專利名稱：一種三角帆蚌的可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因、蛋白及其抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種三角帆蛘的可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(SolubleTNF-related apoptosis-inducing ligand, sTRAIL)基因、蛋白及其抗體的制備，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducingligand, TRAIL)，又稱為凋亡素 2 配體(AP02 ligand, AP0-2L) (Wiley et al. , 1995 ；Pittiet al.，1996)，其胞外結(jié)構(gòu)域在金屬蛋白酶的作用下，可降解形成可溶性的細(xì)胞因子sTRAILCSoluble TRAIL )，TRAIL 具有 TRAIL 的生物學(xué)功能(Bodmer et al.，2000)。TRAIL 是TNF超家族中一類重要的跨膜細(xì)胞因子(Wiley et al. , 1995 ；Pitti et al.，1996)，可選擇性地引起人類大多數(shù)腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡包括腦、腎、肝、肺、胃、結(jié)腸、乳腺、前列腺、胰腺、膽管、宮頸、皮膚和造血系統(tǒng)來(lái)源的腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)或僅具有極低的毒性(Dphil，2007;馬遠(yuǎn)方，2007)，以TRAIL為靶點(diǎn)的分子治療已成為肺癌等癌癥治療的新熱點(diǎn)。我國(guó)是水產(chǎn)大國(guó)，三角帆蛘等貝類養(yǎng)殖是我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)之一。三角帆蛘不僅肉質(zhì)細(xì)嫩、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，還具有抗癌降血脂等功效。目前國(guó)內(nèi)外通過(guò)提取三角帆蛘等貝類體內(nèi)的多糖等生物活性物質(zhì)，并開(kāi)發(fā)出了保健食品。但以上多為多糖等物質(zhì)的混合物，是免疫調(diào)節(jié)產(chǎn)品，并且基礎(chǔ)研究資料少，對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用較低，對(duì)其功效及副作用等所知不多。因此利用基因工程技術(shù)開(kāi)發(fā)三角帆蛘中sTRAIL蛋白抗體產(chǎn)品，有助于新型抗腫瘤藥物的研制與開(kāi)發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種三角帆蛘的可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(Soluble TNF-related apoptosis-inducing ligand, sTRAIL)基因、蛋白及其抗體的制備，設(shè)計(jì)了擴(kuò)增三角帆蛘中sTRAIL編碼序列的寡聚核苷酸引物，獲得了三角帆蛘sTRAIL基因編碼框全序列，并通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體,表達(dá)并純化了可溶性的sTRAIL蛋白質(zhì)產(chǎn)品，并制備了其多克隆兔抗血清。為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的解決方案是
一種三角帆蛘的可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因，具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列?！N三角帆蛘的可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白質(zhì)，具有SEQ IDNO. 2所示的氨基酸序列。—種三角帆蛘的可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的抗體的制備方法，包括如下步驟
1)以三角帆蛘血淋巴細(xì)胞的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，擴(kuò)增sTRAIL蛋白基因的寡聚核苷酸引物，所述的引物具有SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列的，利用PCR技術(shù)獲得具有SEQ ID NO. I所示的sTRAIL的基因編碼框核苷酸序列；
2)利用DNA重組技術(shù)將sTRAIL基因編碼框的序列片段克隆到合適的pMD19_T載體(Takara公司，日本)中，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，與經(jīng)同樣酶切的pET_28 (a)原核表達(dá)載體(Novagen公司，美國(guó))連接，利用PCR法篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序鑒定獲得編碼框正確的重組表達(dá)載體 pET-28a (+) -sTRAIL ；
3)將陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-28(a)_ sTRAIL轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌萬(wàn).coli Rossetta (DE3)(天根公司，中國(guó))，用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG) (Sigma公司，美國(guó))誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行檢測(cè)；
4)將陽(yáng)性表達(dá)菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，利用蛋白質(zhì)純化試劑盒(Merck公司，德國(guó))分離純化重組蛋白質(zhì)，制得的重組蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO. 2所不的氣基酸序列；
5)用純化得到sTRAIL重組蛋白免疫新西蘭大白兔，經(jīng)過(guò)一次初始免疫和三次加強(qiáng)免疫后，頸動(dòng)脈取血，分離血清，獲得sTRAIL多克隆兔抗血清。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明設(shè)計(jì)了擴(kuò)增三角帆蛘中sTRAIL編碼序列的寡聚核苷酸引物，獲得了三角帆蛘sTRAIL基因編碼框全序列，并通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體,表達(dá)并純化了可溶性的sTRAIL蛋白質(zhì)產(chǎn)品，并制備了其多克隆兔抗血清，有助于新型抗腫瘤藥物的研制與開(kāi)發(fā)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
