專利名稱：一種半乳糖凝集素-3結合蛋白及其制備和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體的說是一種半乳糖凝集素-3結合蛋白及其制備和應用。
背景技術：
半乳糖凝集素_3結合蛋白(galectin-3 binding protein, G3BP)是一種分泌至胞外的糖蛋白，它能夠結合半乳糖凝集素-3 (galectin-3)以及其它胞外蛋白，如膠原蛋白 (collagen)、纖維連接蛋白(fibronectin)、β I整合蛋白(β I integrins)等。目前研究最多的是人類G3BP,發(fā)現它在分子結構上含有一個清道夫受體(Scavenger receptor)功能域，該功能域與靶分子結合有關。人類G3BP在免疫組織和細胞中表達，并且在病毒感染以及某些癌癥病人血清中表達上調，因此可能參與機體的免疫抵抗、炎癥反應、腫瘤發(fā)生等過程。迄今G3BP只在兩種魚類(斑馬魚和大西洋鮭)中發(fā)現，但其功能則完全未知。發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供一種半乳糖凝集素_3結合蛋白及其制備和應用。
為實現上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為
—種半乳糖凝集素_3結合蛋白，半乳糖凝集素-3結合蛋白為序列表SEQ ID No. I 中的氨基酸序列所示。
半乳糖凝集素_3結合蛋白的制備，
I)質粒 pETG3BP 的構建
以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物FI和Rl進行PCR擴增，PCR產物純化后與 T-Simple連接,連接混合液轉化大腸桿菌后在含安卡青霉素、Xgal、異丙基-β -D-硫代半乳糖苷的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 - 8h,篩選轉化子提取質粒，得重組質粒pTSG3BP ；
將pTSG3BP用Sma I酶切，回收I. 6kb片段，連接于pET259，連接液轉化入大腸桿菌，在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 - 24小時，篩選轉化子提取質粒，即為pETG3BP ；
2)半乳糖凝集素-3結合蛋白的制備
將上述步驟I)的質粒pETG3BP轉化BL21 (DE3)，在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選轉化子即為BL21/pETG3BP ;將BL21/pETG3BP用終濃度為ImM的異丙基-β -D-硫代半乳糖苷誘導表達后，采用親和層析柱純化重組蛋白，即為序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列所示的半乳糖凝集素_3結合蛋白。
所述步驟I)中 Fl 為 5’ -CCCGGGGCCACCATGGCTTTTACATTTGACCTGTTC -3’ ；R1 為 5 ，-CCCGGGGACTCGGACGTACACTGGTCT-3’。
半乳糖凝集素-3結合蛋白的應用，所述半乳糖凝集素-3結合蛋白能夠結合細菌， 繼而作為細囷的抑制劑。
所述半乳糖凝集素_3結合蛋白能夠結合革蘭氏陰性細菌或革蘭氏陽性細菌。
所述革蘭氏陰性細菌為突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)、大腸桿菌(Escherichia coli)或獲弧菌(Vibrio anguillarum);革蘭氏陽性細菌為海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)或枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點本發(fā)明的半乳糖凝集素_3結合蛋白能夠與多種革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌顯著性結合。本發(fā)明所得自半滑舌鰨中克隆獲得了 G3BP，其與多種細菌具有顯著性結合能力，本發(fā)明乳糖凝集素-3結合蛋白能夠與多種革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌顯著性結合；因此該蛋白具有在抗細菌感染中應用的潛能。


圖I為本發(fā)明實施例提供的純化得到的半乳糖凝集素_3結合蛋白電泳圖譜(其中，純化得到的半乳糖凝集素_3結合蛋白為泳道2 ;泳道I :分子量marker)。
圖2為本發(fā)明實施例提供的半乳糖凝集素_3結合蛋白與各種細菌的結合能力檢測結果。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例旨在對本發(fā)明進行舉例描述，而非以任何形式對本發(fā)明進行限制。
在本發(fā)明實施例中所涉及到的常規(guī)性實驗方法均采用如下方法
I.質粒提取、DNA(PCR)產物純化、DNA片段從凝膠中回收皆使用“天根生化科技 (北京)有限公司”的相應試劑盒。
2.大腸桿菌用 Hanahan 方法(Sambrook and Russell :Molecular Cloning: A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press2001)；酵母轉化按 Invitrogen公司的方法(Catalog no. V175-20);聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS — PAGE)按照 Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press2001o
3.所有限制性內切酶和連接酶皆購自于“紐英倫生物技術有限公司”，北京。
實施例I
