專利名稱：色素上皮所衍生因子的生物活性及使用方法
技術領域：
本發(fā)明的領域是有關用于涉及血管通透性、血管生成與/或神經疾病癥狀的治療或預防的組成物和方法。
優(yōu)先權本發(fā)明申請案所請求的優(yōu)先權為2003年10月29日當申請的美國臨時申請案第60/515,374號。
背景技術：
血管通透性與其調節(jié)控制對體內平衡(homeostasis)相當重要，血管通透性的增加在與敗血癥(sepsis)相關的低血壓、急性呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distress syndrome)、腎病綜合癥(nephroticsyndrome)、糖尿病腎病變和糖尿病視網膜病變的發(fā)展上扮演一個重要的角色。雖然維持正常血管健全的生理重要性已為眾所皆知，但仍難以理解如何維持血管健全，以及血管通透性如何負調控。
已證實血管內皮生長因子(VEGF)的活性能促進血管通透性。除了促進天竺鼠皮膚的血管通透性外，VEGF為活體內血管生成的一個重要媒介，且具有神經營養(yǎng)性(neurotrophic)/神經保護性的活性。VEGF透過兩個酪氨酸激酶受器，fms-like tyrosine kinase-1(Flt-1；VEGFR-1)and fetal liver kinase-1(Flk-1/KDR；VEGFR-2)致力于內皮細胞。VEGFR-2為許多VEGF生物活性的明顯訊號受體，包括血管通透性。
色素上皮所衍生因子(PEDF)有418個氨基酸50千道爾頓(kDa)的醣蛋白，為絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)家族成員的一。雖然PEDF具有傳說中的對蛋白酶敏感性的環(huán)(protease-sensitive loop)，不像典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑(例如αl-抗胰凝乳蛋白酶(αl-antichymotrypsin，ACT))，PEDF缺乏蛋白酶抑制活性。在絲氨酸蛋白酶抑制劑中，并非只有PEDF缺乏抗蛋白酶活性；來自絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的熱休克蛋白47(HSP47)、膠原蛋白特定伴隨蛋白(collagen-specific chaperone protein)，亦缺乏抗蛋白酶活性。PEDF原本視為神網膜光感受器細胞間質(interphotoreceptor matrix)的胞外成分。PEDF的功能在于促進Y79神網膜母細胞瘤(retinoblastoma)的軸突生長。最近，已發(fā)現(xiàn)PEDF為強而有力的抗血管生成因子，有效地抑制缺血所誘發(fā)的視網膜病變的鼠科動物模型其血管發(fā)生。
在某些實例中VEGF和PEDF的生物活性十分相似，然而在其它實例中卻呈拮抗作用。VEGF和PEDF兩者皆在血管生成與運動神經元存活中具有活性。在血管內皮細胞系統(tǒng)中，VEGF和PEDF具有分別對血管生成(proangiogenic)和抗血管生成(antiangiogenic)活性的間具有抗衡的能力。在運動神經元中，PEDF和VEGF兩者的功能與神經營養(yǎng)性/神經保護性藥劑一致。雖然在血管生成與運動神經元存活中已建立PEDF和VEGF的間的關系，尚不清楚在血管通透性中PEDF對VEGF活性有何影響。
在血管通透性與血管生成相關疾病盛行的前提下，仍有需要有效預防和治療該等疾病，尤其是此等與血管通透性與血管發(fā)生并發(fā)癥相關的疾病，例如增生前(preproliferative)與增生性(proliferative)糖尿病神網膜病變。

發(fā)明內容
血管通透性在生命威脅和視力威脅疾病的廣大范圍中扮演一個重要的角色。血管內皮生長因子(VEGF)可增加血管通透性。根據本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)是有關于發(fā)現(xiàn)色素上皮所衍生因子(PEDF)能有效地減少VEGF所誘發(fā)的血管通透性。尤其是，44個氨基酸的PEDF給予抗-血管通透性與抗-血管生成的活性。另外，4種氨基酸(谷氨酸101、異亮氨酸113、亮氨酸112和絲氨酸115)被視為對兩者的活性相當重要。PEDF或衍生物可潛在地減少或恢復來自糖尿病黃斑水腫(macular edema)的視力損失，以及老年黃斑病變(age-related macular degeneration)的血管發(fā)生。再者，PEDF與/或其44個氨基酸(AA)勝肽代表一種新穎的治療方法，其由于過度的血管通透性與/或血管生成而導致與敗血癥(sepsis)相關的低血壓、腎病綜合癥與其它視力威脅和生命威脅疾病。
本發(fā)明是有關于治療與血管通透性增加相關癥狀的病患的方法，該方法包括對該病患投予PEDF、PEDF 44AA的治療有效量、PEDF的同源物(homolog)、PEDF 44 AA的相似物或活化該PEDF受體的藥劑，其中不變的氨基酸殘基是第101個氨基酸位置的谷氨酸，第103個氨基酸位置的異亮氨酸，第112個氨基酸位置的亮氨酸，及第115個氨基酸位置的絲氨酸。所治療的癥狀包括，但不限于此，敗血癥、急性呼吸衰竭、腎病綜合癥、增生前糖尿病腎病變和糖尿病視網膜病變，以及老年黃斑病變的血管發(fā)生。
本發(fā)明是有關于治療與血管生成增加相關癥狀的病患的方法，該方法包括對該病患投予PEDF、PEDF 44 AA的治療有效量、PEDF的相似物、PEDF 44 AA的相似物或活化該PEDF受體的藥劑，其中不變的氨基酸殘基是第101個氨基酸位置的谷氨酸，第103個氨基酸位置的異亮氨酸，第112個氨基酸位置的亮氨酸，及第115個氨基酸位置的絲氨酸。所治療的癥狀包括，但不限于此，癌癥與增生性糖尿病視網膜病變。
再者，本發(fā)明是有關于辨識候選藥劑的篩選法，該方法可與PEDF受體反應并使的活化。此等候選藥劑可包括具有模仿或完成PDEF生物活性能力的任何分子、蛋白質或醫(yī)藥品(例如小分子化學藥劑)。
本發(fā)明其它和進一步態(tài)樣、特征與優(yōu)點將由下述做為揭示目的的本教示的各種具體實施例清楚可見


圖1說明PEDF性質上地抑制經VEGF誘發(fā)的視網膜血管通透性，其中將重組的老鼠VEGF164(VEGF)注入一眼，并在另一對側眼共同注射試劑；螢光素血管攝影(fluorescein angiography)顯示滲漏至視網膜和水晶體的程度，而經VEGF誘發(fā)的血管滲漏程度比下述所觀察的情況更高PBS(a)；與VEGF共同注射的其它藥劑重組的人類PEDF(PEDF)(b)；α1-抗胰凝乳酶(ACT)(c)；及熱休克蛋白47(HSP47)(d)；所有照片皆取自4只或4只以上老鼠的結果特征。
圖2說明PEDF性質上地抑制經VEGF誘發(fā)的視網膜血管通透性，其中將重組的老鼠VEGF164(VEGF)以水晶體注射的方式注入一只眼并以試劑注射至另一對側眼后的24小時，以視網膜伊凡氏藍(Evans blue)的量描繪血管滲漏，經VEGF誘發(fā)的血管滲漏量高于對照組(PBS)為100％；注射PBS的血管滲漏為0％(n＝29)；與VEGF共同注射第二種試劑以測試其在血管通透性的功效；人類PEDF(n＝26)降低經VEGF誘發(fā)的血管通透性，然而ACT(n＝27)與HSP47(n＝28)皆不會降低經VEGF誘發(fā)的血管通透性；資料為平均值±SE，n代表各群組中老鼠數(shù)；*，相較于經VEGF誘發(fā)的血管通透性而言，P＜0.05。
圖3說明來自人類PEDF、PEDFpep的44個氨基酸勝肽能有效地抑制經VEGF誘發(fā)的視網膜血管通透性，其中(a)PEDFPEP的共同注射能有效地抑制來自視網膜血管分布的經VEGF誘發(fā)的螢光滲漏(上方)；以VEGF和ACTpep兩者注射老鼠的眼睛，顯示無法分辨來自PEDFpep相對應區(qū)域中ACT的勝肽與來自以VEGF單獨注射眼睛(下方)的不同處；(b)透過伊凡氏藍分析法，PEDFPEP的共同注射能在數(shù)量上有效地抑制經VEGF誘發(fā)的血管通透性；伊凡氏藍分析法中，PEDFPEP(n＝26)與VEGF的共同注射能有效地抑制經VEGF誘發(fā)的增加；觀察將與PEDFPEP等莫耳濃度的ACTpep做共同注射(n＝28)并無抑制經VEGF誘發(fā)的血管通透性；資料為平均值±SE，n代表各群組中老鼠數(shù)；*，相較于經VEGF誘發(fā)的血管通透性而言，P＜0.05。
圖4說明以PEDFPEP4種氨基酸殘基來取代來自ACT或HSP47相對應的殘基，會破壞血管通透性的調節(jié)，其中以4種氨基酸殘基所取代的PEDFPEP來產生CHIMERApep；PEDFPEP、CHIMERApep、ACTpep與HSP47的相對應序列置于(a)；將相異和相同的氨基酸殘基分別以深藍和淺藍反白表示的，以黃色強調在PEDFPEP中的氨基酸取代經取代而產生CHIMERApep；PEDF(蛋白質數(shù)據庫序號1IMV)與ACT(蛋白質數(shù)據庫序號1QMN)的結晶化的結構圖顯示于(b)；以淺藍帶狀圖強調PEDFPEP和ACTpep分別在PEDF和ACT的相對應區(qū)域；以深藍強調并以紅色標記在PEDFPEP和CHIMERApep間不同的4種氨基酸取代；兩個蛋白都是在分泌訊號勝肽處開始編號；以VEGF注射一只眼，而以VEGF+CHIMERApep注射另一對側眼；藉由螢光素血管攝影(c)與伊凡氏藍分析法(n＝27)(d)無法辨識CHIMERApep(與圖3a的PEDFPEP等莫耳濃度)在經VEGF誘發(fā)的血管通透性的效果。
圖5說明活化PEDF的兩者-抑制內皮細胞移動與抑制血管通透性-需要相同4種氨基酸，其中(a)在PEDF、ACT或HSP47的各種濃度存在下測量經VEGF164刺激的牛視網膜微血管內皮細胞移動。PEDP隨著劑量而抑制經VEGF誘發(fā)的移動，Kd為0.5奈莫耳濃度(Nm)；ACT與HSP47缺乏此類活性；VEGF164存在下的移動細胞數(shù)減去不存在任何添加試劑的移動細胞數(shù)呈現(xiàn)100％移動最大值；各點表示4組的平均值±SE；(b)如a部分予以量測經VEGF164刺激的牛視網膜微血管內皮細胞移動，然而ACTPEP和CHIMERApep的能抑制經VEGF164刺激的牛視網膜微血管內皮細胞移動；PEDFPEP能抑制經VEGF164刺激的內皮細胞移動(Kd＝Nm)至如同完整長度PEDF的相似程度；ACTPEP和CHIMERApep對經VEGF刺激的內皮細胞移動沒有影響。
圖6以一個字母符號來表示完整長度PEDF的氨基酸序列(序列識別號1)。
圖7以一個字母符號來表示PEDF44個氨基酸肽的氨基酸序列(序列識別號2)。
圖8以一個字母符號來表示PEDF44個氨基酸肽的氨基酸序列(序列識別號3)，其中將下述的氨基酸劃底線以說明它們在PEDF44AA的位置谷氨酸在第101個氨基酸的位置，異亮氨酸在第103個氨基酸的位置，亮氨酸在第112個氨基酸的位置，而絲氨酸在第115個氨基酸的位置。
具體實施例方式
要了解到本發(fā)明并非限制于本文所述的特定材料與方法。亦要了解到本文所使用的術語是為描述特定具體實施例的目的，而非意圖限制被后附申請專利范圍所限制的本發(fā)明范疇。如本文所述，除非內容有清楚地說明，否則單數(shù)形式字詞”a”、”an”和”the”是包括復數(shù)參考涵意。舉例而言，熟習此技術領域的人士知道”眼睛組織”意指包括復數(shù)個細胞。
除非有特別說明，本文中所用的所有技術上和科學上的術語具有熟習本發(fā)明所屬的技術領域的人士所一般了解的意義。本文所指的所有公開資料是以引用方式做為描述和揭示可滲透模型、方法、試劑和載體的目的，此等已報導于公開資料且與本發(fā)明相關。本文并非用于承認本發(fā)明被賦予早于此等藉由先前發(fā)明優(yōu)點的揭示。
PEDF、VEGF與其生物活性間的關系PEDF和VEGF的各種活性間的關系并不完全地清楚。最初的研究顯示經PEDF誘發(fā)的軸突生長，以及經VEGF所促進的血管生長和血管通透性。PEDF抗血管生成活性的報告顯示PEDF和VEGF間的血管生成的關系。在神經細胞的各種類型中，PEDF和VEGF共有相似的活性皆有神經營養(yǎng)性/神經保護性。因此，VEGF具有三合一的活性，(i)促進血管生成，(ii)促進神經存活與生長，(iii)促進血管通透性。
