專(zhuān)利名稱：基因重組腫瘤血管凋亡因子pfk及其衍生融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及基因重組腫瘤血管凋亡因子PFK、其衍生融合蛋白以及它們的制備方法。
目前，已經(jīng)在研究中的腫瘤血管抑制藥物有百余種，其中有30多種進(jìn)入臨床試驗(yàn)，有數(shù)種通過(guò)二期臨床試驗(yàn)進(jìn)入三期臨床研究階段。抑制腫瘤血管生成是繼手術(shù)、放療、化療以后實(shí)現(xiàn)腫瘤治療的新的腫瘤治療途徑與傳統(tǒng)方法有良好的協(xié)同作用。
這些腫瘤血管抑制藥物大致可以分為兩類(lèi)一類(lèi)是化學(xué)合成或半合成藥物，這一類(lèi)一般毒副反應(yīng)較大，應(yīng)用限制較多；另一類(lèi)是人體內(nèi)源性的血管生長(zhǎng)抑制因子，如PF4(血小板因子4)(Gengrinovitch S.et alPF4 inhbits themitogenic activity of VEGF125and VEGF165 Using several concurrentmechanisms J.B.C.270.15059-15065 1995)，Angiostatin(血管抑素)(O’Relly，M.S.，Holmgren L，Yuen Shing et.al.AntiangiogenicA novelangiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metasis by a Lewis lungcarcinoma.Cell，1994，79315)，Endostatin(內(nèi)皮抑素)(O’Relly M.S.et alEndostatinan endogenous inhibitor for of angiogenesis and tumor growth Cell1997 88 277)等，可以通過(guò)基因工程方法大量制備，這一類(lèi)內(nèi)源性抑制因子毒副反應(yīng)小，可成為臨床應(yīng)用效果良好的抗腫瘤藥物。
人體內(nèi)存在血管生長(zhǎng)與血管生長(zhǎng)抑制二個(gè)系統(tǒng)，正常成年人二個(gè)系統(tǒng)達(dá)到平衡。成年人血管內(nèi)皮細(xì)胞壽命僅次于神經(jīng)細(xì)胞，代謝速度很慢。婦女妊娠、月經(jīng)周期、傷口愈合過(guò)程會(huì)發(fā)生血管新生，而在一般情況下以抑制為主。腫瘤細(xì)胞大量分泌血管生長(zhǎng)因子，要實(shí)現(xiàn)血管抑制需要使用超過(guò)體內(nèi)正常量大得多的抑制因子。如內(nèi)源性血管生長(zhǎng)抑制因子Angiostatin和Endostatin在動(dòng)物試驗(yàn)中效果良好，副作用輕微，但用量則很大。從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果推算，人體用量每次注射需以克計(jì)。實(shí)際臨床試驗(yàn)中，每次注射用量為100-350mg，是目前其他基因工程藥物的1000倍以上。如果一個(gè)患者，每次用100mg，一個(gè)療程30次，則總用量為3克；以100萬(wàn)人(一個(gè)療程的用量)計(jì)算是300萬(wàn)克，即3000公斤，這是現(xiàn)有基因工程技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)的。
為此解決上述困難，可以從下述三個(gè)方面進(jìn)行突破一是提高基因工程菌株的表達(dá)產(chǎn)量，以適應(yīng)量的要求；二是優(yōu)化蛋白質(zhì)純化方法，以適應(yīng)超大規(guī)模制藥的需要；三是提高藥物活性，減少用量。
1999年BOLANOWSKI申請(qǐng)了PCT(WO99/168889)Fusion ProteinsComprising Angiostain Moisty and Their Use in Ant-tunmor Treatmt 0.8.04.1999C12N-15/62 PCT/US98/20464.BOLANOWSKI專(zhuān)利將Angiostatin與EndostatinI型干擾素、Thromdospondin干擾素誘生蛋白10、PF4拼接，以實(shí)現(xiàn)融合蛋白的易于是純化功能和提高活性能效果。
該專(zhuān)利主要運(yùn)用了Angiostatin，Angiostatin是J FoIkman在1994年發(fā)現(xiàn)的血管生長(zhǎng)抑制因子，是血漿蛋白Plasminogen(纖溶酶原)的N端的片段，分子量為37-43KD。除抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖以外，該蛋白與Plasminogen一樣可被lysines-Sepharose4B柱吸附并被6氨基已酸特異洗脫，有易于純化的特性。利用Angiostatin與Endostatin、PF4等有血管抑制功能的蛋白拼接成融合蛋白，二種異基因具有同功能的蛋白協(xié)同作用，提高活性。同時(shí)，融合蛋白將保留Angiostatin易于純化的特點(diǎn)，這是血管生長(zhǎng)抑制因子研究方面極好的設(shè)計(jì)。
本發(fā)明是在BOLANOWSKI專(zhuān)利的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，是對(duì)它的改進(jìn)，BOLANOWSKI專(zhuān)利中的Anginstatin在酵母中難以表達(dá)，與其他基因拼接，更難實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明用Angiostatin的活性片段(K1片段)代替BOLANOWSKI專(zhuān)利的Angiostatin，這樣分子量小三倍，易于分子改造。然后在K1片段前接上PF4的13個(gè)活性氨基酸片段，生成腫瘤血管凋亡因子PFK，腫瘤血管凋亡因子PFK可以干擾血管生內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)，從而提高對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用。最后，還可以在血管凋亡因子PFK的基礎(chǔ)上進(jìn)一步與K1、K5、Endostatin等拼接構(gòu)建融合蛋白，進(jìn)一步提高抑制活性。
本發(fā)明的另一目的在于提供基因重組腫瘤血管凋亡因子PFK的衍生融合蛋白，以及它們的核苷酸序列和氨基酸序列。
本發(fā)明的另一目的在于提供基因重組腫瘤血管凋亡因子PFK及其衍生融合蛋白的制備方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種基因重組腫瘤血管凋亡因子PFK的cDNA，它的核苷酸序列為SEQID No.3。它的氨基酸序列為SEQ ID No.4。
一種制備基因重組腫瘤血管凋亡因子PFK的方法，其特征在于，包括從肝臟CDNA文庫(kù)中用PCR方法擴(kuò)增K1(Plasminogen Kringle 1)，并在其上游引物合成時(shí)加入血小板因子4(PF4)的13個(gè)氨基酸，用表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，獲得基因重組腫瘤血管凋亡因子PFK；所述的K1片段的核苷酸序列為SEQ ID No.1，所述的13個(gè)氨基酸片段的核苷酸序列為SEQ ID No.2。
一種基因重組腫瘤血管凋亡因子PFK的衍生融合蛋白，其特征在于，它具有以下結(jié)構(gòu)通式PFK-L-Px或PFK-L-Px-L-Py，其中通式中的Px、Py是有血管抑制功能的蛋白或功能片段，如PlasminogenKringle1(k1)，Plasminogen Kringle5(k5)、膠原十八C末端的有血管抑制活性片段Endostatin(En)、VEGFR、有血管抑制功能的催乳素片段等；通式的中L是連接兩種蛋白的柔性連接臂，其核苷酸序列為SEQ ID No.5，所表達(dá)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列為SEQ ID No.6。
上述通式中的Px可為Kringle1(k1)，構(gòu)成的衍生融合蛋白PFK-L-K1的核苷酸序列為SEQ ID No.7，它的氨基酸序列為SEQ ID No.8。
上述通式中的Px可為Plasminogen Kringle 5(k5)，所述的K5基因的核苷酸序列為SEQ ID No.9，構(gòu)成的衍生融合蛋白PFK-L-K5的核苷酸序列為SEQ ID No.10，它的氨基酸序列為SEQ ID No.11。
上述通式中的Px可為Endostatin(En)，所述的En基因的核苷酸序列為SEQ ID No.12，構(gòu)成的衍生融合蛋白PFK-L-En的核苷酸序列為SEQ IDNo.13，它的氨基酸序列為SEQ ID No.14。
上述通式中的Px可為K1，Py為K5，構(gòu)成的衍生融合蛋白PFK-L-K1-K5的核苷酸序列為SEQ ID No.15，它的氨基酸序列為SEQ ID No.16。
上述通式中的Px可為K1，Py也為K1，構(gòu)成的衍生融合蛋白PFK-L-K1-K1的核苷酸序列為SEQ ID No.17，它的氨基酸序列為SEQ ID No.18。
一種制備基因重組腫瘤血管凋亡因子PFK的衍生融合蛋白的方法，其特征在于，由PFK基因構(gòu)建衍生融合蛋白基因，利用酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZ區(qū)有12個(gè)多克隆基因插入位點(diǎn)，首先將PFK基因插入EcoRI/KpnI位點(diǎn)，測(cè)序確認(rèn)正確后，再在KpnI/XhoI位點(diǎn)插入第二個(gè)基因。接著可以在XhoI/NotI位點(diǎn)插入第三個(gè)基因。用這種方法，在表達(dá)質(zhì)粒上插入多個(gè)基因。通過(guò)PFK與K1、K5、Endostatin等基因拼接，制備了多種融合基因，所有基因拼接中，在二個(gè)基因之間插入連接基因L，其核苷酸序列為SEQ ID No.5，以表達(dá)柔性連接肽L，其氨基酸序列為SEQ ID No.4(絲氨酸、甘氨酸、甘氨酸、甘氨酸.絲氨酸、甘氨酸、甘氨酸、甘氨酸絲氨酸、甘氨酸、甘氨酸、甘氨酸)。利用PEK基因可以構(gòu)建更多的融合基因。
