專利名稱：組織因子的抑制劑或拮抗劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織因子，TF，的抑制劑或拮抗劑在制備治療或預防糖尿病或者糖尿病相關(guān)疾病的藥物中的用途。該TF抑制劑或拮抗劑主要用于治療I或II型糖尿病以及由II型糖尿病引起的代謝綜合癥患者。該抑制劑或拮抗劑是一種能夠部分或者完全抑制TF產(chǎn)生的制劑，例如抗TF的抗體或者能夠作用于TF基因的反義構(gòu)建體。。
在前一個案子(I型糖尿病)中，該抑制劑或拮抗劑被用來與朗格罕胰島移植聯(lián)合應(yīng)用，來提高患者的胰島存活率。在后邊的案子中，該抑制劑或拮抗劑用來預防在II型糖尿病患者身上出現(xiàn)的動脈硬化和心血管疾病。
背景技術(shù)：
止血對于生存是至關(guān)緊要的。任何對于凝血平衡的干擾例如血管壁的損傷，會引起凝血系統(tǒng)立即活化。在體內(nèi)，凝血系統(tǒng)主要被一種分子量為47kD的跨膜糖蛋白，組織因子(TF)所引發(fā)，其中TF是作為因子VII被剪切為VIIa過程中和凝血過程組織因子(外分泌)途徑中VIIa蛋白水解功能的共作用因子來起作用的，TF還可以作為受體來起作用。TF屬于細胞因子受體超家族并且已經(jīng)被證明，當其與因子VIIa組成復合物之后可以引發(fā)在血管發(fā)生，血細胞滲出和炎癥反應(yīng)中的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導。TF在血管外膜細胞和像胎盤，腦和肺等這樣血管豐富的組織中有持續(xù)的表達。通常，像內(nèi)皮細胞和單核細胞這樣暴露在血液中的細胞不表達TF，但是在像LPS，免疫復合物和細胞因子這樣特定的炎癥刺激下，可以誘導這些細胞表達TF。在血液中TF被組織因子途徑抑制劑(TFPI)嚴格的調(diào)控。一些最近的文章表明在血液中隱藏的少量TF能夠被一些尚未識別的刺激活化。血液攜帶TF被認為能夠快速激活凝血級聯(lián)系統(tǒng)，同時可能是在動脈硬化斑塊中發(fā)現(xiàn)的TF的來源。血液攜帶TF的來源至今仍是未知的。
在高胰島素血癥/高血糖和凝血級聯(lián)的激活之間存在著一種潛在的耦合關(guān)系，Ceriello等報告在進食后凝血活性會升高。研究進一步強調(diào)灌注葡萄糖可以誘導瞬時的FVIIa生成的增加，這反映了TF途徑的激活，而且灌注葡萄糖也可以增加受試者凝血酶的生成。這種影響在II型糖尿病患者中更加明顯，這種患者的高血糖/高胰島素的過程更長。值得注意的是在高血糖水平相同的情況下同時灌注胰島素可以降低內(nèi)源胰島素的分泌，阻遏TF途徑的活性。不僅患有II型糖尿病的個體而且那些具有高水平BMI的個體，即，有胰島素阻抗因而循環(huán)胰島素的生成和水平增加的患者，都具有升高的TF途徑活性。這種在II型糖尿病患者的高凝狀態(tài)為這類患者糖尿病并發(fā)動脈疾病的高患病率提供了一種可信的解釋。
在臨床胰島移植和實驗研究中，當胰島被暴露在ABO相容的血液中會引起凝固反應(yīng)，這是TF和胰島之間的另外一種潛在的聯(lián)系。這種凝血反應(yīng)被定義為血液介導的快速炎癥反應(yīng)(IBMIR)，其特征為以凝血系統(tǒng)和補體系統(tǒng)的活化開始，快速的結(jié)合并且活化血小板，然后結(jié)合白細胞，共同來破壞胰島的完整性，導致形成一個環(huán)繞胰島的血栓。
多年以來臨床胰島移植大約有10％的成功率，這是以移植一年以后不再依賴胰島素作為標準的。去年Shapiro等在這方面獲得突破，他們發(fā)現(xiàn)通過反復的移植不同供應(yīng)者的胰島，可以使患者不再依賴胰島素。在隨后的研究中這個研究組發(fā)現(xiàn)，盡管患者被移植了不同供應(yīng)者的胰島但其β-細胞的功能只有正常人的20％。綜合來說，這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)其中一定有一個與移植相反的過程，這個相反的過程很可能是移植組織的丟失。
發(fā)明概述本發(fā)明者驚奇地發(fā)現(xiàn)組織因子是在人朗格罕胰島中表達的。在大部分的胰島的內(nèi)分泌細胞中發(fā)現(xiàn)組織因子，但在那些外分泌組織中卻沒有。TF是由胰島的內(nèi)分泌細胞產(chǎn)生的(“胰島產(chǎn)生TF”)，這個意想不到的發(fā)現(xiàn)表明TF的分泌和胰島素的分泌存在著一定的聯(lián)系。這種TF很有可能與II型糖尿病或其前期患者以及糖耐量受損的醫(yī)療對象患動脈硬化和心血管疾病的高發(fā)病率有關(guān)。因此，一種針對于TF從朗格罕胰島中的產(chǎn)生，釋放或者至少針對于其活性形式的抑制劑或拮抗劑可以用來預防這些患者的動脈硬化和心血管疾病。
