在被發(fā)表的抑制樹突細胞成熟的腫瘤來源的純化或未純化因子存在下活化的人類樹突細胞的活化時觀察。
腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑可作用于DC抑制因子本身，例如抗-IL-10單克隆抗體可阻斷IL-10的作用，或通過其它可防止DC抑制因子具有其對腫瘤-浸潤的DC的正常效用的方式，例如抗-IL-10R單克隆抗體可防止IL-10通過其在DC上的受體而發(fā)出信號。
腫瘤-衍生的DC抑制因子的拮抗劑可衍生自抗體或含有抗體片斷。此外，在結(jié)合或功能性分析中顯現(xiàn)抑制受體活化的任何小分子拮抗劑、反義核苷酸序列、包含在基因傳送載體例如腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的核苷酸序列均符合此定義。本領域中已熟知如何篩選特異性結(jié)合給定靶例如腫瘤相關(guān)性分子如受體的小分子。參見例如高流量篩選會議，國際商業(yè)通訊，Southborough，MA 01772-1749。同樣地，可使用缺乏膜穿透功能區(qū)域的可溶型受體。最后，可使用突變拮抗劑型式的腫瘤-衍生的DC抑制因子，其可強力結(jié)合相對應受體，但實質(zhì)缺乏生物活性。
在本發(fā)明的特別優(yōu)選具體實施例中，該腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑是IL-10拮抗劑。術(shù)語″IL-10拮抗劑″包括抑制IL-10活性的IL-10本身的拮抗劑和IL-10受體的拮抗劑。可用于本發(fā)明的IL-10拮抗劑的實例包括，但不限于那些說明在美國專利5,231,012，1993年7月27日申請(針對IL-10和IL-10拮抗劑)和美國專利5,863,796，1999年1月26日申請者(針對IL-10受體和IL-10受體拮抗劑)，它們均引入本文作為參考。
2.TLR激動劑數(shù)種衍生自微生物的TLR激動劑已有所描述，例如脂聚多醣、肽聚醣、鞭毛蛋白和脂磷壁酸(Aderem等人，2000，Nature 406782-787；Akira等人，2001，Nat.Immunol.2675-680)。部分的這些配體可活化不同的樹突細胞亞組，可表達不同模式的TLRs(Kadowaki等人，2001，J.Exp.Med.194863-869)。因此，TLR激動劑可為具有TLR激動劑性質(zhì)的任一種微生物制劑。例如，青霉素殺滅的鏈球菌試劑OK-432含有脂磷壁酸，其可通過TLR結(jié)合誘導Th1細胞因子的生成(Okamoto等人，2000，Immunopharmacology 49363-376)。表1列出數(shù)種已知TLR配體表1已知的TLR配體

LTA脂磷壁酸LPS脂聚醣PG肽聚醣某些類型的未翻譯DNA已顯示通過活化TLRs來刺激免疫反應。特別地，含CpG基序的免疫刺激性寡核苷酸已被廣泛公開及發(fā)表活化淋巴細胞(參見美國專利6,194,388)。本文所使用的″CpG基序″定義為未甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤(CpG)雙核苷酸。含CpG基序的免疫刺激性寡核苷酸也可根據(jù)本發(fā)明方法作為TLR激動劑使用。
許多免疫刺激性寡核苷酸序列已在本領域中有所描述并已可利用指明各方面的免疫反應，例如細胞因子分泌、抗體生成、NK細胞活化和T細胞增殖的標準分析辨別。參見例如美國專利6,194,388和6,207,646；WO98/52962；WO98/55495；WO97/28259；WO99/11275；Krieg等人，1995，Nature 374546-549；Yamamoto等人，1992J.Immunol.1484072-4076；Ballas等人，1996，J.Immunol.157(5)1840-1845；Klinman等人，1997，PNAS 93(7)2879-83；Shimada等人，1986，Jpn.J.Cancer Res.77808-816；Cowdery等人，1996，J.Immunol.1564570-75；Hartmann等人，2000，J.Immunol.164(3)1617-24。
免疫刺激性核苷酸序列可以是大于6個堿基或堿基對的任意長度。免疫刺激性核苷酸序列可包含修飾，例如3′OH或5′OH基的修飾，核苷酸堿基的修飾，糖成份的修飾和磷酸酯環(huán)的修飾。免疫刺激性核苷酸序列可以是單鏈或雙鏈標準DNA，以及單鏈或雙鏈標準RNA或其它修飾的聚核苷酸。免疫刺激性核苷酸序列可包括或不包括一個或多個回文區(qū)域。
免疫刺激性核苷酸序列可使用常用的聚核苷酸分離步驟進行分離，或可使用本領域中已熟知的技術(shù)和核酸合成設備合成，其包括但不限于酶促法、化學法和較大寡核苷酸序列的降解。(參見，例如Ausubel等人，1987和Sambrook等人，1989)。
可使用在本發(fā)明方法中的免疫刺激性核苷酸序列的實例包括但不限于那些公開在美國專利6,218,371；美國專利6,194,388；美國專利6,207,646；美國專利6,239,116和PCT WO00/06588(洛瓦(lowa)大學)；PCT WO01/62909；PCT WO01/62910；PCT WO01/12223；PCT WO98/55495；和PCT WO99/62923(Dynavax TechnologiesCorporation)，均引入本文作為參考。
特別地，美國專利6,194,388(洛瓦大學)公開免疫刺激核酸，其包含寡核苷酸序列，其至少包括下式5’X1X2CGX3X43’其中C和G是未甲基化的，其中X1X2選自GpT、GpG、GpA、ApA、ApT、ApG、CpT、CpA、CpG、TpA、TpT和TpG的雙核苷酸，且X3X4選自TpT、CpT、ApT、TpG、ApG、CpG、TpC、ApC、CpC、TpA、ApA和CpA的雙核苷酸且其中至少一個核苷酸具有磷酸酯骨架修飾。為了促進細胞攝入，已公開的優(yōu)選含CpG的免疫刺激性寡核苷酸大小范圍為8至40個堿基對。符合此式的免疫刺激性寡核苷酸可使用在本申請要求保護的方法中。