血管通透性不僅在非增生性糖尿病視網膜病變上，亦在許多其它疾病狀況上扮演一個重要的病理生理的角色。視網膜脈管系統(tǒng)(vasculature)為研究PEDF對血管通透性潛在影響的較佳模型系統(tǒng)，因為透過清楚的眼睛光學系統(tǒng)能輕易地觀察視網膜脈管系統(tǒng)。在非增生性糖尿病視網膜病變中，即人類視覺損失最常見的原因的一，血管通透性的增加乃為糖尿病視網膜水腫的必要條件。糖尿病視網膜水腫的診斷試驗的黃金定律系為螢光素血管攝影，一個做為證實VEGF在糖尿病視網膜病變的病理生理學上的重要角色。以VEGF注射老鼠眼睛已會增加血管通透性而導致螢光滲漏的增加。本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)中，當共同注射PEDF時此增加將被對抗，以伊凡氏藍分析法證實發(fā)現(xiàn)。因此，PEDF，像VEGF，也有三合一的活性。PEDF不但有做為抗血管生成和神經營養(yǎng)性/神經保護性藥劑的功能外，亦能抑制血管通透性病理上地增加。再者，PEDF以有意義的量自然地存在于眼睛中，因此此等活性可幫助維持眼睛的正常生理。
因為PEDF三合一活性的神經營養(yǎng)性/神經保護性勘能可能為受體調節(jié)，因此抗血管生成和抗血管通透性的活性亦可能為受體調節(jié)。已證實PEDF以0.5nM的IC50能抑制經VEGF刺激內皮細胞移動，且對整段PEDF以相同強度大小下PEDFpep具有3.0nM的IC50。相似的PEDF濃度所需的神經或抗血管生成活性的最大值一半的量與假設相符，該假設是為神經營養(yǎng)性/神經保護性與抗血管生成活性共有相同的細胞表面受體。全部3個PEDF活性的活性部位能局部化為相同的44個氨基酸區(qū)域(后文中稱為”PEDF 44 AA勝肽”，在圖標與具體實施例的簡單說明中也意指”PEDFpep”，請參見序列識別號2)暗示此活性是藉由相同或似的受體來調節(jié)。
為了進一步純提出PEDF44AA勝肽、嵌合(chimeric)勝肽、CHIMERApep中的活性部位的局部，是根據假設來制備，該假設為如果PEDF 44 AA勝肽中的重要氨基酸殘基被來自ACT或HSP47的相對應殘基取代(圖8中劃底線處)，將破壞此生物活性。使PEDF 44 AA勝肽中的這4個候選氨基酸殘基發(fā)生突變，將失去生物活性。CHIMERApep除了這4個氨基酸殘基被來自ACT或HSP47的相對應殘基取代外，與PEDF44AA勝肽完全相同。CHIMERApep藉由螢光素血管攝影或伊凡氏藍分析法，在內皮細胞移動分析法中，對于中和血管系統(tǒng)上任何VEGF的活性并不起作用。
除了辨識PEDF氨基酸殘基78至121中的神經營養(yǎng)性/神經保護性區(qū)域(PEDF 44 AA勝肽)，在PEDF上的許多其它結合部位已以圖標的方式標示出酸性肝素(heparin)結合區(qū)域；膠原蛋白與β-折板A鏈2(β-sheet A strands2)和3及螺旋體(helix)F的結合區(qū)域；以及絲氨酸蛋白酶抑制劑在殘基367至387的所暴露的環(huán)。在本發(fā)明中，抗血管生成與抗血管通透性的活性部位將局部化為氨基酸殘基谷氨酸101、異亮氨酸103、亮氨酸112和絲氨酸115，此指出此兩個活性的部位為完全相同或極為相似。此發(fā)現(xiàn)暗示單一受體或具有非常相似結合具體性的多個受體供應2個或全部3個的活性。功能不同但卻具有極為相似結合具體性的多個受體的實例為2甘露糖-6-磷酸酯受體。
PEDF、PEDF 44 AA勝肽及使用方法本發(fā)明亦涵括整段色素上皮所衍生的生長因子(PEDF；Steele等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(4)1526-1530)及任何用于抑制血管通透性、抑制血管生成和促進神經保護性的PEDF衍生物，包括最佳的是PEDF 44 AA勝肽及其相似物。本發(fā)明亦涵蓋編碼整段PEDF的核酸的使用，以及任何PEDF的血管生成或血管通透性衍生物，包括最佳的是PEDF 44 AA勝及其相似物。
本發(fā)明方法的內容中，PEDF對血管通透性和血管生成具有強而有力的抑制活性。PEDF多肽的一種形式(整段PEDF)是列于第圖6(序列識別號1)；然而，本發(fā)明并不限于此示例性序列的使用。更確切地說，此技術領域已知有其它PEDF序列(請參見，例如已公開的國際專利申請案WO 95/33480和WO 93/24529)。再者，可改變不同種與個體間的基因序列是為眾所皆知。天然性對偶基因變化的范圍包括于本發(fā)明的范疇內。額外地或選擇性地來說，PEDF多肽可包括來自示例性序列或其它天然發(fā)生于PEDF多肽的一個或多個突變點。因此，PEDF多肽典型地對序列識別號1的全部或部分有至少約75％的相似度；較佳為對序列識別號1的全部或部分有至少約80％的相似度(例如對序列識別號1有至少約85％的相似度)；更佳為該PEDF多肽對序列識別號1的全部或部分有至少約90％的相似度(例如對序列識別號1的全部或部分有至少約95％的相似度)；而最佳為對序列識別號1的全部或部分有至少約97％的相似度。更確切地說，PEDF多肽亦可包括其它區(qū)域，譬如抗原決定位置卷標和His卷標(例如，此蛋白可為融合蛋白)。
本

發(fā)明內容
中，PEDF多肽或PEDF 44 AA勝肽可為或包括已知的PEDF序列或其衍生物的插入、刪除或置換突變。較佳地，任何置換可為半保留，是在于以最小地方式中斷該PEDF多肽的生化特性。因此，引入突變以置換氨基酸殘基的突變處，較佳為以帶正電殘基(H、K和R)置換帶正電殘基；較佳為以帶負電殘基(D和E)置換帶負電殘基；較佳為以中性極性殘基(C、G、N、Q、S、T和Y)置換中性極性殘基；較佳為以中性非極性殘基(A、F、I、L、M、P、V和W)置換中性非極性殘基。再者，該PEDF多肽可為已知的PEDF蛋白或其片段的活性片段，最佳為PEDF 44 AA勝肽。當然，因為插入、刪除或置換突變可影響蛋白質醣化，所以PEDF多肽在用于本發(fā)明方法的血管通透性和血管生成上不需要進行醣化來具有所需的抑制活性。
本發(fā)明應進一步推斷為包括PEDF多肽或PEDF 44 AA勝肽的使用，該PEDF 44 AA勝肽可含有一或多個的右旋異構物(D-isomer)型式的PEDF的氨基酸。具有右旋型式(retro-inverso)的D-氨基酸PEDF勝肽的制造，是以所揭示的相同氨基酸來制作，然而本發(fā)明提供至少一個氨基酸，也許所有氨基酸為D-氨基酸以做為簡明的標的。當勝肽中所有氨基酸為D-氨基酸時，該分子的N-和C-端將被反轉，結果為具有相同結構基團的分子在該分子的L-氨基酸型式的相同位置。然而，該分子對蛋白酶解的降解是較穩(wěn)定，因此常用于本文所述的許多應用。
本發(fā)明的方法亦應推斷為包括PEDF或PEDF 44 AA勝肽的用途，如本文所述是以核酸編碼具有生物活性PEDF的型式或其任何具有PEDF生物活性的片段。因此本發(fā)明應推斷為包括核酸的用途，其編碼PEDF的片段和其任何衍生物，或其編碼具有生物活性PEDF的片段。
本文所使用的術語”具有生物活性PEDF”意指出現(xiàn)在本文所包括的實施例細節(jié)/實例部分的任何分析法中，任何PEDF多肽、片段或衍生物，最重要地為具有抑制血管通透性和血管生成的PEDF 44 AA勝。
本文實例部分所列示的具有生物活性的PEDF片段為PEDF的44個氨基酸片段(44mer)。本文所詳盡提供的單離方法和該片段特性是為此技術領域所熟習者。因此，隨著本文所提供的指示以辨識有助于本發(fā)明的具有生物活性的PEDF片段，所以本發(fā)明如本文所述最被推斷為包括任何和所有此等相似物和任何修飾及其衍生物。另外，本發(fā)明應推斷為包括任何和所有核酸，該核酸編碼具有生物活性的PEDF片段，此是如本文所定義的術語。用于隨后所附申請專利范圍的術語”PEDF”，應推斷為包括如本文所述的所有具有生物活性的PEDF型式。
用于本文的術語”外源性”意指PEDF或PEDF 44 AA勝肽，該術語應推斷為包括任何和所有非自然地表現(xiàn)于細胞的PEDF或PEDF 44 AA勝肽。舉例而言，”外源性PEDF”應推斷為包括利用重組技術導入于細胞的核酸所表現(xiàn)的PEDF、加入細胞的PEDF、及其任何與所有組合。因此，該術語不應推斷為僅限于將PEDF加至細胞本身，然而應延伸為包括導入于細胞的核酸所表現(xiàn)的PEDF。
PEDF多和PEDF 44 AA勝肽能抑制血管通透性，于某種程度上而言，藉由減少經細胞的液泡運輸與/或開窗(fenestration)，及/或藉由內皮細胞中緊密細胞間接合的保護。因此，本發(fā)明提供抑制液泡運輸、開窗，或藉由提供外源性PEDF或PEDF AA勝肽來促進緊密接合至此等細胞的方法。除了減少血管通透性外，該方法有助于治療刺激眼睛中血管通透性相關的疾病，例如黃班囊樣水腫(cystoid macularedema)、葡萄膜炎視網膜水腫(uveitic retinal edema)、血管阻塞疾病(vascular occlusive diseases)。在其它器官系統(tǒng)中，該方法有助于大腦、肺、腸水腫和其它滲出性病理。
PEDF多和PEDF44 AA勝能抑制血管生成，于某種程度上而言，藉由減少經活化內皮細胞的遷移與/或收縮，因而還原內皮細胞延伸該組織的能力。因此，本發(fā)明提供抑制內皮細胞移動和延伸的方法，是藉由提供外源性PEDF多肽和PEDF44 AA勝肽至此等細胞。除了減少血管生成外，該方法有助于治療刺激內皮細胞移動相關的疾病，例如腸性粘附(intestinal adhesions)、克隆氏癥(Crohn’s disease)、血管粥狀硬化、硬皮癥和類風濕性關節(jié)炎。
關于本發(fā)明方法，提供PEDF或PEDF 44 AA勝肽于與腸組織相關的內皮細胞。此類細胞可為包含腸組織的細胞、導入至該組織的外源性細胞、或非在該組織內的毗鄰細胞。因此，舉例而言，該細胞可為該組織的細胞，且于原位提供PEDF或PEDF 44 AA勝肽，以使PEDF或PEDF 44 AA勝肽接觸該細胞。另外地，該細胞可為導入至該組織的細胞，其中在將PEDF或PEDF 44 AA勝肽導入至該組織前(例如，細胞外)，可將PEDF或PEDF 44 AA勝肽轉移至該細胞，以及在導入至該組織后，將PEDF或PEDF 44 AA勝肽進行原位轉移。
當PEDF或PEDF 44 AA勝肽導入至細胞因而轉移至該哺乳類動物，不應推斷本發(fā)明為限于將PEDF或PEDF 44 AA勝肽導入至該細胞的方式；亦不應推斷本發(fā)明為限于將該細胞導入至哺乳類動物的方式。如下文所詳述，將DNA導入至細胞的方法為將等細胞送至哺乳類動物組織的已知方法。
與內皮細胞相關的組織為任何欲抑制內皮細胞移動或增生的組織，(例如，為抑制血管生成)，及為抑制液泡運輸、開窗或穿越緊密結合的滲漏(例如，為抑制血管通透性)。在一應用中，該組織可為眼睛組織，其中PEDF或PEDF 44 AA勝肽的存在將抑制新穎的與各種眼睛疾病相關的血管通透性和血管生成。舉例而言，本發(fā)明方法有助于治療眼睛傷害、組織缺氧(hypoxia)、感染、外科手術、雷術手術、糖尿病、視網膜母細胞瘤(retinoblastoma)、肌肉性降解、缺血性視網膜病變，或其它眼睛疾病或疾患。在此方面中，本方法是有助于重建視力、預防失明或延遲各種眼睛疾病相關的視力損耗。絕大部分的糖尿病病患最后都會遭受視力減退，此是由于因應疾病所造成的缺血而使視網膜內血管大量生長。同樣地，暴露于高氧量的早產兒所發(fā)展的視網膜病變，是因為視網膜靜脈或其它血管的阻塞或缺血性異常。如本文所述，缺血所誘發(fā)的視網膜病變可藉由PEDF或PEDF 44 AA勝肽的全身性或局部投予來預防與/或治療。在雷射手術的例子中，關于眼睛，PEDF或PEDF 44 AA勝肽可用于預防治療后的血管再生長。雷射用于消除過多的血管，但亦切除具有潛在視力的視網膜，及在視網膜所造成的傷口誘發(fā)一些血管生成。以PEDF或PEDF 44 AA勝肽做全身或局部治療應做為預防此等再生成及保存可用的視網膜組織，否則可切除。
利用美國專利第5,614,404的方法，藉由建構反轉錄病毒基因轉移載體來完成基因治療以遞送PEDF或PEDF 44 AA勝肽。所描述的重組病毒載體，其共同表現(xiàn)具有組合至有缺陷的非自行增殖病毒顆粒。用于基因轉移載體的病毒，包括反轉錄病毒，其為最常用于人類臨床試驗的載體。為了產生基因治療載體，將有興趣的基因克隆至有復制缺陷的反轉錄病毒顆粒，該有復制缺陷的反轉錄病毒顆粒含有二個長端復制區(qū)(long terminal repeats，LTR)、引子結合位、包裝訊號(packaging signal)及反轉錄所需的聚嘌呤，注射后的反轉錄病毒的完成功能。為了制造病毒載體，將載體的質體型式轉染至包裝細胞株(packaging cell line)，該細胞株制造顆粒組合所需的反轉錄病毒結構蛋白，Gag、Pol和Env。通常利用選擇性標記來產生制造者細胞株(producer cell line)，常藉由該反轉錄病毒載體來攜帶G418抗性基因。所產生的細胞株可經膜套包覆(encapsulated)，如PCT國際專利申請案WO97/44065號所述，其描述含有活體包裝細胞(livingpackaging cells)的生物兼容性膠囊，該活體包裝細胞能分泌用于感染標的細胞的病毒載體；以及遞送該標的細胞有利感染的方法。