有理由相信IBMIR可以解釋在臨床胰島移植中組織丟失如何開始的。到目前為止，引發(fā)IBMIR的原因還沒有被發(fā)現(xiàn)，但是本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)在體外IBMIR能夠被一種凝血酶抑制因子Melagatran所消除，這意味著IBMIR嚴格的依賴于凝血酶的活化。凝血酶的產(chǎn)生有兩種途徑組織因子途徑(外部途徑)和一種自身的擴增循環(huán)途徑。因此TF在胰島中局部產(chǎn)生是最有可能的IBMIR的引發(fā)因素。因此一種針對于TF的抑制劑或拮抗劑能夠抑制或者減弱IBMIR，這種方案和胰島移植共用可以通過增加胰島的存活和避免對移植的胰島的排斥反應(yīng)來治療I型糖尿病。
因此，本發(fā)明的第一個方面涉及組織因子，TF，的抑制劑或拮抗劑在制備治療或預防糖尿病或者糖尿病相關(guān)疾病的藥物中的用途或方法?！疤悄虿』蛱悄虿∠嚓P(guān)疾病”包括糖耐量受損或由于胰島素的非正常產(chǎn)生(例如胰島素的過量產(chǎn)生)而引起的胰島素抵抗以及由于這樣的代謝條件引起的疾病例如動脈硬化，心血管疾病(例如急性心肌梗塞)和腦血管疾病(例如出血或梗塞)。
該抑制劑/拮抗劑可以是能在DNA、RNA或者蛋白質(zhì)水平上影響TF的任何制劑，可以在已知的TF抑制劑中挑選，但不局限于這個范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的全文中，“對TF的抑制作用”表示對于TF特別是其活性形式從胰島中的產(chǎn)生以及釋放的完全或者部分抑制作用。本發(fā)明進一步包括對釋放的胰島產(chǎn)生TF的抑制作用。在這里“抑制劑”代表能夠起到這類抑制作用的物質(zhì)。
如上所述，本發(fā)明的第一個實施方案是用于生產(chǎn)一種能夠用來與胰島素產(chǎn)生細胞移植結(jié)合使用的藥物，以此來治療胰島素依賴的糖尿病即IDDM的患者。
第二個實施方案是利用TF的抑制劑或拮抗劑來生產(chǎn)能夠治療動脈硬化或心血管疾病的藥物。游離的TF結(jié)合在動脈硬化斑上并且增加患血栓癥，例如心肌梗塞的風險。希望這種應(yīng)用可以在對II型糖尿病及其前期患者治療中能夠起非常重要的作用。
該TF的抑制劑或拮抗劑可以是一種TF抗體，這種抗體具有能結(jié)合TF特別是胰島產(chǎn)生的TF的生物效應(yīng)。
該TF的抑制劑或拮抗劑也可以是一種能夠阻遏TF合成的物質(zhì)例如可以阻遏TF基因的反義構(gòu)建體。
在任何一種實施方案中，該TF的抑制劑或拮抗劑都是與抗凝劑，例如肝素或其部分或其衍生物一起使用的。其他可能聯(lián)合應(yīng)用的制劑包括凝血酶抑制劑和/或血小板抑制劑。
在第二方面，本發(fā)明是與治療或預防糖尿病或糖尿病相關(guān)疾病的方法相關(guān)的，包括將TF抑制劑或拮抗劑作用于需要的受試者。例如該方法可以用來治療糖尿病或者糖耐量受損的患者。該方法包括加入一種能夠部分或者完全抑制胰島產(chǎn)生或者釋放TF的抗TF制劑。
在第三個方面，本發(fā)明涉及抑制劑或拮抗劑本身，其具有部分或者完全抑制胰島產(chǎn)生或者釋放的TF的特性。
發(fā)明詳述以下將結(jié)合附圖描述本發(fā)明，所涉及的附圖內(nèi)容簡要介紹如下

圖1a圖.用mAb#4509染色的人類胰腺的切片顯示了一個染色很清楚的胰島。
b圖.用mAb抗TF#4509染色的分離的人類胰島的切片。TF在大部分的胰島細胞內(nèi)都有出現(xiàn)。
c圖.從三個個體中分離純化的人胰島，并且用mAb抗TF#4503或者4509進行免疫沉淀。隨后進行SDS-PAGE和Western blot，所用抗體為兔多抗抗TF#4502。1-6道分別代表三對分別用mAb4503(1，3，5道)和mAb4509(2，4，6道)免疫沉淀下來的TF；7道是單獨沉淀的抗體。
d圖.對于從6個個體分離的人胰島進行RT-PCR(2-7道)得到了一個0.3kb的產(chǎn)物，第7道包括分子量標準。
e圖.人胰島培養(yǎng)0，2，7天(n＝3)時，對其中的TF的定量。
圖2顯示的是對分離的胰島用mAb抗TF#4509進行免疫金標記后的電鏡照片。所有的金顆粒直徑為15納米。所有的條表示100納米。