WO99/62923公開可與本發(fā)明聯(lián)合使用的免疫刺激性核苷酸序列的其它實例。特別地，修飾的免疫刺激性核苷酸序列包含六聚序列或六核苷酸，其含有中心CG序列，其中公開該C殘基通過加入具有吸電子(electron-withdrawing)部分的C-5和/或C-6進行修飾。
免疫刺激性寡核苷酸可通過構(gòu)造修飾來穩(wěn)定，其可使它們相對性抗活體內(nèi)降解。穩(wěn)定化修飾的實例包括硫代磷酸酯修飾(即將至少一個磷酸酯氧以硫取代)、非離子性DNA類似物，例如烷基-或芳基-膦酸酯(其中帶電的膦酸酯氧以烷基或芳基取代)、磷酸雙酯和烷基磷酸三酯，其中該帶電性氧部分是經(jīng)烷基化的。在一端或兩端含有二醇，例如四乙二醇或六乙二醇的寡核苷酸也顯示出基本抗核酸酶降解(參見美國專利6,194,388(洛瓦大學))。
免疫刺激性核苷酸序列也可包埋或結(jié)合于傳送復合物內(nèi)，其可造成對靶細胞表面的更高親和力和/或提高靶細胞的細胞性攝入。免疫刺激性核苷酸序列傳送復合物的實例包括連接于固醇(例如膽固醇)、脂質(zhì)(例如陽離子性脂質(zhì)、病毒體或微脂體)，或靶細胞特異性結(jié)合劑(例如可由靶細胞特定受體辨識的配體)。優(yōu)選的復合物必需在活體內(nèi)足夠穩(wěn)定以防止在靶細胞內(nèi)化前顯著解偶(uncoupling)。然而，該復合物應可在適當?shù)募毎麅?nèi)條件下切割以使寡核苷酸以具有功能性的形式釋放(美國專利6,194,388；WO99/62923)。
在一特別優(yōu)選的具體實施例中，TLR激動劑是TLR9的激動劑，例如在Hemmi等人，2000，Nature 408740-745和Bauer等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 989237-9242所描述的。目前已知的TLR-9配體是含CpG基序的未甲基化寡核苷酸序列，例如老鼠中的CpG 1668(TCCATGACGTTCCTGATGCT)(SEQ ID NO5)和人類中的CpG2006(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)(SEQ ID NO1)(Bauer等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 989237-9242)。表2列出優(yōu)選的TLR9激動劑表2

除上述提到的以外，利用TLRs或其片段進行配體篩選可以辨別其它分子，包括對受體具有結(jié)合親和力的小分子。參見例如高流量篩選會議，國際商業(yè)通訊，Southborough，MA 01772-1749。隨后的生物分析可再用于測定推測的激動劑是否可提供活性。如果化合物具有內(nèi)在的刺激活性，則其可活化受體且其因此刺激配體活性，例如誘導發(fā)出信號的激動劑。
本文所使用的TLR激動劑的″有效量″是引發(fā)所希望的生物效應的量。特別地，有效量是與有效量的腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑聯(lián)合使用時，足以觸發(fā)腫瘤-浸潤的DC活化的量。
″有效量″的腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑是可引發(fā)所希望的生物效應的量。特別地，有效量是與有效量的TLR激動劑聯(lián)合使用時，足以觸發(fā)腫瘤-浸潤的DC活化的量。
″聯(lián)合″給予是指同時和先后給予。腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑可傳送或給予在同一位置或不同位置且可同時或延遲不超過48小時后給予。本文所使用的同時或聯(lián)合給予是指將腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑和/或TLR激動劑和/或抗原在一般治療計劃療程期間內(nèi)的(a)同時，或(b)不同時間給予個體。在后者的情況，兩化合物是在足夠接近以達所希望的效果的時間內(nèi)給予。
用以實施本發(fā)明的腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑和/或TLR激動劑可以是具有與天然產(chǎn)物相同的氨基酸序列的重組蛋白質(zhì)，或是重組蛋白質(zhì)，其衍生自天然產(chǎn)物但含有改變其藥物動力學特性的修飾和/或增加新型生物特性但卻保留其原始DC活化或抗腫瘤特性。
傳送腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑和/或TLR激動劑的模式可通過注射，包括靜脈內(nèi)、腫瘤內(nèi)、皮膚內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或局部。
在本發(fā)明的特別優(yōu)選具體實施例中，一種或多種腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑和TLR激動劑是與腫瘤相關(guān)性抗原聯(lián)合給予。可使用在本發(fā)明中的腫瘤相關(guān)性抗原包括，但不限于Melan-A，酪氨酸酶、p97、β-HCG、GalNAc、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-12、MART-1、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC18、CEA、DDC、黑色素瘤抗原gp75、HKer8、高分子量黑色素瘤抗原、K19、Tyr1和Tyr2、pMel 17基因家族成員、c-Met、PSA、PSM、α-胎兒蛋白(fetoprotein)、甲狀腺過氧化酶(thyroperoxidase)、gp100、NY-ESO-1、端粒酶和p53。此處并非排他性列舉，其僅為可使用以實施本發(fā)明的抗原型式的示例。
