專利名稱：甘露糖結(jié)合凝集素及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及純化的甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)及其在治療中的應(yīng)用，上述甘露糖結(jié)合凝集素中基本不含有與絲氨酸蛋白酶(MASPs)相締合(associated)的MBL。
背景技術(shù)：
甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)，有時稱為甘露聚糖結(jié)合凝集素或甘露糖結(jié)合蛋白，是一種來源于肝臟的C型血清凝集素，其與補(bǔ)體成分Clq具有結(jié)構(gòu)上的同源性。MBL可以通過凝集素和經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體，并且能夠與噬菌細(xì)胞表面特異的Clq類受體相互作用，因此它在首要的宿主防衛(wèi)體系中起著非常重要的作用。
MBL屬于膠原凝集素(collectin)蛋白家族的成員，這類蛋白中不僅存在膠原區(qū)域，而且也具有球狀凝集素區(qū)域。MBL的結(jié)構(gòu)單元是由3個32kDa亞單元組成的96kDa膠原蛋白三股螺旋，其中每一個亞單元都具有碳水化合物識別區(qū)域，上述螺旋通過N末端半胱氨酸之間的二硫鍵實現(xiàn)穩(wěn)定作用。多個這種96kDa單元組成了MBL寡聚體，天然蛋白通常以三聚體到六聚體的形式存在，分子量在270kDa到大約650kDa之間。MBL只有在以較高寡聚體形式存在時才能獲得其全部功能。目前已有證據(jù)表明MBL至少必須以四聚體的形式存在才能有效地進(jìn)行補(bǔ)體激活。這種寡聚體結(jié)構(gòu)使MBL有多個配體結(jié)合位點，并且可以摹擬IgM的多重結(jié)合特性。
MBL可以和多種不同的糖類進(jìn)行結(jié)合，但其最強(qiáng)烈地與甘露糖和N-乙酰氨基葡萄糖相結(jié)合。上述糖類大量存在于許多病原菌的細(xì)胞壁上，例如酵母、革蘭氏陰性腸道細(xì)菌、革蘭氏陽性細(xì)菌、分枝桿菌、一些病毒和特定的寄生蟲等。多數(shù)的MBL糖類靶都不在哺乳動物細(xì)胞表面進(jìn)行高密度的表達(dá)，同時MBL還具有自身和非自身識別的能力，因此在首要的宿主防衛(wèi)體系中，MBL可以作為一種模式識別分子發(fā)揮作用，稱之為先天性免疫系統(tǒng)的核心部分(Turner，1996)。
MBL具有高效而有力的補(bǔ)體激活功能，和其激活功能的核心與體內(nèi)至少兩種原酶密切相關(guān)聯(lián)，它們分別稱為MBL關(guān)聯(lián)(associated)絲氨酸蛋白酶1，2和3(MASP1，MASP2和MASP-3)。當(dāng)MBL與它們各自的配體相結(jié)合，并且通過凝集素途徑啟動有效的補(bǔ)體激活作用時，上述分子量分別為93kDa、76kDa和105kDa的單一多肽就分別轉(zhuǎn)換為活性形式(Turner，1996)。研究表明MAPS2是補(bǔ)體激活作用所必須的，該酶能在缺少MASP1或最近記述的MASP3時單獨起始補(bǔ)體級聯(lián)作用，因此MASP2是與MBL啟動補(bǔ)體級聯(lián)激活作用相關(guān)聯(lián)的至關(guān)重要的酶類。
MBL基因(MBL2)位于第10號染色體的10q11.2-q21上，它包含4個外顯子。已經(jīng)記述了多個影響功能蛋白表達(dá)的MBL2突變體。目前認(rèn)為MBL2基因外顯子1中密碼子52、54和57處的單核苷酸取代作用破壞了MBL亞單元組裝成其基本的三聚體結(jié)構(gòu)單元。
此外，目前至少描述了兩個可以改變個體MBL亞單元表達(dá)水平的啟動子區(qū)域多態(tài)性(分別在位置-550和-221處)。在不同的人種群中MBL基因突變的頻率也不同。例如在高加索人(Caucasians)中，密碼子54處突變體發(fā)生的頻率為15％，而僅僅在非洲人中才會出現(xiàn)密碼子57處發(fā)生突變的變體?；蛲蛔兒蛦幼佣鄳B(tài)性共同發(fā)生的實際意義在于在普通人群中發(fā)生MBL缺乏是相當(dāng)普遍的。在具有野生型基因的純合個體中，血清中MBL的水平為1到5μg/mL；在MBL2基因發(fā)生突變的純合個體中，血清中MBL的水平為5到25ng/mL；在雜合個體中，血清中MBL的水平為常規(guī)的1/8，但是也存在有相當(dāng)大的變化。
許多線索表明MBL缺乏可以導(dǎo)致重大的臨床后果。
1968年，人們認(rèn)為孩童時期反復(fù)感染、不能健壯發(fā)育以及慢性腹瀉等綜合癥狀與體外血漿中缺乏調(diào)理素有關(guān)。后來的研究證明這種綜合癥狀與10個年齡在15個月到9歲的兒童低水平的MBL相關(guān)。通過對醫(yī)院已確認(rèn)發(fā)生感染的345個兒童進(jìn)行連續(xù)的研究表明，MBL2缺乏是造成兒童感染的非常危險的因素之一。在已發(fā)生感染的兒童中，MBL2基因突變的發(fā)生率是未感染兒童的兩倍，同時在雜合個體和純合個體中都增加了易感染性。感染種類從胸部感染和耳炎直到威脅生命的腦膜炎球菌血癥(meningococcaemia)。
通過對266份病例的大量研究，已經(jīng)證實了MBL缺乏與兒童流行性腦脊髓膜炎(meningcoccal disease)之間的相關(guān)性。7.7％的醫(yī)院基礎(chǔ)上的病例屬于MBL多態(tài)性純合型，而對照組為1.5％，讓步比(odds ratio)為6.5。由此可以得出結(jié)論，全部病例中的1/3是由MBL發(fā)生遺傳突變引起的。
上述兒科群體中的數(shù)據(jù)產(chǎn)生了下面一種假設(shè)，即MBL的主要作用是在所謂的“易獲病期”提供一種保護(hù)，而所謂的“易獲病期”(window ofvulnerability)是指母體抗體喪失之后和嬰兒自身抗體組成部分尚未成熟之前的這段時期(6個月到18個月)。
最近的研究結(jié)果表明MBL基因型突變體與常見的可變免疫缺陷和急性成淋巴細(xì)胞白血病的早期發(fā)作和顯現(xiàn)相關(guān)，上述結(jié)果有力地支持了以下假設(shè)，即當(dāng)免疫系統(tǒng)中其它組分尚未成熟或受到損傷時，MBL介導(dǎo)的宿主防衛(wèi)體系發(fā)揮著更重要的調(diào)節(jié)作用。
最近對149個囊腫性纖維化(CF)受試者的研究表明，常見的MBL基因遺傳突變與疾病嚴(yán)重性的增加和感染Burkholderia cepacia危險的增大相關(guān)。MBL突變體等位基因也與預(yù)后不良和夭折(early death)相關(guān)-與通常的CF群體中的純合體相比，突變體等位基因攜帶者的預(yù)計存活時期也縮小了8年。
MBL缺乏在成人中的重要性被越來越多的醫(yī)療證據(jù)所證實，通過對患有“嚴(yán)重且異?！备腥镜某扇耸茉囌?包括反復(fù)性皮膚感染、隱孢子蟲病(cryptosporidiosis)、具有反復(fù)性單純皰疹和食管念珠菌病的流行性腦脊髓膜炎(meningococal meningitis)、以及Klebsiella pneumonia)的研究表明涉及了MBL2基因密碼子52或54處的突變。
在228個疑似具有非HIV相關(guān)性免疫缺陷的成人受試者中，雜合性MBL2基因突變的發(fā)生頻率與對照群體相同，但是在上述疑似具有免疫缺陷的群體中，純合性MBL2基因突變的發(fā)生頻率卻顯著增加(8.3％對0.8％)。相關(guān)數(shù)據(jù)還顯示出在男性MBL多態(tài)性純合體中，感染HIV的危險性較大并且AIDS進(jìn)展的比率也較快。
在因采用化學(xué)療法而使機(jī)體適應(yīng)性免疫反應(yīng)受到損害(compromise)的受試者體內(nèi)，MBL結(jié)構(gòu)基因突變后果和循環(huán)性MBL水平較低是與感染發(fā)生率和感染嚴(yán)重性的增加明顯相關(guān)的。在因血液惡性腫瘤疾病而接受化學(xué)治療的成人中，MBL水平低于0.5μg/mL的受試者感染的發(fā)生率和嚴(yán)重性都顯著增加。人們發(fā)現(xiàn)在成人進(jìn)行同種異體干細(xì)胞移植之后，供體和受體的MBL基因型對發(fā)生感染的風(fēng)險起著重要的作用。在100個接受化學(xué)治療的兒童中，與具有野生型MBL基因的兒童相比，那些具有MBL結(jié)構(gòu)基因突變的受試者發(fā)生發(fā)熱性嗜中性白血球減少癥的天數(shù)是其兩倍，而是那些因感染送入ICU的四倍。在此項研究中，MBL水平低于1μg/mL是一項關(guān)鍵因素。
在預(yù)期的研究之中，還對研究地區(qū)的252名兒童進(jìn)行了檢查(Koch等，2001)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)年齡在6個月到17個月的兒童中，MBL缺乏與急性呼吸感染顯著相關(guān)(發(fā)生的風(fēng)險增加兩倍)，對年齡在0個月到5個月的兒童發(fā)生急性呼吸感染會產(chǎn)生很小的影響，而對年齡在18個月到23個月的兒童則沒有影響。
自從1980年以來，可以在實驗室規(guī)模上對MBL-MASP復(fù)合體進(jìn)行常規(guī)純化?？梢圆捎酶鞣N形式的親和層析對MBL-MASP復(fù)合體進(jìn)行純化。配基通常采用酵母甘露聚糖(Anderson等，1992；Holmskov等，1993)，通過柱用高鹽或EDTA進(jìn)行第一次洗脫(Koppel等，1994；Anderson等，1992；Holmskov等，1993)，用甘露糖進(jìn)行最后一次洗脫(Koppel等，1994；Anderson等，1992；Matsushita等，1992；Holmskov等，1993)，上述洗脫進(jìn)行1或2個循環(huán)。
可以在實驗室規(guī)模(Kilpatrick，2000)，在Statens Serum Institut的GMP條件下(Valdimarsson等，1998)，從分級分離血漿蛋白產(chǎn)生的廢棄部分純化人MBL-MASP復(fù)合體。Scottish Cohn部分III是一種血漿分級分離生產(chǎn)IgG的過程中所產(chǎn)生的廢棄產(chǎn)品，可以用21％的乙醇對血漿中產(chǎn)生的冰冷上清液進(jìn)行沉淀，此步驟產(chǎn)生的沉淀稱之為級分(fraction)I+II+III。采用8％的乙醇進(jìn)行進(jìn)一步的沉淀產(chǎn)生了級分I+III。可以采用Emphaze-甘露聚糖柱從其中進(jìn)行親和捕獲而獲得MBL-MASP復(fù)合體，先用EDTA，然后采用甘露糖溶液進(jìn)行MBL-MASP復(fù)合體的洗脫。采用此程序，從級分I+III糊劑所獲得的MBL-MASP復(fù)合體的產(chǎn)量為10mg/kg，特異性活性比集中血漿提高7倍(Kilpatrick，2000)。以這種方式，也可以采用簡單的甘露糖洗脫獲得高純度的MBL-MASP復(fù)合體(300-600μg/L血漿)。