本發(fā)明的半乳糖凝集素_3結合蛋白為序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列。
序列表SEQ ID No. I 為:
MQTHQNFCRIWVLLLLLHVADGAFTFDLFENIAAPKE⑶VRLAGSRSSSEGRVEVYHDGRWGTVCDDGW DIAEAQVVCRQLRFSGAKGVQVGQPYGEATGPIWMDDMICQGTEKHLLNCAFKSWGVTDCTHKEDVGIICENNDNNS KNAIYSLDHSFSLSDELGQLFDSEVGCDFLIILRSPTGHRFEYETEEMICAHKMILLLVPRFNASQGVSNITVDISQ SCKPYFPTFLRYIYTRQIDVDLSSIHCLHWMASMFEVKHLMEGTARLFSEVLPEDTLFHTQVSIYNYAVETEDLVLQ ENCLQYLSffNFQNLTNSPAffPDISVKLLRAILVRSDLVVPNEYFVLQSVENWITDKDEAISLEDQALILNCLRFPMI PVEKLYVLETNSSLYNNHSKLYSEKILKAFQFNVLLFSDLLTNPKFDREERDYHPRLYVDYPWSVTISPSYSSRSLS TPSHNSLIFRSKTINWEANIYRSHYDCSNRRLQCKSLPMARLASHSHYHGNNIVYQNQLLLSCQGKYICHIQDFKSD LAYVTKNATHGLTYPCPDSQYTYQFVVRPVYVRV
(a)序列特征
長度565
類型氨基酸序列
籲鏈型單鏈
拓撲結構線性
(b)分子類型蛋白質
(C)假設否
(d)反義否
( e )最初來源半滑舌鰨
結構特點該蛋白含有一個清道夫受體功能域(由氨基酸40 - 140組成)。
實施例2
半乳糖凝集素-3結合蛋白G3BP的制備方法
I)質粒 pETG3BP 的構建
以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增。PCR條件為 94 V 60s預變性模板DNA，然后94 °C 40s, 60 V 60s, 72 V 60s, 5個循環(huán)后改為 940C 40s, 650C 60s, 72°C 60s, 30個循環(huán)后再在72°C延伸反應7 — IOmin0 PCR產物用天根的PCR產物純化試劑盒純化后與質粒T-Simple (購于北京全式金生物技術有限公司) 于室溫連接2 - 8小時，連接混合液轉化大腸桿菌DH5 α后在含安卡青霉素(100ug/ml)、 Xgal (40ug/ml)、異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(24ug/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 — 24小時，篩選轉化子提取質粒，得重組質粒PTSG3BP。
將pTSG3BP用Sma I酶切，回收L 6kb片段。將表達載體pET259(pET259構建過程 #JAL Zheng, ff. J. , Hu, Y. H. , Sun, L. , 2010. Cloning and analysis of a ferritin subunit from turbot(Scophthalmus maximus). Fish. Shellfish. Immunol. 28，829-836)用Swa I酶切后回收5. 4kb片段，將其與回收的I. 6kb片段用T4DNA連接酶連接，連接液轉化入大腸桿菌DH5 α，在含卡那霉素(30ug/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 — 24小時，篩選轉化子提取質粒，即為pETG3BP。
所述LB組成成分按重量百分比計1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，I. O %氯化鈉，97. 5%蒸餾水。所述 Fl 為 5’ -CCCGGGGCCACCATGGCTTTTACATTTGACCTGTTC-3’ ；R1 為 5’ -CCCGGGGACTCGGACGTACACTGGTCT-3，。
2)重組半乳糖凝集素_3結合蛋白G3BP的表達和制備
將步驟I)的質粒pETG3BP轉化BL21 (DE3)(購于“天根生化科技(北京)有限公司”)，在含有卡那霉素(30ug/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選轉化子即為BL21/pETG3BP。 將BL21/pETG3BP在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中于37 °C培養(yǎng)至OD6tltl為0. 6，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷使其終濃度達到lmM，37°C繼續(xù)搖動培養(yǎng)4-5小時，而后用GE Healthcare (美國)公司的 Ni-NTA 金屬親和層析填料(nickel-nitrilotriacetic acid) 親和層析柱純化重組蛋白(層析條件用4 - 5ml洗滌液洗柱兩次，隨后用0. 5 - Iml洗脫緩沖液洗柱，收集所有洗脫液)。將重組蛋白用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS - PAGE)分析，發(fā)現其分子量與表SEQ ID No. I中序列的G3BP分子量一致(參見圖I)。
上述洗滌液成分為50mMNaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM imidazole, pH8. 0;上述洗脫緩沖液成分為50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM imidazole, pH8. 0.