a)β-細胞內(nèi)滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的TF(箭所示，arrow)(放大54000倍)b)用金顆粒顯示α-細胞內(nèi)高爾基體中的TF，分別顯示了在高爾基疊層(箭頭，arrowheads)，在高爾基順面產(chǎn)生的暫時性小泡(大箭，large arrow)和在分泌小顆粒(小箭，small arrow)中的TF。(放大36000倍)c)儲存在β-細胞顆粒核心區(qū)中的TF(箭所示，arrow)(放大36000倍)d)在α-細胞顆粒內(nèi)儲存和隨機分布的TF(箭所示，arrow)(放大54000倍)圖3a圖.由人胰島引發(fā)的凝固時間中的抗TF的作用。4微升的人胰島分別用培養(yǎng)基，無抑制作用的mAb抗TF#4503(對照mAb)和有抑制作用的抗TF#4509在室溫下預處理10分鐘。之后，胰島與250微升的無抗凝血活性的人血漿孵育，凝固時間用ReoRoxTM設(shè)備檢測(n＝7)。在管狀環(huán)模型中胰島誘導IBMIR發(fā)生。胰島分別用培養(yǎng)基(空心方塊)，無抑制作用mAb抗TF#4503(對照mAb)(空心三角)和有抑制活性的抗TF#4509(實心圓)在室溫下預處理10分鐘，無胰島培養(yǎng)基用實心的菱形代表。之后，將4微升的人胰島加入到5毫升的無抗凝血活性的人類ABO相容血液然后在管狀環(huán)中孵育。IBMIR分別用b)血小板計數(shù)，用EIAs測定的c)TAT，d)F1+2，和e)FXIa-AT來檢測。
圖4250微升人檸檬酸鹽血漿與不同體積的培養(yǎng)人胰島的培養(yǎng)基混合。在血漿凝固后利用ReoRoxTM估定凝固時間。圖a代表將同一批胰島的培養(yǎng)基稀釋至一系列濃度，圖b代表分別用PBS、mAb4503或mAb4509(平均值±SEM)處理的三個不同個體的60微升培養(yǎng)基。
圖5由人胰島引發(fā)的IBMIR被抗TF和iFVIIa所阻遏。
管狀環(huán)模型內(nèi)由人胰島誘導的IBMIR。胰島分別用PBS(●)，無抑制活性的抗TFmAb4503(對照mAb；▲)或者有抑制活性的抗TFmAb4509(□)預處理?！蟠頍o胰島培養(yǎng)基。胰島在肝素化的管狀環(huán)中與無抗凝血活性的人的ABO相容血液孵育。IBMIR分別用a)血小板計數(shù)，b)酶免疫測定TAT和c)FXIa-AT來檢測。(與僅有胰島的環(huán)來比較*p＜0.05)。可以選擇在有(□)或者沒有(●)40pmol/L的iFVIIa的存在下孵育胰島?！蟠頍o胰島的培養(yǎng)基。IBMIR利用d)血小板計數(shù)，用EIAs測定的e)TAT和f)FXIa-AT來檢測。(與僅有胰島的環(huán)來比較*p＜0.05)圖6在含有煙堿的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后細胞內(nèi)TF的濃度并與對照比較。
圖7TAT的產(chǎn)生，可以反應(yīng)凝血活性。
圖8分別在含有依那普利(40微克/毫升)，環(huán)孢霉素A(10微摩爾/升)，L-精氨酸(1毫摩爾/升)，煙堿(10毫摩爾/升)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞內(nèi)TF的濃度并與對照比較。
發(fā)明詳述人胰島中TF的表達和產(chǎn)生用mAb4509染色顯示在人類胰腺內(nèi)TF的存在(圖1a)。TF分布在絕大部分但不是所有的胰島內(nèi)分泌細胞中。染色顯示TF在大部分的胰島細胞內(nèi)呈顆粒分布。從人類胰腺分離的胰島細胞內(nèi)的TF的分布也很相似，這表明分離的過程不影響TF的表達(圖1b)。還發(fā)現(xiàn)TF在較大血管的外膜中存在。內(nèi)皮細胞沒有被染色，這表明，TF不會由于一些炎癥信號而表達。在外分泌胰腺的腺泡細胞內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)TF。
為了確定人胰島中有TF的存在，利用兩種不同的mAb(#4503和4509)抗TF抗體從純化的胰島裂解液中抽提蛋白。抗體結(jié)合的蛋白用SDS-PAGE分離并隨后進行Western blot。沉淀的蛋白用抗TF的多抗進行鑒定。在相似的實驗中，TF用抗TF的多抗進行抽提，并用兩種mAb中的一種進行鑒定(結(jié)果未顯示)。多肽的分子量是47kDa與TF的分子量相同(圖1c)。每個培養(yǎng)的胰島中的TF的量是用ELISA對裂解液中TF進行定量后計算所得(圖1d)。在分離胰島后直接測量，含量為13pg/胰島。在培養(yǎng)中含量會有臨時的增加，有三次在第二天增加(42pg/胰島)，但是可以確認在第七天會下降(21pg/胰島)。對于分離純化的胰島進行RT-PCR也驗證了在mRNA水平上TF有表達(圖1e)。