在WO99/64453中還討論了另外一種純化技術(shù)，其揭示了采用非共軛性多聚糖基質(zhì)進(jìn)行層析純化的步驟。
發(fā)明概述本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在激活補(bǔ)體級聯(lián)過程中，缺少MASP的MBL組合物比經(jīng)純化獲得的與MASPs相結(jié)合的MBL復(fù)合體更加優(yōu)良。因此本發(fā)明進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，為給受試者明確提供一種安全、有效的治療藥物產(chǎn)品，在MBL-MASP復(fù)合體純化過程中或在其純化之前或在其純化之后，MASPs或者至少已被激活的MASPs應(yīng)從MBL中去除。
因此本發(fā)明的第一方面提供了一種藥物組合物，其包含了分離的非重組性甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)以及制藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，其中分離的非重組性甘露糖結(jié)合凝集素中基本上不含有已被激活的與絲氨酸蛋白酶(MASPs)相交聯(lián)的MBL。
優(yōu)選的上述組合物中基本上不含有MASPs，無論其被激活與否。典型的MBL是人MBL。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)缺少MASP的MBL能夠從血漿中補(bǔ)充MASPs，進(jìn)而產(chǎn)生功能性復(fù)合體，其可成功地激活補(bǔ)體級聯(lián)作用。與之相比，純化的MBL-MASP復(fù)合體僅具有有限的補(bǔ)充原酶(或新鮮的)MASP的能力。這可能是由于在純化過程中，作為激活的結(jié)果(例如在結(jié)合到甘露聚糖柱上時被激活)，在純化復(fù)合體中已被激活的MASP吸附在MBL結(jié)合位點上，并且已被激活的MASP很難被置換下來。相反在純化的缺少MASP的MBL中，原酶MASPs可以被不斷地補(bǔ)充到其結(jié)合位點上，這也恢復(fù)了MBL-MASP復(fù)合體中的調(diào)節(jié)成分，從而生產(chǎn)出更加安全有效的治療產(chǎn)品。
在一個優(yōu)選實施例中，可以采用以下方法獲得MBL(i)提供一種非重組性MBL和一個或更多個MASPs的復(fù)合體；(ii)在適當(dāng)?shù)木彌_液中培養(yǎng)上述復(fù)合體，使MBL與一個或更多個MASPs發(fā)生分離；并且(iii)從一個或更多個MASPs中將MBL分離出來。
在步驟(ii)中，緩沖液優(yōu)選pH從4.0到5.0的EDTA/乙酸鹽緩沖液。
此外，緩沖液中優(yōu)選含有NaCl，緩沖液中優(yōu)選NaCl的濃度至少為0.5M，緩沖液中更加優(yōu)選NaCl的濃度大約為1M。
在步驟(iii)中，優(yōu)選包含一種層析方法和/或過濾方法。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施例中，層析方法選自以下組粒徑分離層析和離子交換層析。
本發(fā)明的第二方面提供了一種生產(chǎn)藥物組合物的方法，該方法包括(i)提供一種非重組性MBL和一個或更多個MASPs的復(fù)合體；
(ii)從至少部分(some)的一個或更多個MASPs中使MBL發(fā)生分離；(iii)從至少部分的一個或更多個MASPs中使MBL分離出來；并且(iv)將第(iii)步產(chǎn)生的MBL與制藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑相混合。
步驟(ii)優(yōu)選包括在適當(dāng)?shù)木彌_液中培養(yǎng)復(fù)合體。
緩沖液優(yōu)選pH從4.0到5.0的EDTA/乙酸鹽緩沖液。
此外，緩沖液中優(yōu)選含有NaCl，緩沖液中優(yōu)選NaCl的濃度至少為0.5M，緩沖液中更加優(yōu)選NaCl的濃度大約為1M。
在步驟(iii)中，優(yōu)選包含一種層析方法和/或過濾方法。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施例中，層析方法選自以下組大小排阻層析和離子交換層析。
在優(yōu)選實施方案中，步驟(i)包括了從血漿分級過程(Plasma fractionproccess)中提供附加級分(side fraction)的步驟。步驟(i)進(jìn)一步優(yōu)選包括采用甘露聚糖親和層析法從其它血漿蛋白中分離非重組MBL和一個或更多個MASPs復(fù)合體的步驟，其中其它血漿蛋白存在于血漿分級過程中產(chǎn)生的附加級分中。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其是通過本發(fā)明第二方面所述的方法獲得的。優(yōu)選的組合物中基本上不含有激活的MASPs。
另一方面，本發(fā)明提供了一種在受試者中治療或預(yù)防疾病的方法，該方法包括給受試者施用有效劑量的本發(fā)明所述的藥物組合物。
疾病可以是任何條件的，可以通過給受試者施用純化的缺少MASP的MBL以幫助對疾病的治療和預(yù)防作用。該方法適合的接受者包括，但并不局限于，骨髓同種異體移植接受者、囊腫性纖維化受試者、免疫缺陷受試者、急性成淋巴細(xì)胞白血病受試者、社區(qū)獲得性或醫(yī)院性敗血病受試者、病原體感染或病原體易感性受試者、低出生體重和/或早熟嬰兒。典型的是，受試者M(jìn)BL產(chǎn)生缺乏。
本發(fā)明還提供了包含分離的非重組性MBL的組合物在預(yù)防和治療中的應(yīng)用，上述組合物基本上不含有MASPs。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含分離的非重組性MBL的組合物在生產(chǎn)藥物中的應(yīng)用，上述組合物基本上不含有MASPs，該藥物用于施用給實際需要上述組合物的受試者。
適合的接受者包括，但并不局限于，骨髓同種異體移植接受者、囊腫性纖維化受試者、免疫缺陷受試者、急性成淋巴細(xì)胞白血病受試者、社區(qū)獲得性或醫(yī)院性敗血病受試者、病原體感染或病原體易感性受試者、低出生體重和/或早熟嬰兒。典型的是，受試者M(jìn)BL產(chǎn)生缺乏。
為了測定樣品中MASP的活性水平，本發(fā)明者還設(shè)計了裂解性底物及其應(yīng)用試驗。上述試驗可用于監(jiān)控此處描述的MBL純化步驟或其它任何需要分析MASP活性的目的。
因此本發(fā)明的另一方面提供了一種通式為X-R1-Arg-R2-Y的肽，其中R1-Arg-R2是來源于補(bǔ)體蛋白MASP切割位點的由6個或更多個連續(xù)氨基酸組成的肽；X為氨基，保護(hù)基團(tuán)或可檢測性標(biāo)記；Y為羧基或可檢測性標(biāo)記，并且當(dāng)X是氨基或保護(hù)基團(tuán)時，Y不能是羧基，當(dāng)Y為羧基時，X不能是氨基或保護(hù)基團(tuán)(blocking group)。
優(yōu)選的補(bǔ)體蛋白是C4。
優(yōu)選的C4蛋白是人的C4并且切割位點包含Arg756。
在進(jìn)一步的優(yōu)選實施方案中，X是猝滅劑分子并且Y是熒光標(biāo)記，反之亦然，從而保證當(dāng)?shù)孜锉磺谐龝r可以獲得熒光信號。
本發(fā)明的另一方面提供了本發(fā)明的肽在確定樣品中存在MASP活性的方法中的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一方面提供了一種確定樣品中存在MASP活性的方法，該方法包括將樣品與本發(fā)明的肽相接觸，從而確定上述肽是否被切除。
本發(fā)明的另一方面提供了一種生產(chǎn)本發(fā)明藥物組合物的方法，該方法包括(i)提供一種非重組性MBL和一個或更多個MASPs的復(fù)合體；(ii)在適當(dāng)?shù)木彌_液中培養(yǎng)上述復(fù)合體，使MBL與一個或更多個MASPs發(fā)生分離；(iii)從一個或更多個MASPs中將MBL分離出來；(iv)采用本發(fā)明的方法在步驟(iii)獲得的MBL中篩選MASP活性；并且(v)將上述產(chǎn)生的純化的MBL與制藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑相混合。
附圖簡述附

圖1缺少(depleted)MASP的MBL和MBL-MASP復(fù)合體中MBL水平與C4富集(deposition)對照圖，顯示出缺少MASP的級分在體外補(bǔ)充MASP2和補(bǔ)體激活的優(yōu)勢。在數(shù)值達(dá)到1.0時，C4產(chǎn)生超量。
附圖2缺少MASP的MBL和MBL-MASP復(fù)合體中MBL水平與C4富集對照圖，顯示出缺少MASP的級分在體外補(bǔ)充MASP2和補(bǔ)體激活的優(yōu)勢。在數(shù)值達(dá)到1.0時，C4產(chǎn)生超量。
發(fā)明詳述除非特殊說明，否則此處所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義相同(例如在細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、雜交技術(shù)和生物化學(xué)等方面)。在分子、遺傳免疫和生物化學(xué)方法及化學(xué)方法中采用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)(參見常規(guī)的，Sambrook et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，3rded.(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y和Ausubel et al.，Short Protocols in Molecular Biology(1999)4thEd，John Wiley & Sons，Inc.-和the full version entitled CurrentProtocols in Molecular Biology，Ed Harlow and David Lane(editors)AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，(1988)，和J.E.Coliganet al.(editors)Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons(includingall updates until present)，which are incorporated herein by reference)。