具體為，首先將PFK基因插入EcoRI/KpnI位點(diǎn)，測(cè)序確認(rèn)正確后，將PFK基因連上一個(gè)連接基因L，再在KpnI/XhoI位點(diǎn)插入K1基因。這樣就可以得到衍生融合蛋白PFK-L-K1，它的核苷酸序列為SEQ ID No.7，其氨基酸序列為SEQ ID No.8。
具體為，首先將PFK基因插入EcoRI/KpnI位點(diǎn)，測(cè)序確認(rèn)正確后，將PFK基因連上一個(gè)連接基因L，再在KpnI/XhoI位點(diǎn)插入K5基因。這樣就可以得到衍生融合蛋白PFK-L-K5，它的核苷酸序列為SEQ ID No.10，其氨基酸序列為SEQ ID No.11。
具體為，首先將PFK基因插入EcoRI/KpnI位點(diǎn)，測(cè)序確認(rèn)正確后，將PFK基因連上一個(gè)連接基因L，再在KpnI/XhoI位點(diǎn)插入Endostatin基因。這樣就可以得到衍生融合蛋白PFK-L-Endostatin，它的核苷酸序列為SEQ IDNo.13，其氨基酸序列為SEQ ID No.14。
具體為，在衍生融合蛋白PFK-L-K1的基礎(chǔ)上連上一個(gè)連接基因L，接著可以在XhoI/NotI位點(diǎn)插入K5基因。這樣就可以得到衍生融合蛋白PFK-L-K1-L-K5，它的核苷酸序列為SEQ ID No.15，其氨基酸序列為SEQ IDNo.16。
具體為，在衍生融合蛋白PFK-L-K1的基礎(chǔ)上連上一個(gè)連接基因L，接著可以在XhoI/NotI位點(diǎn)插入K1基因。這樣就可以得到衍生融合蛋白PFK-L-K1-L-K1，它的核苷酸序列為SEQ ID No.17，其氨基酸序列為SEQ IDNo.18。
融合蛋白PFK及衍生融合蛋白的表達(dá)、純化，含PFK及融合基因的質(zhì)粒導(dǎo)入酵母，應(yīng)用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)融合蛋白，操作按Invitrogen公司提供的操作說(shuō)明書(shū)操作，融合蛋白的用SDS電泳及western blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物，PFK基因及通過(guò)拼接獲得的衍生基因，可表達(dá)系列融合蛋白。這些融合蛋白均可以通過(guò)Lysine-Sepharose4B純化，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有良好的抑制作用。
本發(fā)明的效果1.良好的純化效果含有K1片段的融合蛋白可以用Lysine-sepharose吸附并被6氨基己酸特異洗脫，一次親和純化，蛋白質(zhì)純度可以提高一萬(wàn)以上。而且洗脫條件十分溫和，不會(huì)影響蛋白質(zhì)活性。是可以實(shí)現(xiàn)基因藥物的超大規(guī)模，超高效率，低成本純化。而且，可以通過(guò)K1片段自身拼接成2K、3K改變與Lysine-sepharose 4B的吸附特性，以適應(yīng)實(shí)際純化工藝的需要。
2.良好的協(xié)同作用及活性通過(guò)同功能不同基因拼接，基因重組的融合蛋白是實(shí)現(xiàn)功能蛋白的性能改善的常用方法，可以使二種蛋白實(shí)現(xiàn)協(xié)同作用。PF4活性片段干擾VEGF和FGF的作用。PFK的K1片段是Angiostatin的活性片段，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞晚期凋亡，IC50為500nm。它的活性還受培養(yǎng)系統(tǒng)中血管生長(zhǎng)因子濃度影響，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中生長(zhǎng)因子(FGF或VEGF)增加可以完全消除K1或Angistatin的抑制作用，PF4的作用是干擾生長(zhǎng)因子FGF和VEGF的作用，因此，K1與PF4的拼接起推挽協(xié)同作用。作用于人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制IC50為50nm，較K1活性提高10倍，較PF4片段活性高50倍，PFK與其他蛋白融合產(chǎn)生新的融合蛋白的效果更好。
3.融合蛋白可以高效表達(dá)Angiostatin在酵母中是低產(chǎn)表達(dá)蛋白，由Angiostatin構(gòu)建的融合蛋白，一般產(chǎn)量含更低。而且PFK的基因較Angiostatin小3倍，由PFK構(gòu)建的融合蛋白較Angiostatin構(gòu)建的融合蛋白表達(dá)產(chǎn)量高10倍左右，活性較Angiostatin高2倍。
4.融合基因在基因治療應(yīng)用中的意義外源基因通過(guò)適當(dāng)載體實(shí)施基因治療，融合蛋白由于協(xié)同作用，提高活性，在較低濃度即達(dá)到有效水平，為基因治療提供可能性。
圖2為PFK-L-K5的電泳圖。A為Marker，B為PFK-L-K5。
圖3為PFK-L-En的電泳圖。A為Marker，B為PFK-L-En。
實(shí)施例1 PFK基因克隆首先按照《精編分子生物學(xué)指南》P123方法制備肝組織總mRNA并通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增Plasminogen的k1片段(SEQ ID No.1)。PCR上游引物合成時(shí)加入PF4基因的39個(gè)堿基(PF4基因58-70bp，SEQ ID No.2)，具體上游引物和下游引物序列如下P1 5′-gaa ttc ccg ctg tac aag aaa ata att aag aaa ctt ttg gag agt ggc cgg ggc gtgtat ctc tca gag tgc-3′P2 5′-ggt acc tca tca ttc ctc ttc aca ctc aag-3′PCR擴(kuò)增用Takara Biotech co.Ltd提供的Ex Tag DNA聚合酶，工作條件按該公司提供的操作說(shuō)明書(shū)操作。在瓊脂糖電泳凝膠板上可看到分子量約為350bp的基因。按《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》P91及Takara Biotech co.Ltd為T(mén)4連接酶提供的操作說(shuō)明書(shū)，將PCR擴(kuò)增的帶有EcoRI/KpnI酶切位點(diǎn)及帶有終止密碼子的基因插入Invitrogen公司酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA的EcoRI/KpnI位點(diǎn)。電轉(zhuǎn)化方法將含目的基因的質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌Top10F(參見(jiàn)《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》P24)。
經(jīng)含有25mg/ml Zeocin的LB平板培養(yǎng)過(guò)夜。第二天取10個(gè)菌落分別接種5ml LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，用華舜生物價(jià)補(bǔ)貼工程有限公司提供的小量質(zhì)粒提取試劑盒，按其操作說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒，送基康生物公司測(cè)定基因序列，其核苷酸序列為SEQ ID No.3，其氨基酸序列為SEQ ID No.4。
實(shí)施例2 PFK-L-K1基因克隆引物合成P1 5′-ggt acc tct ggc ggc ggc tct ggc ggc ggc tct ggc ggc ggc gtg tat ctc tcatgc-3′P2 5′-ctc gag tca tca ttc ctc ttc aca ctc aag-3′用上述引物以K1基因?yàn)槟０澹琍CR擴(kuò)增帶有KpnI/XhoI酶切位點(diǎn)、有連接基因L以及tga tga終止密碼的K1片段。用實(shí)例1方法在KpnI/XhoI位點(diǎn)插入帶有PFK基因的pPICZαA質(zhì)粒，導(dǎo)入大腸桿茵TOP10F，測(cè)序，其核苷酸序列為SEQ ID No.7，其氨基酸序列為SEQ ID No.8。
實(shí)施例3 PFK-L-K5基因克隆。
引物設(shè)計(jì)P1 5′-ggt acc tct ggc ggc ggc tct ggc ggc ggc tct ggc ggc ggc cct gtt gtc ctg cttcca-3′P2 5′-gcg gcc gc tca tca act aaa tga agg ggc cgc aca gc-3′用上述引物，以肝CDNA為模板，PCR擴(kuò)增帶有Kpn/Not1及終止密碼子、帶有連接臂L的K5片段(其核苷酸序列為SEQ ID No.9)，用實(shí)施例1相同的方法，插入帶有PFK基因的PPICZ A質(zhì)粒，KpnI/NotI位點(diǎn)導(dǎo)入大腸桿菌TOP10F，測(cè)序確認(rèn)DNA序列的正確性，其核苷酸序列為SEQ IDNo.10，其氨基酸序列為SEQ ID No.11，具體操見(jiàn)作按新編分子生物子操作指南p91實(shí)施。
實(shí)施例4 PFK-L-Endostatin基因克隆引物設(shè)計(jì)P1 5′-ggt acc tct cgg cgg cgg tct cgg cgg cgg tct cgg cgg cgg cac agc cac cgcgac ttc-3′P2 5′-gc ggc cgc tca tta ctt gga ggc agt cat gaa-3′用上述引物以肝CDNA為模板，PCR擴(kuò)增帶有KpnI/NotI、連接基因L及終止密碼子的Endostatin基因(其核苷酸序列為SEQ ID No.12)，用實(shí)施例2方法插入帶有PFK基因的pPICZαA質(zhì)粒，將質(zhì)粒導(dǎo)入Top10F大腸桿菌，測(cè)序確認(rèn)DNA序列與設(shè)計(jì)相符，其核苷酸序列為SEQ ID No.13，其氨基酸序列為SEQ ID No.14。