人胰島中TF的電鏡檢測用電子顯微鏡觀察兩個正常的胰臟中原位的胰島和兩批分離的胰島中的TF，用低溫處理的Lowicryl包埋樣品然后進行免疫金標記(圖2)。雖然由于組織沒有用鋨處理，所以內(nèi)分泌細胞的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)不是最佳的，但是在所有檢測的胰島內(nèi)分泌細胞在超微結(jié)構(gòu)水平上得到了很好的保存。在原位和分離的胰島中，金顆粒顯示在α和β-細胞內(nèi)都有TF的存在。在這兩種細胞內(nèi)，TF都被定位在滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(圖2a)，高爾基體堆疊和高爾基體順面產(chǎn)生的暫時小囊泡(圖2b)和α，β-細胞的激素顆粒(圖2c和d)中。在β-細胞顆粒中，TF含量中等，尤其是在電子密度區(qū)，但是在α-細胞中TF的濃度更高，并且隨機的分布在細胞的整個基質(zhì)中。在δ或PP細胞中沒有產(chǎn)生TF的免疫反應(yīng)。實驗中所有的陰性對照都是負結(jié)果。
利用抗TF抗體阻遏IBMIR用粘度測定法發(fā)現(xiàn)在人胰島與無抗凝血活性的人血漿混合9.5分鐘之后會凝膠化而只加入緩沖液的對照60分鐘之內(nèi)沒有發(fā)生凝固，比較說明胰島能夠誘導凝血的活化(圖3a)。為了將TF在胰島中的表達和胰島的促凝血活性聯(lián)系起來，我們試著用抗TF的抗體來阻遏胰島的促凝血活性。在有抑制活性的抗TF(mAb4509)的存在下凝膠化被推遲到53分鐘，推遲了5.6倍。而加入針對TF無功能表位的抗體(mAb4503)凝膠化被推遲了1.8倍。
為了觀察IBMIR是否由TF引發(fā)的，用新鮮的人ABO相容血液對人胰島在管狀環(huán)模型中灌注30分鐘(圖3)。在這些胰島加入管狀環(huán)之前先把它們與抗TF抗體孵育10分鐘，然后洗三遍。15分鐘之內(nèi)，對照培養(yǎng)基和無抑制活性的抗TF(4503)的樣品發(fā)生凝固，但是在有抑制活性的抗TF(4509)的樣品中在觀察過程中凝固沒有發(fā)生。這反映在血小板消耗(血小板計數(shù))、一種血小板α-顆粒內(nèi)容物(b-血小板球蛋白)的釋放和凝血酶-抗凝血酶、凝血酶原片段1+2以及XIa-抗凝血酶因子復合物的形成都被4509所抑制而不能被4503所抑制(圖3；表格I)。這些結(jié)果表明IBMIR是由TF所引發(fā)的。
培養(yǎng)胰島釋放的TF誘發(fā)人血漿的凝固將培養(yǎng)胰島的培養(yǎng)基與人血漿混合會體現(xiàn)出其促凝血活性(圖4)。在培養(yǎng)胰島培養(yǎng)基存在的情況下，血漿在5分鐘之內(nèi)凝固。凝固活性可以被mAb4509所阻遏，但是mAb4503沒有此作用。用100000g離心，得到的上清無凝固反應(yīng)，但是沉淀與培養(yǎng)胰島的培養(yǎng)基相比其活性加倍。這表明TF的活性是與高分子量部分相關(guān)的，由于TF是含有跨膜部分的膜結(jié)合蛋白所以在離心的時候是與微粒部分在一起的。
IBMIR被抗TF抗體和iFVIIa所阻遏將人胰島加入無活性的新鮮的人血漿孵育，大約9.5分鐘之后誘導凝膠化(用粘度分析檢測)，然而在只加入緩沖液的情況下60分鐘后仍無凝固反應(yīng)，這表明胰島能夠誘導凝血反應(yīng)的活化(n＝7，結(jié)果未顯示)。為了將胰島內(nèi)TF的表達與促凝血活性聯(lián)系起來，我們試著用抗TF抗體阻遏凝膠化。在有抑制活性的TF抗體(mAb4509)存在的情況下凝膠化比正常情況慢5.6倍發(fā)生(53分鐘之后發(fā)生)，而在對照的mAb即無活性的TF抗原表位的抗體(mAb4503)存在的情況下，凝膠化慢1.8倍。
為了觀察是否是由所觀測的TF引發(fā)的IBMIR，用新鮮的人ABO相容血液對人胰島在管狀環(huán)模型中灌注30分鐘(圖5)。胰島在加入管狀環(huán)之前分別和有或無抑制活性的抗TF mAb孵育10分鐘并且洗三次。在對照樣品中(血液只加入胰島或者只加入無抑制活性的抗TFmAb4503)，凝固在15分鐘之內(nèi)發(fā)生，但是在有抑制活性的抗TF(mAb4509)存在的情況下，在觀察過程中凝固反應(yīng)沒有發(fā)生。這反映在血小板的消耗(血小板計數(shù))，一種血小板α-顆粒成分(β-血小板球蛋白)的釋放和TAT、F1+2及FXIa-AT的生成都被有抑制活性的mAb4509所抑制，但是不能被無抑制活性的mAb4503所抑制(圖5a-c；表格I)。一種有效的TF活性抑制劑iFVIIa能夠更加顯著的抑制IBMIR。在血液中有40pmol/L的iFVIIa能夠完全抑制血小板數(shù)目的下降和TAT、FXIa-AT及C3a的增加(圖5d-h)。這兩種抑制劑的作用為TF引發(fā)IBMIR提供了有力的證據(jù)。