其它異于腫瘤相關(guān)性抗原的抗原可與腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑和TLR激動劑一起給予以提高對抗這些抗原的特異性免疫反應。這些抗原包括但不限于細菌、病毒、真菌、寄生蟲表達的原態(tài)或修飾的分子?？乖部砂ㄗ儜妥陨砜乖?，且這種狀況下，腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑和TLR激動劑的組合將與抗原一同給予以使免疫反應再度朝向較適合的結(jié)果，例如將Th2型免疫反應轉(zhuǎn)形至Th1型免疫反應中。
可使用顯示對不同族群、性別、地理分布和疾病階段具有最佳功能的不同組合的抗原。在本發(fā)明的具體實施例中，至少二或更多種不同抗原與腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑和TLR激動劑組合一同給予。
腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑和/或TLR激動劑的給予可彼此和/或與抗原聯(lián)合使用或可以各種方式彼此或與抗原連結(jié)(參見例如WO98/16247；WO98/55495；WO99/62823)。例如TLR激動劑和/或腫瘤-衍生的DC抑制因子和/或抗原的給予可為空間性彼此相近，或為混合物(即在溶液中)。連結(jié)的達成可通過許多方法，包括接合(conjugation)、衣殼化、經(jīng)由附加至平臺或吸附在表面。
要將TLR激動劑接合至腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑和/或抗體，可使用多種方法。其結(jié)合可通過共價相互作用和/或通過非共價相互作用，包括高親和力和/或低親和力相互作用?？膳己蟃LR激動劑與腫瘤-衍生的DC抑制因子的非共價相互作用的實例包括但不限于離子鍵、疏水性相互作用、氫鍵和范德華力。當腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑是一種蛋白質(zhì)或抗體且TLR激動劑是一種免疫刺激性聚核苷酸時，例如可利用本領域中已熟知的方法將接合的肽部分通過固態(tài)載體化學連接于免疫刺激性聚核苷酸的3′端(參見例如Haralambidis等人，1990a，Nucleic Acids Res.18493-499和Haralambidis等人，1990b，Nucleic Acids Res.18501-505)?；蛘撸迦刖哂袧撛诜磻δ苄缘摹暹B接臂″，例如在胞嘧啶堿基的C-5處的胺或羧基提供肽連接的柄(handle)(Ruth，4th Annual Congress forRecombinant DNA Research，p.123)。免疫刺激性聚核苷酸至肽的連接也可通過高親和力，非共價性相互作用形成，例如生物素-鏈霉抗生物素蛋白復合物。生物素基團可例如連接至寡核苷酸的修飾的堿基(Roget等人，Nucleic Acids Res.(1989)177643-7651)。將鏈霉抗生物素蛋白部分引入肽部分可生成鏈霉抗生物素蛋白接合的肽的非共價鍵復合物和生物素化聚核苷酸。
設計以進一步活化或刺激DC成熟化的部分可有利地給予。這些試劑的實例為TNF-α，IFN-α，RANK-L或RANK的激動劑，CD40-L或CD40的激動劑。這些活化劑可提供額外的成熟化信號，其可與TLR激動劑共同參與i)加速來自組織的DC經(jīng)由引流淋巴(draining lymph)遷移至淋巴樣器官，和ii)活化DC以分泌提高免疫反應-特別是抗腫瘤反應的分子-例如IL-12和IFNα(Banchereau等人，1998，Nature392245-252)。
在本發(fā)明方法中，GM-CSF，G-CSF或FLT3-L也可有利地給予。給予GM-CSF，G-CSF或FLT3-L的目的可以是提高循環(huán)的DC的數(shù)目，其可再局部的在腫瘤內(nèi)局部補充。此方案暗示一種使用GM-CSF，G-CSF或FLT3-L至少五至七天的系統(tǒng)性預治療?；蛘呔植拷o予GM-CSF，G-CSF或FLT3-L局部分化的DC前體(單核細胞，DC的類漿細胞前體(plasmacytoid precursors)至DC內(nèi)，其可再拾起傳送至相同位置的抗原。
此外，趨化因子或多重趨化因子的組合可有利地與本發(fā)明的腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑和TLR激動劑聯(lián)合給予。已知具有利作用的趨化因子包括CCL21、CCL3、CCL20、CCL16、CCL5、CCL25、CXCL12、CCL7、CCL8、CCL2、CCL13、CXCL9、CXCL10、CXCL11(參見例如Sozzani等人，1995，J.Immunol.1553292-3295；Sozzani等人，1997，J.Immunol.1591993-2000；Xu等人，1996，J.Leukoc.Biol.60365-371；MacPherson等人，1995，J.Immunol.1541317-1322；Roake等人，1995，J.Exp.Med 1812237-2247和歐洲專利申請案EP 0 974 357 A1，1998年7月16日申請且2000年1月26日公開)。一般而言，腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑、TLR激動劑和/或活化劑和/或細胞因子是以在醫(yī)藥載體中包含有效量的腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑和TLR激動劑和/或抗原和/或活化劑和/或細胞因子的醫(yī)藥組合物給予。這些試劑可聯(lián)合其它活性或惰性成份用于治療用途，例如在常用的醫(yī)藥上可接受的載體或稀釋劑，例如免疫原性輔劑中，伴隨生理無害性穩(wěn)定劑和賦形劑。醫(yī)藥載體可為任何適于傳送本發(fā)明組合物至患者的相容的、無毒性物質(zhì)。