實(shí)施例5 PFK-L-K1-L-K5基因克隆引物設(shè)計(jì)P1 5′-ctc gag tct ggc ggc ggc tct ggc ggc ggc tct ggc ggc ggc cct gtt gtc ctg cttcaa-3′P2 5′-gc ggc cgc tca tca atg aaa tga agg ggc cgc-3′用上述引物，以肝CDNA為模板，PCR擴(kuò)增帶有XhoI/NotI及終止密碼的Plasminogen K5片段，用實(shí)施例2的方法，插入實(shí)例帶有PFK-K1基因的pPICZαA質(zhì)粒XhoI/NotI位點(diǎn)，帶有PFK-L-K1-L-K5基因的pPICZαA質(zhì)粒導(dǎo)入Top10F大腸桿菌，測(cè)序確定DNA序列與設(shè)計(jì)相符合，其核苷酸序列為SEQ ID No.15，其氨基酸序列為SEQ ID No.16。
實(shí)施例6 PFK-L-K1-L-K1基因克隆引物設(shè)計(jì)P15′-ctc gag tct ggc ggc ggc tct ggc ggc ggc tct ggc ggc ggc gtgtat ctc tca tgc-3′P25′-gc ggc cgc tcatcattc ctc ttc aca ctc aag-3′用上述引物以K1基因?yàn)槟０?，PCR擴(kuò)增帶有XhoI/NotI酶切位點(diǎn)，有連接臂L基因，有tca tca終止密碼子的K1基因片段。用實(shí)例2介紹的方法，將基因插入帶有PFK-L-L1基因的XhoI/NotI位點(diǎn)。然后將含有PEK-L-K1-L-K1基因的PPICZαA質(zhì)粒導(dǎo)入TOPlOF大腸桿茵，測(cè)序確認(rèn)序列正確，其核苷酸序列為SEQ ID No.17，其氨基酸序列為SEQ ID No.18。
實(shí)施例7 PFK基因酵母表達(dá)結(jié)果1、PFK基因酵母表達(dá)酵母表達(dá)系統(tǒng)是從Invitrogen公司購(gòu)買(mǎi)的PPICZ質(zhì)粒及相應(yīng)表達(dá)菌株GS115、KH71。將含有基因的質(zhì)粒用新芝產(chǎn)2001-2B基因?qū)雰x導(dǎo)入酵母，條件是1200V 25mF 200Ω.PFK質(zhì)粒5-10mg用75％乙醇沉淀，溶解于20μl水中.酵母菌GS115培養(yǎng)到中晚期，80μl電擊液中含有的108酵母菌。轉(zhuǎn)化的酵母菌培養(yǎng)于含有25ug/ml zeocin的YPD平板，在4天以后，挑出克隆轉(zhuǎn)移到50ug/ml的Zeocin YPD平板，隨后二周內(nèi)分步接種Zeocin濃度倍增的YPD平板，直到5mg/ml。挑取在5mg/ml Zeocin YPD平板上生長(zhǎng)良好的酵母菌用于表達(dá)篩選。
用于表達(dá)篩選的酵母菌培養(yǎng)于BMMY培養(yǎng)液，加入0.5％甲醇誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物，72hr培養(yǎng)后，培養(yǎng)上清液用20％三氯醋酸沉淀，經(jīng)丙酮洗三遍后用于SDS電泳分析。PFK基因酵母表達(dá)按照Invitrogen公司操作說(shuō)明書(shū)實(shí)施(Amanual of methods for expression of recombinant proteins using pPIcz and pPIczain pichia patoris，catalog No K1 740-01)2.PFK表達(dá)產(chǎn)物純化PFK基因表達(dá)產(chǎn)物分泌于酵母培養(yǎng)液中純化表達(dá)產(chǎn)物用的Lysine-sepharose4B購(gòu)于sigma公司，10ml Lysine-sepharose4B柱用PH7.7 0.1MTris·HCl洗滌，酵母培養(yǎng)上清液用1M tris調(diào)至PH7.7，緩慢流過(guò)層析柱，經(jīng)0.1M 6氨基己酸洗脫，用核酸蛋白儀檢測(cè)蛋白洗脫峰。洗脫蛋白用SDS電泳分析純度。SOS電泳上顯示純化產(chǎn)物為一條電泳帶(見(jiàn)

圖1)。經(jīng)密度掃描儀分折，純度為92.3％。用紫外比色法測(cè)，定搖瓶發(fā)酵條件下，PFK產(chǎn)量的為95mg/ml。
3、表達(dá)產(chǎn)物活性測(cè)定用于活性測(cè)定的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株自來(lái)中科院細(xì)胞株，人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于含有FGF生長(zhǎng)因子的MDM細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后用含有5％小牛血清的1640培養(yǎng)液懸浮，96孔板中每孔加入5000只細(xì)胞，酵母表達(dá)并純化的融合蛋白用含5％小牛血清的1640培養(yǎng)液逐步對(duì)半稀釋至不同濃度，每孔加0.1ml，37℃培養(yǎng)72小時(shí)，用常規(guī)MTT法測(cè)定對(duì)臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的抑制的百分比。具體操作以下文獻(xiàn)實(shí)施王樹(shù)森等1H11內(nèi)皮細(xì)胞株測(cè)定血管形成抑制劑的方法研究，徐醫(yī)學(xué)學(xué)院報(bào)18、176、1998。PFK對(duì)人臍靜肪血首內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用見(jiàn)表I表I純化融合蛋白PFK對(duì)人臍靜肪血首內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用。
濃度(nm) 05102550 100 200 400抑制(％) 0.0 5.2 15.4 30.5 53 61.5 70.0 85.3實(shí)施例8 PFK-L-K5基因酵母表達(dá)及結(jié)果1、PFK-L-K5基因酵母表達(dá)，產(chǎn)物純化及活性測(cè)定方法與實(shí)施例7相同2、通過(guò)Lysine-Sepharose4B純化，活性電泳分析，可是一條泳帶密度掃描顯示純度約為90％(見(jiàn)圖2)。約為65ng/ml搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下表達(dá)產(chǎn)量。
3、對(duì)人臍靜肪血首內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用見(jiàn)表II表II，PFK-L-K5融合蛋白對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用。
濃度(nm) 0 2.55 102550100 200 400抑制(％) 0 10.0 25.2 45.3 58.2 64.5 70.8 78.9 88.5實(shí)施例9 PFK-L-Endostatin基因酵母表達(dá)及結(jié)果1、PFK-L-Endostatin基因酵母表達(dá)，產(chǎn)物純化及活力測(cè)定方法同實(shí)施例7。
2、通過(guò)Lysine-Sepharose4B純化，SDS泳顯示一條電泳帶(見(jiàn)圖3)，密度掃描儀掃描結(jié)果顯示純度為91.5％，搖瓶培養(yǎng)條件表達(dá)產(chǎn)量幾次平均分85.5mg/L。
3、對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用見(jiàn)表III表III，PFK-L-Endostatin對(duì)人臍靜內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用。濃度(nm) 01.0 2 4 8 204080200 400抑制率(％)0.0 3.0 10.5 30.2 48.0 55.3 62.1 70.0 78.5 83.2
序列表<110>談立松陳宇光張尚權(quán)<120>基因重組腫瘤血管凋亡因子PFK及其衍生融合蛋白<160>18<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>261<212>DNA<213>Human<400>1gtgtatctct cagagtgcaa gactgggaat ggaaagaact acagagggac gatgtccaaa60acaaaaaatg gcatcacctg tcaaaaatgg agttccactt ctccccacag acctagattc 120tcacctgcta cacacccctc agagggactg gaggagaact actgcaggaa tccagacaac 180gatccgcagg ggccctggtg ctatactact gatccagaaa agagatatga ctactgcgac 240attcttgagt gtgaagagga a 261<210>2<211>39<212>DNA<213>human<400>2ccgctgtaca agaaaataat taagaaactt ttggagagt 39<210>3<211>309<212>DNA<213>artificial sequence<220><221>CDS<222>(1)..