專利名稱:植物培養(yǎng)物中高甘露糖蛋白的生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生高甘露糖蛋白的轉(zhuǎn)化宿主細胞,以及用于產(chǎn)生這些蛋白質(zhì), 特別是在植物培養(yǎng)物中產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)的方法和系統(tǒng)。
背景技術(shù):
戈謝病(Gaucher、disease)是最流行的溶酶體貯積病。它是由導(dǎo)致葡糖腦苷脂 酶(亦稱葡糖神經(jīng)酰胺酶)缺乏的隱性遺傳疾病(染色體Iq21_q31)引起的,該酶是膜結(jié) 合溶酶體酶,催化鞘糖脂葡糖腦苷脂(葡糖神經(jīng)酰胺,GlcCer)水解成葡萄糖和神經(jīng)酰胺。 戈謝病由hGCD (人葡糖腦苷脂酶)基因(GBA)的點突變引起,它導(dǎo)致GlcCer在巨噬細胞的 溶酶體中積累。這種特有的貯藏細胞(稱為戈謝細胞)存在于肝、脾和骨髓中。有關(guān)臨床 癥狀包括嚴重的肝脾大、貧血、血小板減少和骨骼退變。1985年首次對人GCD的編碼基因進行了測序(6)。該蛋白質(zhì)由得自536聚體肽 原(pro-p印tide)的497個氨基酸組成。成熟hG⑶含有5個N-糖基化氨基酸共有序列 (Asn-X-Ser/Thr) 0這些位點中的4個通常被糖基化。第一位點的糖基化是產(chǎn)生活性蛋白 質(zhì)所必需的。已經(jīng)鑒定出高甘露糖和復(fù)合寡糖鏈(7)。得自胎盤的hG⑶含有7%的糖類, 其中20%為高甘露糖型(8)。生化誘變和定點誘變研究提供了對折疊、激活因子相互作用 和活性位點定位十分重要的初步的區(qū)域和殘基圖(9)。用胎盤hG⑶與神經(jīng)氨酸酶(產(chǎn)脫唾液酸酶)治療導(dǎo)致大鼠肝細胞的清除率和 攝入率提高,同時肝的酶促活性增加(Furbish等,1981,Biochim.Biophys.Acta 673 425-434)。這種聚糖修飾的胎盤hGC目前被用作治療戈謝病的治療藥。生化誘變和定點誘 變研究提供了對折疊、激活因子相互作用和活性位點定位十分重要的初步的區(qū)域和殘基圖 [Grace 等,J. Biol. Chem. 269 :2283_2291 (1994)]。有三種不同類型的戈謝病,各取決于hGC的活性水平。受該病所累的主要細胞是 巨噬細胞,由于GlcCer積累使之變得很大,因此亦稱“戈謝細胞”。把鑒定出GCD缺陷作為戈謝病的主要病因?qū)е铝藢⒚钢脫Q療法發(fā)展成為該病的 治療策略。另一種已充分表征的溶酶體貯積病是法布萊病(Fabry disease)。法布萊病是X 連鎖溶酶體貯積病,是由溶酶體酶a-半乳糖苷酶A(a-Gal A)活性缺乏引起的。患典型 法布萊病的患者的a-Gal A活性通常低于1%,常常顯示全部癥狀,包括四肢劇痛(肢端感 覺異常)、少汗、角膜和晶狀體改變、皮膚損害(血管角化瘤)、腎衰竭、心血管疾病、肺衰竭、 神經(jīng)病癥狀和中風(fēng)。在非典型的法布萊病中,帶有殘留酶活性的個體在生命晚期顯示出癥 狀,該癥狀通常限于一個或數(shù)個器官。由于隨機X-染色體失活,女性攜帶者臨床表現(xiàn)差異 相當大。雖然攜帶者一般在整個生命中無癥狀,但是許多人表現(xiàn)出的臨床癥狀與受累男性 的臨床癥狀一樣多變和嚴重。De Duve最早提出用外源有生物活性的酶置換缺失的溶酶體酶,可能是治療溶酶 體貯積病的可行方法[Fed Proc. 23 1045 (1964)]。自此,各種研究提出酶置換療法有利于治療各種溶酶體貯積病。用由胎盤制備(Ceredase ),或者最近經(jīng)重組制備(Cerezyme )的外源酶⑶-葡糖腦苷脂酶)治療的I 型戈謝病個體,顯示取得了重大成功。得自天然來源的未修飾的葡糖腦苷脂酶是具有4條糖鏈的糖蛋白。