本文所用術語”視網膜病變”意指視網膜內或周圍血管異常發(fā)展，此等血管可或不可進入玻璃體。受傷、疾病、缺血性事件、雷射或其它醫(yī)治引起的處理可誘發(fā)視網膜病變。
在其它具體實施例中，該組織為腫瘤(例如良性或癌性生長)，此例中的發(fā)明方法將抑制腫瘤內和至腫瘤的血管生長，在一些例子中，將誘發(fā)腫瘤細胞發(fā)生變異，而慢慢區(qū)分開。腫瘤內血管生長的抑制將阻斷就該腫瘤尺寸所供應給該腫瘤的足夠養(yǎng)分和氧氣。因此，本發(fā)明方法可阻止因遺傳性易染病體質(例如，BRCA-1突變載體、具有p53突變的Li Fraumeni病患等)或外在致癌源(例如煙草、酒精、工業(yè)溶劑等)其已存在于癌性細胞的成核現(xiàn)象(nucleation)。除了阻止癌癥生成(tumorigenesis)，本發(fā)明方法可延遲存在腫瘤的生長，因此賦予他們較易抑制與興奮的性質而可造成他們復原。此應用高度有益于治療難以進行手術的腫瘤(例如腦瘤或前列腺瘤)。另外，本方法有助于治療孩童時期的腫瘤，包括但不限于，神經母細胞瘤(neuroblastoma)。再者，減少存在于腫瘤內的血管數(shù)能減輕腫瘤轉移的可能性。在治療腫瘤中，本方法可單獨使用，或組合其它治療法，以控制腫瘤的生長。更確切地說，使用本發(fā)明方法可加強一些腫瘤對其它治療的反應。舉例而言，本發(fā)明方法選擇性地做為(例如約一星期前的)預處理，且持續(xù)期間，可做為化學治療或放射線支配的預處理。本發(fā)明方法亦可配合生物反應調節(jié)者的用途而予以使用，例如干擾素，或其它抗血管生成藥劑，亦可用于配合誘發(fā)抗血管生成藥劑于活體內產生的藥劑的用途。進一步，本發(fā)明方法可用于配合能促進細胞分化的藥劑，尤其是，不限于促進腦腫瘤細胞分化的藥劑。
本發(fā)明方法用于其它組織，能有效地使疾病宿主的新生血管預防得到處理。因此，舉例而言，本發(fā)明方法可用于治療血管疾病(例如，血管瘤和動脈粥狀斑塊的微血管增生)、肌肉(例如心肌血管生成或平滑肌血管生成)、關節(jié)(例如關節(jié)炎、血友病的關節(jié)等)，以及其它與血管生成(例如Osler-Webber綜合癥、斑塊血管生成、毛細血管擴張癥(telangiectasia)、傷口顆?；?telangiectasia)等)相關的疾病。另外，本方法用于治療鼻息肉(nasal polyps)特別是在囊腫性纖維化(cystic fibrosis)病患、其骨髓來自異常生長的骨髓細胞的血癌，及前列線癌。本方法可建構于有利于治療良性腫瘤的通則。
本發(fā)明方法亦有利于做為預防與血管通透性或血管生成相關的疾病或疾患發(fā)生的手段，例如有利于做為預防在該疾病風險下的病患的預防手段。舉例而言，并未限制，PEDF或PEDF 44 AA勝肽可用于預防具有糖尿病病患其糖尿病視網膜的發(fā)生；預防在某些已知癌癥風險下的病患其癌癥的發(fā)生；等。因此，本發(fā)明方法不應建構為限制在治療公開疾病，而應建構為用于預防在風險下病患的疾病。
本發(fā)明亦應建構為包括癌化前病癥的治療，舉例而言，但不限于，鼻息肉，尤其是具有囊腫性纖維化的病患。此等病患的鼻息肉為血管生成，另外，囊腫性纖維化病患的脊髓液含有過多的血管生成因子VEGF。此等癥狀的緩解，特別是囊腫性纖維化病患，其中該緩解包含投予包涵于本發(fā)明的PEDF或PEDF 44 AA勝肽。
本發(fā)明方法的內容中，PEDF或PEDF 44 AA勝肽可單獨供應，或配合其它已知的血管生成因子。舉例而言，PEDF或PEDF 44 AA勝肽可配合使用阻斷整合素(integrin)接合的抗體和勝肽、抑制金屬蛋白酶(metalloproteinases)(例如marmistat)的蛋白質和小分子、阻斷內皮細胞內一連串磷酸化的藥劑(例如herbamycin)、用于已知血管生成誘發(fā)者的顯性負型受體、抗血管生成誘發(fā)者的抗體，或其它阻斷他們活性的化合物(例如蘇拉明(suramin))，或其它利用其它方法發(fā)生作用的化合物(例如維甲酸(retinoid)、IL-4、干擾素等)。更確切地說，當此等因子藉由不同機制來調節(jié)血管生成，是使用PEDF或PEDF 44 AA勝肽，并在所欲組織內配合其它可加強更強而有力(和潛在的增效劑)抑制血管生成的抗血管生成藥劑。使用PEDF或PEDF 44 AA勝肽與一或多種其它抗血管生成因子。較佳地，可使用至少兩種抗血管生成因子，并配合PEDF或PEDF 44 AA勝肽。
如本文所討論，PEDF或PEDF 44 AA勝肽為蛋白質感染因子。因此，在一方法中，本方法涉及藉由供應PEDF多肽或PEDF 44 AA勝肽至細胞以提供PEDF或PEDF 44 AA勝肽(例如，在合適的組成物)?？墒褂萌魏斡糜诒景l(fā)明的適當方法以獲得PEDF多肽或PEDF 44 AA勝肽。許多適當?shù)腜EDF多肽可從自然地產生PEDF的組織或具有各種PEDF-所產生細胞(例如，視網膜母細胞瘤三細胞株WER127)的條件的介質中純化得來。舉例而言，已知利用各種肌肉、脾臟的巨核細胞(megakaryocyte)、纖維母細胞、腎小管、小腦的Purkinje細胞、毛囊的纖毛狀油脂(piliosebaceous)線體和視網膜細胞來制造PEDF。自然產生PEDF特別佳的來源為眼睛的水晶體和水狀液。從此類蛋白質萃取物中純化PEDF的一方法為利用30kDa超過濾膜進行濃縮/透析，再以約65％至約95％的硫酸銨進行蛋白沉淀，接著在0.5M甲基-.α.-D喃甘露糖苷(mannopyranoside)藉由扁豆凝集素(lentil lectin)瓊脂醣管柱，再來由PHARMACIA HiTrap肝素管柱在0.5MnaCl進行梯度/等分洗提。在此技術領域中已知其它用來純化PEDF多肽的方法(請參見，例如，已公開的國際專利申請案WO 95/33480和WO 93/24529)。由序列識別號1所表示的原始PEDF多肽透過SDS-PAGE為約45至50kDa的蛋白質予以確認。其它PEDF多肽或PEDF 44 AA勝肽可利用標準直接勝肽合成技術予以合成(例如，Bodanszky，1984，Principles of PeptideSynthesis(Springer-Verlag，Heidelberg)所做的概述，譬如透過固相合成技術(請見，例如，Merrifield，1963，J.Am.Chem.Soc.852149-2154；Barany等人，1987，Int.J.Peptide Protein Res.30705-739；及美國專利第5,424,398號)。當然，已知的PEDF多肽基因(請參見，例如已公開的國際專利申請案WO 95/33480和WO93/24529)；亦請參見基因庫獲準號(GenBank accession)U29953)，或可追溯自本文所討論的多肽序列，PEDF多肽或PEDF44AA勝肽可藉由標準重組DNA方法予以制造。
在其它方法中，可提供PEDF多肽或PEDF 44 AA勝肽給有興趣的組織，是可藉由將包括編碼PEDF核酸的表現(xiàn)載體轉移至與有興趣的組織相關的細胞。該細胞制造并分泌PEDF多肽，而使得適當?shù)靥峁┰摻M織中內皮細胞能抑制他們的收縮或移動(用于血管生成)，以及開窗、液泡或經接告運輸(用于血管通透性)，因此予以減輕有興趣的組織或全身性的血管通透性和血管生成。編碼PEDF多肽的核酸序列是為已知(請參見，例如已公開的國際專利申請案WO 95/33480和WO 93/24529；亦請參見基因庫獲準號U29953)，其它可追溯至本文所討論的多肽序列。因此，PEDF或PEDF 44 AA勝肽表現(xiàn)載體典型地包括和PEDF或PEDF44 AA勝肽序列為同構型的單離的核酸序列，例如，他們將與至少一已知片段雜交，是在至少輕度的嚴苛條件下，更佳為在中度的嚴苛條件下，，最佳為在高度的嚴苛條件下(輕度、中度和高度的嚴苛條件的使用定義，如Sambrook等人，1989，Molecular CloningA LaboratoryManual，第二版，Cold Spring Harbor Press所述)。
除了編碼PEDF或PEDF 44 AA勝肽的核酸外，本發(fā)明內容中尚有包括激活子(promoter)的表現(xiàn)載體，該激活子必需能驅使細胞內PEDF或PEDF 44 AA勝肽cDNA的表現(xiàn)。許多病毒的激活子專用于此等表現(xiàn)區(qū)域(例如反轉錄病毒ITRs、LTRs、即興早期病毒激活子(IEp)(例如疹病毒IEp(例如ICP4-IEp和ICPO-Iep)及巨細胞病毒(CMV)IEp)，以及其它病毒激活子(例如，晚期病毒激活子、潛伏-活性激活子(LAPs)、勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，RSV)激活子，及鼠白血病病毒(Murine Leukemia Virus，MLV)激活子))。其它合適的激活子為含有增強子(enhancer)序列的真核激活子(例如兔子β-球蛋白調節(jié)成分)、基本的活性激活子(例如P-肌動蛋白激活子等)、訊號與/或組織特異性激活有反應的激活子、子(例如可誘發(fā)與/或可抑制激活子，譬如對TNF或RU486有反應的激活子、金屬硫氨酸(metallothionine)激活子等)，以及腫瘤-特異性激活子。
在表現(xiàn)載體中，PEDF或PEDF 44 AA勝肽cDNA與激活子可實行地連接，使得該激活子能驅使PEDF或PEDF 44 AA勝肽基因的表現(xiàn)。再者，表現(xiàn)載體可選擇性地包括其它成分，例如拼接位(splice site)、聚腺苷化(polyadenylation)序列、轉錄調節(jié)成分(例如增強子、靜默子(silencers)等)，或其它序列。
表現(xiàn)載體必需以一方式導入該細胞，此方式使得他們能表現(xiàn)本文所述及的編碼PEDF或PEDF 44 AA勝肽的單離核酸?？墒褂萌魏魏线m的載體，許多載體皆為此技術領域中已知。此類載體的實例包括單純(naked)DNA載體(例如寡核苷酸或質體)、病毒載體譬如與腺苷相關的病毒載體(Berns等人，1995，Ann.N.Y.Acad.Sci.77295-104)、腺病毒載體(Bain et al.，1994，Gene Therapy 1S68)、 疹病毒載體(Fink et al.，1996，Ann.Rev.Neurosci.19265-287)、經包裝的增大子(amplicons)(Federoffet等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891636-1640)、乳突瘤(papilloma)病毒載體、小核糖核酸病毒(picornavirus)載體、多瘤(polyoma)病毒載體、反轉錄病毒載體、SV40病毒載體、牛痘病毒載體和其它載體。除了有興趣的表現(xiàn)載體外，該載體亦圖包括其它其因成分，例如編碼可選擇標記的基因(例如β-gal或賦予對毒素有抗性的標記)、醫(yī)藥上活性蛋白、轉錄因子，或其它生物活性物質。
任何載體選擇必需具有在真核細胞產生大量的能力。另外，該載體必需建構在使其能轉移至帶有PEDF或PEDF 44 AA勝肽序列的有興趣的細胞，而使不包含PEDF或PEDF 44 AA勝肽序列的載體做為控制載體，包含PEDF或PEDF 44 AA勝肽序列的載體為實驗或治療載體。此技術領域已知用于制造該載體核酸的方法(請參見Sambrook等人，supra)以及包括直接克隆、利用重組酶的特定位置重組(site specificrecombination)、同源重組(homologous recombination)與其它建構重組載體的合適方法。在此方法中，可建構表現(xiàn)載體使其成為在任何想要的細胞中復制、在任何想要的細胞表現(xiàn)，以及甚至可結合至任何想要的細胞基因中。
PEDF或PEDF 44 AA勝肽表現(xiàn)載體導入細胞，是利用任何適合轉移DNA至的方法。許多此等方法為此技術領域已知者(Sambrook等人，supra；亦請參見Watson等人，1992，Recombinant DNA，Chapter12，第二版，Scientific American Books)。因此，藉由下述方法將質體轉移，譬如磷酸鈣沉淀、電穿孔法(electroporation)、脂質體(liposome)媒介的轉感染、基因槍、微注射、病毒包膜(capsid)媒介的轉移、凝聚胺(polybrene)媒介的轉移、原生質體(protoplast)融合等。病毒載體最常藉由直接感染細胞來轉移至細胞。然而，該感染模式可視該病毒和該載體正確特性而定。
在可誘發(fā)激活子的控制下將PEDF或PEDF 44 AA勝肽cDNA轉移至細胞，倘若需要可用于本發(fā)明方法中做為短暫轉換體(transformant)。此等細胞本身可轉移至用于其有治療益處的哺乳動物。典型地，將該細胞轉移至哺乳動物體內的位置，使得其所表現(xiàn)并分泌的PEDF接觸所欲的內皮細胞，為了抑制血管通透性和血管生成。另外，尤其是該載體在體外被加至細胞的例子中，該細胞首先可進行幾個周期的克隆性選擇(通常藉由使用該載體中的可選擇標記予以協(xié)助)以選擇合適的轉換體。此等合適的轉換體被轉移至用于其有治療益處的哺乳動物。