(309)<223><400>3ccg ctg tac aag aaa ata att aag aaa ctt ttg gag agt ggc cgg gcc 48Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser Gly Arg Ala1 5 10 15gtg tat ctc tca gag tgc aag act ggg aat gga aag aac tac aga ggg 96Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly20 25 30acg atg tcc aaa aca aaa aat ggc atc acc tgt caa aaa tgg agt tcc 144Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser35 40 45act tct ccc cac aga cct aga ttc tca cct gct aca cac ccc tca gag 192Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu50 55 60gga ctg gag gag aac tac tgc agg aat cca gac aac gat ccg cag ggg 240Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly65 70 75 80ccc tgg tgc tat act act gat cca gaa aag aga tat gac tac tgc gac 288Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp85 90 95att ctt gag tgt gaa gag gaa 309Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu100<210>4<211>103<212>PRT<213>artificial sequence<400>4Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser Gly Arg Ala1 5 10 15Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly20 25 30Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser35 40 45Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu50 55 60Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly65 70 75 80Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp85 90 95Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu100<210>5<211>36<212>DNA<213>human<220><221>CDS<222>(1)..(36)<223><400>5ctc ggc ggc ggc ctc ggc ggc ggc ctc ggc ggc ggc 36Leu Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly1 5 10<210>6<211>12<212>PRT<213>human<400>6Leu Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly1 5 10<210>7<211>558<212>DNA<213>artificial sequence<220><221>CDS<222>(1)..(558)<223><400>7ctc tca gag tgc aag act ggg aat gga aag aac tac aga ggg acg atg48Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met1 5 10 15tcc aaa aca aaa aat ggc atc acc tgt caa aaa tgg agt tcc act tct96Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser20 25 30ccc cac aga cct aga ttc tca cct gct aca cac ccc tca gag gga ctg144Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu35 40 45gag gag aac tac tgc agg aat cca gac aac gat ccg cag ggg ccc tgg192Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp50 55 60tgc tat act act gat cca gaa aag aga tat gac tac tgc gac att ctt240Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu65 70 75 80gag tgt gaa gag gaa ggt acc tct ggc ggc ggc tcc ggc ggc ggc tct288Glu Cys Glu Glu Glu Gly Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser85 90 95ggc ggc ggc gtg tat ctc tca gag tgc aag act ggg aat gga aag aac336Gly Gly Gly Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn100 105 110tac aga ggg acg atg tcc aaa aca aaa aat ggc atc acc tgt caa aaa384Tyr Arg Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys115 120 125tgg agt tcc act tct ccc cac aga cct aga ttc tca cct gct aca cac432Trp Ser Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His130 135 140ccc tca gag gga ctg gag gag aac tac tgc agg aat cca gac aac gat480Pro Ser Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp145 150 155 160ccg cag ggg ccc tgg tgc tat act act gat cca gaa aag aga tat gac528Pro Gln Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp165 170 175tac tgc gac att ctt gag tgt gaa gag gaa 558Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu180 185<210>8<211>186<212>PRT<213>artificial sequence<400>8Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met1 5 10 15Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser20 25 30Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu35 40 45Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp50 55 60Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu65 70 75 80Glu Cys Glu Glu Glu Gly Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser85 90 95Gly Gly Gly Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn100 105 110Tyr Arg Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys115 120 125Trp Ser Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His
130 135 140Pro Ser Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp145 150 155 160Pro Gln Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp165 170 175Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu180 185<210>9<211>303<212>DNA<213>human<400>9cctgttgtcc tgcttccaga tgtagagact ccttccgaag aagactgtat gtttgggaat 60gggaaaggat accgaggcaa gagggcgacc actgttactg ggacgccatg ccaggactgg120gctgcccagg agccccatag acacagcatt ttcactccag agacaaatcc acgggcgggt180ctggaaaaaa attactgccg taaccctgat ggtgatgtag gtggtccctg gtgctacacg240acaaatccaa gaaaacttta cgactactgt gatgtccctc agtgtgcggc cccttcattt300gat 303<210>10<211>654<212>DNA<213>artificial sequence<220><221>CDS<222>(1)..