抗TF抗體和點失活FVIIa抗人TF抗體(mAb4509和4503以及多克隆抗體4502)購自American Diagnostica Inc.(Greenwich，Connecticut)。MAb4509可以抑制TF的活性，mAb4503識別一個無功能的TF抗原表位。多克隆山羊抗小鼠/10和15nm Au(GAM-G10/15)和多克隆山羊抗兔/10和15nm Au(GAR-G10/15)購自Amersham international(Amersham，Bucks，England)。點失活因子VIIa(iFVIIa)是根據(jù)Wildgoose等的報道，利用丹酰-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸氯甲基酮失活的FVIIa(購自NovoSeven，Novo Nordic，丹麥)制備的。
討論目前研究的結(jié)果都一致表明TF是由胰島中的α，β-細胞產(chǎn)生和分泌的。免疫沉淀，RT-PCR和電鏡研究都表明TF在α，β-細胞都有表達，而在δ或PP細胞內(nèi)沒有表達。在培養(yǎng)基上清中發(fā)現(xiàn)的TF活性表明TF被胰島釋放出來。TF在α，β-細胞中的定位表明TF是和胰島素及胰高血糖素一起釋放的。然而，TF合成的調(diào)節(jié)目前仍未可知。
最近發(fā)現(xiàn)大部分的IBMIR是由凝血酶驅(qū)動和倍增的，結(jié)合這個發(fā)現(xiàn)和IBMIR可以由抗TF抗體所抑制的事實，我們提出一個假設(shè)來解釋這個反應(yīng)是如何進行的，但是這一假設(shè)不應(yīng)理解為對本發(fā)明權(quán)利要求的限制。開始是由胰島表達的TF引發(fā)凝血酶的生成，然后由凝血酶活化的血小板開始結(jié)合在胰島的表面。雖然結(jié)合在胰島上的血小板能夠結(jié)合哪些組織還沒有被鑒定出來，但是已有報導I，III，IV和V型膠原蛋白環(huán)繞在人胰島附近。膠原蛋白是已知的結(jié)合，激活血小板的調(diào)節(jié)因子。隨后血液中的血小板會快速的消失。通過包括因子XI和活化的血小板在內(nèi)的擴增循環(huán)形成更多的凝血酶，產(chǎn)生很多的纖維蛋白膠囊環(huán)繞在胰島周圍。
在移植之前抑制胰島結(jié)合的TF的活性能夠預防臨床胰島移植的IBMIR?？梢栽O(shè)想在不久的將來，將會研究出一種由阻遏TF表達(抗TF抗體)的藥物和阻遏TF合成的藥物，例如反義制劑，組成的預處理治療方法。在移植之前對胰島進行預處理在臨床上有很明顯的好處，因為這樣可以使接受者沒有凝血的副作用。
血液運載的TF的一個可能來源是白細胞，已知白細胞可以產(chǎn)生微粒結(jié)合的TF。在正常的個體中發(fā)現(xiàn)，葡萄糖灌注會引起TF途徑活性的增加，這個點發(fā)現(xiàn)有力的說明了TF活性是由選擇性葡萄糖敏感機制開始的。與胰島素共同釋放的TF和表面上沒有發(fā)生炎癥反應(yīng)的個體緊密的聯(lián)系在一起。破裂的動脈硬化斑包含TF并且TF的數(shù)量與動脈硬化斑的凝血活性相關(guān)。由于靠近動脈硬化斑腔面的TF濃度增加，所以假設(shè)動脈硬化斑相關(guān)的TF是來源于血液的。血液運載的TF能結(jié)合在動脈硬化斑上并且隨后開始形成動脈血栓，這為上述發(fā)現(xiàn)提供了有力支持。目前的研究證明至少血液運載的TF中的一部分是由胰島產(chǎn)生的?？紤]到凝血酶生成的增加是響應(yīng)于II型糖尿病患者的高血糖癥可能也響應(yīng)于一些患者的胰島素抵抗及高胰島素血癥，更多的活化的TF可能會出現(xiàn)并且結(jié)合在動脈硬化斑上。這可能會增加具有這些癥狀的患者得血栓癥的風險。
按照本發(fā)明的進一步研究，TF的產(chǎn)生和/或其釋放能夠被使用胰島素或者其他一些能夠抑制胰島素生成的藥物所抑制。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，那些使用胰島素的患者得心血管疾病的幾率會明顯的降低。提出的解釋是TF在產(chǎn)生胰島素的胰島中與胰島素是緊密聯(lián)系在一起的，因此TF釋放的效率會隨著胰島素釋放的效率降低而降低。
被提出的其中所包含的機制是胰島素能夠降低血液中的葡萄糖的水平，然后葡萄糖感知系統(tǒng)會感知到葡萄糖水平的降低，因此不會進一步引發(fā)胰島釋放胰島素，這樣就降低了TF的釋放。
目前深受II型糖尿病之苦的患者并沒有利用胰島素治療。取而代之的是他們被給予一些能夠引發(fā)胰島釋放胰島素的藥物，但是這樣會伴隨TF的釋放，增加了冠心病(CHD)發(fā)生的危險。
這意味著胰島素可以用來阻止易得CHD的患者例如II型糖尿病及其前期癥狀的患者和胰島素抵抗的患者患CHD的風險。因此，本發(fā)明為這些患者提供了一種新的治療方法包括給予患者一些藥物，這些藥物的特征是能夠減少胰島素生成和釋放，不過這是通過抑制TF來起作用的。