A.基本上不含有MASPs的MBL的純化可以從非重組性資源獲得本發(fā)明的純化的缺少MASP的MBL，例如從血漿等動物或人體的生物材料中純化獲得。然而，在上述材料中MBL與MASPs以復(fù)合體的形式存在，因此為獲得本發(fā)明純化的基本上不含有激活的MASPs的MBL，需要從上述MASPs中分離MBL。
典型的純化過程包括兩個主要步驟-從其它生物材料中純化MBL-MASP復(fù)合體和分離MBL-MASP復(fù)合體以獲得基本純化的缺少MASP的MBL。上述兩個步驟可以以任何順序發(fā)生，甚至可以同時進(jìn)行。然而，由于MBL在血漿總蛋白含量中通常低于0.05％，因此為了富集MBL-MASP復(fù)合體，在分離步驟之前，需要進(jìn)行一個典型的預(yù)純化步驟以至少去除一些生物材料，例如非MBL-MASP血漿蛋白等。所以諸如血漿等生物材料需要進(jìn)行典型的處理以獲得包含MBL-MASP復(fù)合體的部分純化的組合物。
MBL純化的一個起始點是血液、血漿、肝臟和肝細(xì)胞培養(yǎng)物。然而可以從來源于血漿的產(chǎn)品或副產(chǎn)品來純化缺少MASP的MBL。缺少MASP的MBL的優(yōu)選來源是血漿分級分離過程中產(chǎn)生的附加級分(side fraction)。具體實例包括，但并不局限于，來源于沉淀或過濾過程的沉淀物或上清液，或來源于離子交換層析的附加級分，或來源于親和層析的附加級分，或并非用于生產(chǎn)其它血漿類產(chǎn)品的方法所產(chǎn)生的級分。作為熟練的人員可以了解有許多不同的已知方法進(jìn)行血漿分級分離。然而，熟練的人員可以容易地分離MBL以確定既定的血漿分級分離過程中所產(chǎn)生的級分中是否包含有MBL，例如采用此處描述的甘露聚糖結(jié)合、MBL抗原或C4富集試驗和/或親和層析純化不同級分中的MBL。
工業(yè)大規(guī)模乙醇分級分離過程中所產(chǎn)生的原始血漿蛋白級分，例如Cohn級分II和/或III是生產(chǎn)缺少MASP的MBL的一個實例，它是在血漿分級分離過程中所產(chǎn)生的附加級分。這些級分通常是被廢棄的，但其中含有MBL-MASP復(fù)合體，并且該MBL-MASP復(fù)合體中包含了源自Cohn上清液I的糊劑(此處稱為“真球蛋白糊劑”)，因此作為起始材料，它們具有經(jīng)濟(jì)上的優(yōu)勢。同時由于血液是有價值的稀有資源，因此需要最大限度地利用上述附加級分。
缺少MASP的MBL可以來源于動物體或人體，但優(yōu)選從人體資源中純化缺少MASP的MBL。
當(dāng)采用血漿/血漿副產(chǎn)品時，通常需要對其進(jìn)行處理以富集血漿蛋白。典型的從血漿或血漿來源的產(chǎn)品獲得血漿蛋白的方法例如是進(jìn)行沉淀處理?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的各種合適的試劑對血漿或血漿副產(chǎn)品進(jìn)行沉淀以獲得血漿蛋白，例如各種分子量形式的聚乙烯(乙二醇)、乙醇和硫酸銨。
進(jìn)一步可選擇的步驟包括過濾，例如深度過濾，和脫脂。
例如可以采用如下的方法獲得真球蛋白糊劑用注射用水(WFI)和冷乙醇在低于5℃的溫度下處理已解凍的新鮮冷凍血漿，通過離心分離所產(chǎn)生的沉淀。上清液經(jīng)通常的脫脂反應(yīng)以利于吸收脂蛋白，并通過過濾進(jìn)行澄清。然后采用截除分子量不低于10000道爾頓的超濾膜對上清液進(jìn)行完全過濾以降低電導(dǎo)率。降低完全過濾所獲得的上清液的pH以促進(jìn)真球蛋白發(fā)生沉淀，并且通過過濾作用回收澄清的上清液，在此過程中收集真球蛋白糊劑。
可以通過典型的親和純化方法從其它血漿蛋白中提取MBL-MASP，該方法可以從其它血漿蛋白中分離MBL(大多數(shù)是與MASP形成的復(fù)合體)。通常的親和俘獲配體采用糖類，例如包括但并不局限于甘露聚糖和N-乙酰氨基葡萄糖。在優(yōu)選的實施例中，親和俘獲配體采用甘露聚糖，例如甘露聚糖-瓊脂糖凝膠(Sepharose)或甘露聚糖-瓊脂糖。由于MBL-MASP復(fù)合體存在于真球蛋白糊劑等沉淀物中，因此在上親和樹脂之前，需要對沉淀蛋白進(jìn)行重新溶解。合適的溶解緩沖液是Tris/NaCl/CaCl2緩沖液，例如可以在室溫下，采用Tris/NaCl/CaCl2緩沖液將真球蛋白糊劑溶解1小時。
通常采用離心和/或過濾的方法去除不溶性物質(zhì)。將可溶性血漿蛋白沉淀上親和樹脂，在采用EDTA等螯合性鈣離子洗脫MBL-MASP復(fù)合體之前，需要對樹脂進(jìn)行清洗。
在WO99/64453中描述了另外一種純化MBL-MASP復(fù)合體的方法，其僅僅采用了多聚糖基質(zhì)，而未使用任何甘露聚糖等共軛性碳水化合物配體。由于MBL可以直接結(jié)合于多聚糖基質(zhì)，因此可以采用相似的甘露聚糖親和樹脂進(jìn)行有效的純化，同時并不需要制備共軛性親和樹脂。
然后對通過上述方法或其它適當(dāng)方式所獲得的溶解在溶液中的MBL-MASP復(fù)合體進(jìn)行處理以使MBL復(fù)合體發(fā)生分離，即使MASPs從MBL中分離出來。例如可以在適當(dāng)?shù)暮幸宜徕c溶液(pH4.0-5.0)和EDTA的緩沖液中培養(yǎng)MBL復(fù)合體以實現(xiàn)上述分離的目的。此外，緩沖液中可以進(jìn)一步含有NaCl，可以采用本領(lǐng)域公知的技術(shù)容易地確定用于分離MBL-MASP復(fù)合體所合適的NaCl濃度。在一個具體實施方案中，緩沖液中NaCl的濃度至少為0.5M，更優(yōu)選緩沖液中NaCl的濃度約為1M。
然后采用適當(dāng)?shù)募兓襟E從MASPs中分離MBL以獲得純化的缺少MASP的MBL。典型的分離方法是基于大小/分子量進(jìn)行的，例如大小排阻層析，或采用過濾和/或電泳方法，或基于電荷進(jìn)行，例如離子交換層析，但是也可以采用其它適當(dāng)?shù)姆椒?。例如，采用聚丙烯酰胺葡聚糖S-300大小排阻層析或過濾方法。收集含有MBL的級分之后是對其進(jìn)行典型的濃縮過程。
在整個純化過程中，為增加缺少MASP的MBL和/或MBL-MASP復(fù)合體的濃度，需要在一個或更多個階段包括濃縮步驟?？梢酝ㄟ^親和純化方法達(dá)到上述目的，但也可以包括一個或更多個超濾步驟。優(yōu)選超濾膜具有10,000Da到100,000Da的截斷(cut-off)分子量。通常在整個濃縮過程中需要將MBL和/或MASP復(fù)合體保存在適當(dāng)?shù)木彌_液中。
由于缺少MASP的MBL來源于動物體/人體的生物產(chǎn)品，因此在缺少MASP的MBL的純化過程中優(yōu)選包含一個或更多個病毒滅活過程。病毒滅活技術(shù)是本領(lǐng)域公知的一項技術(shù)，典型的方法包括將MBL與病毒滅活試劑相接觸，例如清潔劑/溶劑聯(lián)合使用。美國專利US4,314,997和US4,315,991中描述了合適的清潔劑，同時也包括了Triton X-100和吐溫80，合適的溶劑包括了二烷基磷酸鹽和三烷基磷酸鹽，例如三(n-丁基)磷酸鹽。
“分離的”非重組性MBL是指非重組性MBL至少部分與其天然狀態(tài)下相關(guān)聯(lián)或連接的分子發(fā)生分離。分離的非重組性MBL優(yōu)選至少50％、優(yōu)選至少75％、更優(yōu)選至少90％與其天然狀態(tài)下相關(guān)聯(lián)的組分發(fā)生分離。
本發(fā)明者的研究表明，去除結(jié)合于非重組性MBL上的MASPs可以增強(qiáng)MBL激活補(bǔ)體途徑的能力。熟練人員可以掌握在純化過程中去除任何結(jié)合于MBL的已被激活的MASPs都將增強(qiáng)MBL組分的活性。通常情況下，去除越多的結(jié)合于MBL的已被激活的MASPs，MBL組分所具有的活性就會越高。基于此本發(fā)明生產(chǎn)出的藥物組合物，在與其起始來源(例如血漿)相比，非重組性MBL與已激活的MASPs之間具有較高的比率。
本發(fā)明的一個方面提供了一種組合物，其包含基本上不含有已激活的MASPs的純化的非重組性MBL，特別是不含有已激活的MASP-2。在上下文中，術(shù)語“基本上不含有(substantially free)”是指包含5μg分離的非重組性MBL的組合物，其C4富集試驗的結(jié)果大于約0.3U/μl。優(yōu)選C4富集試驗的結(jié)果約大于0.5U/μl，更優(yōu)選約大于0.75U/μl，更優(yōu)選約大于1U/μl，更優(yōu)選約大于1.25U/μl，甚至更優(yōu)選約大于1.5U/μl。合適的C4富集試驗為本領(lǐng)域所公知，同時此處也進(jìn)行了描述。
本發(fā)明的另一方面提供了一種純化基本上不含有已激活的MASP的非重組性MBL的方法。在上下文和一個具體實施例中，術(shù)語“基本上不含有”是由上述的C4富集試驗所決定的?；蛘咝g(shù)語“基本上不含有”也可以通過將起始材料的MASP活性與至少部分純化的MBL產(chǎn)品的MASP活性進(jìn)行對比來決定，此時尚未采用任何方法步驟對起始材料的MBL-MASP復(fù)合體進(jìn)行分離。在一個優(yōu)選的實施方案中，MASP的活性至少降低75％，更優(yōu)選至少降低80％，更優(yōu)選至少降低85％，更優(yōu)選至少降低90％，更優(yōu)選至少降低95％，更優(yōu)選至少降低97％，甚至更優(yōu)選至少降低99％。MASP活性試驗為本領(lǐng)域所公知，同時也包括了此處所描述的那些方法。
術(shù)語“已激活的MASP”是指MASP已不是原酶形式，而是由于蛋白質(zhì)水解作用而處于激活狀態(tài)。可以通過大小來區(qū)分已激活的MASP和原酶，原酶的分子量大約在70到110kDa，而已激活形式的酶由一條大約50到65kDa的重鏈和一條大約30到40kDa的輕鏈構(gòu)成?？梢酝ㄟ^在還原條件下進(jìn)行凝膠電泳來區(qū)分，電泳結(jié)束后進(jìn)行顯影和/或免疫檢測(例如Western印跡)。
然而，在一個優(yōu)選的實施方案中，MBL是基本上不含有MASPs的，因此激活與否是相對于MBL-MASP復(fù)合體來計算的。