(654)<223><400>10ccg ctg tac aag aaa ata att aag aaa ctt ttg gag agt ggc cgg ggc48Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser Gly Arg Gly1 5 10 15gtg tat ctc tca gag tgc aag act ggg aat gga aag aac tac aga ggg96Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly20 25 30acg atg tcc aaa aca aaa aat ggc atc acc tgt caa aaa tgg agt tcc144Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser35 40 45act tct ccc cac aga cct aga ttc tca cct gct aca cac ccc tca gag192Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu50 55 60gga ctg gag gag aac tac tgc agg aat cca gac aac gat ccg cag ggg240Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly65 70 75 80ccc tgg tgc tat act act gat cca gaa aag aga tat gac tac tgc gac288Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp85 90 95att ctt gag tgt gaa gag gaa ggt acc tct ggc ggc ggc tct ggc ggc336Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Gly Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly100 105 110ggc tct ggc ggc ggc cct gtt gtc ctg ctt cca gat gta gag act cct384Gly Ser Gly Gly Gly Pro Val Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro115 120 125tcc gaa gaa gac tgt atg ttt ggg aat ggg aaa gga tac cga ggc aag432Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys130 135 140agg gcg acc act gtt act ggg acg cca tgc cag gac tgg gct gcc cag480Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln145 150 155 160gag ccc cat aga cac agc att ttc act cca gag aca aat cca cgg gcg528Glu Pro His Arg His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala165 170 175ggt ctg gaa aaa aat tac tgc cgt aac cct gat ggt gat gta ggt ggt576Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly180 185 190ccc tgg tgc tac acg aca aat cca aga aaa ctt tac gac tac tgt gat624Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp195 200 205gtc cct cag tgt gcg gcc cct tca ttt gat 654Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro Ser Phe Asp210 215<210>11<211>218<212>RT<213>artificial sequence<400>11Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser Gly Arg Gly1 5 10 15Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly20 25 30Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser35 40 45Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu50 55 60Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly65 70 75 80Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp85 90 95Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Gly Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly100 105 110Gly Ser Gly Gly Gly Pro Val Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro115 120 125Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys130 135 140Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln145 150 155 160Glu Pro His Arg His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala165 170 175Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly180 185 190Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp195 200 205Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro Ser Phe Asp210 215<210>12<211>549<212>DNA<213>human<400>12cacagccacc gcgacttcca gccggtgctc cacctggttg cgctcaacag ccccctgtca 60ggcggcatgc ggggcatccg cggggccgac ttccagtgct tccagcaggc gcgggccgtg120gggctggcgg gcaccttccg cgccttcctg tcctcgcgcc tgcaggacct gtacagcatc180gtgcgccgtg ccgaccgcgc agccgtgccc atcgtcaacc tcaaggacga gctgctgttt240cccagctggg aggctctgtt ctcaggctct gagggtccgc tgaagcccgg ggcacgcatc300ttctcctttg acggcaagga cgtcctgagg caccccacct ggccccagaa gagcgtgtgg360catggctcgg accccaacgg gcgcaggctg accgagagct actgtgagac gtggcggacg420gaggctccct cggccacggg ccaggcctcc tcgctgctgg ggggcaggct cctggggcag480agtgccgcga gctgccatca cgcctacatc gtgctctgca ttgagaacag cttcatgact540gcctccaag549<210>13<211>900<212>DNA<213>artificial sequence<220><221>CDS<222>(1)..(900)<223><400>13ccg ctg tac aag aaa ata att aag aaa ctt ttg gag agt ggc cgg gcc48Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser Gly Arg Ala1 5 10 15gtg tat ctc tca gag tgc aag act ggg aat gga aag aac tac aga ggg96Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly20 25 30acg atg tcc aaa aca aaa aat ggc atc acc tgt caa aaa tgg agt tcc144Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser35 40 45act tct ccc cac aga cct aga ttc tca cct gct aca cac ccc tca gag192Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu50 55 60gga ctg gag gag aac tac tgc agg aat cca gac aac gat ccg cag ggg240Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly65 70 75 80ccc tgg tgc tat act act gat cca gaa aag aga tat gac tac tgc gac288Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp85 90 95att ctt gag tgt gaa gag gaa ggt acc tct ggc ggc ggc tct ggc ggc336Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Gly Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly100 105 110ggc tct ggc ggc ggc cac agc cac cgc gac ttc cag ccg gtg ctc cac384Gly Ser Gly Gly Gly His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His115 120 125ctg gtt gcg ctc aac agc ccc ctg tca ggc ggc atg cgg ggc