細胞因子和/或趨化因子可任選地使用包含趨化因子或細胞因子或其生物活性片段或變體和導向部分(targeting moiety)的導向構(gòu)建物(targeting construct)傳送至腫瘤。本文所使用的″導向部分″是指辨識或靶定腫瘤相關(guān)性抗原或由腫瘤的非癌性成份特異性表達的構(gòu)造，例如腫瘤血管的部分。導向部分的實例包括但不限于肽、蛋白質(zhì)、小分子、載體、抗體或抗體片段，其辨識或靶定腫瘤相關(guān)性抗原或由腫瘤的非癌性成份特異性表達的構(gòu)造。在優(yōu)選具體實施例中，該導向部分是肽、蛋白質(zhì)、小分子、載體，例如病毒載體、抗體或抗體片段。在更優(yōu)選具體實施例中，該導向部分是抗體或抗體片段。在最優(yōu)選具體實施例中，導向載體是ScFv片段。
導向部分可特異于腫瘤細胞表達的抗原，如已說明于在人類，例如特異于葉酸鹽受體(Melani等人，1998，Cancer Res.584146-4154)，Her2/neu受體，表皮生長因子受體和CA125腫瘤抗原(Glennie等人，2000，Immunol.Today 21403-410)。其它數(shù)種腫瘤抗原可作為靶且可由腫瘤的惡性細胞優(yōu)選表達、獨特表達、過度表達或表達為成熟形式(Boon等人，1997，Curr.Opin.Immunol.9681-683)。其可包括Melan-A、酪氨酸酶、p97、β-HCG、GalNAc、MUC3、MUC4、MUC18、CEA、DDC、黑色素瘤抗原gp75、HKer8、高分子量黑色素瘤抗原、K19、Tyr1和Tyr2、pMel17基因家族成員、c-Met、PSA、PSM、α-胎兒蛋白、甲狀腺過氧化酶、gp100、類胰島素生長因子受體(IGF-R)、端粒酶和p53。此處并非排他性地列舉，其僅為可使用于實施本發(fā)明的抗原型式的示例?；蛘?，導向部分可特異于腫瘤的異于惡性細胞的成份優(yōu)選表達，并在特定腫瘤血管中的抗原。αv整聯(lián)蛋白家族、VEGF受體和蛋白聚醣NG2是這些腫瘤血管相關(guān)性抗原的實例(Pasqualini等人，1997，Nat.Biotechnol.15542-546)。
原發(fā)和轉(zhuǎn)移癌均可根據(jù)本發(fā)明治療?？芍委煹陌╊愋桶ǖ幌抻诤谏亓?，胸、胰、結(jié)腸、肺、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細胞性、子宮內(nèi)膜、胃部、腸、腎、前列腺、甲狀腺、卵巢、睪丸、肝、頭和頸、結(jié)腸直腸、食道、胃、眼、膀胱、成膠質(zhì)細胞瘤和轉(zhuǎn)移癌。術(shù)語″癌″是指惡性的上皮或內(nèi)分泌組織，包括呼吸系統(tǒng)癌、胃腸系統(tǒng)癌、泌尿生殖系統(tǒng)癌、前列腺癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌和黑色素瘤。本文所使用的轉(zhuǎn)移的定義為腫瘤散布至遠離區(qū)淋巴結(jié)的位置。
有效治療所需的試劑量根據(jù)許多不同因素而定，包括給予方式、靶定位置、患者的生理狀態(tài)和所給予的其它藥物。因此，治療劑量可調(diào)整至最佳安全性和功效。針對特定癌癥的有效治療劑量的動物試驗可供作人類劑量的進一步預測指標。各種考慮例如Gilman等人(編著)(1990)Goodman和Gilman的The Pharmacological Bases ofTherapeutics，第八版，Pergamon Press；和Remington′sPharmaceutical Sciences，第17版(1990)，Mack Publishing Co.Easton，PA中有所描述。給予方法在其中和下文有所討論，例如針對靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)給予，經(jīng)皮膚擴散和其它。醫(yī)藥上可接受的載體可包括水、生理鹽水、緩沖液和其它化合物，例如Merck Index，Merck & Co.，Rahway，New Jersey中有所描述。緩慢釋放配方或緩慢釋放裝置可用于連續(xù)給予。
腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑和/或TLR激動劑的劑量范圍根據(jù)激動劑/拮抗劑的形式而定。例如，IL-10受體抗體的有效劑量典型范圍為約0.05至約25微克/公斤/天，優(yōu)選為約0.1至約20微克/公斤/天，最優(yōu)選為約1至約10微克/公斤/天。至于免疫原性組合物，例如TLR激動劑，其用量可基于TLR激動劑的形式、個體、待治療病癥和其它本領域技術(shù)人員顯而易見的因素而改變。需考慮的因素包括抗原性、該TLR激動劑是否復合或共價性連接于輔劑或傳送分子、給予途徑和待給予的免疫劑量數(shù)目。這些因素是本領域已知的。適當?shù)膭┝糠秶翘峁┧Ｍ臉渫患毎罨牧?。一般而言，免疫刺激性寡核苷酸的劑量范圍可例如是約下列任一劑量01.至100微克，01.至50微克，01.至25微克，01.至10微克，1至500微克，100至400微克，200至300微克，1至100微克，100至200微克，300至400微克，400至500微克?；蛘撸瑒┝靠梢允羌s下列任一劑量0.1微克，0.25微克，0.5微克，1.0微克，2.0微克，5.0微克，10微克，25微克，50微克，75微克，100微克。因此，劑量范圍可以是那些下限為約下列任一劑量0.1微克，0.25微克，0.5微克和1.0微克；和上限是約下列任一劑量25微克，50微克和100微克。在此組合物中，含ISS聚核苷酸與抗原的摩爾濃度比可變化。給予各患者的絕對量根據(jù)藥理性質(zhì)，例如生物利用性、清除速率和給予途徑而定。