這種蛋白質(zhì)在 體內(nèi)不會靶向吞噬細胞,因此治療價值有限。在開發(fā)用于戈謝病的最新療法時,通過用三種 不同的糖苷酶處理相繼脫去葡糖腦苷脂酶糖鏈上的末端糖。這種糖苷酶處理產(chǎn)生了其末端 糖由甘露糖殘基組成的糖蛋白。因為吞噬細胞具有甘露糖受體,能識別其中寡糖鏈終止于 甘露糖殘基的糖蛋白和糖肽,所以葡糖腦苷脂酶的糖重塑提高了酶對這些細胞的靶向作用 [Furbish Biochem. Biophys. Acta 673:425, (1981)]。如本文所述,糖基化在hG⑶活性中起至關(guān)重要的作用,因此使用衣霉素(Sf9細 胞)或破壞所有糖基化位點的點突變(Sf9細胞和C0S-1細胞兩者)使在該細胞系中表達 的hGCD去糖基化,導(dǎo)致酶促活性完全喪失。另外,發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌(E. coli)中表達的hGCD 無活性。進一步的研究表明了各個糖基化位點對于蛋白質(zhì)活性的重要性。除糖基化在實際 蛋白質(zhì)活性中的作用外,商業(yè)化生產(chǎn)的酶含有促進特定藥物遞送的聚糖序列修飾。在提取 糖基化蛋白后對其進行重塑以僅包括含有甘露糖的聚糖序列。人GOT酶含有4個糖基化位點和22個賴氨酸。重組產(chǎn)生的酶(CereZymeTm)在495 位上不同于胎盤的酶(Ceredase ),此位置上精氨酸被組氨酸取代。此外,寡糖組成在重組 GCD與胎盤GCD之間不同,因為前者具有較多的巖藻糖和N-乙酰基-葡糖胺殘基,而后者保 留一條高甘露糖鏈。如上所述,GCD的兩種類型用三種不同的糖苷酶(神經(jīng)氨酸酶、半乳糖 苷酶和P-N乙酰-葡糖苷酶)處理以暴露出末端甘露糖,這使得能夠靶向吞噬細胞。一種 包含重組產(chǎn)生的酶的藥物制品參見US 5,549,892。應(yīng)當注意的是,所有所提及的參考文獻 均通過引用并入本文如同全文列于本文。已在昆蟲(sf9)細胞(參見US 7,011, 831)、人成纖維細胞(參見US6,395,884)和 植物細胞(參見US 6,846,968)中生成用于酶置換療法的重組a -半乳糖苷酶A。已經(jīng)對重 組 a-Gal 半乳糖苷酶[法布瑞酶(Fabrazyme) ] :Genzyme Corporation, Cambridge, Mass ; a -半乳糖苷酶[R印lagal] :TKT Corporation, Cambridge, Mass)進行了臨床試驗, 兩種藥物都獲準用于臨床應(yīng)用。與現(xiàn)有溶酶體酶置換療法治療有關(guān)的一個缺點是由于例如攝取少、對特定細胞 (其中底物聚集)溶酶體的靶向作用水平低以及在溶酶體中的功能性體內(nèi)半壽期短,使得 酶的體內(nèi)生物活性不理想地偏低?,F(xiàn)有GOT重組酶的另一個主要缺點是其費用,這可能給衛(wèi)生保健系統(tǒng)帶來沉重的 經(jīng)濟負擔。這些重組酶的高昂成本是復(fù)雜的純化方案和現(xiàn)有治療需要相對大量的治療藥造 成的。因此急需降低GCD的成本,以便能夠向需要更支付得起的療法的所有人提供這種挽 救生命的療法。用于藥物應(yīng)用的蛋白質(zhì)傳統(tǒng)上在哺乳動物或細菌表達系統(tǒng)中產(chǎn)生。在過去的十多 年內(nèi),已在植物中開發(fā)出一種新的表達系統(tǒng)。該方法利用土壤桿菌屬(Agrobacterium),這 是一種能夠?qū)捂淒NA分子(T-DNA)插入植物基因組的細菌。由于導(dǎo)入用于大量生產(chǎn)蛋白 質(zhì)和肽的基因相對簡單,因此該方法越來越普遍地成為替代的蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)(1)。