atc cgc432Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg130 135 140ggg gcc gac ttc cag tgc ttc cag cag gcg cgg gcc gtg ggg ctg gcg480Gly Ala Asp Phe Gln Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala145 150 155 160ggc acc ttc cgc gcc ttc ctg tcc tcg cgc ctg cag gac ctg tac agc528Gly Thr Phe Arg Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser165 170 175atc gtg cgc cgt gcc gac cgc gca gcc gtg ccc atc gtc aac ctc aag576Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys180 185 190gac gag ctg ctg ttt ccc agc tgg gag gct ctg ttc tca ggc tct gag624Asp Glu Leu Leu Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu195 200 205ggt ccg ctg aag ccc ggg gca cgc atc ttc tcc ttt gac ggc aag gac672Gly Pro Leu Lys Pro Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp210 215 220gtc ctg agg cac ccc acc tgg ccc cag aag agc gtg tgg cat ggc tcg720Val Leu Arg His Pro Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser225 230 235 240gac ccc aac ggg cgc agg ctg acc gag agc tac tgt gag acg tgg cgg768Asp Pro Asn Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg245 250 255acg gag gct ccc tcg gcc acg ggc cag gcc tcc tcg ctg ctg ggg ggc816Thr Glu Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly260 265 270agg ctc ctg ggg cag agt gcc gcg agc tgc cat cac gcc tac atc gtg864Arg Leu Leu Gly Gln Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val275 280 285ctc tgc att gag aac agc ttc atg act gcc tcc aag900Leu Cys Ile Glu Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys290 295 300<210>14<211>300<212>PRT<213>artificial sequence<400>14Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser Gly Arg Ala1 5 10 15Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly20 25 30Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser35 40 45Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu50 55 60Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly65 70 75 80Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp85 90 95Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Gly Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly100 105 110Gly Ser Gly Gly Gly His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His115 120 125Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg130 135 140Gly Ala Asp Phe Gln Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala145 150 155 160Gly Thr Phe Arg Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser165 170 175Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys180 185 190Asp Glu Leu Leu Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu
195 200 205Gly Pro Leu Lys Pro Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp210 215 220Val Leu Arg His Pro Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser225 230 235 240Asp Pro Asn Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg245 250 255Thr Glu Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly260 265 270Arg Leu Leu Gly Gln Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val275 280 285Leu Cys Ile Glu Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys290 295 300<210>15<211>957<212>DNA<213>artificial sequence<220><221>CDS<222>(1)..(957)<223><400>15ccg ctg tac aag aaa ata att aag aaa ctt ttg gag agt ggc cgg ggc48Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser Gly Arg Gly1 5 10 15gtg tat ctc tca gag tgc aag act ggg aat gga aag aac tac aga ggg96Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly20 25 30acg atg tcc aaa aca aaa aat ggc atc acc tgt caa aaa tgg agt tcc144Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser
35 40 45act tct ccc cac aga cct aga ttc tca cct gct aca cac ccc tca gag192Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu50 55 60gga ctg gag gag aac tac tgc agg aat cca gac aac gat ccg cag ggg240Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly65 70 75 80ccc tgg tgc tat act act gat cca gaa aag aga tat gac tac tgc gac288Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp85 90 95att ctt gag tgt gaa gag gaa ggt acc tct ggc ggc ggc tct ggc ggc336Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Gly Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly100 105 110ggc tct ggc ggc ggc gtg tat ctc tca gag tgc aag act ggg aat gga384Gly Ser Gly Gly Gly Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly115 120 125aag aac tac aga ggg acg atg tcc aaa aca aaa aat ggc atc acc tgt432Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys130 135 140caa aaa tgg agt tcc act tct ccc cac aga cct aga ttc tca cct gct480Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala145 150 155 160aca cac ccc tca gag gga ctg gag gag aac tac tgc agg aat cca gac528Thr His Pro Ser Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp165 