一般而言，治療系由低于化合物最佳劑量較小劑量開始。其后，少量提高劑量直至達到環(huán)境中的最佳效果為止。適當劑量的確定和特定情況中的給予方法是在本領域的技術(shù)范圍內(nèi)。
通過載體方式給予的腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑和TLR激動劑的劑量可主要依據(jù)所使用的特定載體的效率和患者的病情以及受治療患者的體重或表面積而定。劑量大小也可通過伴隨特定載體的給予的任何不良副作用的存在，特性和程度，或在特定患者內(nèi)的轉(zhuǎn)導細胞類型決定的。在決定治療中給予的有效量載體時，醫(yī)師需評估載體的循環(huán)性血漿水平、載體毒性、疾病的進展，和抗載體抗體的生成。核酸的典型劑量主要根據(jù)給予途徑和基因傳送系統(tǒng)而定。根據(jù)傳送方法，劑量的范圍可大概為約1微克至100毫克或以上。一般對于典型的70公斤患者，來自載體的裸核酸劑量當量為約1微克至100微克，且包含病毒粒子的載體的劑量也加以計算以得到治療性核酸的當量。
在要求保護的本發(fā)明的方法的實施中的GM-CSF、G-CSF或FLT-L的優(yōu)選生物活性劑量是可誘導循環(huán)的CD14+/CD13+前體細胞數(shù)目的最大量增加；在DC前體和成熟DC表面的抗原呈現(xiàn)(presenting)分子的表達；對T細胞的抗原呈現(xiàn)活性；和/或刺激抗原依賴性T細胞反應連同成熟DC功能的劑量組合。皮下給予所使用的GM-CSF量的典型范圍為約0.25微克/公斤/天至約10.0微克/公斤/天，優(yōu)選為約1.0-8.0微克/公斤/天，最優(yōu)選為2.5-5.0微克/公斤/天。對于特定患者的有效量可通過測定一種或多種上述指明的參數(shù)的顯著變化而確立。
實施例本發(fā)明可通過下列非限制性實施例的方式說明。
實施例1C26-6CK腫瘤-浸潤的樹突細胞與骨髓-衍生的樹突細胞相比較，對LPS+抗-CD40+IFNγ組合無反應。
在此實施例中，發(fā)明人已表明DC浸潤的C26-6CK腫瘤與骨髓-衍生的DC相比較，對于在混合白血球反應(MLR)中的IL-12生成或刺激能力，對LPS+IFNγ+抗-CD40抗體無反應(圖1)。所有腫瘤細胞均培養(yǎng)在DMEM(Gibco-BRL，Life Technologies，Paisley Park，Scotland)中，其中添加10％FCS(Gibco-BRL)，1mM hepes(Gibco-BRL)，Gentallin(Schering-Plough，Union，NJ)，2×10-5M beta-2巰基乙醇(Sigma，St.Louis，MO)。所有細胞均培養(yǎng)在37℃下，經(jīng)調(diào)濕并具有5％CO2的溫育箱中。C26結(jié)腸癌和TSA乳癌是由MarioColombo(Istituto Nazionale per lo Studio e la Cura deiTumori，Milano，Italy)提供。B16F0黑色素瘤和LL2癌得自美國菌種保存中心(LGC，Strasbourg，法國)。改造的可穩(wěn)定分泌老鼠趨化因子6Ckine/SLC/CCL21的C26-26CK細胞系已由本發(fā)明人先前說明(Vicari等人，2000，J.Immunol.1651992-2000)。使用抗-CD11c磁珠(Myltenyi Biotec Gmbh，德國)將來自C26-26CK腫瘤的TIDC富集。骨髓-衍生的DC的獲得是通過將骨髓祖細胞與GM-CSF(Schering-Plough，Union，NJ)和TNFα(R&D Systems，Minneapolis，MN)一起培養(yǎng)5天?；罨峭ㄟ^在培養(yǎng)基中添加10ng/毫升LPS(Sigma，St.Louis，MO)，20ng/毫升IFNγ(R&D Systems)和20微克/毫升純化的抗-CD40抗體的FKG45.5(由AG Rolink，免疫學基礎研究所，瑞士贈予)培養(yǎng)過夜。圖1A顯示通過FACS(門控在CD11c陽性細胞上)的MHC第二族，CD40和CD86的表面表達的分析。圖1B顯示CD11c+細胞在20小時，包括與Brefeldin A溫育2.5小時后的IL-12p40的細胞內(nèi)表達。圖1C中，將混合的白血球反應TIDC或以LPS+IFNγ+抗-CD40刺激的骨髓-衍生的DC被照射并以不同數(shù)目在恒定數(shù)目的富集的同種異體的T細胞(3×105T細胞)存在下培養(yǎng)5天。通過插入放射性胸腺嘧啶測定培養(yǎng)的最后18小時期間的增殖。圖1D說明以LPS+IFNγ+抗-CD40活化后通過特異性ELISA在培養(yǎng)上清液中測定IL-12p70。
這些綜合結(jié)果暗示樹突細胞浸潤的C26-6CK腫瘤并不可經(jīng)由LPS+IFNγ+抗-CD40的刺激而得到樹突細胞的典型功能，即刺激同種異體的T細胞的能力和分泌IL-12的能力。這些受損的功能似乎是樹突細胞與腫瘤相互作用的結(jié)果。
實施例IIC26-6CK腫瘤-浸潤的樹突細胞中的CpG 1668+抗-IL 10R組合復原的IL-12和TNFα。
在此實施例中，發(fā)明人已顯示CpG 1668與抗-IL 10R抗體聯(lián)合給予在C26-6CK腫瘤-浸潤的樹突細胞中復原的IL-12和TNFα(圖2)。
使用抗-CD11c磁珠富集來自C26-6CK腫瘤的TIDC?；罨窃贕M-CSF10ng/毫升存在下進行過夜?；罨瘎┦褂?0ng/毫升LPS，20ng/毫升IFNγ，20微克/毫升抗-CD40抗體的FKG45.5，5微克/毫升CpG1668(序列TCC-ATG-ACG-TTC-CTG-ATG-CT，經(jīng)硫代磷酸酯修飾，MWG Biotech，德國)和10微克/毫升抗-IL 10R(1B13A復制體，Castro等人，2000，J.Exp.Med.1921529-1534)。使用特異性ELISA在經(jīng)24小時刺激后的培養(yǎng)上清液中測定IL-12p70和TNFα含量。