在本發(fā)明中另一個重要的發(fā)現(xiàn)是在II型糖尿病患者中高胰島素血癥和心血管疾病之間有一定的聯(lián)系。因此，發(fā)現(xiàn)胰島表達TF與眾所周知的二型糖尿患者中冠心病(CHD)高發(fā)病率之間的聯(lián)系能夠在本發(fā)明的領(lǐng)域中得到應(yīng)用，其目的是研究出一種藥物或者治療方法。
高胰島素血癥是II型糖尿病和具有其前期癥狀如胰島素抵抗的患者中普遍的癥狀。在這兩種情況中日益增加的胰島素抵抗使胰島的β-細胞產(chǎn)生更多的胰島素來調(diào)節(jié)相關(guān)的高血糖癥。這兩種情況都與CHD的高患病率有關(guān)。因此那些目前健康的II型糖尿病患者患心肌梗塞的幾率與那些已患有心肌梗塞的患者是一樣高的。
幾個報道都稱進食后會發(fā)生凝血的活化。這些發(fā)現(xiàn)被其他報告所支持，這些報告稱在普通受試者中葡萄糖灌注能夠誘導FVIIa生成的暫時增加，這反映了TF途徑的活化，還能誘導凝血酶生成的增加。這些影響在二型糖尿病患者中更加明顯，二型糖尿病患者的高血糖/高胰島素時期更長。特別引起我們興趣的是觀察到在同樣的高血糖水平下當同時灌注胰島素時內(nèi)源胰島素的分泌就會下降并且能夠阻遏TF途徑的活性，這個結(jié)果表明胰島素的內(nèi)源產(chǎn)生是凝血作用活化的先決條件。
微粒結(jié)合TF與血小板的結(jié)合在血栓形成過程中起重要的作用。特別是在急性心肌梗塞或者不穩(wěn)定心絞痛患者中血液運載TF明顯增加。
高血糖過程的延長使得人胰島會在局部產(chǎn)生和分泌TF，這為高胰島素血癥過程中全身的TF途徑的活化提供了一個試驗性的解釋。
動脈硬化斑中含有TF，并且TF的量與這些斑的凝血活性有關(guān)。這些斑中的TF的來源還不清楚，但是已知位于動脈硬化斑中的脂類核心中的平滑肌細胞和泡沫細胞有TF的表達。動脈硬化斑能夠通過兩種途徑引發(fā)血栓的形成一是空斑破裂釋放出其含有TF的脂類核心，二是空斑表面的內(nèi)皮細胞脫落，其底部的組織誘導血栓的形成。在后面的例子里邊，血液運載的TF能夠附著在內(nèi)皮下表面并且引發(fā)血栓的形成。
因此根據(jù)本發(fā)明的一個方面，TF抑制劑包括那些能夠減少胰島素分泌從而減少TF從胰島的釋放的物質(zhì)，例如降低胰島素抵抗的四氫噻唑，和/或外源胰島素；或天然或重組的胰島素類似物。
材料與方法胰島的分離我們按照別處所描述的方法從捐獻者的尸體中分離胰島(被道德協(xié)會認證)，我們利用Liberase灌注，然后用連續(xù)密度梯度的Ficoll在COBE2991冷凍離心機(COBE Blood Component Techology，Lakewood，CO，USA)中離心純化。胰島在37℃(5％CO2)的條件下在培養(yǎng)基(購自CMRL1066；ICN Biomedicals，Costa Mesa，CA)中培養(yǎng)1-7天。體積和純度是用雙硫腙染色之后利用顯微鏡測定的。生長活性是根據(jù)胰島素分泌來測定的，而胰島素的分泌是隨動力學灌注系統(tǒng)內(nèi)葡萄糖的變化(1.67、16.7然后恢復到1.67微摩爾/升葡萄糖)而變化的。
抗TF抗體抗人組織因子抗體(mAb#4509，#4503和多抗#4502)購自American Diagnostica Inc.(Greenwich，CT，USA)。
免疫組織化學染色完整胰腺的一部分和分離的胰島收集在包埋培養(yǎng)基(Tissue-Tek；Miles，Eckhart，IN)中，然后用液氮急凍。樣品分裝后，用mAb#4509染色，然后用HRP結(jié)合的豬抗小鼠免疫球蛋白(DAKOA/S，Glostrup，Denmark)處理。
從分離的胰島中免疫沉淀TF兩千個胰島用PBS洗五次，每一次都用9g的速度在室溫(RT)離心，所述PBS中還含有5mMEDTA、10mM芐脒、0.1mg/ml的大豆胰島素抑制劑和1mM的PMSF。沉淀用0.5毫升加入1％Triton X-100的同樣緩沖液37℃孵育30分鐘。在這之后用10000g離心5分鐘分離細胞碎片。將3微克mAb#4509或#4503和250微升細胞裂解液混合在37℃孵育30分鐘并用Protein G Sepharose(Pharmacia Upjohn，Stockholm，Sweden)沉淀。然后利用SDS-PAGE和Western blot進行分析，所用的抗體為兔多抗#4502以及HRP偶聯(lián)的抗兔免疫球蛋白抗體。(Dako A/S)。