雖然細菌表達系統(tǒng)中不存在翻譯后修飾,但是植物衍生的表達系統(tǒng)卻有利于已知 對蛋白質(zhì)表達和活性至關(guān)重要的這些修飾。哺乳動物蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)和植物蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)之間的一個主要差別是由生物合成途徑的不同所引起的蛋白質(zhì)糖側(cè)鏈的差異。研究表明 糖基化對活性、折疊、穩(wěn)定性、溶解度、對蛋白酶的敏感性、血液清除率和蛋白質(zhì)的抗原潛力 都有重要作用。因此,在植物中產(chǎn)生的任何蛋白質(zhì)都應(yīng)考慮植物糖基化的可能后果。蛋白質(zhì)糖基化被分成兩類N聯(lián)修飾和0聯(lián)修飾(2)。兩個類型的不同在于聚糖部 分所連接的氨基酸一N聯(lián)是與Asn殘基連接,而0聯(lián)則是與Ser或Thr殘基連接。另外,每 個類型的聚糖序列具有獨特的區(qū)別性特征。在兩個類型中,N聯(lián)糖基化非常豐富,其對蛋白 質(zhì)功能的作用已得到廣泛深入的研究。另一方面,0聯(lián)聚糖相對稀少,可獲取的有關(guān)它對蛋 白質(zhì)作用的信息較少。發(fā)明_既述背景技術(shù)沒有教導(dǎo)或提出用于在植物培養(yǎng)物中生產(chǎn)糖基化蛋白的裝置、系統(tǒng)或方 法。
背景技術(shù):
也沒有教導(dǎo)或提出用于在植物培養(yǎng)物中產(chǎn)生高甘露糖蛋白的這類裝置、系統(tǒng) 或方法。
背景技術(shù):
也沒有教導(dǎo)或提出在植物培養(yǎng)物中通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)產(chǎn)生蛋白質(zhì)的裝置、 系統(tǒng)或方法。
背景技術(shù):
也沒有教導(dǎo)或提出在植物培養(yǎng)物中通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)同時繞過高爾 基體產(chǎn)生蛋白質(zhì)的這類裝置、系統(tǒng)或方法。
背景技術(shù):
也沒有教導(dǎo)或提出用于在植物培養(yǎng)物 中通過利用ER信號以繞過高爾基體來產(chǎn)生蛋白質(zhì)的這類裝置、系統(tǒng)或方法。本發(fā)明通過提供用于在植物培養(yǎng)物中產(chǎn)生糖基化蛋白、特別是具有高甘露糖糖基 化的蛋白質(zhì)的裝置、系統(tǒng)和方法,克服了這些背景技術(shù)的缺點,同時任選和優(yōu)選用ER信號 靶向(和/或另外操縱這類蛋白質(zhì)的加工)這類蛋白質(zhì)。我們無意受一種假設(shè)的限制,但 是我們認為這類尋靶使蛋白質(zhì)繞過高爾基體并由此保留下所需要的糖基化,特別是高甘露 糖糖基化。應(yīng)當注意的是,本文所用術(shù)語“植物培養(yǎng)物”包括在培養(yǎng)物中生長的任何類型的 轉(zhuǎn)基因和/或其它經(jīng)遺傳工程改造的植物細胞。遺傳工程可任選為永久或瞬時的。培養(yǎng)物 的特征優(yōu)選為不裝配形成完整植株的細胞,使得至少一個植物的生物結(jié)構(gòu)不存在。培養(yǎng)物 的特征可任選和優(yōu)選為多種不同類型的植物細胞,但優(yōu)選培養(yǎng)物的特征為特定類型的植物 細胞。應(yīng)當注意的是,以特定類型的植物細胞為特征的植物培養(yǎng)物任選可最初衍生自多種 不同類型的這類植物細胞??砂凑杖魏芜m當?shù)呐囵B(yǎng)方法類型使植物細胞生長,包括但不限于培養(yǎng)在固體表面 (例如塑料培養(yǎng)容器或培養(yǎng)板)或培養(yǎng)懸液中。本發(fā)明進一步涉及采用轉(zhuǎn)基因植物根、特別是胡蘿卜細胞用于表達和產(chǎn)生有酶促 活性的高甘露糖溶酶體酶的載體和方法。