由于親和力的增加，MBL在以低聚體的形式存在時功能更強(qiáng)。因此本發(fā)明的缺少MASP的MBL優(yōu)選保持其天然的低聚體狀態(tài)。優(yōu)選至少50％純化的MBL以低聚體形式存在，更優(yōu)選為四聚體或較高級數(shù)的低聚體。
B.藥物組合物本發(fā)明純化的缺少MASP的MBL可以與各種成分組合來生產(chǎn)缺少MASP的MBL組合物。典型的包括有用以生產(chǎn)藥物組合物(其可用于人體或動物體)的藥物學(xué)上可接受載體或稀釋劑的組合物以生產(chǎn)本發(fā)明的藥物組合物。術(shù)語“藥物學(xué)上可接受的”是指那些施與動物體、特別是哺乳動物體，甚至特別是人體時，不會產(chǎn)生過敏、毒性或其它不良反應(yīng)的分子實體和組合物。藥物學(xué)上可接受的介質(zhì)或載體包括了任何一種和所有的溶劑、分散劑、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、穩(wěn)定劑、等滲劑和延遲吸收劑等類似物質(zhì)。上述介質(zhì)和試劑作為藥物活性物質(zhì)的使用為本領(lǐng)域所公知。
合適的載體和稀釋劑包括了等滲鹽溶液，例如磷酸鹽緩沖液。載體也可以是溶劑或含有水、乙醇、多羥基化合物(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等類似物)和它們適當(dāng)混合物的分散介質(zhì)以及植物油?？梢酝ㄟ^使用包衣劑，例如卵磷脂，在進(jìn)行散開時通過保持所需顆粒的大小以及通過使用表面活性劑來保持適當(dāng)?shù)牧鲃有??？梢酝ㄟ^各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑來阻止微生物體的活動，例如parabens、氯丁醇、苯酚、山梨酸和硫柳汞等類似物。在許多情況下，優(yōu)選含有等滲劑，例如糖類或氯化鈉?？梢酝ㄟ^在組合物中使用延遲吸收劑來延長注射型組合物的吸收，例如單硬脂酸鋁和白明膠。
合適的穩(wěn)定劑包括了，但并不局限于藥物純級別的單糖、二糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、肌醇、葡聚糖等類似物和除MBL或MASP之外的血漿蛋白產(chǎn)品，如白蛋白、氨基酸以及多元醇(polyol)(例如聚乙二醇)等類似物。
組合物可以是諸如液體或固體等適當(dāng)?shù)男问??？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的任何技術(shù)獲得固體組合物，例如噴霧干燥、冷凍干燥、噴霧冷凍干燥、空氣干燥、真空輔助干燥和流床式干燥等類似方法。
本發(fā)明的組合物可以通過直接注射進(jìn)行給藥。組合物也可以設(shè)計成各種給藥途徑，包括腸胃外給藥、肌肉給藥和靜脈給藥。其它給藥系統(tǒng)可以包括按時釋放(time-release)、延遲釋放或持續(xù)釋放。上述系統(tǒng)可以避免重復(fù)施與本發(fā)明的缺少MASP的MBL組合物，為受試者和醫(yī)師帶來了方便?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員可以獲得并公知的多種類型延遲釋放給藥系統(tǒng)。
它們包括基于聚合體的系統(tǒng)，例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚酐和聚己酸內(nèi)酯；非聚合體系統(tǒng)，包括了脂質(zhì)，例如固醇，特別是膽固醇、膽甾醇酯和脂肪酸或中性脂肪，例如單甘油酯、二甘油酯和三甘油酯；水凝膠釋放系統(tǒng)；硅橡膠系統(tǒng)；肽基礎(chǔ)系統(tǒng)；蠟包衣，采用傳統(tǒng)的結(jié)合劑和賦形劑的壓縮片劑，部分融合包埋等類似系統(tǒng)。此外，也可以使用基于泵技術(shù)的金屬物給藥系統(tǒng)(hardware delivery system)，其中的一些系統(tǒng)適合于進(jìn)行移植操作。
也可以采用長期持續(xù)釋放植入物。此處所說的長期釋放是指合理構(gòu)建和安排植入物以便純化的MBL的治療水平可以保持至少30天，優(yōu)選60天。長期持續(xù)釋放植入物為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知。
MBL蛋白的典型給藥量是每千克體重0.001到100毫克，優(yōu)選0.01到10毫克/千克，更優(yōu)選0.05到1毫克/千克體重。
例如對于MBL缺乏的成人而言，適合的起始劑量為100毫升鹽中含有6毫克MBL，如果采用灌輸?shù)男问?，隨后劑量為約6毫克，如果需要每周進(jìn)行兩次。
上述給藥途徑和劑量僅僅起到一種指導(dǎo)作用，因為一名熟練的醫(yī)師能夠根據(jù)特定受試者和條件決定合適的給藥途徑和劑量。
本發(fā)明的組合物可以與含有未被激活的純化的MASPs組合物聯(lián)合給藥。可以采用本領(lǐng)域公知的重組技術(shù)制備適于聯(lián)合給藥的上述MASPs。可以通過GenBank Accession No.NM_001879獲得人MASP-1核酸序列，通過GenBank Accession AH010229獲得人MASP-2核酸序列，通過GenBankAccession AF284421獲得人MASP-3核酸序列C.MASP活性試驗需要通過試驗來證實本發(fā)明的MBL組合物中基本上不含有MASP。可以通過使用包括免疫方法(例如ELISA)在內(nèi)的各種技術(shù)測定MASP的存在。此外，還可以在切除標(biāo)記底物的基礎(chǔ)上進(jìn)行試驗來測定MASP的活性，例如MASP切除補(bǔ)體蛋白產(chǎn)生產(chǎn)物的C末端標(biāo)記肽-C2、C3、C4或C5。
此外，本發(fā)明提供了一種高靈敏度測定活性MASP的試驗方法，其所使用的底物來源于C4蛋白上的MASP切割位點。上述底物與美國專利US6,235,494中所公開的底物不同，因為在未進(jìn)行切割的補(bǔ)體蛋白的切割位點兩側(cè)都含有氨基酸序列，而美國專利US6,235,494中所公開的底物，其精氨酸切割位點的C-末端則不含有任何氨基酸殘基。額外氨基酸的增加使精氨酸的兩側(cè)為氨基酸所側(cè)接，從而提供了附加的特異性和穩(wěn)定性。
因此本發(fā)明提供了一種通式為X-R1-Arg-R2-Y的肽，其中R1-Arg-R2是來源于補(bǔ)體蛋白MASP切割位點的包含6個或更多個連續(xù)氨基酸的肽；X為氨基，保護(hù)基團(tuán)或可檢測性標(biāo)記；Y為羧基或可檢測性標(biāo)記，并且當(dāng)X是氨基或保護(hù)基團(tuán)時，Y不能是羧基，當(dāng)Y為羧基時，X不能是氨基或保護(hù)基團(tuán)。
優(yōu)選R1和/或R2包含至少3個氨基酸，優(yōu)選至少4個氨基酸。優(yōu)選R1-Arg-R2包含少于10個氨基酸，更優(yōu)選R1-Arg-R2由7或8個氨基酸組成。
衍生出R1-Arg-R2的補(bǔ)體蛋白切割位點優(yōu)選C2、C3、C4或C5蛋白的MASP切割位點，例如人C4的Arg756(登錄號(Accession No).P01028)。
本發(fā)明的肽包括，但并不局限于X-Lys-Gly-Gly-Leu-Gln-Arg-Ala-Leu-Glu-Ile-Y (序列1)X-Gly-Leu-Gln-Arg-Ala-Leu-Glu-Ile-Y (序列2)
X-Gly-Gly-Leu-Gln-Arg-Ala-Leu-Glu-Y(序列3)X-Gly-Gly-Leu-Gln-Arg-Ala-Leu-Glu-Ile-Y(序列4)X-Glu-Ser-Leu-Gly-Arg-Lys-Ile-Gln-Ile-Gln-Y(序列5)X-Ser-Leu-Gly-Arg-Lys-Ile-Gln-Ile-Y(序列6)X-Glu-Ser-Leu-Gly-Arg-Lys-Ile-Gln-Y(序列7)X-Ser-Leu-Gly-Arg-Lys-Ile-Gln-Ile-Gln-Y(序列8)也可以采用天然產(chǎn)生的補(bǔ)體蛋白切割位點序列的衍生物。術(shù)語“衍生物”是指除精氨酸殘基外，補(bǔ)體蛋白切割位點序列天然發(fā)生的微小的取代、插入和缺失，從而導(dǎo)致產(chǎn)生的序列可以為一個或更多個MASPs進(jìn)行切割，并且精氨酸切割位點的C-末端產(chǎn)生至少2個，優(yōu)選至少3個或至少4個氨基酸殘基。
可以使用如下表所示的保守取代，第二欄中同一(block)區(qū)的氨基酸，優(yōu)選第三欄中同一行的氨基酸可以相互進(jìn)行取代。
也可以使用非天然存在的氨基酸類似物進(jìn)行取代。
基于此處所公開的內(nèi)容，熟練人員很容易篩選出標(biāo)記了已知MASP切割底物的衍生物(既包括天然產(chǎn)生的氨基酸，和/或包括非天然產(chǎn)生的氨基酸)，并確定出適于在本發(fā)明試驗中所采用的衍生物。
X或Y之中至少一個是可檢測性標(biāo)記，從而允許對切割底物進(jìn)行檢測?？梢允褂萌魏魏线m的檢測性標(biāo)記，例如放射性標(biāo)記、比色標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記、產(chǎn)色標(biāo)記或熒光標(biāo)記。然而，在一個優(yōu)選實施方案中，其中的一個標(biāo)記是熒光標(biāo)記。在一個高度優(yōu)選的實施方案中，X是一種熒光標(biāo)記，而Y是一種猝滅劑分子，反之亦然。按照這種方式，在未進(jìn)行切割的底物中，如果X和Y相互之間在一定的距離之內(nèi)(例如相距8或更少個氨基酸)，就不會產(chǎn)生熒光信號。然而通過MASP對底物進(jìn)行切割后，猝滅劑分子就會與熒光標(biāo)記相分離，從而產(chǎn)生熒光信號。
猝滅劑分子包括，但并不局限于二硝基苯乙二胺(EDDnp)和賴氨酸(Dnp)。熒光標(biāo)記包括，但并不局限于7-氨基-4甲基香豆素(AMC)和氨基苯甲酸(Abz)。比色分子包括，但并不局限于對(Para)-硝基苯胺。
可以采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的典型合成技術(shù)制備本發(fā)明的肽，例如采用固相合成技術(shù)。Borgia和Fields(2000)總結(jié)了各種化學(xué)合成肽的技術(shù)，其詳細(xì)描述在此處一并作為參考。
可以通過試劑盒的形式提供本發(fā)明的試驗體系，這樣有助于測定樣品中已激活的MASP的水平。試劑盒所包括的底物盛裝在適當(dāng)?shù)娜萜髦?，或者與固體支持物相連，例如微量滴定板或其它適當(dāng)?shù)闹С治?，或盛裝在微量滴定板的孔中。試劑盒中也可以包含進(jìn)行試驗所需要的試驗指導(dǎo)。