實施例3
半乳糖凝集素-3結合蛋白G3BP的細菌結合作用
I)細菌懸液制備。在LB培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)革蘭氏陰性細菌熒光假單胞菌 (Pseudomonas fluorescens)(保存于 CGMCC，保藏日期 2008 年 I 月 9 日，編號為 CGMCC 2329)、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)(保存于CGMCC，保藏日期2008年I月9日， 編號為CGMCC 2330)、大腸桿菌(Escherichia coli) (DH5a ,購于“天根生化科技(北京) 有限公司”)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)(保存于CGMCC，保藏日期2012年6月21日，編號為CGMCC 6250，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)以及革蘭氏陽性細菌海豚鏈球菌(Str印tococcus iniae)(保存于CGMCC，編號為CGMCC1984，保藏日2007年3月22)和枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)(購買自 CGMCC，編號為 CGMCC I. 460)至 0D_ 為 0. 8，離心(5000g， 4° C離心IOmin)收集菌體，重新懸于包被液(包被液為O. 159% Na2CO3, 0. 293% NaHCO3, pH9.6)至 108CFU/ml。
2)酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。將 96 孔 ELISA板用包被液處理lh，隨后用PBS洗三次。將上述步驟I)的各種細菌懸液加入ELISA 板(每孔100ul)。將ELISA板于4°C保溫15h，每孔加入200ul3%(重量/體積比)的脫脂奶粉，于37°C保溫lh。將ELISA板用PBS洗三次，隨后每孔加入IOOul上述實施例2步驟2) 制備的半乳糖凝集素-3結合蛋白G3BP或者PBS (對照)。將ELISA板用PBS洗三次，隨后每孔加入IOOul鼠抗His抗體(購于“天根生化科技(北京)有限公司”)，于37°C保溫lh。 將ELISA板用PBS洗三次，隨后每孔加入IOOul羊抗鼠IgG — HRP抗體(購于“天根生化科技(北京)有限公司”)，于37°C保溫lh。將ELISA板用PBS洗三次，用TMB試劑盒(購于北京“天根生化科技有限公司”)顯色，隨后在450nm測定吸光值。半乳糖凝集素_3結合蛋白 G3BP與細菌的結合指數(Binding index)計算如下=ELISA反應中含有G3BP的細菌的吸光值/含有PBS的細菌的吸光值。通常Binding index大于2即被認為是有意義的(positive reading)。
結果表明，半乳糖凝集素_3結合蛋白G3BP與所檢測的細菌的Binding index皆大于5(參見圖2)，說明G3BP能夠與多種革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌發(fā)生顯著結合。 因此G3BP可望在細菌性疾病的防控中應用。
所述PBS組成成分按重量百分比計0. 8 % NaCl, 0. 02 % KCl, 0. 358 % Na2HPO4. 12H20, 0. 024% NaH2PO4,余量為水。
權利要求
1.一種半乳糖凝集素-3結合蛋白，其特征在于半乳糖凝集素-3結合蛋白為序列表 SEQ ID No. I中的氨基酸序列所示。
2.—種權利要求I所述半乳糖凝集素_3結合蛋白的制備，其特征在于1)質粒PETG3BP的構建以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物Fl和Rl進行PCR擴增，PCR產物純化后與T-Simple 連接，連接混合液轉化大腸桿菌后在含安卡青霉素、Xgal、異丙基-β -D-硫代半乳糖苷的 LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 - 8h,篩選轉化子提取質粒，得重組質粒pTSG3BP ；將pTSG3BP用Sma I酶切，回收I. 6kb片段，連接于pET259，連接液轉化入大腸桿菌，在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 - 24小時，篩選轉化子提取質粒，即為pETG3BP ；2)半乳糖凝集素_3結合蛋白的制備將上述步驟I)的質粒PETG3BP轉化BL21 (DE3)，在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)， 篩選轉化子即為BL21/pETG3BP ;將BL21/pETG3BP用終濃度為ImM的異丙基-β -D-硫代半乳糖苷誘導表達后，采用親和層析柱純化重組蛋白，即為序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列所示的半乳糖凝集素_3結合蛋白。
3.按權利要求2所述的半乳糖凝集素-3結合蛋白的制備，其特征在于所述步驟I)中 Fl 為 5’-CCCGGGGCCACCATGGCTTTTACATTTGACCTGTTC-3’；R1 為 5’-CCCGGGGACTCGGACGTACAC TGGTCT 3，。
4.一種權利要求I所述的半乳糖凝集素_3結合蛋白的應用，其特征在于所述半乳糖凝集素_3結合蛋白能夠結合細菌，繼而作為細菌的抑制劑。
5.按權利要求4所述的半乳糖凝集素-3結合蛋白的應用，其特征在于所述半乳糖凝集素_3結合蛋白能夠結合革蘭氏陰性細菌或革蘭氏陽性細菌。
6.按權利要求5所述的半乳糖凝集素-3結合蛋白的應用，其特征在于所述革蘭氏陰性細菌為突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)、大腸桿菌(Escherichia coli)或鰻弧菌(Vibrio anguillarum);革蘭氏陽性細菌為海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)或枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體的說是一種半乳糖凝集素-3結合蛋白及其制備和應用。半乳糖凝集素-3結合蛋白為序列表SEQ I D No.1中的氨基酸序列所示。制備方法以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物F1和R1進行PCR擴增，PCR產物連接表達載體后得質粒pETG3BP，將其轉化BL21DE3)，獲得轉化子BL21/pETG3BP，經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導后，利用親和層析柱純化重組蛋白，即為半乳糖凝集素-3結合蛋白。所述半乳糖凝集素-3結合蛋白具有顯著的結合多種細菌的能力。
文檔編號C12N15/70GK102942624SQ201210371948
公開日2013年2月27日 申請日期2012年9月28日 優(yōu)先權日2012年9月28日
發(fā)明者孫黎, 陳騁 申請人:中國科學院海洋研究所