亦可提供PEDF或PEDF 44 AA勝肽給予內皮細胞，是藉由轉移至其它細胞族群包含編碼PEDF或PEDF 44 AA勝肽的單離核酸的載體，其中該PEDF或PEDF 44 AA勝肽在該細胞表現(xiàn)并從其它細胞分泌。其它如此轉感染的細胞族群被轉移至哺乳動物體內的位置，其中將如此分泌的PEDF或PEDF 44 AA勝肽以接觸該內皮細胞，并抑制血管通透性或血管生成。由其它細胞表現(xiàn)和分泌的PEDF或PEDF 44 AA勝肽對該內皮細胞具有益處。不需要將DNA編碼的PEDF或PEDF 44 AA勝肽穩(wěn)定地結合至該細胞。PEDF或PEDF 44 AA勝肽可從細胞中非經結合或經結合的DNA表現(xiàn)和分泌。
該細胞中，使PEDF或PEDF 44 AA勝肽模型表現(xiàn)，而讓該細胞表現(xiàn)和分泌該PEDF或PEDF 44 AA勝肽。該基因成功地表現(xiàn)可利用標準分子生物技術予以評估(例如，北方雜交法、西方墨點法、免疫沉淀法、酵素免疫分析法等)。
根據該有興趣的組織的位置，可以任何適于將PEDF提供至有興趣組織中的內皮細胞的方式來供應PEDF。因此，舉例而言，包含PEDF來源(即如本文所述的PEDF多肽或PEDF表現(xiàn)載體或PEDF的細胞)的組成物可被導至全身循環(huán)中，此將分配PEDF來源至有興趣的組織。另外，含有PEDF來源的組成物可局部地供應至有興趣的組織(例如注射、或以連續(xù)灌輸來唧入、或在腫瘤或經皮或皮下位置以一次投予、滴入眼睛的表面等)。
當PEDF或PEDF 44 AA勝肽的來源為PEDF肽時(例如在合適的組成物內)，是以一濃度提供并足以抑制該組織中血管通透性或血管生成的時間。
為了協(xié)助本發(fā)明方法，本發(fā)明提供醫(yī)藥上組成物，其包PEDF或PEDF 44 AA勝肽的來源和合適的稀釋劑。除了PEDF或PEDF 44 AA勝肽的來源外，該組成物包括含有一或多個醫(yī)藥上可接受載體的稀釋劑。根據本發(fā)明所用的醫(yī)藥上組成物可利用一或多個含有賦形劑醫(yī)藥上或生理上可接受載體以習知方式予以調制，以及視需要幫助活性成分至醫(yī)藥上可用的制品的輔助劑。適當?shù)恼{制端視所選投藥的途徑。因此，為了全身性注射，PEDF或PEDF 44 AA勝肽的來源可以水性溶液調制，較佳可使用生理上可兼容的緩沖液，倘若需要，包含穩(wěn)定劑譬如聚伸乙二醇。關于經肌肉投藥，該調配品使用穿刺物適當?shù)乇淮┐讨猎撟枵?。此等穿刺物通常為此技術領域所習知者。關于經口投藥，PEDF或PEDF 44 AA勝肽的來源可與適于包含至錠劑、丸劑、糖衣藥丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、脂質體、懸浮液等的載體予以合并。關于藉由吸入投藥，PEDF或PEDF 44 AA勝肽的來源可便利地從經壓縮的包裝或噴霧器，同時適當?shù)厥褂猛七M器，以氣態(tài)溶膠噴霧存在的形式遞送出。PEDF或PEDF 44 AA勝肽的來源可調制成利用注射的非經腸投藥，例如藉由一次注射或連續(xù)灌輸。此等組成物可以此等形式，例如懸浮液、溶液或包在油狀或水狀賦形劑的乳化劑，以及可包含調裂用藥劑，譬如懸浮用、穩(wěn)定用與/或分散用藥劑。關于施用于皮膚，PEDF或PEDF44 AA勝肽的來源可調制成合適凝膠、乳漿劑(magma)、乳霜、軟膏或其它載體。關于施用于眼睛，PEDF或PEDF 44 AA勝肽的來源可以水狀液予以調制，較佳為以生理可兼容的緩沖液，除了施用于皮膚所述的方法。PEDF或PEDF 44 AA勝肽的來源亦可調制成其它譬如此技術領域中所習知的醫(yī)藥組成物。本文另外提供醫(yī)藥組成物和調制品的詳述。
除了上述補，本發(fā)明亦應推斷為包括調節(jié)細胞中內源性PEDF的表現(xiàn)的方法。舉例而言，可能藉由誘發(fā)細胞中短暫高氧現(xiàn)象來正調控PEDF的產生。此等處理具有使血管生成誘發(fā)子受負調控的新增好處。本發(fā)明應推斷為包括將本方法應用于本文所述各形式的處理。
定義本文所用術語”毗鄰”意指兩者直接相連接的核苷酸序列，且無插入的核苷酸。藉由實施例的方式，當兩者相連為5’-AAAAACTTT-3’或5’-TTTAAAAA-3’，但并非兩者相連為5’-AAAAACTTT-3’，即為五核苷酸5’-AAAAA-3’與三核苷酸5’-TTT-3’毗鄰。
如本文所使用，”癥狀緩解”意指降低該癥狀的程度。
如本文所使用，藉由其全名、藉由其相對應的三個字母符號、或藉由其相對應的一個字母符號所表達的氨基酸，如下表所述全名/三個字母符號/一個字母的氨基酸符號天門冬氨酸Asp D谷氨酸Glu E離氨酸Lys K精氨酸Arg R組氨酸His H酪氨酸Tyr Y半胱氨酸Cys C天門冬酰氨Asn N谷酰氨Gln Q絲氨酸Ser S羥丁氨酸Thr T甘氨酸Gly G丙氨酸Ala A纈氨酸Val V亮氨酸Leu L異亮氨酸Ile I甲硫氨酸Met M脯氨酸Pro P苯丙氨酸Phe F色氨酸Trp W由基因密碼鏈的核酸殘基與基因非密碼鏈的核酸所組成的基因“密碼區(qū)”，其與藉由基因轉譯所制造的mRNA分子的密碼區(qū)分別為同源或相對應。
由基因密碼鏈的核酸殘基與基因非密碼鏈的核酸所組成的基因的“mRNA-密碼區(qū)”，其與藉由基因轉譯所制造的mRNA分子分別為同源或相對應。將明了因為mRNA修飾是發(fā)生在真核細胞的某些例子中，基因的mRNA-密碼區(qū)可包括在所發(fā)生基因體中單一區(qū)域或分散在基因中的復數(shù)個區(qū)域。當基因的mRNA-密碼區(qū)包括在基因體中的分離區(qū)域時，“mRNA-密碼區(qū)”是各別地或組合地意指此等區(qū)域的各者。
本文所用的“互補”意指兩核酸間次單位序列互補的廣大概念，例如與DNA分子。當兩分子的核酸位置藉由有互相配對堿基的正常能力的核苷酸來填滿，而該核酸被視為在此位置上彼此互補。因此，當各分子中相對應位置的連續(xù)數(shù)量核酸藉由有互相配對堿基的正常能力的核苷酸(例如 A∶T和G∶C核苷酸對)來填滿時，此兩核酸互為互補。
“癥狀”意指動物的健康狀態(tài)，其中該動物為法維持體內恒定性，且其中倘若該疾病無法改善，則此動物的健康持續(xù)惡化。疾病獲得”緩解”，意指具有此等癥狀的病患其癥狀的嚴重性獲得降低。
“編碼”意指在聚核苷酸中的核苷酸特定序列的遺傳性質，例如基因、cDNA、或mRNA，以做為在生物方法中合成其它聚合物和巨分子的模板，該生物方法具有經定義的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或經定義的氨基酸序列，以及導致此的生物活性。因此，倘若在細胞中或其它生物系統(tǒng)中相對應于產生該蛋白質的基因質mRNA的轉錄和轉譯作用，基因將編碼蛋白質。該兩密碼鏈，其核苷酸序列經辨識為mRNA序列，且通常以序列名單提供，而做為基因或cDNA轉錄模板的非密碼鏈，可意指編碼此基因或Cdna的蛋白質或其它產物。
除非另行指明，否則”核苷酸序列所編碼的氨基酸序列”包括能使彼此型式退化且編碼相同氨基酸氫列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質和RNA的核苷酸序列可包括插入子(intron)。
本文所用的“同源性”，意指相同的次單元序列存在兩聚合分子間，例如在兩核酸分子間、例如在兩DNA分子或兩RNA分子間、或在兩多勝分子間。當存在于兩分子的次單元藉由相同單分子構造的次單元所填滿，例如倘若在兩DNA分子的各者的位置藉由腺嘌呤所填滿，而使他們在此位置有同源性。兩序列間的同源為直接具有相配對或同源性位置數(shù)目的功能，例如倘若在兩化合物序列的一半位置(例如長度上有十個次單元的聚合物有五個位置)為同源性，則與兩個序列為50％同源性，倘若此位置的90％，例如10個有9個，為相配對或同源性，這兩個序列分配為90％同源性。以此實施例的方式而言，該DNA序列3’ATTGCC5和3’TATGGC分配為50％同源性。
如本文所使用，使用”同源”與”相同”的意義相當。兩核苷酸或氨基酸序列間的相同性百分比的測量可利用數(shù)學算法來完成。舉例而言，有益于比較兩序列的數(shù)學算法為Karlin和Altschul(1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268)的算法，是以Karlin和Altschul(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877)修飾的。此算法被合并至Altschul等人(1990，J.Mol.Biol.215403-410)的NBLAST和XBLAST程序，且可被使用，例如在NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI)的網站上有通用的資源雷達(locator)http://www.nlm.nih.gov/BLAST。BLAST核苷酸研究者可以NBLAST程序(在NCBI的網站上標示為″blastn″)，利用下列參數(shù)來進行gap penalty＝5；gap extension penalty＝2；mismatch penalty＝3；match reward＝1；expectation value 10.0；and word size＝11以獲得對本文所述的核酸有同源性的核苷酸序列。BLAST蛋白質研究者可以XBLAST程序(在NCBI的網站上標示為″blastn″)或NCBI的″lastp″程序，利用下列參數(shù)來進行expectationvalue10.0，BLOSUM62 scoring matrix以獲得對本文所述的蛋白質分子有同源性的氨基酸序列。為了獲得用于相較目的的差異校正(gappedalignments)，可利用在Altschul等人(1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)所述的Gapped BLAST。此外，PSI-Blast或PHI-Blast可做為進行偵測分子間(Id.)遠關聯(lián)的反復研究，以及分享共同模型的分子間的關聯(lián)。當利用BLAST、Gapped BLAST、PSI-Blast和PHI-Blast程序，可使用各別程序的不存在的參數(shù)(例如，XBLAST和NBLAST)。請參見http://www.ncbi.nlm。
兩分子間的相同性百分比可利用上述所述的類似技術來量測，具有或不具允許的差異。在相同性百分比的計算中，典型地計算出正確的配對。
“單離的核酸”意指在天然發(fā)生情況下被來自其兩側的序列所分開的核苷酸區(qū)段或片段，例如從正常毗鄰于該DNA片段的氫列所移除的DNA片段、例如毗鄰于其天然存在基因體中片段的序列。該術語亦可用于從其它伴隨核酸的成分中具體純化出的核酸，例如RNA或DNA或蛋白質，其天然地伴隨于細胞中。該術語其包括，例如，合并于載體的重組DNA、合并于自動復制質體或病毒的重組DNA、或合并于原核細胞或真核細胞的基因體DNA的重組DNA，或存在于從其它氫列獨立出的分離分子(例如cDNA或由PCR或限制酶分解所制造的基因或cDNA片段)。亦可包括能編碼額外多肽序列雜交基因的一部分的重組DNA。
將兩聚核苷酸描述為”可實行地連接”單鏈或雙鏈核酸的部分基團包括兩個分列于該核酸部分基團的聚核苷酸，其使得這兩個聚核苷酸的至少一者藉由能與其它區(qū)分開的特性所使用的生理效果。藉由此實施例的方式，激活子可實行地連接至該基因的密碼區(qū)，而能促進該密碼區(qū)的轉錄。
“聚核苷酸”意指核酸的單鏈或平行或反平行(anti-parallel)鏈。因此，聚核苷酸可為單鏈或雙鏈的核酸。
術語”核酸”典型地意指大的聚核苷酸。
術語”寡核苷酸”典型地意指短的聚核苷酸，通常不超過約50個核苷酸。將明了點以DNA序列(即A、T、G、C)來表示核苷酸序列時，此亦包括RNA序列(即A、U、G、C)，其中”U”取代”T”。
本文所用的習知符號是描述聚核苷酸序列單鏈聚核苷酸序列的左手端為5端；雙鏈聚核苷酸序列的左手方向意指5端方向。
以5端至3端的方向增加核苷酸至初期的RNA轉錄體(transcript)意指轉錄方向。該具有如mRNA相同序列的DNA鏈意指當做”密碼鏈”；位于5端的DNA鏈上的序列至DNA上的參考點意指”上游序列”；位于3端的DNA鏈上的序列至DNA上的參考點意指”下游序列”。
如本文所述，術語”激活子/調節(jié)序列”意指用于表現(xiàn)可實行地連接至該激活子/調節(jié)序列的基因產物所需的核酸序列。在某些例子中，此序列可為中心激活子序列，以及在其它例子中，此序列亦可包括增強子序列和其它基因產物表現(xiàn)所需的調節(jié)序列成分。激活子/調節(jié)序列，例如可為以特定組織的方式表基因產物者。