總之，這些結(jié)果指出CpG 1668本身并不誘導C26-6CK腫瘤-浸潤的DC生成IL-12。抗-IL 10R本身(未顯示)也無作用或與LPS+IFNγ+抗-CD40聯(lián)合只有微小作用。只有抗-IL 10R與CpG1668的組合可誘導顯著的自C26-6CK腫瘤-浸潤的DC生成具有生物活性的IL-12和TNFα。
實施例IIICpG1668+抗-IL-10R組合復原的C26-6CK腫瘤-浸潤的樹突細胞中的MLR刺激能力。
在此實施例中，發(fā)明人已顯示CpG1668+抗-IL-10受體抗體的聯(lián)合給予所復原的MLR刺激能力。
使用抗-CD11c磁珠富集來自C26-6CK腫瘤的TIDC并在GM-CSF和各種組合的LPS、IFNγ、抗-CD40、抗-IL 10R和CpG1668存在下培養(yǎng)過夜。再將細胞照射并以不同數(shù)目在固定數(shù)目的富集的同種異體的T細胞(3×105T細胞)存在下培養(yǎng)5天。通過在培養(yǎng)的最后18小時期間并入放射性胸苷測定其增殖。結(jié)果顯示腫瘤-浸潤的DC在MLR分析中為弱刺激子細胞，但其刺激能力可受CpG1668少量提高，可被抗-IL 10R+LPS+IFNγ+抗-CD40的組合進一步提高，且被抗-IL 10R與CpG1668的組合提高最多。因此，此實施例顯示抗-IL 10R加CpG1668是復原在MLR中的DC刺激能力的最合適的組合。此可解釋為使用IL-10拮抗劑和TLR9激動劑的組合治療癌癥時，可有優(yōu)選的活體內(nèi)原態(tài)T細胞性質(zhì)，并因而有較好的T細胞-介導的抗腫瘤免疫反應。
實施例IV來自C26野生型的腫瘤-浸潤的樹突細胞和來自其它組織學特性的腫瘤對于LPS+IFNγ+抗-CD40無反應但對CpG1668+抗-IL-10R反應生成IL-12。
此實施例顯示來自C26野生型的腫瘤-浸潤的樹突細胞和來自其它組織學特性的腫瘤對于LPS+IFNγ+抗-CD40組合無反應但對CpG1668+抗-IL-10R反應生成IL-12。
使用抗-CD11c磁珠富集來自均在皮下生長的C26結(jié)腸癌、B16黑色素瘤和LL2肺癌腫瘤的TIDC并在GM-CSF和各種組合的LPS、IFNγ、抗-CD40、抗-IL 10R和CpG1668存在下培養(yǎng)過夜。以FACS分析經(jīng)20小時，包括與Brefeldin A溫育2.5小時后的IL-12p40的細胞內(nèi)表達對CD11c的表面表達。圖4顯示，就C26-6CK腫瘤所發(fā)現(xiàn)，分離自親代C26腫瘤和不同組織學來源的腫瘤的DC對于以LPS、IFNγ、抗-CD40活化均無反應但對于TLR-9激動劑CpG1668加抗-IL 10R的組合可反應生成IL-12。因此，這些觀察提示IL 10拮抗劑與TLR-9激動劑的組合可以是許多腫瘤的有效療法。
實施例VCpG1668+抗-IL-10R抗體在C26-6CK腫瘤模型中的療效。
-在第0天于七只8周大的雌BALB/c小鼠組皮下植入1×105個C26-6CK腫瘤細胞并如下治療-在第7、14和21天在腫瘤周圍(若腫瘤太小)或內(nèi)部注射10微克的CpG1668。
-在第7天開始(第24天結(jié)束)一周兩次腹膜注射250微克純化的抗-IL10R抗體。對照抗體為純化的GL113抗體。
每周三次以觸診評估腫瘤發(fā)展并使用雙角規(guī)形夾(caliper)測定腫瘤，其腫瘤體積＝I2×L×0.4，I為小直徑而L為大直徑。若腫瘤超過1500立方毫米則將小鼠犧牲或人道處理。
圖5顯示所有單獨注射對照抗體或抗-IL10R抗體的小鼠均在7至10天內(nèi)發(fā)展出腫瘤，其終于造成約4周即需犧牲動物。注射TLR-9激動劑和CpG1668有微小效果，因為1/7老鼠未發(fā)展出腫瘤。此外，CpG1668組中的存活率稍佳且其三周后的腫瘤平均體積比對照組小。相反的，CpG1668與抗-IL10R組合治療的小鼠雖然發(fā)展出可觸摸到的腫瘤，但7只小鼠中有6只可排除腫瘤。隨后，在其余實驗中將這些小鼠歸屬為無腫瘤者。這些結(jié)果指出TLR-9激動劑與IL-10拮抗劑的組合在C26-6CK模型中具有治療價值，暗示其可用于治療其它腫瘤，包括在人體中。
實施例VICpG1668+抗-IL10R抗體在C26腫瘤模型中的療效。
-在第0天在七只8周大的雌BALB/c小鼠組皮下植入5×104個C26腫瘤細胞并如下治療-在第7、14和21天在腫瘤內(nèi)部注射5微克的CpG1668。
-在第7、14和21天腹膜注射250微克純化的抗-IL10R抗體。對照抗體是純化的GL113抗體。
每周三次以觸診評估腫瘤發(fā)展并使用雙角規(guī)形夾(caliper)測定腫瘤，其腫瘤體積＝I2×L×0.4，I為小直徑而L為大直徑。若腫瘤超過1500立方毫米則將小鼠犧牲或人道處理。
圖6顯示所有單獨注射對照抗體、CpG1668或抗-IL10R抗體的小鼠均在7天內(nèi)發(fā)展出腫瘤，其終于造成約3至4周即需犧牲動物。相反的，以CpG1668與抗-IL10R組合治療的小鼠雖然發(fā)展出可觸摸到的腫瘤，但7只小鼠中有6只可排除腫瘤。隨后，在其余實驗中將這些小鼠歸屬為無腫瘤者。這些結(jié)果指出TLR-9激動劑與IL-10拮抗劑的組合在C26模型中具有治療價值，暗示其可用以治療其它腫瘤，包括在人體中。
實施例VIICpG1668+抗-IL10R抗體在B16F0黑色素瘤模型中的療效。
-在第0天在七只8周大的雌C57BL/6小鼠組皮下植入5×104個B16F0腫瘤細胞并如下治療-在第7、14和21天在腫瘤內(nèi)部注射5微克的CpG1668。
-在第7、14和21天腹膜注射250微克純化的抗-IL10R抗體。對照抗體為純化的GL113抗體。
每周三次以觸診評估腫瘤發(fā)展并使用雙角規(guī)形夾(caliper)測定腫瘤，其腫瘤體積＝I2×L×0.4，I為小直徑而L為大直徑。若腫瘤超過1500立方毫米則將小鼠犧牲或人道處理。