試劑盒中也可以任選包含完成試驗所需要的其它試劑，其中包括了對照，胰島酶，F(xiàn)uthan或其它絲氨酸蛋白酶抑制劑，緩沖液，例如PBS，終止溶液和其它此類試劑。試劑盒中也可以包含合適的輔助性供應(yīng)品，例如微量滴定板，小瓶，已標(biāo)記的配體或已標(biāo)記的抗-配體，標(biāo)準(zhǔn)溶液，對照，清洗溶液，固相支持物等類似物。
本發(fā)明的肽可以用于檢測樣品中的MASP活性，例如含有上述純化的缺少MASP的MBL樣品，也可以用于檢測例如血液等生物樣品，上述樣品來源于受試者，其中包括了懷疑患有MBL缺乏癥的受試者。
由上可見，本發(fā)明提供了一種檢測樣品中存在MASP活性的方法，其中包括了將樣品與本發(fā)明的肽相接觸，并且檢測所述肽是否被切割。
檢測例如切割底物等蛋白水解活性的方法往往因標(biāo)記種類的不同而有所變化，例如基于定量測量或定性測量所進(jìn)行的檢測。
就定量測量而言，典型的作法是從反應(yīng)開始時就測量標(biāo)記激發(fā)所產(chǎn)生的信號，其結(jié)果用于獲得起始速率。僅僅由C4切割位點N-末端殘基組成的底物在被Cls和MBL-MASP復(fù)合體切割時才符合通常的Michaelis-Menten動力學(xué)。這意味著切割反應(yīng)的起始速率與底物濃度之間可以描繪成直角雙曲線，并且可以從數(shù)據(jù)的非線性回歸適合度中獲得常數(shù)km(米氏常數(shù)等同于酶和底物之間的親和性)和Vmax(最大反應(yīng)速度)。
然而，C4切割位點的N端和C端同時含有氨基酸殘基的底物在被Cls和MBL-MASP復(fù)合體切割時不符合Michaelis-Menten動力學(xué)。相反切割反應(yīng)的起始速率與底物濃度之間可以很好地描繪成S(Sigmoidal)曲線，這表明酶顯示出變構(gòu)行為或在切割P4-P’4底物時表現(xiàn)出正的共協(xié)作關(guān)系。此時曲線的非線性回歸適合度產(chǎn)生了3個不同的常數(shù)Vmax(仍是相互作用最大反應(yīng)速度)，k0.5(或最大反應(yīng)速度達(dá)到一半時底物的濃度，表明了酶和底物之間的親和性)以及Hill常數(shù)(h，表明了正的共協(xié)作程度)。
以前曾經(jīng)報道過C1抑制子(C1INH)與MASPs以1∶1的比率進(jìn)行結(jié)合。因此可以采用活性濃度已知的C1INH制品來測量MASP制品中活性酶的含量?？梢詫ls設(shè)為陽性對照來進(jìn)行，然后計算MASPs和熒光底物之間相互作用的Kcat。一旦繪制出相對于C1INH濃度的活性(熒光)，就可以從直線與X軸交匯點處測定出MASP制品中活性酶的濃度。
然后可以采用變構(gòu)動力學(xué)來確定酶底物反應(yīng)的k0.5和Vmax值。通過使用以下方程式等有關(guān)活性酶濃度的知識可以計算出酶底物反應(yīng)的Kcat常數(shù)Kcat＝Vmax/[活性酶]其中Vmax是酶-底物反應(yīng)的最大速度，[活性酶]是制品中具有切割底物能力的酶的摩爾數(shù)。
一旦確定了Kcat值，MASP制品可在底物的濃度是k0.5值的二倍時分析，所產(chǎn)生的速度通常等同于Vmax。然后將Kcat和Vma值代入方程式Kcat＝Vmax/[活性酶]。通過對方程式進(jìn)行重新排列就可以估測出樣品中活性酶的濃度。
D.治療用途本發(fā)明的藥物組合物可用于治療需要MBL的受試者。
此處所采用的“有效劑量”是指至少能足以提高受試者免疫系統(tǒng)調(diào)理病原體的能力并且可以誘導(dǎo)針對病原體的補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)的劑量。
受試者可包括骨髓同種異體移植接受者、囊腫性纖維化受試者、免疫缺陷受試者、急性成淋巴細(xì)胞白血病受試者、社區(qū)獲得性(communityacquired)或醫(yī)院性敗血病受試者、病原體感染或病原體易感性受試者、低出生體重和/或早熟嬰兒。典型的是，受試者具有MBL缺乏，例如適度MBL缺乏癥。
此處所采用的“MBL缺乏癥”是指受試者的MBL水平低于500ng/ml和/或受試者的C4富集(deposition)試驗結(jié)果小于0.3U/μl。特別是那些MBL水平低于400ng/ml的受試者將受益于本發(fā)明所描述的方法，例如MBL水平低于300ng/ml的受試者，或MBL水平低于250ng/ml的受試者，或MBL水平低于200ng/ml的受試者。
病原體可以是任何生物體，其包含有能與MBL相結(jié)合的分子，從而激活補(bǔ)體途徑。上述病原體可以是酵母、革蘭氏陰性腸道細(xì)菌、革蘭氏陽性細(xì)菌、分枝桿菌、一些病毒和特定的寄生蟲等。上述病原菌更具體的實例包括，但并不局限于那些選自以下組的病原體寄生蟲，例如Cryptospridiumparvum和Plasmodium falciparum；真菌，例如隱球酵母屬，包括新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)，白色假絲酵母(Candida albican)和煙曲霉(Aspergillus fumigatus)；細(xì)菌，例如β溶血鏈球菌組(haemolytic streptoccus)A，Bifidobacterium bifidum，Actinomyces israelli，Proprionibacterium acnes，擬桿菌屬(Bacteroides sp.)，大腸桿菌，真細(xì)菌屬(Eubacterium sp.)，梭菌屬(Fusobacterium sp.)，韋榮氏球菌屬(Veillonella sp.)，流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)，淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)，腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，Salmonella enterica，Burkholderia cepacia和肺炎克雷白氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)。
特定的適應(yīng)癥包括神經(jīng)病學(xué)慢性炎性脫髓鞘多聚神經(jīng)病(CIDP)，多焦肌肉運動性神經(jīng)病，多重硬化癥(Multiple Sclerosis)，肌無力(Myasthenia)Gravis，伊頓脈管炎-蘭伯特(Eaton-lamlert’s)綜合病癥，Opticus神經(jīng)炎(Neuritis)，癲癇癥；婦科醫(yī)學(xué)習(xí)慣性流產(chǎn)(Abortus habitualis)，原發(fā)性(primary)抗磷脂綜合病癥；風(fēng)濕病學(xué)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性狼瘡erythematosus，系統(tǒng)性硬皮病，脈管炎(vasculitis)，Wegner氏肉芽腫病(granulomatosis)，Sjogren氏綜合病癥，青少年風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；血液病學(xué)自體免疫性嗜中性白血球減少癥，自體免疫性溶血性貧血，嗜中性白血球減少癥；腸胃病學(xué)克羅恩氏(crohn’s)病，大腸潰瘍(Colitis)，乳糜泄(coeliacdisease)；其它哮喘(Asthma)，白血病(Septic)休克綜合病癥，慢性疲勞(fatigue)綜合病癥，牛皮癬(Psoriasis)，中毒性休克綜合病癥，糖尿病，Sinuitis，膨脹性心肌炎(Dilated cardiomyopathy)，心內(nèi)膜炎(Endocarditis)，動脈硬化癥(Atherosclerosis)，成人AIDS和細(xì)菌感染，包含普通可變性免疫缺陷的原發(fā)性亞/丙種球蛋白缺乏癥，Wiskot-Aldrich綜合病癥和嚴(yán)重性結(jié)合免疫缺陷(SCID)，患有慢性淋巴性白血病(CLL)和多種骨髓瘤的次發(fā)性亞/丙種球蛋白缺乏癥(hypo/agammaglobulinaemia)，兒童AIDS和細(xì)菌感染，急性和慢性先天性血小板紫癜(thrombocytopenic purpura)(ITP)，異源性骨髓移植(BMT)，川崎(Kawasaki’s)病和Guillan-Barre氏綜合病癥。
現(xiàn)有結(jié)果表明缺乏MBL的嬰兒容易感染急性成淋巴細(xì)胞白血病。因此，也可以采用本發(fā)明的方法預(yù)防由MBL缺乏或與MBL缺乏相關(guān)的各種紊亂，例如急性成淋巴細(xì)胞白血病。因此適合于本發(fā)明的還包括那些由于MBL缺乏而經(jīng)受上述紊亂的那些受試者，例如經(jīng)受急性成淋巴細(xì)胞白血病危險升高的MBL缺乏嬰兒。
參照以下實施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明，其僅僅是對本發(fā)明進(jìn)行解釋說明并不對其構(gòu)成限制作用。
實施例實施例1-缺少MASP的MBL的純化在低于5℃的溫度下軟化并溶解新鮮冷凍的血漿，然后采用連續(xù)流動離心從冰冷的上清液中分離冰冷的沉淀。向冰冷的上清液中加入冷乙醇，終濃度達(dá)到8％(v/v)。在-2℃±1℃下，采用離心或過濾方法從上清液中分離形成的沉淀。處理上清液以吸收脂蛋白，并過濾澄清。采用截斷分子量不低于10000道爾頓的超濾膜對脫脂上清液進(jìn)行完全過濾以降低電導(dǎo)率。降低脫脂的完全過濾所獲得的上清液的pH以促進(jìn)真球蛋白發(fā)生沉淀，并且通過過濾作用回收澄清的上清液，在此過程中收集的真球蛋白糊劑經(jīng)進(jìn)一步純化處理以提取MBL-MASP復(fù)合體。
在環(huán)境溫度下進(jìn)行純化過程。在室溫下，采用20mM Tris/100mMNaCl/15mM CaCl2緩沖液溶解真球蛋白糊劑1小時。通過離心去除不溶性物質(zhì)。采用親和層析方法從其它血漿蛋白中分離MBL-MASP復(fù)合體，將可溶性真球蛋白糊劑上甘露聚糖-瓊脂糖柱，在采用10mM EDTA洗脫MBL-MASP復(fù)合體之前，用Tris/NaCl/CaCl2/吐溫20緩沖液清洗柱子。