“基本的”激活子為在細胞中以一定的方式，能驅動可實行地連接的基因表現(xiàn)的激活子。藉由實施例的方式，激活子能驅動細胞管家基因(housekeeping gene)的表現(xiàn)被視為基本的激活子。
“可誘發(fā)的”激活子意指當與聚核苷酸可實行地連接時，使基因產物編碼或具體化的核苷酸序列，僅當相對應于該激活子的誘發(fā)子存在于細胞時，將造成基因產物在活體細胞被具體地制造。
“特定組織的”激活子意指當與聚核苷酸可實行地連接時，使基因產物編碼或具體化的核苷酸序列，僅當細胞為相對應于該激活子的組織類型的細胞時，將造成基因產物在活體細胞被具體地制造。
倘若兩寡核苷酸接合(anneal)的條件下，其中僅至少的75％的寡核苷酸，更佳為至少約90％或至少約95％的寡核苷酸，彼此互補相連，則第一寡核苷酸與第二寡核苷酸是”以高度嚴苛條件”接合。用于接合兩寡核苷酸的嚴苛條件，如為已知，比起其它因素而言，尤其為溫度、接合介質的離子強度、培育期、寡核苷酸的長度、寡核苷酸的G-C含量及兩寡核苷酸間所預期的非同源程度的函數(shù)。調整接合狀態(tài)的嚴苛條件是為已知(請參見，例如，Sambrook等人，1989，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork)。
“預防的”處理意指投藥給予不顯現(xiàn)疾病癥狀或僅表現(xiàn)該疾病早期癥狀的主體，目的在于減少發(fā)展成與該疾病相盼的病理風險。
“治療的”處理意指投藥給予顯現(xiàn)病理癥狀的主體，目的在于減輕或削減此等癥狀。
化合物的“治療有效量”意指投予該化合物使足以提供有益效果給予該主體的化合物量?！陛d體”為包括單離核酸的組成物物質，且其可用于遞送該單離核酸至細胞內部。此技術領域已知的多數(shù)載體，包括但不限于，線型聚核苷酸、與離子化合物或兩性(amphiphilic)化合物、質體和疾毒相關的聚核苷酸。因此，術語”載體”包括獨立的復制質體或病毒。此術語亦應推斷為包括與質體和非病毒的化合物，其有助于將核酸轉移至細胞，例如，聚離氨基化合物、脂質體等。病毒載體包括但不限于，腺病毒故體、腺-相關的病毒載體、反轉錄病毒載體等。
“表現(xiàn)載體”意指包含重組聚核苷酸的載體，該重組聚核苷酸包含有效地連接至核苷酸序列而被表現(xiàn)出的表現(xiàn)控制序列。表現(xiàn)載體包括用于表現(xiàn)的足夠的順式作用(cis-acting)元素；其它用于表現(xiàn)的元素可藉由宿主細胞或在活體外的表現(xiàn)系統(tǒng)所供應。表現(xiàn)載體包括此技術領域所習知者，例如粘粒載體(cosmid)、質體(例如裸露或包含于脂質體中)，以及合任該重組聚核苷酸的病毒。
勝肽的修飾與合成下述部分意指勝肽的修飾及其合成。當然將了解到用于本發(fā)明方法的勝肽可合并沒有影響活性的氨基酸殘基。舉例而言，此界線可衍生成包括阻斷基團，即適于保護與/或穩(wěn)定N端和C端的來自”非所欲的降解”，”非所欲的降解”意指在可能影響該化合物功能的端點位置包涵該化合物的酵素性、化學性或生化性的任何類型崩解，即在該化合物的端點有連續(xù)的降解。
阻斷基團包括在勝肽化學技術領域中已習知使用的保護基團，且將不會有害地影響活體內的勝肽活性。舉例而言，適當?shù)腘端阻斷基團可藉由N端的烷化或?；瘉韺?。適當?shù)腘端阻斷基團，包括C.sub.l-C.sub.5分枝或非分枝烷基、?；┤缂柞；鸵阴；?，以及其經取代的型式，譬如乙酰氨甲基(Acm)。氨基酸的去氨基(desamino)衍生物亦有助于N端阻斷基團，且可偶合至該勝肽的N端或用以取代該N端殘基。適當?shù)腃端阻斷基團，其中合并或不合并該C端的羧基，包括酯類、酮類或酰氨類。C端阻斷基團的實例為酯或酮所形成的烷基，尤其是低碳數(shù)烷基譬如甲基、乙基和丙基，以及酰胺所形成的氨基譬如一級胺(-NH-sub.2)，以及單-與二-烷基氨基譬如甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、甲基乙基氨基等。經去羧基化(descarboxylated)的氨基酸類似物譬如精胺(agmatine)亦有助于C端阻斷基團，且可偶合至該勝肽的N端或用以取代該C端殘基。再者，將明了在端點的游離氨基和羧基可從該勝肽一起移除，以產生其去氨基和去羧基的型式而不影響勝肽活性。
亦可合并其它修飾而不影響該勝肽的生物活性，且此等包括但不限于，一或多個在天然L異構物型式的氨基酸的取代，以及在D異構物型式的氨基酸的取代。因此，該勝肽可包括一或多個D-氨基酸殘基，或可包含所有在D-型式的氨基酸。根據本發(fā)明亦可包括具有D-型式(retro-inverso)的勝肽，舉例而言，插入勝肽(inverted peptides)中所有氨基酸為經D-氨基酸所取代。
本發(fā)明的酸性添加鹽(acid addition salt)亦可預期為功能性相等物(functional equivalents)。因此，本發(fā)明的勝肽是以無機酸(例如氫氯酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等)，或有機酸(例如醋酸、丙酸、羧乙酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、琥珀酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、桂皮酸、苯乙醇酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸等)來處理，以提供適用于本發(fā)明方法的該勝肽的水溶性鹽類。
本發(fā)明亦提供藉由本文揭示的核酸所編碼的蛋白質或勝肽類似物。類似物可異于藉由傳統(tǒng)氨基酸序列差異、或藉由非有害影響序列的修飾、或兩者所自然地造成的蛋白質或勝肽。
舉例而言，可造成傳統(tǒng)氨基酸變化，雖然此不改變該蛋白質或勝肽的初級序列，但卻不正常地改變其功能。傳統(tǒng)氨基酸取代典型地包括下述基團的取代甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天門冬氨酸、谷氨酸天門冬酰氨、谷酰氨；絲氨酸、羥丁氨酸；離氨酸、精氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸。
如上所述，修飾(其不正常地改變初期序列)包括多肽的在活體內、或在活體外的化學衍生作用，例如，乙酰化、或羧酸化。亦包括醣化的修飾，例如在合成和制造期間或進一步制造步驟中，由多肽的醣化模型所修飾制造者；例如藉由使該多肽暴露于能影響醣化的酵素；例如哺乳動物的醣化或去醣化酵素。亦接受具有經磷酸化的氨基酸殘基的序列，例如磷基酪氨酸、磷基絲氨酸、或磷基羥丁氨酸。
亦包括使用原本分子生物技術所修飾的多肽，以使得增強其對蛋白水解降解的抗性，或有效利用溶解性的抗性，或使其更適于做為治療藥劑。此等多肽類似物包括含有與天然發(fā)生于L-氨基酸的殘基者，例如，D-氨基酸或非天然發(fā)生的合成氨基酸。本發(fā)明的勝肽并不限于本文所述的任何特定的列示性方法的產物。
本發(fā)明的勝肽可藉由Stewart等人，in Solid Phase PeptideSynthesis，第二版，1984，Pierce Chemical Company，Rockford，Ill以及Bodanszky和Bodanszky in The Practice of Peptide Synthesis，1984，Springer-Verlag，New York所述的標準、已建立的固相勝肽合成(SPPS)予以輕易地制備。在開始，適當?shù)亟泜€護氨基酸殘基透過其羧基連接至經衍生的、不溶的聚合撐體，例如經交聯(lián)的聚苯乙烯或聚酰胺樹脂?！边m當經保護”意指存在于該氨基酸的α-氨基與在任何官能性側鏈上的保護基。側鏈保護基通常對溶劑、試劑和透過合成的反應狀態(tài)皆呈現(xiàn)穩(wěn)定，且在不影響最終產物的狀況下可移除。逐步地合成寡勝肽是藉由將來自起始氨基酸的N端保護基移除，并將所欲勝肽序列的下一個氨基酸的羧基端偶合。此氨基酸亦適當?shù)亟洷Ｗo?？蓪⑺冒被岬聂然逵尚纬梢环磻曰鶊F(例如形成碳化二酰亞胺、合成的酸酐或”活性酯”基譬如羥基苯并三唑或五氟苯基酯)而予以活化，以與撐體相連氨基酸的N端發(fā)生反應。
固相勝肽合成方法的實例，包括利用第三丁氧基羰基做為α-氨基酸保護基的BOC法，以及利用9-茀基甲氧基羰基以保護該氨基酸殘基的α-氨基酸的FMOC法，及藉由此技術領域中熟習者將兩種已知方法共同操作。亦可利用對固相勝肽合成方法已習知的操作來獲得N端與/或C端阻斷基團的合并。關于C端阻斷基團，舉例而言，所欲勝肽的合成典型地利用固相、已經化學修飾的支撐樹脂來進行，以使從該樹脂的剪切造成具有所欲C端阻斷基團的勝肽。為了提供具有能忍受一級胺阻斷基團的C端的勝肽，舉例而言，當完成勝肽合成時，利用對甲基苯基羥基胺(MBHA)樹脂來進行合成，以氫氟酸處理產生所欲的C端經酰胺化的勝肽。同樣地，利用N-甲基氨基乙基所衍生的DVB來獲得在C端的N-甲基胺阻斷基團的合并，其在HF處理下產生能忍受N-甲基酰胺化的C端的勝肽。藉由酯化的C端阻斷亦可利用習知方法來獲得。樹脂/阻斷基團合并的必要使用允許從該樹脂產生側鏈勝肽，以使所欲的酒精進行連續(xù)的反應，以形成該酯類功能。FMOC保護基團，配合與甲氧基烷氧基苯甲基醇或相等物連結劑所衍生的DVB樹脂，可用于此目的，以來自由二氯甲烷中的TFA所影響的剪切。適當?shù)亟浕罨然倌芑孽セ缫訢CC，可藉由添加所欲的醇類予以制造，然后藉由去保護基及該經酯化勝肽產物的單離。
當該經合成勝肽仍連接至樹脂，可獲得N端阻斷基團的合并，例如藉由以適當?shù)乃狒碗骖悂硖幚?。為了合并在N端的乙酰基阻斷基團，例如，該經樹脂偶合的勝肽可以20％乙酸酐的乙腈來處理。N端阻斷勝肽物可從該樹脂剪切，去保護基，然后分離。
為了確保從化學性或生物性合成技術所獲得的勝肽為所欲的勝肽，該進行該勝肽組成物的分析。此類氨基酸組成物分析可利用高分辨率質譜儀來進行，以測量該勝肽的分子量。選擇性地，或額外地，該勝肽的氨基酸含量可藉由水解在酸性水溶液的勝肽、分離、鑒定，以及利用HPLC或氨基酸分析儀來定量該混合物的成分來確定。蛋白質定序儀，能連續(xù)地降解該勝肽，并鑒定該氨基酸序列，亦可用于定義性地測定該勝肽的序列。
在本發(fā)明方法的應用前，純化該勝肽以移除污染物。因此，將了解到將純化該勝肽以達到標準量測機關(regulatory agencies)所設定的標準。許多習知純化方法的任一者可用于獲得純化所需的標準，舉例而言，反相高效層析儀(HPLC)是利用經烷基化的硅管柱譬如C.sub.4-，C.sub.C.sub.18-硅。增加有機含量的漸序移動相通常用于完成純化，例如乙腈的水性緩沖液，通常含有小量三氟乙酸。離子交換層析法亦可根據勝肽的分子量來分離勝肽。
用于辨識具有PEDF生物活性的候選藥劑的分析本文中使用的術語「藥劑」或「化合物」述及任何分子，例如具有仿真或實行PEDF生物作用的能力的蛋白質或藥劑。一般而言，可將多種分析混合物與不同藥劑濃度一起進行，以獲得對各種濃度的差別反應。典型地，將此等濃度中的一者作為陰性對照組，亦即，于零濃度或低于檢測濃度。
候選藥劑(化合物)涵蓋許多化學族群，雖然典型地該候選藥劑為有機分子，較佳為具有高于50且低于約2,500道爾頓(dalton)分子量的小有機化合物。候選藥劑包含用來與蛋白質進行結構交互作用(特別是氫鍵結)所需的官能基，且典型地包括至少胺、羰基、羥基或羧基，較佳為該等官能化學基團的至少二者。該候選藥劑通常包含經一個或多個上述官能基取代的環(huán)狀碳或雜環(huán)結構及/或芳香族或聚芳香族結構。候選藥劑亦于生物分子中發(fā)現(xiàn)，包括但非限于勝肽、多醣類、脂肪酸、膽固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、結構類似物或其組合。
候選藥劑是由各種廣泛的來源獲得，包括合成或天然化合物的數(shù)據庫。舉例而言，可利用許多方法來隨機或指定合成各種廣泛的有機化合物及生物分子，包括表現(xiàn)隨機的寡核苷酸及寡勝肽?；蛘?，可利用或輕易地制造以細菌、真菌、植物及動物萃取物的形式的天然化合物數(shù)據庫。此外，天然或合成制造的數(shù)據庫及化合物乃經由習知的化學、物理及生化方法輕易地改質，且可用于制造組合性數(shù)據庫。已知的醫(yī)藥藥劑可接受指定或或隨機化學改質，諸如?；?、烷化、酯化、酰胺化等來制造結構類似物。篩選可針對已知的醫(yī)藥活性化合物及其化學類似物。
篩選分析為利用PEDF受體的結合分析(參見申請于2003年8月7日的美國臨時申請案第60/493,713號)，其內容以參考資料的方式合并于此，可將一種或多種分子加以標定，其中該標定可直接地或間接地提供可偵測的訊號。各種標定包括放射性同位素、螢光劑、化學冷光劑、酵素、專一性結合分子、粒子(如磁性粒子)等。專一性結合分子包括偶分子，例如生物素(biotin)及鏈霉親和素(streptavidin)、地高辛(digoxin)及抗地高辛(antidigoxin)等。至于專一性結合成員，可依據已知的程序將互補的成員依慣例標定偵測用的分子。