本實(shí)施例的一種三角帆蛘的可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因，具有SEQ IDNO. I所示的核苷酸序列。一種三角帆蛘的可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白質(zhì)，具有SEQ IDNO. 2所示的氨基酸序列。一種三角帆蛘的可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的抗體的制備方法，包括如下步驟
I、PCR擴(kuò)增剪取三角帆蛘的外套膜組織，用液氮研磨后，用TRIzoI (上海生工，加拿大)法提取三角帆蛘的的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海生工，加拿大)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得三角帆蛘的cDNA。以該cDNA為模板，設(shè)計(jì)擴(kuò)增sTRAIL蛋白基因的引物，所述的引物具有SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列，將設(shè)計(jì)好擴(kuò)增sTRAIL蛋白基因的寡聚核苷酸引物序列作為目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行嵌套聚合酶鏈?zhǔn)絇CR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)的參數(shù)為94°C預(yù)變性5min ;35個(gè)循環(huán)94°C 45sec, 58°C 45sec, 72°C 55 sec ;72°C 10 min ;獲得具有SEQ IDNO. I所示的sTRAIL的基因編碼框核苷酸序列。2.重組表達(dá)載體pET-28a(+)_sTRAIL的構(gòu)建將PCR擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與PMD19-T載體(Takara公司，日本)相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(天根生物，德國(guó))，涂布含氨芐青霉素的LB (上海生工，加拿大)篩選平板，挑取幾個(gè)單克隆進(jìn)行酶切和PCR鑒定；取一陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，以堿裂解法抽提質(zhì)粒，將純化后的質(zhì)粒以及和ZAoI限制性內(nèi)切酶(上海生工，加拿大)雙酶切，再插入經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的pET-28a(+)載體(Novagen公司，美國(guó))的相應(yīng)位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3) (Novagen，美國(guó))。利用PCR法篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序鑒定獲得編碼框正確的重組表達(dá)載體pET-28a (+)-sTRAIL。3.重組蛋白的表達(dá)與鑒定將陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET_28a(+)-sTRAIL轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌萬(wàn).coli Rossetta (DE3 )(天根公司，中國(guó))感受態(tài)，涂布含卡那霉素的LB(上海生工，加拿大)平板，37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取一個(gè)單克隆菌落，轉(zhuǎn)入LB-Kan培養(yǎng)液(上海生工，加拿大)，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取適量菌液，按1:100的比例擴(kuò)大培養(yǎng)至OD6c 為O. 4-0.5時(shí)，將菌液分為若干等份，不加或分別加入異丙基硫代半乳糖苷IPTG(Sigma公司，美國(guó))誘導(dǎo)表達(dá)，使其終濃度在0-1. O mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，離心收集細(xì)菌。細(xì)菌經(jīng)超聲波裂解后(300W，20分鐘，超聲2秒鐘，間隔2秒鐘)，離心分離上清液和沉淀，分別上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳(SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)鑒定目的蛋白。4、重組蛋白質(zhì)的純化將步驟3)中重組蛋白的表達(dá)為陽(yáng)性的表達(dá)菌液擴(kuò)大培養(yǎng)， 按上述方法進(jìn)行超聲處理后，將破碎過(guò)的菌液過(guò)Ni-NTA親和層析柱(Novagen公司，美國(guó))，sTRAIL重組蛋白結(jié)合在柱上,其它蛋白不能結(jié)合而流失；再利用蛋白試劑盒(Merck公司，德國(guó))中提供的洗脫液，將sTRAIL蛋白洗脫下來(lái)，即得所需純化的重組蛋白；采用12%的SDS-PAGE進(jìn)行電泳鑒定；制得的重組蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。5、蛋白質(zhì)定量將純化鑒定過(guò)的蛋白質(zhì)按Brad-ford法進(jìn)行定量(Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities ofprotein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976，72:248-254)o6、sTRAIL多克隆兔抗血清的制備將純化蛋白質(zhì)定量后，取適量蛋白，挑選2只體重約2 kg的健康新西蘭大白兔(雄兔)，進(jìn)行多克隆抗體制備。用純化所得的pET-28a(+)-sTRAIL為抗原加入等體積的佐劑充分乳化后免疫兔子，采用多點(diǎn)背部皮下注射，共免疫四次。(I)免疫前，從耳靜脈處收集3_5ml正常血清作為抗體檢測(cè)時(shí)的陰性對(duì)照。(2)用剪刀剪去兔子背部部分兔毛，酒精消毒后進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射。(3)初次免疫取約I mg抗原，加入等體積的弗氏完全佐劑充分乳化后注射，背部選取8-10個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)注射約0. I ml ;
(4)第二次免疫間隔14天后進(jìn)行，抗原量為0.5mg，加入等體積弗氏不完全佐劑充分乳化后注射，方法同上；
(5)第三、四次免疫間隔7天后按同樣方法，進(jìn)行第四次免疫后，從耳靜脈采血Iml分離血清，用雙相瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行免疫血清的抗體效價(jià)檢測(cè)，效價(jià)應(yīng)達(dá)到1:16以上才能放血；
(6)血清分離第四次免疫后第4天，待抗體效價(jià)達(dá)到要求后，進(jìn)行頸動(dòng)脈采血并分離血清。分裝后，保存于_80°C。7、抗體效價(jià)檢測(cè)免疫后的兔抗血清用ELISA方法檢測(cè)1:5000稀釋的多克隆兔抗血清的效價(jià)，具體操作步驟如下
(I)包被與封閉用包被液將蛋白稀釋至1-10 μ g/ml ;在每個(gè)聚苯乙烯酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中加入O. I ml，4°C過(guò)夜；棄去孔內(nèi)溶液，用5%的脫脂奶粉封閉2 h，PBST洗3次，每次