更具體地講,本發(fā)明涉及用于以高產(chǎn)量表達和產(chǎn) 生有生物活性的高甘露糖葡糖腦苷脂酶(GCD)和a-半乳糖苷酶A的宿主細胞、特別是轉(zhuǎn) 基因的懸浮胡蘿卜細胞、載體和方法。本發(fā)明進一步提供用于治療溶酶體貯積病的組合物 和方法。本發(fā)明還涉及用于向缺陷型細胞提供足夠量的有生物活性的溶酶體酶、特別是人 GCD和a-半乳糖苷酶A的裝置、系統(tǒng)和方法。本發(fā)明還涉及包含新的載體組成的宿主細 胞,所述載體組成使得能夠有效產(chǎn)生編碼溶酶體酶(例如GCD和a-半乳糖苷酶A)的基因。本發(fā)明因此解決了長期以來深有感受的對經(jīng)濟適用技術(shù)的需要,所述技術(shù)可產(chǎn)生 具有特定糖基化要求的蛋白質(zhì),例如溶酶體酶的高甘露糖糖基化(例如GCD和a-半乳糖 苷酶A)。本發(fā)明能夠利用植物細胞培養(yǎng)物解決這個長期以來深有感受的需要。為了進一步說明本發(fā)明,現(xiàn)提供對高甘露糖蛋白生物合成途徑的簡要說明。在所有真核生物中,高甘露糖和復(fù)合N聯(lián)聚糖的基本生物合成途徑是高度保守的。生物合成始 于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER),其中通過寡糖基轉(zhuǎn)移酶將聚糖前體從多萜醇脂質(zhì)載體轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的特定 Asn殘基上。該前體隨后在ER中被糖苷酶I和糖苷酶II及假定的甘露糖苷酶修飾,產(chǎn)生高 甘露糖結(jié)構(gòu),類似于發(fā)生在哺乳動物中的過程。聚糖序列進一步修飾成復(fù)雜結(jié)構(gòu)及雜合結(jié)構(gòu)發(fā)生在高爾基體中。這類修飾包括通 過a “甘露糖苷酶I脫去4個甘露糖殘基中的1個,加入1個N-乙?;咸前窔埢?,通過 a -甘露糖苷酶II脫去另外2個甘露糖殘基,加入N-乙酰基葡糖胺,任選在這個階段,可加 入木糖和巖藻糖殘基以得到植物特有的N聯(lián)聚糖。在木糖和巖藻糖轉(zhuǎn)移到核心(core)上 之后,可通過加入末端巖藻糖和半乳糖,進一步加工成復(fù)合型N-聚糖。進一步的修飾可發(fā) 生在糖蛋白轉(zhuǎn)運期間。
背景技術(shù):
中目前使用若干方法用于控制并調(diào)節(jié)植物蛋白質(zhì)糖基化,所有這些方法 都有重大缺陷,特別是與本發(fā)明比較時??傮w修飾,例如完全抑制糖基化或從肽鏈脫去糖基 化位點是一種策略。然而,這種方法可能導(dǎo)致結(jié)構(gòu)缺陷。另一種方法包括敲除和導(dǎo)入特定 的糖加工酶。同樣,這種方法十分困難,而且還可能對植物細胞本身帶來有害作用。本發(fā)明通過利用ER信號和/或通過阻斷自ER向高爾基體的分泌,克服了背景技 術(shù)方法的這些不足。我們無意受一種假設(shè)的限制,因為溶酶體酶的高甘露糖結(jié)構(gòu)是優(yōu)選的, 如果可以阻斷分泌,則可將蛋白質(zhì)保留在ER中,而不需要重塑便可得到天然存在的高甘露 糖結(jié)構(gòu)。如上所述,經(jīng)由內(nèi)膜系統(tǒng)轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)最先進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。該步驟必需的轉(zhuǎn)運信號 由分子N端的信號序列表示,即所謂的信號肽。一旦該信號肽完成其功能,即將連接在自身 上的前體蛋白插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,其則經(jīng)蛋白水解從前體蛋白上裂解下來。