各種其它試劑可包含于該篩選分析中。此等試劑包括用于促進最佳的蛋白質-蛋白質結合及/或降低非專一性或背景交互作用的試劑，如鹽類、中性蛋白質(例如白蛋白、界面活性劑等)。可使用增進分析效果的試劑，如蛋白酶、抑制劑、核酸酶抑制劑、抗微生物劑等。各成分的混合物是以任何能提供必須結合的順序來添加。于任合適當?shù)臏囟认屡囵B(yǎng)，典型地介于4至40℃之間。培養(yǎng)時間取決于最佳的活性，但亦可為了促進快速高輸出的篩選而最佳化。
醫(yī)藥組成物以下將敘述利用本文中所述的任何方法所辨識且可調配及投予至哺乳動物中用于治療本文中所揭示的疾病的化合物。
本發(fā)明涵蓋制備及利用包含適用于本發(fā)明的方法中作為活性成分的化合物的醫(yī)藥組成物。該等醫(yī)藥組成物可以適用于投予至個體的形式由單獨的活性成分組成，或該醫(yī)藥組成物可包含活性成分及一種或多種醫(yī)藥上可接受的載劑、一種或多種額外的成分、或此等物質的某種組合?；钚猿煞挚梢陨砩峡山邮艿孽セ螓}的形式存在于醫(yī)藥組成物中，諸如此相關技藝中已知的與生理上可接受的陽離子或陰離子組合。
本文中使用的術語「醫(yī)藥上可接受的載劑」意指活性成分可與其組合，且組合之后可用于將該活性成分投予至個體的化學組成物。
本文中使用的術語「生理上可接受的」酯或鹽意指由活性成分形成的酯或鹽，其與該醫(yī)藥組成物的任何其它成分兼容，且對于該組成物欲投予的個體無害。
本文中所述的醫(yī)藥組成物的調配物可藉由任何醫(yī)藥技藝中已知的或之后發(fā)展出的方法予以制備。一般而言，該等制備方法包括以下步驟將活性成分與載劑或一種或多種其它附加成分結合，然后若有需要或較適當?shù)?，將產物成形或包裝成所欲的單一或多劑量單位。
雖然本文中所提供的醫(yī)藥組成物的說明主要是針對適用于依據處方投予至人類的醫(yī)藥組成物，但熟悉此技藝者將了解該等組成物可普遍地適用于投予至所有種類的動物。為了使適用于投予至人類的醫(yī)藥組成物能適用于投予至各種動物的改質為已知的，且一般熟練的獸醫(yī)藥理學者，若需要，可僅利用任何一般的實驗加以設計并進行該等改質。本發(fā)明醫(yī)藥組成物預期投予的個體包括，但非限于人類及其它靈長類；哺乳動物，包括商業(yè)上重要的哺乳動物，如牛、豬、馬、羊、貓及狗；鳥類，包括商業(yè)上重要的鳥類，如雞、鴨、鵝及火雞。適用于本發(fā)明方法的醫(yī)藥組成物可以適用于口服的、直腸的、陰道的、非經腸的、局部的、肺部的、鼻內的、口腔的、眼部的、囊內的或其它投予途徑的調配物來制備、包裝或販售。其它預期的調配物包括投射奈米粒子、脂質體制劑、含有活性成分的釋放型紅血球、及免疫型調配物。
本發(fā)明醫(yī)藥組成物可以單一單位劑量或多個單一單位劑量的散裝來制備、包裝或販售。本文中使用的「單位劑量」為含有預定量活性成分的醫(yī)藥組成物的分離量?；钚猿煞值牧恳话愕扔谠摶钚猿煞钟队柚羵€體的劑量或該等劑量合宜的部分(例如，該劑量的二分之一或三分之一)。
活性成分、醫(yī)藥上可接受的載劑、及任何額外的成分在本發(fā)明醫(yī)藥組成物中的相對量會依據特性、尺寸、所治療個體的癥狀以及進一步依據該組成物欲投予的途徑而有所不同。經由實施例，該組成物可包含0.1重量％及100重量％之間的活性成分。
除了活性成分之外，本發(fā)明組成物可進一步包含一種或多種額外添加的醫(yī)藥活性藥劑。尤其考慮的添加劑包括止吐劑及清除劑，如氰化物及氰化物清除劑。
本發(fā)明醫(yī)藥組成物的控制型或持續(xù)釋放型調配物可利用習知技術予以制造。
本發(fā)明醫(yī)藥組成物的調配物可以分離固體劑量單位的形式來制備、包裝或販售，該分離固體劑量單位包括，但非限于各含有預定量活性成分的錠劑、硬或軟膠囊、扁囊劑、片劑或口含錠。其它適用于口服投予的調配物包括，但非限于粉狀或粒狀調配物、水性或油性懸浮液、水性或油性溶液、或乳劑。
本文中使用的「油性」液體為包含含碳液體分子且顯現(xiàn)低于水的極性特性的液體。
含有活性成分的錠劑可藉由例如將該活性成分視需要與一種或多種添加劑進行壓縮或模制來制造。壓縮錠劑可藉由以適當?shù)难b置，視需要與粘結劑、潤滑劑、賦形劑、界面活性劑及分散劑中的一種或多種壓縮自由流動形式的活性成分(例如粉狀或粒狀制劑)予以制備。模制錠劑可藉由以適當?shù)难b置模制以下成分的混合物而制造活性成分、醫(yī)藥上可接受的載劑、及至少足夠潤濕該混合物的液體。用于制造錠劑的醫(yī)藥上可接受的賦形劑包括，但非限于鈍性稀釋劑、?；氨澜鈩⒄辰Y劑、及潤滑劑。已知的分散劑包括，但非限于馬鈴薯淀粉及淀粉乙醇鈉。已知的界面活性劑包括，但非限于硫酸月桂酯鈉。已知的稀釋劑包括，但非限于碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、微晶纖維素、磷酸鈣、磷酸氫鈣、及磷酸鈉。已知的粒化及崩解劑包括，但非限于玉米淀粉及藻酸。已知的粘結劑包括，但非限于明膠、阿拉伯膠(acacia)、預糊化玉米淀粉、聚乙烯吡咯啶酮、及羥丙基甲基纖維素。已知的潤滑劑包括，但非限于硬脂酸鎂、硬脂酸、氧化硅及滑石。
錠劑可為未經包覆的，或者其可利用已知的方法包覆，以達到在個體的腸胃道中延遲崩解，藉此提供活性成分的持續(xù)釋放及吸收。經由實施例，可采用諸如單硬脂酸甘油或二硬脂酸甘油的材料包覆錠劑。進一步經由實施例，錠劑可藉由采用美國專利第4,256,108、4,106,452及4,265,874號所述的方法進行包覆，以形成滲透控制釋放型錠劑。錠劑可進一步包含甜味劑、調味劑、著色劑、防腐劑、或此等添加劑的某種組合，俾以提供醫(yī)藥上精致且美味的制劑。
包含活性成分的硬膠囊可利用生理上可降解的組成物(例如明膠)來制造。該等硬膠囊包含活性成分，且可進一步包含額外的成分，該額外的成分包括例如鈍性稀釋劑，如碳酸鈣、磷酸鈣、或高嶺土。
包含活性成分的軟膠囊可利用生理上可降解的組成物(例如明膠)來制造。該等軟膠囊包含活性成分，其可與水或油性基質(如花生油、液態(tài)石臘或橄欖油)進行混合。
適用于口服投予的本發(fā)明醫(yī)藥組成物的液體調配物可以液體形式或以使用前利用水或其它適當媒劑而重新構成的干燥產物的形式予以制備、包裝或販售。
液體懸浮液可利用習知方法制備，以達成將活性成分懸浮于水性或油性媒劑。水性媒劑包括，例如水及等張性鹽水。油性媒劑包括，例如杏仁油、油性酯類、乙醇、植物油(如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)、分餾植物油、及礦物油(如液態(tài)石臘)。液體懸浮液可進一步包含一種或多種添加劑，包括，但非限于懸浮劑、分散或濕潤劑、乳化劑、緩和劑、防腐劑、緩沖劑、鹽類、調味劑、著色劑、及甜味劑。油性懸浮液可進一步包含硬化劑。已知的懸浮劑包括，但非限于山梨糖醇漿、氫化食用脂肪、藻酸鈉、聚乙烯吡咯啶酮、黃蓍膠(gumtragacanth)、阿拉伯膠、及纖維素衍生物(如羧甲基纖維素、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素)。已知的分散或濕潤劑包括，但非限于天然發(fā)生的磷脂類(例如卵磷脂)；環(huán)氧烷與脂肪酸、與長鏈脂肪族醇、與衍生自脂肪酸及己醣醇的部分酯、或與衍生自脂肪酸及己醣醇酸酐的部分酯的縮合產物(例如分別為聚氧伸乙基硬脂酸酯、十七伸乙基氧基鯨蠟醇、聚氧伸乙基山梨糖醇單油酸酯、及聚氧伸乙基山梨糖醇酐單油酸酯)。已知的乳化劑包括，但非限于卵磷脂及阿拉伯膠。已知的防腐劑包括，但非限于對-羥苯甲酸甲酯、對-羥苯甲酸乙酯、或對-羥苯甲酸正丙酯、抗壞血酸、及山梨酸。已知的甜味劑包括，例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、蔗糖、及糖精。用于油性懸浮液的已知的硬化劑包括，例如蜂蠟、固體石蠟、及鯨蠟醇。
在水性或油性溶劑中的活性成分的液體溶液可依照實質上類似于液體懸浮液的方式來制備，主要的差別在于該活性成分是溶解的，而非懸浮于溶劑中。本發(fā)明醫(yī)藥組成物的液體溶液可包含液體懸浮液中所述的各成分，但應了解在溶劑中不需要懸浮劑輔助該活性成分的溶解。水性溶劑包括，例如水及等張性鹽水。油性溶劑包括，例如杏仁油、油性酯、乙醇、植物油(如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)、分餾植物油、及礦物油(如液態(tài)石臘)。
本發(fā)明醫(yī)藥組成物的粉狀及粒狀調配物可利用已知的方法來制備。該等調配物可直接投予至個體，可用于例如制成錠劑、填充膠囊、或藉由添加水性或油性媒劑于其中而制備水性或油性懸浮液或溶液。此等調配物的各者可進一步包含一種或多種分散或濕潤劑、懸浮劑、及防腐劑。于此等調配物中亦可包括額外的賦形劑(如填充劑)及甜味劑、調味劑、或著色劑。
本發(fā)明醫(yī)藥組成物亦可以水包油乳劑或油包水乳劑的形式來制備、包裝或販售。油相可為植物油(如橄欖油或花生油)、礦物油(如液態(tài)石蠟)、或此等油類的組合。該等組成物可進一步包含一種或多種乳化劑，例如天然發(fā)生的樹膠(如阿拉伯膠或黃蓍膠)；天然發(fā)生的磷脂類，例如大豆磷脂或卵磷脂；衍生自脂肪酸與己醣醇酸酐的組合的酯類或部分酯類，例如山梨糖醇酐單油酸酯；以及該等部分酯類與環(huán)氧乙烷的縮合產物，例如聚氧伸乙基山梨糖醇酐單油酸酯。此等乳劑亦可包含額外的成分，包括，例如甜味劑或調味劑。
本發(fā)明醫(yī)藥組成物可以適用于直腸投予的調配物來制備、包裝或販售。該等組成物可為例如栓劑、保留灌腸(retention enema)制劑、及用于直腸或結腸灌洗的溶液。
栓劑調配物可藉由結合活性成分與非灌洗用的醫(yī)藥上可接受的賦形劑而制造，該賦形劑在一般室溫(亦即，約20℃)下為固體，而在個體的直腸溫度(亦即，在健康人體中約為37℃)下為液體。適當?shù)尼t(yī)藥上可接受的賦形劑包括，但非限于可可脂、聚乙二醇、及各種甘油酯。栓劑調配物可進一步包含各種額外的成分，包括，但非限于抗氧化劑及防腐劑。
保留灌腸制劑或用于直腸或結腸灌洗的溶液可藉由結合活性成分與醫(yī)藥上可接受的液體載劑來制備。如同此相關技藝中所知，灌腸制劑可利用適應于個體直腸解剖結構的遞送裝置而進行投予，且該灌腸制劑可包裝于其中。灌腸制劑可進一步包含各種額外的成分，包括，但非限于抗氧化劑及防腐劑。
本發(fā)明醫(yī)藥組成物可以適用于陰道投予的調配物來制備、包裝或販售。該等組成物可為例如栓劑、充滿或包覆式陰道可插入性材料(如塞墊)、沖洗制劑、或用于陰道灌洗的凝膠或乳霜或溶液。
以化學組成物充滿或包覆材料的方法在相關技藝中為已知的，包括，但非限于沉積或結合化學組成物于表面上的方法、在材料的合成期間將化學組成物結合至該材料結構中的方法(亦即，例如與醫(yī)藥上可降解的材料)、以及將水性或油性溶液或懸浮液吸收至吸收性材料并進行或不進行后續(xù)干燥的方法。
沖洗制劑或用于陰道灌洗的溶液可藉由結合活性成分與醫(yī)藥上可接受的液體載劑來制造。如同此相關技藝中所知，沖洗制劑可利用適應于個體陰道解剖結構的遞送裝置而進行投予，且該沖洗制劑可包裝于其中。沖洗制劑可進一步包含各種額外的成分，包括，但非限于抗氧化劑、抗生素、抗真菌劑、及防腐劑。
本文中使用的醫(yī)藥組成物的「非經腸式投予」包括任何投予途徑，其特征在于個體組織的物理性侵入及透過侵入該組織而進行醫(yī)藥組成物的投予。因此，非經腸式投予包括，但非限于藉由注射醫(yī)藥組成物而進行該組成物的投予、藉由通過外科手術切口施用該組成物而進行的投予、藉由通過組織穿透性非外科手術傷口施用該組成物而進行的投予等。詳言之，非經腸式投予預期包括，但非限于皮下注射、腹膜內注射、肌內注射、胸骨內注射、及腎滲透性注入技術。
適用于非經腸式投予的醫(yī)藥組成物的調配物包含與醫(yī)藥上可接受的載劑結合的活性成分，該醫(yī)藥上可接受的載劑諸如無菌水或無菌等張性鹽水。該等調配物可以適用于高劑量投予或連續(xù)投予的形式來制備、包裝或販售?？勺⑸湔{配物可以單位劑量形式，例如，于安瓿中或含有防腐劑的多劑量容器中來制備、包裝或販售。用于非經腸式投予的的調配物包括，但非限于懸浮液、溶液、于油性或水性媒劑中的乳劑、糊劑、及植入式持續(xù)釋放型或生物可降解型調配物。該等調配物可進一步包含一種或多種額外的添加劑，包括，但非限于懸浮劑、安定劑、或分散劑。用于非經腸式投予的調配物的一個具體例中，活性成分是以在進行重組式組成物的非經腸式投予之前，利用適當媒劑(例如，不含熱原(pyrogen)的無菌水)而重新構成的干燥(亦即，粉末或顆粒)形式提供。