5min。 (2)加樣加入用PBST稀釋指定倍數(shù)的待檢抗血清于O. I ml于上述已包被的反應(yīng)孔中，37°C孵育I h ；PBST洗3次，每次5 min (同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔)。
(3)加酶標(biāo)抗體于各反應(yīng)孔中，加入O. Iml新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體，37°C孵育I h，PBST洗3次，每次5 min。 (4)顯色于各反應(yīng)孔中加入新鮮配制的O. I ml OPD底物溶液，37°C，顯色15-30分鐘。 (5)反應(yīng)終止于各反應(yīng)孔中分別加入O. 05 ml反應(yīng)終止液(2 M)。 (6)數(shù)據(jù)測(cè)定與計(jì)算用酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)各孔的OD值，大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2. I倍，即為陽(yáng)性?？贵w效價(jià)計(jì)算公式為樣本OD值-空白對(duì)照OD值)/(陰性對(duì)照OD值-空白對(duì)照OD值。通過(guò)本實(shí)施例設(shè)計(jì)了擴(kuò)增三角帆蛘中sTRAIL編碼序列的寡聚核苷酸引物，獲得了三角帆蛘sTRAIL基因編碼框全序列，并通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體，表達(dá)并純化了可溶性的sTRAIL蛋白質(zhì)產(chǎn)品，并制備了其多克隆兔抗血清，有助于新型抗腫瘤藥物的研制與開(kāi)發(fā)。SEQ ID NO. IATGGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGAGTAGCAGCTCACATAACTGGGACCAGAGGAAGAAGCAACACATTG
TCTTCTCCAAACTCCAAGAATGAAAAGGCTCTGGGCCGCAAAATAAACTCCTGGGAATCATCAAGGAGTGGGCATTCATTCCAGAGCAACTTGCACTCGAGGAATGGTGAACTGGTCATCCATGAAAAAGGGTTTTACTACATCTATTCCCAAACATACTTTCGATTTCAGGAGGAAATAAAAGAAAACGCAAAGAACGACAAACAAATGGTCCAATATATTTACAAATACACAAGTTATCCTGACCCTATATTGTTGATGAAAAGTGCTAGAAATAGTTGTTGGTCTAAAGATGCAGAATATGGACTCTATTCCATCTATCAAGGGGGAATATTTGAGCTTAAGGAAAATGACAGAATTTTTGTTTCTGTAACAAATGAGCACTTGATAGACATGGACCATGAAGCCAGTTTTTTCGGGGCCTTTTAASEQ ID NO. 2
MVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFQSNLHSRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENAKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFSEQ ID NO. 3
sTRAILf :5’ 一 GAATGTTCAGAGCCTATTCC —3’
Adaptorp :5’ 一 CTG ATC TAG AGG TAC CGG ATC C TTTTTTTTTTTTTTT—3’
權(quán)利要求
1.一種三角帆蛘的可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因，其特征在于具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列。
2.一種三角帆蛘的可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白質(zhì)，其特征在于具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
3.—種如權(quán)利要求I所述的三角帆蛘的可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的抗體的制備方法，其特征在于包括如下步驟 1)以三角帆蛘血淋巴細(xì)胞的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，擴(kuò)增sTRAIL蛋白基因的寡聚核苷酸引物，所述的引物具有SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列的，利用PCR技術(shù)獲得具有SEQ ID NO. I所示的sTRAIL的基因編碼框核苷酸序列； 2)利用DNA重組技術(shù)將sTRAIL基因編碼框的序列片段克隆到合適的pMD19_T載體中，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，與經(jīng)同樣酶切的pET-28 (a)原核表達(dá)載體連接，利用PCR法篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序鑒定獲得編碼框正確的重組表達(dá)載體pET-28a(+)-sTRAIL ； 3)將陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET-28(a)_ sTRAIL轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌疋coli RossettaiM ,)，用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行檢測(cè)； 4)將陽(yáng)性表達(dá)菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，利用蛋白質(zhì)純化試劑盒分離純化重組蛋白質(zhì)，制得的重組蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO. 2所不的氣基酸序列； 5)用純化得到sTRAIL重組蛋白免疫新西蘭大白兔，經(jīng)過(guò)一次初始免疫和三次加強(qiáng)免疫后，頸動(dòng)脈取血，分離血清，獲得sTRAIL多克隆兔抗血清。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種三角帆蚌的可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體基因，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；一種三角帆蚌的可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白質(zhì)，具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；及其抗體的制備。通過(guò)本發(fā)明得到三角帆蚌sTRAIL蛋白抗體產(chǎn)品，有助于新型抗腫瘤藥物的研制與開(kāi)發(fā)。
文檔編號(hào)C12N15/28GK102965379SQ201210480470
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月23日
發(fā)明者楊受保 申請(qǐng)人:紹興文理學(xué)院