170 175aac gat ccg cag ggg ccc tgg tgc tat act act gat cca gaa aag aga576Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg180 185 190tat gac tac tgc gac att ctt gag tgt gaa gag gaa ctc gag tct ggc624Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Leu Glu Ser Gly195 200 205ggc ggc ctc ggc ggc ggc ctc ggc ggc ggc cct gtt gtc ctg ctt cca672Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Pro Val Val Leu Leu Pro210 215 220gat gta gag act cct tcc gaa gaa gac tgt atg ttt ggg aat ggg aaa720Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys225 230 235 240gga tac cga ggc aag agg gcg acc act gtt act ggg acg cca tgc cag768Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln245 250 255gac tgg gct gcc cag gag ccc cat aga cac agc att ttc act cca gag816Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile Phe Thr Pro Glu260 265 270aca aat cca cgg gcg ggt ctg gaa aaa aat tac tgc cgt aac cct gat864Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp275 280 285ggt gat gta ggt ggt ccc tgg tgc tac acg aca aat cca aga aaa ctt912Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu290 295 300tac gac tac tgt gat gtc cct cag tgt gcg gcc cct tca ttt gat957Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro Ser Phe Asp305 310 315<210>16<211>319<212>PRT<213>artificial sequence<400>16Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser Gly Arg Gly1 5 10 15Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly20 25 30Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser35 40 45Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu50 55 60Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly65 70 75 80Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp85 90 95Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Gly Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly100 105 110Gly Ser Gly Gly Gly Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly115 120 125Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys130 135 140Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala145 150 155 160Thr His Pro Ser Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp165 170 175Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg180 185 190Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Leu Glu Ser Gly195 200 205Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Pro Val Val Leu Leu Pro210 215 220Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys225 230 235 240Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln245 250 255Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile Phe Thr Pro Glu260 265 270Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp275 280 285Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu290 295 300Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro Ser Phe Asp305 310 315<210>17<211>915<212>DNA<213>artificial sequence<220><221>CDS<222>(1)..(915)<223><400>17ccg ctg tac aag aaa ata att aag aaa ctt ttg gag agt ggc cgg ggc48Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser Gly Arg Gly1 5 10 15gtg tat ctc tca gag tgc aag act ggg aat gga aag aac tac aga ggg96Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly20 25 30acg atg tcc aaa aca aaa aat ggc atc acc tgt caa aaa tgg agt tcc144Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser35 40 45act tct ccc cac aga cct aga ttc tca cct gct aca cac ccc tca gag192Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu50 55 60gga ctg gag gag aac tac tgc agg aat cca gac aac gat ccg cag ggg240Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly65 70 75 80ccc tgg tgc tat act act gat cca gaa aag aga tat gac tac tgc gac288Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp85 90 95att ctt gag tgt gaa gag gaa ggt acc tct ggc ggc ggc tct ggc ggc336Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Gly Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly100 105 110ggc tct ggc ggc ggc gtg tat ctc tca gag tgc aag act ggg aat gga384Gly Ser Gly Gly Gly Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly115 120 125aag aac tac aga ggg acg atg tcc aaa aca aaa aat ggc atc acc tgt432Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys130 135 140caa aaa tgg agt tcc act tct ccc cac aga cct aga ttc tca cct gct480Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala145 150 155 160aca cac ccc tca gag gga ctg gag gag aac tac tgc agg aat cca gac528Thr His Pro Ser Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp165 170 175aac gat ccg cag ggg ccc tgg tgc tat act act gat cca gaa aag aga576Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg180 185 190tat gac tac tgc gac att ctt gag tgt gaa gag gaa ctc gag tct ggc624Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Leu