然后用含有EDTA的0.1M乙酸鈉溶液(pH5.0)培養(yǎng)洗脫液，使MASPs從MBL分子上分離出來。上述材料上聚丙烯酰胺葡聚糖S-300大小排阻柱并用SDS page膠對級分進(jìn)行分析。結(jié)果顯示出已從其它蛋白成分中分離出MBL。采用本發(fā)明描述的底物試驗對級分的MASP活性進(jìn)行分析。7種含有MBL的級分具有較低水平或幾乎缺少MASP活性。每一級分的總蛋白濃度在10-90μg/mL之間。
實施例2-證實缺少MASPs的試驗對實施例1獲得的混合MBL級分進(jìn)行檢測以確定MBL基本上不含有MASPs。
底物設(shè)計MASPs的底物設(shè)計是在C4蛋白天然底物切割位點(756R)周圍氨基酸序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。上述底物用于確定MBL純化材料中MASPs的活性。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)所包括的額外氨基酸使精氨酸的側(cè)接為氨基酸，從而提供了附加的特異性和穩(wěn)定性(表1)。
表1-純化的MBL-MASP復(fù)合體中MASPs蛋白水解活性的動力學(xué)常數(shù)，合成底物的是基于補(bǔ)體蛋白C4的P4-P1和P4-P4’氨基酸
底物(2Abz-GLQRALEI-Lys(Dnp)-NH2)中，在C4切割位點的前面和后面各有4個氨基酸，并且氨苯甲酸(aminobenzoic acid)(Abz)熒光基團(tuán)吸附于N末端。當(dāng)Lys(Dnp)與Abz基團(tuán)的距離不超過8個氨基酸時，Lys可使Abz發(fā)生猝滅(quench)作用。底物的切割位點位于Abz基團(tuán)和Lys(Dnp)基團(tuán)之間，從而保證了當(dāng)酶對底物進(jìn)行切割時，Lys(Dnp)的猝滅能力喪失，Abz基團(tuán)發(fā)出熒光。然后對熒光的變化進(jìn)行檢測，其與酶的蛋白水解活性呈一定的比例關(guān)系。試驗證實存在于純化的MBL材料中的MASPs可以對該底物進(jìn)行切割(K0.5＝6.5μM)。
如果在以純化的MBL材料進(jìn)行試驗時，觀察到了蛋白水解活性(例如熒光發(fā)生改變)，這表明沒有成功去除MASPs，接下來以抗-MASP的抗體進(jìn)行ELISA或免疫雜交試驗以證實上述結(jié)果是由于MASPs的蛋白水解活性造成的，而不是由MBL產(chǎn)品中一些其它蛋白酶而引起的。底物切割試驗中可以使用與MASPs同源性最近的Cls作為陽性對照。
底物切割試驗用熒光試驗緩沖液對底物進(jìn)行稀釋(FAB-50mM tris-羥基亞甲基，150mM NaCl，0.2％聚乙二醇8000，0.02％疊氮化鈉，pH7.4)，從而使終濃度達(dá)到與Vmax相等。底物和酶(Cls(10μg/mL)或純化的MBL材料)在熒光板中培養(yǎng)幾分鐘，讀數(shù)器設(shè)定在37℃。然后將100μL稀釋底物轉(zhuǎn)移到含有100μL稀釋酶(Cls或純化的MBL材料)的孔中，并在激發(fā)波長＝320nm，發(fā)射波長＝420nm處測量熒光動力學(xué)。每次檢測執(zhí)行3次。然后從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出熒光數(shù)量，進(jìn)而計算出純化的MBL材料中活性MASP酶的濃度。
實施例3-缺少MASP的MBL能夠從血漿中補(bǔ)充MASPs并且能夠激活補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)定量試驗的標(biāo)準(zhǔn)曲線和對照材料采用國際主要標(biāo)準(zhǔn)混合血清(Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark)對全部的定量試驗進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，其中每毫升血清中含有3.3μgMBL。對于夾層(Sandwich)ELISA和C4富集試驗，對上述血清進(jìn)行1∶25、1∶50、1∶75、1∶100、1∶150、1∶200倍稀釋以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行3重測定。對于甘露聚糖結(jié)合ELISA則按照1∶25、1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶300和1∶400倍進(jìn)行稀釋，稀釋液詳述如下。采用混合的正常供體血漿制備內(nèi)部(in-house)二級對照，每一檢測板進(jìn)行3次，將每次檢測的結(jié)果進(jìn)行繪圖。任何一次檢測結(jié)果中，如果獲得的內(nèi)部對照MBL數(shù)值與之前確定的平均值相比超過+/-ZSD，則放棄整次檢測。每次(run)與每次之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行覆蓋以確保獲得恒定的斜率，因此也為定性對照提供了靈敏的工具。
采用雙抗體夾層ELISA對MBL進(jìn)行定量(“雙抗體試驗”)此MBL抗原檢測試驗是在Garred等(1992)提出的原始方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，除商業(yè)性IgG鼠單抗外，采用抗-人MBL替代兔抗-MBL多克隆抗，因為抗-人MBL可與MBL結(jié)構(gòu)單元成膠(collagenous)頸項區(qū)域的肽抗原表位靶向結(jié)合。
簡言之，蓋上平底微量滴定板(Nunc-Immuno Maxisorp，Nalge NuncInternational)，并在4℃下過夜培養(yǎng)，微量滴定板中裝有2μg/ml抗-MBL單抗(Staten Serum Institiut，Copenhagen，Denmark)，上述單抗溶于新鮮的50mM碳酸鹽-重碳酸鹽(bicarbonate)緩沖液，pH9.6中。用0.1M PBS-0.05％吐溫20，pH7.4(TBST)將正常的供體血漿稀釋1∶25和1∶100倍，并進(jìn)行3重測定，上述緩沖液也用作清洗緩沖液。22℃培養(yǎng)90分鐘后，將孔清洗3次，按1∶4000的比例加入用生物素標(biāo)記(Biotin Tag)(Sigma-Aldrich Pty Ltd)的單克隆抗-MBL，上述稀釋比例是采用混合正常血漿通過棋盤(chequerboard)格滴定所確定的。22℃培養(yǎng)90分鐘后，將孔清洗3次，加入ExtrAvidin過氧化物酶共軛體(1∶500)，并在22℃培養(yǎng)40分鐘。采用OPD片劑和稀釋液(AbbottLaboratories，Illinois，USA)進(jìn)行顯色，用1N的硫酸終止反應(yīng)，并在Bio-Rad讀板儀(Bio-Rad laboratories Pty Ltd.，Regents Park，Australia)中在490nm下立即讀取數(shù)據(jù)。
run變異系數(shù)(cv)在1∶25時為8.2％和在1∶100時為12％。Run to run標(biāo)準(zhǔn)曲線重疊以確定恒定斜率(costant slope)，由此提供了定性對照的靈敏的工具。
采用甘露聚糖結(jié)合ELISA對MBL進(jìn)行定量(“甘露聚糖結(jié)合試驗”)此試驗是在Holmskov等(1993)方法的基礎(chǔ)上測量MBL與甘露聚糖相結(jié)合的能力，上述甘露聚糖包被于聚丙烯基質(zhì)上。
蓋上微量滴定板(如上所述)，并在4℃下過夜培養(yǎng)，微量滴定板中裝有10μg/ml甘露聚糖(Sigma-Aldrich Pty Ltd，Castle Hill，Australia)，其溶于新鮮的50mM碳酸鹽-重碳酸鹽緩沖液，pH9.6中。按照夾層ELISA方法進(jìn)行正常供體血漿檢測，但以加入15mM CaCl2、并含有0.05％吐溫-20的Tris緩沖鹽(TBST)，pH7.5作為稀釋液和清洗緩沖液。所有培養(yǎng)都在22℃下進(jìn)行，MBL和抗體每次捕獲時間為90分鐘。與ExtrAvidin過氧化物酶培養(yǎng)僅需30分鐘。按照夾層ELISA的方法進(jìn)行顯色和數(shù)據(jù)讀取。
按1∶25進(jìn)行稀釋時，兩次檢測(run)之間的變異系數(shù)(CV)為6.1％，按1∶100進(jìn)行稀釋時，CV為8.8％。每次與每次之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行覆蓋以確保獲得恒定的斜率，因此也為定性對照提供了靈敏的工具。
采用Statens Serum Institut主要標(biāo)準(zhǔn)混合血清所繪制的線性標(biāo)準(zhǔn)曲線證實了上述試驗中MBL的特異性。在每次試驗中，本發(fā)明也采用純化的甘露聚糖結(jié)合凝集素進(jìn)行了有限的稀釋測驗，上述甘露聚糖結(jié)合凝集素由甘露聚糖親和層析制備而來并經(jīng)Western免疫印跡所證實。在甘露聚糖結(jié)合試驗中，本發(fā)明通過采用10mM EDTA或0.1M甘露糖溶液稀釋檢測樣品阻止了與血漿MBL之間的結(jié)合作用。
功能性補(bǔ)體(C4)富集試驗(“C4富集試驗”)在此之前，Super等(1989)描述了對C3b和C3bi富集(deposited)進(jìn)行檢測，Valdimarsson等(1998)對其進(jìn)行了改進(jìn)。本試驗顯示了通過結(jié)合固相純化甘露聚糖使MBL發(fā)生激活之后所進(jìn)行的C4b富集作用。
蓋上微量滴定板(如上所述)，并在4℃下過夜培養(yǎng)，微量滴定板中裝有1μg/ml甘露聚糖(Sigma-Aldrich Pty Ltd，Castle Hill，Australia)，其溶于新鮮的50mM碳酸鹽-重碳酸鹽緩沖液，pH9.6中。用含有15mM CaCl2的TBST溶液，pH7.2，將正常的供體血漿稀釋1∶25倍，并進(jìn)行3重測定，上述緩沖液也用作清洗緩沖液。同時檢測1∶10倍的稀釋液，其作用僅僅是證實在MBL低含量的供體中，C4富集的水平也很低或幾乎不存在。22℃培養(yǎng)90分鐘后，將孔清洗5次，加入缺少MBL的人血清(完全缺少MBL，獲得于informedconsent)，其是用巴比妥(barbital)溶液，14mM NaCl，10mM巴比妥鈉(sodiumbarbitone)和5mM CaCl2按1∶20的比例稀釋而得的。22℃培養(yǎng)30分鐘以保證完成補(bǔ)體激活。用清洗緩沖液將孔清洗5次，加入用TBST按1∶1500倍稀釋的經(jīng)生物素標(biāo)記(Sigma-Aldrich Pty Ltd)的兔抗-人C4(Sigma-Aldrich PtyLtd)。22℃培養(yǎng)90分鐘后，將孔清洗5次，加入用TBST按1∶500倍稀釋的ExtrAvidin過氧化物酶(Sigma-Aldrich Pty Ltd)，并在22℃培養(yǎng)40分鐘。顯色反應(yīng)和數(shù)據(jù)讀取與定量試驗相同。