圖7顯示所有單獨注射對照抗體、CpG1668或抗-IL10R抗體的小鼠均在7天內(nèi)發(fā)展出腫瘤，其終于造成約3至4周即需犧牲動物。單獨CpG1668對存活率有微小效果。相反的，以CpG1668與抗-IL10R組合治療的小鼠雖然發(fā)展出可觸摸到的腫瘤，但7只小鼠中有6只可排除腫瘤。隨后，在其余實驗中將這些小鼠歸屬為無腫瘤者。這些結(jié)果指出TLR-9激動劑與IL-10拮抗劑的組合在B16F0模型中具有治療價值，暗示其可用以治療其它腫瘤，包括在人體中。
實施例VIII來自C26-6CK腫瘤的腫瘤-浸潤的DC可對抗-IL10抗體和CpG1668的組合反應生成IL-12。
使用抗-CD11c磁珠富集來自C26-6CK的TIDC并在GM-CSF和各種組合的純化抗-IL 10抗體與CpG1668存在下培養(yǎng)過夜。以FACS分析經(jīng)20小時，包括與Brefeldin A溫育2.5小時后的IL-12p40的細胞內(nèi)表達對CD11c的表面表達。
圖8顯示CpG1668與抗-IL10的組合可在C26-6CK腫瘤-浸潤的樹突細胞內(nèi)誘導IL-12的生成，這暗示IL-10本身的拮抗劑與有效量的TLR-9激動劑在一起，可有效治療癌癥。
實施例IX由來自C26腫瘤的上清液抑制骨髓-衍生的DC活化可被抗-IL-10R和/或吲哚美辛(indomethacin)(為一種環(huán)氧化酶抑制劑)回復。
骨髓-衍生的DC的獲得是通過將骨髓祖細胞與GM-CSF與TNFα在10％體積比的C26腫瘤上清液存在或缺乏的下培養(yǎng)5天。腫瘤上清液的制備是將皮下生長在BALB/c小鼠的0.5cm C26腫瘤割下并切碎，再在10毫升的DMEM中培養(yǎng)48小時。將所得上清液以0.2微米過濾并在使用前冷凍。此上清液以特異性ELISA(R&D Systems)測定含0.25ng/毫升的IL-10和50ng/毫升的PGE2。為了要抑制上清液中的PGE2合成，在48小時培養(yǎng)期間加入1微克/毫升的環(huán)氧化酶吲哚美辛抑制劑(Sigma)。
5天的后，骨髓DC被不同組合的最佳劑量的LPS、IFNγ和抗-CD40抗體在10微克/毫升的抗-IL10R抗體存在或缺乏的下活化。DC活化的測定是通過FACS測其共同刺激分子CD40和CD86的表達和通過胞內(nèi)染色測其IL-12生成。
圖9顯示C26腫瘤上清液可抑制DC活化。在吲哚美辛存在下添加所制得的上清液或抗-IL10R的DC培養(yǎng)中可部分減輕效用，但二者的組合可完全恢復CD40和CD86的上升調(diào)節(jié)和IL-12表達。
這些實驗強烈暗示環(huán)氧化酶的生成，特別是前列腺素，也為腫瘤-衍生的DC抑制因子。
實施例XCpG1668+吲哚美辛在C26-6CK腫瘤模型中的療效-在第0天在七只6周大的雌BALB/c小鼠組皮下植入5×104個C26-6CK腫瘤細胞并如下治療-在第7、14和21天在腫瘤內(nèi)部注射5微克的CpG1668。
-在第5天開始至28天止在飲水中隨意添加5微克/毫升吲哚美辛。
每周三次以觸診評估腫瘤發(fā)展。若腫瘤超過1500立方毫米則將小鼠犧牲或人道處理。
圖10顯示所有對照小鼠均在7天內(nèi)發(fā)展出腫瘤，其終于造成約3至4周即需犧牲動物。CpG或吲哚美辛組中僅有1/7未發(fā)展出腫瘤。相反的，4/7以CpG1668和吲哚美辛的組合治療的小鼠未發(fā)展出腫瘤。這些結(jié)果指出TLR-9激動劑與環(huán)氧化酶抑制劑的組合在C26-6CK模型中具有治療價值，暗示其可用于治療其它腫瘤，包括在人體中。
本發(fā)明可在不遠離其精神和范圍下進行許多修飾和變化，其對于本領域技術(shù)人員是顯而易見的。本文中說明的特定具體實施例僅供作范例，且本發(fā)明并不僅限制于所附的權(quán)利要求的專有名詞，連同該權(quán)利要求范圍所稱的同義語的全部范圍。
權(quán)利要求
1.一種治療癌癥的方法，其包括給予所需個體有效量的腫瘤-衍生的樹突細胞(DC)抑制因子拮抗劑聯(lián)合有效量的TLR激動劑。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑選自IL-6拮抗劑，VEGF拮抗劑，CTLA-4拮抗劑，OX-40拮抗劑，TGF-B拮抗劑，前列腺素拮抗劑，神經(jīng)節(jié)糖苷拮抗劑，M-CSF拮抗劑和IL-10拮抗劑。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中該腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑是IL-10拮抗劑。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中該IL-10拮抗劑選自IL-10的拮抗劑和IL-10受體的拮抗劑。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中該IL-10拮抗劑是a)重組體；b)天然配體；c)小分子；d)抗體或抗體片段；e)反義核苷酸序列；或f)可溶性IL-10受體分子。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中該抗體是單克隆抗體。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中該抗體是抗-IL-10R單克隆抗體。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該TLR激動劑是a)重組體；b)天然配體；c)免疫刺激性核苷酸序列；d)小分子；e)純化的細菌提取物；f)不活化的細菌制劑。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該TLR激動劑是TLR-9激動劑。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中該TLR激動劑是免疫刺激性核苷酸序列。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中該免疫刺激性核苷酸序列含有CpG基序。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中該免疫刺激性核苷酸選自CpG 2006(SEQ ID NO1)、CpG 2216(SEQ ID NO2)、AAC-30(SEQ IDNO3)和GAC-30(SEQ ID NO4)。