電子顯微鏡分析超微結(jié)構(gòu)分析所采用的正常胰腺組織樣品分別來自兩個男性患者的胰腺組織和從兩個胰腺捐獻者分離出來的胰島。所選患者和捐獻者都沒有代謝疾病，所采用的胰腺在肉眼可見和微觀水平上都是正常的并且沒有任何淀粉樣沉淀。為了保存其抗原性所有的樣品是在低溫下處理的。將超薄切片鋪在鎳網(wǎng)上然后用免疫金技術(shù)進行免疫標記。TF抗體mAb#4509，#4503和pAb#4502按照1∶25稀釋(可見表1)，并用10或15納米的膠體金顆粒作電子密度標準。在利用Philips201電子顯微鏡檢測前，利用醋酸鈾和檸檬酸鉛對切片進行對比染色。
凝固時間血漿的凝固時間是通過一種四通道自由擺動式血流速度儀來測量的，ReoRex 4，購自GHI(Global Haemostais Institute AB，Linkoping，Sweden)。
管狀環(huán)模型我們將以前所述的模型進行改造之后進行利用。用PVC管制成的環(huán)(直徑6.3毫米，長度390毫米)按照制造者的建議將其表面進行Corline肝素化(Corline，Uppsala，Sweden)。
四微升(～4000IEQ)清洗過的胰島(用CMRL1066洗兩次)分別和15微升mAb#4509，對照mAb#4503或者PBS在室溫下孵育10分鐘。胰島經(jīng)過三步清洗之后用150微升CMRL1066重懸然后加到環(huán)中，之后加入(5ml)人ABO相容血液。為了產(chǎn)生大約100ml/min的血流速度我們將其放在一個搖動裝置上，放置于37℃孵育器上30分鐘。我們還作了一個對照的環(huán)含有血液和150微升的CMRL1066但是不加胰島。在灌注之前和灌注5，15和30分鐘時我們分別取血液樣品并加入EDTA(終濃度4.1mM)以便進行進一步分析。
血液和血漿的分析血液中的血小板和不同的白細胞是利用Coulter AcT diff分析器進行計數(shù)的(Beckman Coulter，F(xiàn)L，USA)。
血漿中凝血酶原片段1+2(F1+2)和凝血酶-抗凝血酶復合物(TAT)的水平利用可購得的EIA試劑盒(EnzygnostF1+2和TAT，Dade Behring，Marburg，Germany)來定量。血漿中FXIa-AT復合物的含量是按照Sanchez等的方法定量的。β-血小板球蛋白(β-TG)用Asserachom(Diagnostica Stago，Asnieres-sur-Seine，F(xiàn)rance)來分析。補體活化產(chǎn)物C3a和sC5b-9利用前述方法來確定。
RT-PCR分析胰島胞漿RNA按照前述方法提取。單鏈cDNAs利用寡聚dT引物(Amersham Pharmacia)來制備。將PCR引物結(jié)合使用來產(chǎn)生包括兩個或更多的TF轉(zhuǎn)錄物外顯子的PCR產(chǎn)物，并且只擴增cDNA但不擴增痕量的基因組DNA。RT-PCR用高保真的PCR成分(Expand，Boeringer-Mannheim，Germany)進行35個循環(huán)，之后利用含0.5微克/毫升EB濃度為3％的瓊脂糖凝膠進行電泳，分析PCR產(chǎn)物。
統(tǒng)計分析所有的結(jié)果都表達為平均數(shù)±SEM。平均值利用Friedman ANOVA來比較。顯著性定義為α＝0.05。
表1所用抗體 來源1.單克隆抗人組織因子抗體(#4509) 小鼠
2.多克隆抗人組織因子抗體(#4502) 兔3.單克隆抗人組織因子抗體(#4503) 小鼠4.單克隆抗人胰島素(XX)小鼠5.多克隆山羊抗小鼠/10納米Au(GAM-G10) 山羊6.多克隆山羊抗兔/15納米Au(GAR-G15)山羊1，2，3和4來自于American Diagnostica Inc.，Greenwich，CT，USA5和6來自于Amesham International，Amersham，Bucks，England對TF的合成與分泌的抑制作用胰島在含有10mM煙堿的CMRL培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，這種培養(yǎng)基是培養(yǎng)胰島的標準培養(yǎng)基。然后換成不含煙堿的CMRL培養(yǎng)基。再經(jīng)過24小時的基線期后挑選胰島并分析其TF含量。用含有可以影響TF在單核細胞和內(nèi)皮細胞中表達的試劑的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)胰島48小時，這種培養(yǎng)基含有L-精氨酸，環(huán)孢霉素A，乙酰半胱氨酸和煙堿。收集胰島，使用可購得的EIA試劑盒分析TF含量，在體外環(huán)狀模型中測試胰島。