1μl Statens Serum Institut(SSI)的MBL標(biāo)準(zhǔn)對應(yīng)于1個單位的C4富集活性。參照SSI的標(biāo)準(zhǔn)可以將試驗進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。按1∶25倍進(jìn)行稀釋時，兩次檢測之間的CV為9.4％。
缺少MASP的MBL能夠補(bǔ)充MASP并且能夠激活補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)的證實
(4)聚合物JR30M，購自Amerchol(5)聚合物L(fēng)R400，購自Amerchol(6)Polyox WSR N-750，購自Amerchol(7)Polyox WSR N-3000，購自Amerchol(8)Polyox WSR N-60K，購自Amerchol(9)Viscasil 330M，購自General Electric Silicones(10)DC1664，購自Dow Corning Silicones(11)ZPT，其平均粒徑為約2.5m，購自Arch/Olin。
洗發(fā)劑組合物-實施例11-20
(1)瓜耳膠，其分子量為約400,000，且其電荷密度為約0.84meq/g，購自Aqualon。
(2)瓜耳膠，其分子量為約400,000，且其電荷密度為約2.0meq/g，購自Aqualon。
(3)陽離子瓜耳膠Jaguar C17，購自Rhodia(4)聚合物JR30M，購自Amerchol(5)聚合物L(fēng)R400，購自Amerchol(6)Polyox WSR N-750，購自Amerchol(7)Polyox WSR N-3000，購自Amerchol(8)Polyox WSR N-60K，購自Amerchol(9)Viscasil 330M，購自General Electric Silicones(10)DC1664，購自Dow Corning Silicones(11)ZPT，其平均粒徑為約2.5m，購自Arch/Olin。
實施例4-缺少MASP的MBL補(bǔ)充MASP和補(bǔ)體激活能力的證實按照總蛋白濃度將實施例3中獲得的級分進(jìn)行混合。第一個混合樣品包括級分3-7，其總蛋白濃度為85μg/ml。第二個混合樣品由級分8和9組成，其總蛋白濃度為35μg/ml。在濃度為1-100μg/ml的范圍內(nèi)，以MBL-MASP復(fù)合體為平行對照，再次對上述兩個缺少MASP的MBL混合樣品進(jìn)行滴定。所有的樣品都要平行進(jìn)行甘露聚糖結(jié)合試驗和C4富集試驗。相對于級分的C4激活能力，將實際MBL的量化結(jié)果(甘露聚糖結(jié)合試驗)進(jìn)行繪圖。
結(jié)果與實施例3中每一單獨級分的分析結(jié)果相比，不含有MASP的MBL混合級分表現(xiàn)出了可重復(fù)再現(xiàn)的結(jié)果。由級分3-7組成的混合樣品，其補(bǔ)體激活能力過剩，由級分8和9組成的混合樣品，其補(bǔ)體激活能力達(dá)到試驗上限，而MBL-MASP復(fù)合體在12μg時，開始出現(xiàn)最高穩(wěn)定水平，并且隨著MBL濃度的不斷增加，C4富集基本不再增加，上述結(jié)果重復(fù)了實施例3的試驗結(jié)果。缺少MASP的MBL具有超級的補(bǔ)充MASP的能力，并且如結(jié)果所示其具有比MBL-MASP復(fù)合體更加有效的激活補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)的能力(參見附圖2和表3)。
表3-在甘露聚糖結(jié)合試驗和C4富集試驗中對缺少MASP的混合級分(3-7和8-9)和親和純化的MBL-MASP復(fù)合體進(jìn)行的滴定
結(jié)果也繪制于附圖2中。
結(jié)論實施例3和4的結(jié)果顯示出缺少MASP的MBL能夠從血漿中補(bǔ)充MASPs，并且能夠成功地激活補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)。游離的MASPs在血漿中處于循環(huán)狀態(tài)，并且其含量超過了MBL-MASP復(fù)合體。個體的MASP-1水平在1.48到12.83μg/ml之間。血清中MASP-1水平的算術(shù)平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差為6.27±1.85μg/ml。研究表明血清中MASP-1的水平與年齡強(qiáng)烈相關(guān)，血清中MBL的水平也如此。同時研究也表明血清中MASP-1的水平顯著高于MBL的水平(1.71±1.13μg/ml)，并且人體血清中絕大多數(shù)的MASP-1似乎以循環(huán)的形式存在，其并不與MBL相結(jié)合(Terai等，1995)。通常認(rèn)為MASP-2的水平低于MASP-1。當(dāng)采用乙酸鈉緩沖溶液(pH5.0)對MBL-MASP復(fù)合體進(jìn)行透析時，MASP與MBL發(fā)生破壞分離，隨后用TBST EDTA緩沖溶液(pH7.8)進(jìn)行透析時，MBL與MASP重新形成復(fù)合體。采用低pH方法分離MBL-MASP復(fù)合體是一種可逆的過程(Tan等，1996)。
此外，這些數(shù)據(jù)表明以復(fù)合體形式被純化的MBL具有有限的激活補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)的能力，這可能是由于在純化過程中，MBL的MASP結(jié)合位點被已激活的MASP所封堵，從而降低了其與新鮮MASPs相結(jié)合的能力。例如，當(dāng)采用先前描述的甘露聚糖柱親和純化或采用WO99/64453中教導(dǎo)的非共軛性多糖基質(zhì)對MBL進(jìn)行純化時，MBL與MASPs共同被純化下來。雖然在親和純化步驟中，由于與多糖底物相接觸，保證了一定級分的MASPs仍保持其原酶形式(90kDa)，但大多數(shù)MASPs仍以被激活的形式與MBL一起洗脫下來。
通過對缺少MASP的MBL進(jìn)行的體外C4富集試驗檢測表明，與純化的MBL-MASP復(fù)合體相比，其具有超級的補(bǔ)充MASP和起始補(bǔ)體激活的能力。通常情況下，體內(nèi)產(chǎn)生的與MBL-MASPs復(fù)合體相關(guān)聯(lián)的MASPs僅僅在MBL與外源生物體發(fā)生特異性結(jié)合后才能被激活，這就是MBL途徑中補(bǔ)體激活的主要調(diào)控點。因此施與含有已激活的MASPs的MBL就消除了上述調(diào)控機(jī)制。
包括C1抑制子(C1INH)在內(nèi)的生理性抑制子可與已激活的MASP-1和MASP-2形成復(fù)合體，同時ClINH也可以劑量依賴的方式抑制MASP-1的C3切割作用。MASP-1對C2的激活作用以及MASP-2對C4和C2的激活作用也是相同的。具有非常強(qiáng)大的蛋白酶抑制活性的β2-巨球蛋白也對MASPs具有抑制作用(Storgaard等，1995)。
然而，缺乏如C1INH等抑制子的情況是很少發(fā)生的，這就意味著缺少抑制子的個體在施與MBL-MASP復(fù)合體之后，容易產(chǎn)生并發(fā)癥，這是因為激活了不適當(dāng)?shù)难a(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)。因此本發(fā)明認(rèn)為吸附有關(guān)聯(lián)性MASPs的MBL純化產(chǎn)品不僅效率很底，甚至存在著潛在的醫(yī)療危險。
以上說明書中提及的全部出版物此處一并作為參考。
對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，對本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)所作的各種修改和變化都顯然未超出本發(fā)明的范圍和精神。雖然本發(fā)明是在結(jié)合具體優(yōu)選實施例的基礎(chǔ)上進(jìn)行描述的，但應(yīng)理解為本發(fā)明請求保護(hù)的并不僅僅局限于上述特定的實施方案。事實上，對于分子生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，對完成本發(fā)明所描述方式的各種修改都將落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在整個說明書中，除非上下文需要，否則詞語“包含”及其變化形式應(yīng)理解為暗示包含了確定的整體或步驟或幾組整體或步驟，但也不排除其它任何整體或步驟或其它幾組整體或步驟。
上述特定部分中對特定的實施方案進(jìn)行了描述，但對上述實施例進(jìn)行必要的修正后也可恰當(dāng)?shù)赜糜谄渌糠帧?br> 任何對本說明書中已包括的文獻(xiàn)、技術(shù)、材料、裝置、文章等類似物所進(jìn)行的討論，其目的僅僅是為了提供本發(fā)明所包括的內(nèi)容。沒有必要將上述內(nèi)容之任一或全部看作是形成部分已有技術(shù)的基礎(chǔ)或是與本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的普通常識性知識，這是因為在本申請每項權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日之前它們就已經(jīng)存在了。
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序列表<110>昆士蘭醫(yī)學(xué)研究學(xué)院理事會(The Council of the Queensland Institute of Medical Research)<120>甘露糖結(jié)合凝集素及其應(yīng)用<130>501303<150>AU PS 1961<151>2002-04-24<150>AU 2002953324<151>2002-12-13<160>8<170>Patcntln version 3.1<210>1<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>切割底物<400>1Lys Gly Gly Leu Gln Arg Ala Leu Glu Ile1 5 10<210>2<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>切割底物<400>2Gly Leu Gln Arg Ala Leu Glu Ile1 5<210>3<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>切割底物<400>3Gly Gly Leu Gln Arg Ala Leu Glu1 5