13.如權(quán)利要求10所述的方法，其中該免疫刺激性核苷酸序列通過結(jié)構(gòu)修飾，例如硫代磷酸酯修飾進行穩(wěn)定。
14.如權(quán)利要求10所述的方法，其中該免疫刺激性核苷酸序列包覆于陽離子脂質(zhì)體內(nèi)。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑是抗-IL-10R單克隆抗體且TLR激動劑是CpG 2006(SEQ ID NO1)。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其進一步包括一種物質(zhì)，其可使腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑和/或TLR激動劑在傳送位置緩慢釋放。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑和/或TLR激動劑是靜脈內(nèi)、腫瘤內(nèi)、皮膚內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或局部給予。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其進一步包括至少一種腫瘤相關(guān)性抗原。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中該腫瘤相關(guān)性抗原連接于TLR激動劑。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，其中該腫瘤相關(guān)性抗原選自Melan-A，酪氨酸酶、p97、β-HCG、GalNAc、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-12、MART-1、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC18、CEA、DDC、黑色素瘤抗原gp75、HKer8、高分子量黑色素瘤抗原、K19、Tyr1和Tyr2、pMel 17基因家族成員、c-MET、PSA、PSM、α-胎兒蛋白、甲狀腺過氧化酶、gp100、NY-ESO-1、p53和端粒酶。
21.如權(quán)利要求1所述的方法，其中待治療癌癥選自黑色素瘤，胸、胰、結(jié)腸、肺、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細胞性、子宮內(nèi)膜、胃部、腸、腎、前列腺、甲狀腺、卵巢、睪丸、肝、頭和頸、結(jié)腸直腸、食道、胃、眼、膀胱、膠質(zhì)母細胞瘤和轉(zhuǎn)移癌。
22.如權(quán)利要求1所述的方法，其進一步包括給予活化劑。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中該活化劑選自IFNα，TNFα，RANK配體/激動劑，CD40配體/激動劑，或其它TNF/CD40受體家族成員的配體/激動劑。
24.如權(quán)利要求1所述的方法，其進一步包括給予提高血液樹突細胞數(shù)目的細胞因子。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中該樹突細胞增殖劑選自FLT3-L，GM-CSF和G-CSF。
26.如權(quán)利要求1所述的方法，其進一步包括傳送活化于樹突細胞的趨化因子。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中該趨化因子選自CCL21，CCL3，CCL20，CCL16，CCL5，CCL25，CXCL12，CCL7，CCL8，CCL2，CCL13，CXCL9，CXCL10和CXCL11。
28.如權(quán)利要求26所述的方法，其中該趨化因子利用導向構(gòu)建物傳送至腫瘤，其包括趨化因子或生物活性片段或其變體與導向部分。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中該導向部分選自a)至少有10個氨基酸的肽；b)蛋白質(zhì)；c)小分子；d)載體；和e)抗體或抗體片段。
30.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑和/或TLR激動劑彼此連結(jié)。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中該腫瘤-衍生的DC抑制因子拮抗劑和/或TLR激動劑進一步連結(jié)于腫瘤相關(guān)性抗原。
全文摘要
樹突細胞(DC)在抗原特異性免疫反應中扮演重要角色。材料和方法被提供用于治療疾病狀態(tài)，包括癌癥，其通過活化因疾病而對活化刺激表達低反應的宿主的樹突細胞。特別地，提供用于治療哺乳類癌癥的方法，其包括對于該哺乳類給予有效量的腫瘤－衍生的DC抑制因子拮抗劑聯(lián)合有效量的Toll類受體(TLR)激動劑。
文檔編號C12N5/08GK1617742SQ02827598
公開日2005年5月18日 申請日期2002年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月27日
發(fā)明者A·P·維卡里, C·考克斯 申請人:先靈公司