將胰島與維生素B煙堿共培養(yǎng)可以減少TF的合成與分泌，當胰島與濃度為0mM～50mM的煙堿共培養(yǎng)時，胰島中的組織因子的生成受到劑量依賴性抑制(圖1A)。相似的，在測試中當在體外環(huán)狀系統(tǒng)中與人血液接觸時，細胞內(nèi)TF的量就與凝聚的活化關(guān)聯(lián)起來，這反應(yīng)在TAT的產(chǎn)生上(圖1B)。這表明胰島細胞內(nèi)TF的含量以及TF的分泌被煙堿以劑量依賴的方式抑制了。免疫抑制藥物環(huán)孢霉素A(圖2)，L-精氨酸(圖2)，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑依那普利(圖2)和抗氧化劑乙酰半胱氨酸(未顯示)都有類似的作用。
圖6-8顯示煙堿的效果胰島分別在含0，10，25和50mM煙堿的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時并分析其胞內(nèi)TF含量，見圖6。在體外環(huán)狀模型中，將胰島暴露在新鮮的人ABO相容血液中，經(jīng)過5，15，30，60分鐘取樣并分析TAT，見圖7。
胰島在含依那普利(40ug/ml)，環(huán)孢霉素A(10ug/ml)，L-精氨酸(1mmol/l)，煙堿(10mmol/l)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時，并檢測胞內(nèi)TF濃度。TF濃度用相對于未處理的對照的百分數(shù)表示，見圖8。
值得注意的是煙堿有抗氧化的性質(zhì)，這是造成它具有如此活性的機制的重要因素之一。根據(jù)本發(fā)明可預期這組物質(zhì)中的其他化合物也是可用的，這類化合物的例子有維生素E、谷胱甘肽、乙酰半胱氨酸、吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽、2-巰基吡啶氧化物、己酮可可堿(pentoxifylline)、hemoxygenase-1/CO-膽紅素、前列腺素A1，但是這一列舉并非窮舉。
權(quán)利要求
1.組織因子，TF，的抑制劑或拮抗劑在制備治療或預防糖尿病或者糖尿病相關(guān)疾病的藥物中的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其指制備用于與胰島素生成細胞移植共同施用的藥物，用于治療胰島素依賴的糖尿病，IDDM，患者。
3.權(quán)利要求1的用途，其指制備用于治療心血管疾病和/或動脈硬化的藥物。
4.權(quán)利要求3的用途，用于治療I I型糖尿病或其前期患者。
5.上述權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述TF的抑制劑或拮抗劑是具有結(jié)合TF生物學效應(yīng)的抗TF抗體。
6.權(quán)利要求1-4中任一項的用途，其中所述抑制劑是抑制TF從郎格罕(langerhan)胰島中產(chǎn)生和/或釋放的物質(zhì)。
7.權(quán)利要求1-4中任一項的用途，其中所述TF的抑制劑或拮抗劑是能阻遏TF合成的制劑。
8.權(quán)利要求7的用途，其中所述制劑是阻遏TF基因的反義構(gòu)建體。
9.權(quán)利要求1-5中任一項的用途，其中所述物質(zhì)抑制TF的產(chǎn)生和/或釋放是以降低郎格罕胰島中胰島素的產(chǎn)生為特征的。
10.權(quán)利要求9的用途，其中所述物質(zhì)是胰島素或胰島素類似物。
11.上述權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述TF的抑制劑或拮抗劑是與抗凝劑，例如肝素或其部分或其衍生物聯(lián)合應(yīng)用的。
12.上述權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述TF的抑制劑或拮抗劑是與凝血酶抑制劑聯(lián)合應(yīng)用的。
13.上述權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述TF的抑制劑或拮抗劑是與血小板抑制劑聯(lián)合應(yīng)用的。
14.治療或預防糖尿病或糖尿病相關(guān)疾病的方法，其中包括將組織因子，TF，的抑制劑或拮抗劑施用于需要的受試者。
全文摘要
本發(fā)明涉及組織因子，TF，的抑制劑或拮抗劑在制備治療或預防糖尿病或者糖尿病相關(guān)疾病的藥物中的用途。該TF抑制劑或拮抗劑主要用于治療I或II型糖尿病以及由II型糖尿病引起的代謝綜合癥患者。該抑制劑或拮抗劑是一種能夠部分或者完全抑制TF產(chǎn)生的制劑，例如抗TF的抗體或者能夠作用于TF基因的反義構(gòu)建體。
文檔編號A61K45/00GK1646162SQ03809065
公開日2005年7月27日 申請日期2003年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月22日
發(fā)明者O·科爾斯格倫, B·尼爾松 申請人:普羅菲醫(yī)療公司