Glu Ser Gly195 200 205ggc ggc tct ggc ggc ggc tct ggc ggc ggc gtg tat ctc tca gag tgc672Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Val Tyr Leu Ser Glu Cys210 215 220aag act ggg aat gga aag aac tac aga ggg acg atg tcc aaa aca aaa720Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys225 230 235 240aat ggc atc acc tgt caa aaa tgg agt tcc act tct ccc cac aga cct768Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser Pro His Arg Pro245 250 255aga ttc tca cct gct aca cac ccc tca gag gga ctg gag gag aac tac816Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr260 265 270tgc agg aat cca gac aac gat ccg cag ggg ccc tgg tgc tat act act864Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr275 280 285gat cca gaa aag aga tat gac tac tgc gac att ctt gag tgt gaa gag912Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu290 295 300gaa915Glu305<210>18<211>305<212>PRT<213>artificial sequence<400>18Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser Gly Arg Gly1 5 10 15Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly20 25 30Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser35 40 45Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu50 55 60Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly65 70 75 80Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp85 90 95Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Gly Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly100 105 110Gly Ser Gly Gly Gly Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly115 120 125Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys130 135 140Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala145 150 155 160Thr His Pro Ser Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp165 170 175Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg180 185 190Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Leu Glu Ser Gly195 200 205Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Val Tyr Leu Ser Glu Cys210 215 220Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys225 230 235 240Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser Pro His Arg Pro245 250 255Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr260 265 270Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr275 280 285Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu290 295 300Glu30權(quán)利要求
1.一種基因重組腫瘤血管凋亡因子PFK的cDNA，其特征在于，它的核苷酸序列為SEQ ID No.3。
2.一種基因重組腫瘤血管凋亡因子PFK，其特征在于，它的氨基酸序列為SEQ ID No.4。
3.一種制備基因重組腫瘤血管凋亡因子PFK的方法，其特征在于，包括從肝臟CDNA文庫(kù)中用PCR方法擴(kuò)增K1(Plasminogen Kringle 1)，并在其上游引物合成時(shí)加入血小板因子4(PF4)的13個(gè)氨基酸，用表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，獲得基因重組腫瘤血管凋亡因子PFK；所述的K1片段的核苷酸序列為SEQ ID No.1，所述的13個(gè)氨基酸片段的核苷酸序列為SEQ ID No.2。
4.一種基因重組腫瘤血管凋亡因子PFK的衍生融合蛋白，其特征在于，它具有以下結(jié)構(gòu)通式PFK-L-Px或PFK-L-Px-L-Py，其中通式中的Px、Py是有血管抑制功能的蛋白或功能片段，如PlasminogenKringle1(k1)，Plasminogen Kringle5(k5)、膠原十八C末端的有血管抑制活性片段Endostatin(En)、VEGFR、有血管抑制功能的催乳素片段等；通式的中L是連接兩種蛋白的柔性連接臂，其核苷酸序列為SEQ IDNo.5，所表達(dá)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列為SEQ ID No.6。
5.如權(quán)利要求4所述的基因重組腫瘤血管凋亡因子PFK的衍生融合蛋白，其特征在于，其中Px為Kringle1(k1)，構(gòu)成的衍生融合蛋白PFK-L-K1的核苷酸序列為SEQ ID No.7，它的氨基酸序列為SEQ ID No.8。
6.如權(quán)利要求4所述的基因重組腫瘤血管凋亡因子PFK的衍生融合蛋白，其特征在于，其中Px為Plasminogen Kringle 5(k5)，所述的K5基因的核苷酸序列為SEQ ID No.9，構(gòu)成的衍生融合蛋白PFK-L-K5的核苷酸序列為SEQ ID No.10，它的氨基酸序列為SEQ ID No.11。
7.如權(quán)利要求4所述的基因重組腫瘤血管凋亡因子PFK的衍生融合蛋白，其特征在于，其中Px為Endostatin(En)，所述的En基因的核苷酸序列為SEQ ID No.12，構(gòu)成的衍生融合蛋白PFK-L-En的核苷酸序列為SEQ IDNo.13，它的氨基酸序列為SEQ ID No.14。
8.如權(quán)利要求4所述的基因重組腫瘤血管凋亡因子PFK的衍生融合蛋白，其特征在于，其中Px為K1，Py為K5，構(gòu)成的衍生融合蛋白PFK-L-K1-K5的核苷酸序列為SEQ ID No.15，它的氨基酸序列為SEQ ID No.16。
9.如權(quán)利要求4所述的基因重組腫瘤血管凋亡因子PFK的衍生融合蛋白，其特征在于，其中Px為K1，Py也為K1，構(gòu)成的衍生融合蛋白PFK-L-K1-K1的核苷酸序列為SEQ ID No.13，它的氨基酸序列為SEQ ID No.14。
10.一種制備基因重組腫瘤血管凋亡因子PFK的衍生融合蛋白的方法，其特征在于，首先將首先將PFK基因插入質(zhì)粒pPICZαA的EcoRI/KpnI位點(diǎn)，測(cè)序確認(rèn)正確后，再在KpnI/XhoI位點(diǎn)插入第二個(gè)基因，接著可以在XhoI/NotI位點(diǎn)插入第三個(gè)基因，基因拼接中，在二個(gè)基因之間插入連接基因L以表達(dá)柔性連接肽L。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因重組腫瘤血管凋亡因子PFK及其衍生融合蛋白，以及它們的制備方法。首先從肝臟CDNA文庫(kù)中用PCR方法擴(kuò)增K1基因，上游引物設(shè)計(jì)時(shí)增加PF4的活性片段，成為PFK基因。然后利用酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZ區(qū)有12個(gè)多克隆基因插入位點(diǎn)，首先將PFK基因插入EcoRI/KpnI位點(diǎn)，測(cè)序確認(rèn)正確后，再在KpnI/XhoI位點(diǎn)插入第二個(gè)基因。接著可以在XhoI/NotI位點(diǎn)插入第三個(gè)基因。通過(guò)PFK與K1、K5、Endostatin等基因拼接，制備了多個(gè)融合基因。本發(fā)明的PFK及其衍生融合蛋白易于在酵母中表達(dá)，易于純化，具有良好活性，能夠抑制腫瘤血管新生、阻斷腫瘤發(fā)展的營(yíng)養(yǎng)供給和新陳代謝。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1458160SQ0211168
公開(kāi)日2003年11月26日 申請(qǐng)日期2002年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月15日
發(fā)明者談立松, 陳宇光, 張尚權(quán) 申請(qǐng)人:談立松, 陳宇光, 張尚權(quán)