<210>4<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>切割底物<400>4Gly Gly Leu Gln Arg Ala Leu Glu Ile1 5<210>5<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>切割底物<400>5Glu Ser Leu Gly Arg Lys Ile Gln Ile Gln1 5 10<210>6<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>切割底物<400>6Ser Leu Gly Arg Lys Ile Gln Ile1 5<210>7<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>切割底物<400>7Glu Ser Leu Gly Arg Lys Ile Gln1 5<210>8<211>9<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>切割底物<400>8Ser Leu Gly Arg Lys Ile Gln Ile Gln1 權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，其包含分離的非重組性甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，其中分離的非重組性甘露糖結(jié)合凝集素中基本上不含有已被激活的與絲氨酸蛋白酶(MASPs)相締和的MBL。
2.按照權(quán)利要求1所述的組合物，其中MBL基本上不含有MASPs。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中MBL是人MBL。
4.按照權(quán)利要求1-3中任一項所述的組合物，其中的MBL通過下述方法獲得(i)提供一種非重組性MBL和一個或更多個MASPs的復(fù)合體；(ii)在適當(dāng)?shù)木彌_液中培養(yǎng)上述復(fù)合體，使MBL與一個或更多個MASPs發(fā)生解離；并且(iii)從一個或更多個MASPs中將MBL分離。
5.按照權(quán)利要求4所述的組合物，其中步驟(ii)中的緩沖液是pH從4.0到5.0的EDTA/乙酸鹽緩沖液。
6.按照權(quán)利要求4或5所述的組合物，其中步驟(ii)中的緩沖液包含NaCl。
7.按照權(quán)利要求4至6中任意一項所述的組合物，其中步驟(iii)中包括層析方法和/或過濾。
8.按照權(quán)利要求7所述的組合物，其中層析方法選自下組大小排阻層析和離子交換層析。
9.一種生產(chǎn)藥物組合物的方法，其包括(i)提供一種非重組性MBL和一個或更多個MASPs的復(fù)合體；(ii)從至少部分的一個或更多個MASPs中使MBL發(fā)生解離；(iii)從至少部分的一個或更多個MASPs中使MBL分離；并且(iv)將第(iii)步產(chǎn)生的MBL與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑相混合。
10.按照權(quán)利要求9的方法，其中步驟(ii)包括在適當(dāng)?shù)木彌_液中培養(yǎng)復(fù)合體。
11.按照權(quán)利要求10的方法，其中緩沖液是pH從4.0到5.0的EDTA/乙酸鹽緩沖液。
12.按照權(quán)利要求10或11的方法，其中緩沖液中包含NaCl。
13.按照權(quán)利要求9至12中任意一項的方法，其中步驟(iii)中包括層析方法和/或過濾。
14.按照權(quán)利要求13所述的方法，其中層析方法選自下組大小排阻層析和離子交換層析。
15.按照權(quán)利要求9至14中任意一項所述的方法，其中步驟(i)中包括從血漿分級過程中提供附加級分。
16.按照權(quán)利要求15所述的方法，其中步驟(i)進(jìn)一步包括了采用甘露聚糖親和層析法從其它血漿蛋白中分離非重組MBL和一個或更多個MASPs復(fù)合體的步驟，其中所述其它血漿蛋白存在于血漿分級過程中產(chǎn)生的附加級分中。
17.由權(quán)利要求9至16中任一項的方法所獲得的藥物組合物。
18.按照權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其基本上不含有已激活的MASPs。
19.一種在受試者中治療或預(yù)防疾病的方法，其包括了給受試者施用有效劑量的權(quán)利要求1至8、17或18中任一項所述的藥物組合物。
20.按照權(quán)利要求19所述的方法，其中受試者為骨髓同種異體移植接受者。
21.按照權(quán)利要求19所述的方法，其中受試者為免疫缺陷受試者。
22.按照權(quán)利要求19所述的方法，其中受試者為社區(qū)獲得性或醫(yī)院性敗血病受試者。
23.按照權(quán)利要求19所述的方法，其中受試者為低出生體重和/或早熟嬰兒。
24.按照權(quán)利要求19所述的方法，其中受試者為病原體感染受試者。
25.按照權(quán)利要求19至24中任意一項所述的方法，其中受試者具有MBL缺陷。
26.按照權(quán)利要求25所述的方法，其中受試者具有發(fā)展為急性成淋巴細(xì)胞白血病危險的嬰兒。
27.包含分離的非重組性MBL的治療組合物在預(yù)防或治療中的應(yīng)用，上述組合物基本上不含有已活化的MASPs。
28.包含分離的非重組性MBL的治療組合物在預(yù)防或治療中的應(yīng)用，上述組合物基本上不含有MASPs。
29.包含分離的非重組性MBL的組合物在生產(chǎn)藥物中的應(yīng)用，上述組合物基本上不含有MASPs，該藥物用于施用給需要上述組合物的受試者。
30.按照權(quán)利要求29所述的應(yīng)用，其中受試者為骨髓同種異體移植接受者。
31.按照權(quán)利要求29所述的應(yīng)用，其中受試者為免疫缺陷受試者。
32.按照權(quán)利要求29所述的應(yīng)用，其中受試者為社區(qū)獲得性或醫(yī)院性敗血病受試者。
33.按照權(quán)利要求29所述的應(yīng)用，其中受試者為具有發(fā)展為急性成淋巴細(xì)胞白血病危險的嬰兒。
34.按照權(quán)利要求29所述的應(yīng)用，其中受試者為低出生體重和/或早熟嬰兒。
35.按照權(quán)利要求29所述的應(yīng)用，其中受試者為病原體感染受試者。
36.按照權(quán)利要求29至35中任意一項所述的應(yīng)用，其中組合物基本上不含有MASPs。
37.一種通式為X-R1-Arg-R2-Y的肽，其中R1-Arg-R2是來源于補(bǔ)體蛋白MASP切割位點的由6個或更多個連續(xù)氨基酸組成的肽；X為氨基、保護(hù)基團(tuán)或可檢測性標(biāo)記；Y為羧基或可檢測性標(biāo)記，并且當(dāng)X是氨基或保護(hù)基團(tuán)時，Y不是羧基，當(dāng)Y為羧基時，X不是氨基或保護(hù)基團(tuán)。
38.按照權(quán)利要求37所述的肽，其中補(bǔ)體蛋白是C4。
39.按照權(quán)利要求38所述的肽，其中C4蛋白是人C4蛋白并且切割位點包含Arg756。
40.按照權(quán)利要求37至39中任意之一所述的肽，其中X是猝滅劑分子，Y是熒光標(biāo)記，反之亦然，從而保證當(dāng)?shù)孜锉磺懈顣r可以獲得熒光信號。
41.權(quán)利要求37至40中任意一項所述的肽在確定樣品中存在有MASP活性的方法中的應(yīng)用。
42.按照權(quán)利要求41所述的應(yīng)用，其中樣品是權(quán)利要求1至8、17或18中任意一項所述的組合物。
43.一種確定樣品中存在MASP活性的方法，其包括將樣品與權(quán)利要求37至40中任意一項所述的肽相接觸，并確定上述肽是否被切割。
44.按照權(quán)利要求43所述的方法，其中樣品是權(quán)利要求1至8、17或18中任意一項所述的組合物。
45.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1至3中任意一項藥物組合物的方法，其包括(i)提供一種非重組性MBL和一個或更多個MASPs的復(fù)合體；(ii)在適當(dāng)?shù)木彌_液中培養(yǎng)上述復(fù)合體，使MBL與一個或更多個MASPs發(fā)生解離；(iii)從一個或更多個MASPs中將MBL分離；(iv)采用權(quán)利要求43所述的方法，在步驟(iii)所獲得的MBL中篩選MASP活性；并且(v)將上述產(chǎn)生的純化的MBL與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑相混合。
全文摘要
本發(fā)明表明缺少MASP的MBL能夠從血漿中補(bǔ)充MASPs，并且能夠成功地激活補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)。此外，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)與缺少MASP的MBL相比，純化的MBL復(fù)合體具有有限的激活補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)能力。因此，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含分離的非重組性甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)以及制藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，其中分離的非重組性甘露糖結(jié)合凝集素中基本上不含有已被激活的與絲氨酸蛋白酶(MASPs)相交聯(lián)的MBL。同時，本發(fā)明還提供了一種治療需要MBL的受試者的方法，包括了給受試者施用有效劑量的本發(fā)明的藥物組合物。
文檔編號A61P33/00GK1646152SQ03808971
公開日2005年7月27日 申請日期2003年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月24日
發(fā)明者格雷斯·奧布賴恩, 羅伯特·N·派克, 梅林達(dá)·M·迪安, 羅賓·M·明欽頓, 特里薩·M·馬蒂內(nèi)利 申請人:昆士蘭醫(yī)學(xué)研究學(xué)院理事會