該醫(yī)藥組成物可以無菌注射用水性或油性懸浮液或溶液的形式來制備、包裝或販售。此懸浮液或溶液可依據已知的技藝而予以調配，且除了活性成分以外，可包含額外的成分，如本文中所述的分散劑、濕潤劑、或懸浮劑。該等無菌注射調配物可利用無毒性非經腸式可接受的稀釋劑或溶劑(例如，水或1，3-丁二醇)來制備。其它可接受的稀釋劑及溶劑包括，但非限于林格氏溶液(Ringer’s solution)、等張性氯化鈉溶液、及不揮發(fā)油(如單-或二-甘油酯)。其它有用的非經腸式投予調配物包括彼等于微晶形式、脂質體制劑中含有活性成分者，或活性成分作為生物可降解性聚合物系統(tǒng)的成分者。用于持續(xù)釋放或植入的組成物可包含醫(yī)藥上可接受的聚合物型或疏水型材料，例如乳劑、離子交換樹脂、略溶性聚合物、或略溶性鹽。
適用于局部投予的調配物包括，但非限于液體或半液體制劑，例如搽劑、洗劑、水包油或油包水乳劑(如乳霜、膏劑或糊劑)、及溶液或懸浮液?？删植客队枵{配物可包含例如約1重量％至約10重量％的活性成分，雖然該活性成分的濃度可與該活性成分在溶劑中的溶解度上限一樣高。用于局部投予的調配物可進一步包含一種或多種本文中所述的額外成分。
本發(fā)明醫(yī)藥組成物可以適用于經由口腔的肺部投予的調配物形式來制備、包裝或販售。該等調配物可包含干燥粒子，該干燥粒子包含活性成分且具有介于約0.5至約0.7奈米且較佳為約1至約6奈米的直徑。該等組成物方便地呈干燥粉末的形式，以利用含有干燥粉末貯槽的裝置進行投予，其中推進劑流可導向該貯槽以分散該粉末；或者利用自推進溶劑/粉末分散容器進行投予，例如于密封容器中含有溶解或懸浮于低沸點推進劑的活性成分的裝置。較佳地，該等粉末包含的粒子中，至少98重量％的該粒子具有高于0.5奈米的直徑且至少95數(shù)量％的該粒子具有低于7奈米的直徑。更佳地，至少95重量％的該粒子具有高于1奈米的直徑且至少90數(shù)量％的該粒子具有低于6奈米的直徑。干燥粉末組成物較佳包括諸如糖類的固體細微粉末稀釋劑，且方便地以單位劑量形式提供。
低沸點推進劑一般包括于大氣壓力下具有低于65沸點的液體推進劑。一般而言，推進劑可構成50至99.9重量％的該組成物，且活性成分可構成0.1至20重量％的該組成物。推進劑可進一步包含額外的成分，如液態(tài)非離子性或固態(tài)陰離子性界面活性劑、或固體稀釋劑(較佳具有與含有該活性成分的粒子相同規(guī)格的粒子尺寸)。
調配成肺部遞送的本發(fā)明醫(yī)藥組成物亦可以溶液或懸浮液的滴劑形式來提供活性成分。該等調配物可以含有活性成分的水性或烯釋酒精溶液或懸浮液(視需要為無菌)形式來制備、包裝或販售，且可方便地利用氣化或霧化裝置來進行投予。該等調配物可進一步包含一種或多種額外的成分，包括，但非限于調味劑(例如，糖精鈉)、揮發(fā)性油、緩沖劑、界面活性劑、或防腐劑(例如，羥苯甲酸甲酯)。藉此投予途徑提供的滴劑較佳具有介于約0.1至約200奈米范圍內的平均直徑。
本文中所述適用于肺部遞送的調配物亦適用于本發(fā)明醫(yī)藥組成物的鼻內遞送。
另一種適用于鼻內投予的調配物為包含活性成分且具有約0.2至500微米平均粒子的粗粉末。該等調配物是以吸入方式，亦即藉由通過鼻信道而自保持在鼻孔附近的粉末容器快速吸入的方式來進行投予。
適用于經鼻投予的調配物可包含例如低至約0.1重量％及高達100重量％的活性成分，且可進一步包含一種或多種本文中所述的額外成分。
本發(fā)明醫(yī)藥組成物可以適用于口腔投予的調配物形式來制備、包裝或販售。該等調配物可例如為利用習知方法所制造的錠劑或口含錠的形式，并可例如為0.1至20重量％活性成分，余量包含口服可溶性或可降解性組成物及視需要地一種或多種本文中所述的額外成分?；蛘?，適用于口腔投予的調配物可包含含有活性成分的粉末、或氣化或霧化溶液或懸浮液。當分散該等粉末狀、氣化或霧化調配物時，其較佳具有介于約0.1至約200奈米范圍內的平均粒子或液滴尺寸，且可進一步包含一種或多種本文中所述的額外成分。
本發(fā)明醫(yī)藥組成物可以適用于眼部投予的調配物形式來制備、包裝或販售。該等調配物可例如呈眼部滴劑的形式，其包括例如0.1至1.0重量％活性成分的溶液或懸浮液于水性或油性液體載劑中。該等滴劑可進一步包含緩沖劑、鹽類、或一種或多種其它本文中所述的額外成分。其它適用的眼部可投予式調配物包括彼等于微晶形式或脂質體制劑中含有活性成分者。
本文中使用的「額外的成分」包括，但非限于一種或多種下列物質賦形劑；界面活性劑；分散劑；鈍性稀釋劑；粒化或崩解劑；粘結劑；潤滑劑；甜味劑；調味劑；著色劑；防腐劑；生理上可降解的組成物，例如明膠；水性媒劑或溶劑；油性媒劑或溶劑；懸浮劑；分散或濕潤劑；乳化劑；緩和劑；緩沖劑；鹽類；硬化劑；填充劑；乳化劑；抗氧化劑；抗生素；抗真菌劑；安定劑；及醫(yī)藥上可接受的聚合物型或疏水型材料。其它可涵蓋于本發(fā)明醫(yī)藥組成物的「額外的成分」于此相關技藝中為已知的，且詳述于例如Genaro編輯，1985，Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，其以參考資料之方式并入本文中。
含有PEDF的持續(xù)釋放型組成物可能為特別有用的。舉例而言，持續(xù)釋放型組成物可用于玻璃體且亦可用于眼睛后面。如本文他處所述，持續(xù)釋放型組成物亦可用于投予PEDF的系統(tǒng)性或其它遞送途徑。熟悉此技藝者將了解適當?shù)某掷m(xù)釋放型組成物可用于治療所欲疾病達到所欲的結果。
典型地，本發(fā)明化合物可投予至動物(較佳為人類)的劑量為該動物每公斤體重投予1微克至約100克范圍的量。但是，精確的投予劑量將依據任意數(shù)量的因子而有所不同，該因子包括，但非限于動物的類型及欲治療疾病的類型、動物的年齡及投予途徑。較佳地，化合物的劑量是在該動物每公斤體重投予約1毫克至約10克的范圍中變化。更佳地，該劑量是在該動物每公斤體重投予約10毫克至約1克的范圍中變化。
該化合物可以每日數(shù)次的頻率投予至動物，或可以較低頻率投予，例如每日一次、每周一次、每二周一次、每月一次，或甚至更低的頻率，例如數(shù)個月一次或甚至每年一次或更低。劑量的頻率對于熟悉此技藝者而言為明顯易知的，且取決于任意數(shù)量的因子，例如，但非限于欲治療疾病的類型或嚴重度、動物的類型及年齡等。
實施例本發(fā)明將藉由下列實施例而予以進一步說明，該等實施例僅提供說明的目的，本發(fā)明不應以任何方式局限于此等實施例，本發(fā)明應涵蓋本文中所提出的教示內容可得到的任何及所有明顯的變化。本申請案全文所引用的所有參考資料、專利、及公開專利申請案，以及圖式，皆以參考資料的方式并入本文中。
例示將下列方法及材料用于下列實施例中PEDF的制備如之前所述19在人類胚胎腎癌293細胞中制造重組的人類PEDF。PEDF蛋白依據之前所述的程序43自條件培養(yǎng)基中予以純化。利用線性NaCl梯度(20nM NaH2PO4，pH6.2，0至500mM NaCl，10％甘油)自Mono S FPLC管柱洗提出PEDF。
合成勝肽的制備合成三種勝肽(圖4a)。PEDF勝肽(PEDFpep)對應于蛋白質的第78至121個氨基酸殘基(GenBankTM登錄號P36955)。ACT勝肽對應于蛋白質的第73至118個氨基酸殘基(登錄號P01011)。嵌合肽(CHIMERApep)長度為44個氨基酸，具有來自PEDF的40個氨基酸加上來自ACT或HSP47(登錄號P29043)的4個氨基酸殘基。
用于評估血管滲透性的生物活性的玻璃體內注射依照視力及眼科研究學會對于使用動物于眼科及視力研究的報告(Association forResearch in Vision and Ophthalmology Statement for the Use ofAnimals in Ophthalmic and Vision Research)來照料6至8周齡的C57BL/6J小鼠。麻醉時，各動物分別于肌內給予含有20mg/kg克他命(ketamine)、20mg/kg甲苯噻嗪(xylazine)及800mg/kg氨甲酸乙酯(urethane)的0.3至0.4ml的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS、1.06mM KH2PO4、0.15 M NaCl及3.00mM Na2HPO4，pH7.4)。于10倍放大率下，將1μl的鼠VEGF164(12.6 ng/μl于PBS；R&D系統(tǒng)，Minneapolis，Minnesota)經由傾斜20°且具有13至20μm尖頭直徑的玻璃吸量管進行遞送。對側的眼睛則給予同樣體積單獨的PBS或含有12.6ng VEGF164的PBS、以及20倍莫耳濃度的過量PEDF(232ng)、ACT(278ng)、HSP47(278ng)、PEDFpep(28.1ng)、ACTpep(29.7ng)或CHIMERApep(28.2ng)。
螢光素血管攝影于玻璃體內注射12小時后，以1滴1％硫酸阿托平(atropine sulfate)使各瞳孔放大。于玻璃體內注射0.1ml的25％螢光素后，利用Kowa Genesis相機拍攝連續(xù)的視網膜影像。第一張照片是在玻璃體內注射螢光素的20秒以內拍攝。在右眼及左眼的視網膜影像間交替的時間間隔平均為10秒。螢光素滲漏會顯示出模糊的血管邊界且發(fā)展成擴散模糊的螢光。
伊凡氏藍(Evans Blue)分析本發(fā)明使用Qaum等人所述的方法44的改良。簡言之，對每一小鼠給予玻璃體內注射蛋白質與勝肽，以及頸靜脈內注射伊凡氏藍44。2小時后，抽取200μl血液并分析伊凡氏藍。將視網膜擠出并切開而使其不帶有任何玻璃體或粘連的視網膜色素上皮細胞。
為了分析伊凡氏藍-白蛋白濃度，于620nm及740nm測量視網膜萃取物及血漿樣本的光密度。視網膜的血管通透性藉由利用之前所述的公式32，44將視網膜的伊凡氏藍的量對視網膜乾重、血漿伊凡氏藍濃度、及循環(huán)時間進行標準化而計算。由于此報告中的所有動物皆有1眼單獨注射VEGF，因此注射VEGF的眼睛的視網膜通透性是對有一眼給予PBS的動物的組別中該注射VEGF的眼睛來進行標準化。
BRCEC移動分析如之前所述45將牛的視網膜的微血管內皮細胞(BRCEC)單離并培養(yǎng)。以標定有1，1’-雙十八烷基-3，3，3’，3’-四甲基-吲哚羰花青過氯酸鹽的乙?；兔芏戎鞍?DiI-Ac-LDL；Biomedical Technologies Inc.，Stoughton，Massachusetts)處理之后，藉由細胞分選儀將BRCEC進一步純化。將第五和第九傳代之間的細胞在含有D-Val及2％胎牛血清的MEM中使其饑餓隔夜。將聚碳酸酯過濾器(10μm孔徑，PVPF；Osmonics Inc.，Minnetonka，Minnesota)以100μg/ml膠原包覆。將四份含有測試樣本的MEM D-Val(28μl)及含有104個細胞的MEM D-Val(50μl)分別置于微趨化箱(microchemotaxis chamber)(NeuroProbe，Gaithersburg，Maryland)的下層孔及上層孔。于37℃培養(yǎng)8小時后，將過濾器上表面未移動的細胞移除，并將過濾器以哈利氏蘇木素(Harris’hematoxylin)染色。對于每一測試樣本，于一個400倍視野下計算該每一四份的各象限。由4個象限的總細胞數(shù)，計算該四份孔的平均及標準差。基線移動等于含有MEM D-Val而不添加任何蛋白質或勝肽的移動細胞的數(shù)目。基線與含有添加的VEGF的移動細胞的數(shù)目的差等于最大總移動量。
統(tǒng)計分析所有結果以平均±標準差表示。使用Student的配對t-檢定(paired Student’s t test)來比較同一動物的眼睛。藉由單因子變異數(shù)分析(one-way ANOVA)來分析群組的差異。當P＜0.05時，則差異被認為具統(tǒng)計顯著性。
實施例1PEDF于質量上抑制VEGF所誘發(fā)的視網膜血管通透性螢光素血管攝影為一種臨床診斷技術，其使得我們能影像化地見到調節(jié)VEGF所誘發(fā)的通透性的因子的影響。相對于對側的另一眼而言，某一眼下降的螢光可歸因于注射至兩眼的藥劑。由于VEGF促進血管通透性28，因此如同預期，相較于注射鹽水的對側眼睛，接受VEGF164(鼠中人類的VEGF165的同源基因(ortholog))的眼睛出現(xiàn)增加的螢光素滲漏(圖1a)。當PEDF與VEGF164共同注射時，則無觀察到VEGF誘發(fā)的血管通透性(圖1b)。
為了顯現(xiàn)出抗血管通透活性對于PEDF具有專一性，我們以相同的分析測試ACT及HSP47的影響。ACT及HSP47是來自絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)超家族的兩個亞家族29，其與PEDF所隸屬的亞家族不同。盡管絲氨酸蛋白酶抑制劑之間具有高程度的結構保守性，ACT及HSP47在小鼠視網膜中對VEGF誘發(fā)的螢光素滲漏不具影響(圖1c、d)。因此，PEDF對VEGF所誘發(fā)的血管通透性的抑制效果是專一于PEDF。
實施例2PEDF于數(shù)量上抑制VEGF所誘發(fā)的視網膜血管通透性為了量化及證實PEDF抑制VEGF所誘發(fā)的血管通透性的能力，我們采用改良的伊凡氏藍分析32。將如同螢光素血管攝影實驗中進行玻璃體內注射的小鼠，于24小時后經血管內接受伊凡氏藍。PEDF幾乎終止(95.6±21.2％)VEGF所誘發(fā)的血管通透性，而ACT及HSP47則不具可辨識的影響(分別為3.4±18.2％及19.4±22.3％的抑制性)(圖2)。此等數(shù)據于數(shù)量上證實我們藉由螢光素血管攝影于質量上所觀察到的PEDF抑制VEGF所誘發(fā)的血管通透性。
實施例3PEDFpep抑制VEGF所誘發(fā)的血管通透性由于PEDF的神經營養(yǎng)/神經保護活性已知是44個氨基酸區(qū)域所造成24，26，因此我們欲知此區(qū)域是否亦擁有通透性調節(jié)的活性。PEDFpep是由人類PEDF的第78至121個氨基酸殘基所構成，將該PEDFpep進行玻璃體內注射以等莫耳量代替全長PEDF。該勝肽于螢光素血管攝影分析中有效地抑制VEGF所誘發(fā)的血管通透性(圖3a)。來自ACT相對應區(qū)域的46個氨基酸肽(位置73至118，命名為ACTpep)則對VEGF所誘發(fā)的血管通透性不具影響。
伊凡氏藍分析證實螢光素血管攝影的發(fā)現(xiàn)(圖3b)。PEDFpep阻斷83.7±17.1％的VEGF所誘發(fā)的對于伊凡氏藍-白蛋白的血管通透性。類似于全長的ACT，ACTpep不會抑制VEGF所誘發(fā)的血管通透性(-26.4±34.3％)。全長的PEDF與PEDFpep在等莫耳濃度下具有相似的效力。單因子變異數(shù)分析顯示在該二者的功效之間無顯著的差異。接近PEDF的N端的44個氨基酸區(qū)域賦予PEDF對于VEGF所誘發(fā)的血管通透性的抑制活性。
實施例4PEDFpep中的4個氨基酸殘基對于抑制VEGF所誘發(fā)的血管通透性是必要的為了確認生物活性所需的氨基酸殘基，我們比較ACT、HSP47及PEDF的序列及結晶構造(圖4a、b)，并選出PEDF中的4個候選氨基酸殘基作為關鍵部分進行評估。先前的研究工作24，25與我們的初步研究皆針對PEDF的第78至121個殘基作為活性位置。由結晶構造可知，44個氨基酸區(qū)域包括完整的二級結構元素s6B、hB及hC；一個hD轉角(turn)；及連接環(huán)(loop)31。s6B及hB皆埋于PEDF的內部。元素hC、hD及連接二者的環(huán)則大量地暴露出來，形成易接近的表面?；诖死碛?，我們將焦點著重于第99至121殘基，其包含hC、連接環(huán)及一個hD轉角。
我們推論關鍵氨基酸應為PEDF與該二種缺乏血管通透性的調節(jié)活性的絲氨酸蛋白酶抑制劑(ACT及HSP47)之間相異的殘基(圖4a)?；诖耍孀R出6個氨基酸。此6個氨基酸殘基中的二個被排除。精氨酸99被排除的原因在于將其改變成丙氨酸并不會改變PEDF的生物活性(未公開的結果)。脯氨酸116被排除的原因在于脯氨酸的角色是維持該勝肽骨架的結構。將PEDFpep中的其它4個殘基(谷氨酸鹽101、異亮氨酸103、亮氨酸112、絲氨酸115)進行改質來創(chuàng)造CHIMERApep。類似于丙氨酸掃描(alanine scanning)，將谷氨酸鹽101置換為丙氨酸(HSP47中的對應殘基)。將異亮氨酸103、亮氨酸112、絲氨酸115以谷氨酸鹽(ACT中的對應殘基)取代。在此3個殘基處，ACT及HSP47共有類似的富含電子的側鏈基團(HSP47中的谷氨酸鹽或天冬氨酸鹽)。
于螢光素血管攝影分析(圖4c)及伊凡氏藍分析(圖4d)中，CHIMERApep無法抑制VEGF所誘發(fā)的血管通透性。CHIMERApep抑制VEGF所誘發(fā)的伊凡氏藍-白蛋白滲漏率僅為16.0±27.8％。于單因子變異數(shù)分析測試中，對于VEGF所誘發(fā)的血管通透性的抑制性而言，CHIMERApep的功效顯著地低于PEDF。
實施例5PEDF的相同區(qū)域抑制VEGF164所刺激的細胞移動我們采用微趨化箱分析，以牛的視網膜的微血管內皮細胞(BRCEC)作為用于血管發(fā)生活性的代替品。PEDF以劑量相依的方式抑制VEGF所刺激的內皮細胞移動，其具有0.5nM的半數(shù)最大抑制濃度(IC50)(圖5a)。ACT及HSP47于相同濃度下對移動活性并不顯現(xiàn)出效果。類似于PEDF，PEDFpep以劑量相依的方式有效地抑制VEGF所刺激的BRCEC的移動，其具有3.0nM的IC50。ACTpep及CHIMERApep于相同分析中均不顯現(xiàn)出任何效果(圖5b)。因此，內皮細胞移動是取決于相同的4個氨基酸。
所有本文中所揭示的文獻及專利申請案的全部內容皆以參考資料的方式并入本申請案，其可用于本發(fā)明中。
熟悉此技藝者將輕易地了解本發(fā)明經過良好的修飾而達成目的，并得到如前述的結果及優(yōu)點，以及其中所固有的優(yōu)點。熟悉此技藝者將了解在不悖離本發(fā)明的精神及范疇的情況下，在實行本發(fā)明時可進行各種修改及變化。熟悉此技藝者所發(fā)現(xiàn)的其變化及其它用途皆涵蓋于且同等于本發(fā)明的精神，根據權利要求書的范疇所界定者。
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權利要求
1.一種治療患有涉及增加血管通透性的癥狀的病患的方法，包含對該病患投予治療有效量的PEDF。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，PEDF由序列識別號1的氨基酸序列所構成。
3.根據權利要求1所述的方法，其中，該癥狀為敗血癥。
4.根據權利要求1所述的方法，其中，該癥狀為急性呼吸窘迫綜合癥。
5.根據權利要求1所述的方法，其中，該癥狀為腎病綜合癥。
6.根據權利要求1所述的方法，其中，該癥狀為糖尿病性腎病變。
7.根據權利要求1所述的方法，其中，該癥狀為增生前糖尿病視網膜病變。
8.一種治療患有涉及增加血管通透性的癥狀的病患的方法，包含對該病患投予治療有效量的PEDF的44個氨基酸肽。
9.根據權利要求8所述的方法，其中，PEDF的44個氨基酸肽由序列識別號2的氨基酸序列所構成。
10.根據權利要求8所述的方法，其中，該癥狀為敗血癥。
11.根據權利要求8所述的方法，其中，該癥狀為急性呼吸窘迫綜合癥。
12.根據權利要求8所述的方法，其中，該癥狀為腎病綜合癥。
13.根據權利要求8所述的方法，其中，該癥狀為糖尿病性腎病變。
14.根據權利要求8所述的方法，其中，該癥狀為增生前糖尿病視網膜病變。
15.一種治療患有涉及增加血管通透性的癥狀的病患的方法，包含對該病患投予治療有效量的PEDF的44個氨基酸肽的同源物，其中，氨基酸殘基中第101個氨基酸位置的谷氨酸、第103個氨基酸位置的異亮氨酸、第112個氨基酸位置的亮氨酸、及第115個氨基酸位置的絲氨酸皆不改變。
16.根據權利要求15所述的方法，其中，該同源物由PEDF的44個氨基酸肽的同源序列所構成，該同源序列由序列識別號3的氨基酸序列所構成。
17.根據權利要求15所述的方法，其中，該癥狀為敗血癥。
18.根據權利要求15所述的方法，其中，該癥狀為急性呼吸窘迫綜合癥。
19.根據權利要求15所述的方法，其中，該癥狀為腎病綜合癥。
20.根據權利要求15所述的方法，其中，該癥狀為糖尿病性腎病變。
21.根據權利要求15所述的方法，其中，該癥狀為增生前糖尿病視網膜病變。
23.一種治療患有涉及增加血管通透性的癥狀的病患的方法，包含對該病患投予治療有效量的活化PEDF受體的藥劑。
24.根據權利要求23所述的方法，其中，該藥劑為小分子。
25.根據權利要求23所述的方法，其中，該癥狀為敗血癥。
26.根據權利要求23所述的方法，其中，該癥狀為急性呼吸窘迫綜合癥。
27.根據權利要求23所述的方法，其中，該癥狀為腎病綜合癥。
28.根據權利要求23所述的方法，其中，該癥狀為糖尿病性腎病變。
29.根據權利要求23所述的方法，其中，該癥狀為增生前糖尿病視網膜病變。
30.一種在組織內降低血管通透性的方法，該方法包含在PEDF足以降低該組織內的血管通透性的條件下，對連接該組織的內皮細胞提供外源的該PEDF。
31.一種在組織內降低血管通透性的方法，該方法包含在PEDF的44個氨基酸肽足以降低該組織內的血管通透性的條件下，對連接該組織的內皮細胞提供外源的該PEDF的44個氨基酸肽。
32.一種在組織內降低血管通透性的方法，該方法包含在PEDF的44個氨基酸肽足以降低該組織內的血管通透性的條件下，對連接該組織的內皮細胞提供外源的該PEDF的44個氨基酸肽的同源物。
33.根據權利要求32所述的方法，其中，該同源物的氨基酸在下列氨基酸殘基處不改變第101個氨基酸位置的谷氨酸、第103個氨基酸位置的異亮氨酸、第112個氨基酸位置的亮氨酸、及第115個氨基酸位置的絲氨酸。
34.根據權利要求30至33所述的方法，其中，該組織為眼部組織。
35.根據權利要求30至33所述的方法，其中，該組織為肺部組織。
36.根據權利要求30至33所述的方法，其中，該組織為腎臟組織。
37.一種治療患有涉及增加血管發(fā)生的癥狀的病患的方法，包含對該病患投予治療有效量的PEDF的44個氨基酸肽。
38.根據權利要求37所述的方法，其中，PEDF的44個氨基酸肽由序列識別號2的氨基酸序列所構成。
39.根據權利要求37所述的方法，其中，該癥狀為癌癥。
40.根據權利要求37所述的方法，其中，該癥狀為增生前糖尿病視網膜病變。
41.一種治療患有涉及增加血管發(fā)生的癥狀的病患的方法，包含對該病患投予治療有效量的PEDF的44個氨基酸肽的同源物，其中，氨基酸殘基中第101個氨基酸位置的谷氨酸、第103個氨基酸位置的異亮氨酸、第112個氨基酸位置的亮氨酸、及第115個氨基酸位置的絲氨酸皆不改變。
42.根據權利要求15所述的方法，其中，該同源物由PEDF的44個氨基酸肽的同源序列所構成，該同源序列由序列識別號3的氨基酸序列所構成。
43.根據權利要求15所述的方法，其中，該癥狀為癌癥。
44.根據權利要求15所述的方法，其中，該癥狀為增生前糖尿病視網膜病變。
45.一種治療患有涉及增加血管發(fā)生的癥狀的病患的方法，包含對該病患投予治療有效量的活化PEDF受體的藥劑。
46.根據權利要求23所述的方法，其中，該藥劑為小分子。
47.根據權利要求23所述的方法，其中，該癥狀為癌癥。
48.根據權利要求23所述的方法，其中，該癥狀為增生前糖尿病視網膜病變。
49.一種在組織內降低血管發(fā)生的方法，該方法包含在PEDF的44個氨基酸肽足以降低該組織內的血管通透性的條件下(under conditionssufficient for said PEDF 44 AA peptide to vascular permeabilitywithin said tissue)，對連接該組織的內皮細胞提供外來的該PEDF的44個氨基酸肽。
50.一種在組織內降低血管發(fā)生的方法，該方法包含在PEDF的44個氨基酸肽足以降低該組織內的血管通透性的條件下(under conditionssufficient for said PEDF 44 AA peptide to vascular permeabilitywithin said tissue)，對連接該組織的內皮細胞提供外源的該PEDF的44個氨基酸肽的同源物。
51.根據權利要求50所述的方法，其中，該同源物的氨基酸在下列氨基酸殘基處不改變第101個氨基酸位置的谷氨酸、第103個氨基酸位置的異亮氨酸、第112個氨基酸位置的亮氨酸、及第115個氨基酸位置的絲氨酸。
52.根據權利要求49至51所述的方法，其中，該組織為眼部組織。
53.根據權利要求49至51所述的方法，其中，該組織為癌癥組織。
54.一種治療患有涉及神經病變的癥狀的病患的方法，包含對該病患投予治療有效量的PEDF的44個氨基酸肽。
55.根據權利要求8所述的方法，其中，PEDF的44個氨基酸肽由序列識別號2的氨基酸序列所構成。
56.根據權利要求54所述的方法，其中，該癥狀為神經退化性疾病。
57.根據權利要求54所述的方法，其中，該癥狀由局部缺血所造成。
全文摘要
本發(fā)明是有關于治療涉及增加血管通透性或增加血管生成的癥狀的病患的方法，該方法包括對該病患投予PEDF、PEDF 44AA勝肽、PEDF 44AA的同源物的治療有效量或活化該PEDF受體的藥劑，PEDF44AA的同源物其中不變的氨基酸殘基是第101個氨基酸位置的谷氨酸，第103個氨基酸位置的異亮氨酸，第112個氨基酸位置的亮氨酸，及第115個氨基酸位置的絲氨酸。用于治療的癥狀包括但不限于，敗血癥急性呼吸窘迫綜合癥、腎病綜合癥、糖尿病腎病變和增生性糖尿病視網膜病變、癌癥或增生前糖尿病視網膜病變。
文檔編號A61K38/18GK101014358SQ200480039358
公開日2007年8月8日 申請日期2004年10月29日 優(yōu)先權日2003年10月29日
發(fā)明者P·童, H·劉 申請人:約翰·霍普金斯大學