由于其功能特殊,因 此在所有活細胞中,不論是細菌、酵母、真菌、動物還是植物,該類型的信號肽序列在進化進 程中高度保守。通過信號肽插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的許多植物蛋白質(zhì)并不停留在ER中,而是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運 到高爾基體中,并繼續(xù)由高爾基體運輸?shù)揭号葜?。用于該運輸停留的這類分選信號中的 一類是存在于前體蛋白C端部分的信號[Neuhaus和Rogers,(1998)Plant Mol. Biol. 38 127-144]。預(yù)期同時含有用于插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的N端信號肽和C端液泡引導(dǎo)信號的蛋白質(zhì)含有 在高爾基體中與之連接的復(fù)合聚糖[Lerouge等,(1998) PlantMol. Biol. 38 :31_48]。這類C 端分選信號的性質(zhì)可發(fā)生非常大的變化。US 6,054,637披露了從煙草堿性幾丁質(zhì)酶區(qū)獲得 的肽片段,這是一種用作液泡引導(dǎo)肽的液泡蛋白。含有C端引導(dǎo)信號和復(fù)合聚糖的液泡蛋 白的實例是菜豆種子貯存蛋白即菜豆蛋白[Frigerio等(1998)Plant CelllO =1031-1042 ; Frigerio 等(2001)Plant Cell 13:1109-1126]。在所有真核細胞中典型的模式是液泡蛋白穿過ER和高爾基體后,被隔離在液泡 中作為其終點。預(yù)料不到的是,本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物根細胞產(chǎn)生預(yù)料不到的高甘露糖GCD和 a -半乳糖苷酶A。有利的是發(fā)現(xiàn)這種高甘露糖產(chǎn)物具有生物活性,因此其活化無需更多的 步驟。我們無意受一種假設(shè)的限制,但似乎是使用ER信號與在植物細胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的重組 蛋白能夠克服向高爾基體的轉(zhuǎn)運,因此保留了所需要的高甘露糖糖基化。任選可按照本發(fā) 明利用能夠產(chǎn)生高甘露糖糖基化的任何機制類型,包括繞過高爾基體的任何機制類型。第一方面,本發(fā)明涉及產(chǎn)生目標高甘露糖重組蛋白的宿主細胞。該細胞可用編碼目標蛋白質(zhì)的重組核酸分子或包含該核酸分子的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。這類核酸分子包 含編碼目標蛋白質(zhì)的第一核酸序列,其與編碼液泡引導(dǎo)信號肽的第二核酸序列可操作性連 接。第一核酸序列可任選與編碼ER(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))引導(dǎo)信號肽的第三核酸序列進一步可操作性 連接。本發(fā)明的宿主細胞的特征是目標蛋白質(zhì)由細胞以高甘露糖化的形式產(chǎn)生。本發(fā)明的宿主細胞可以是真核細胞或原核細胞。在一個實施方案中,本發(fā)明的宿主細胞是原核細胞,優(yōu)選為細菌細胞,最優(yōu)選為根 癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)細胞。這些細胞用來感染下述優(yōu)選的植物宿主 細胞。在另一個優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明的宿主細胞可以是真核細胞,優(yōu)選為植物細 胞,最優(yōu)選為選自以下的植物根細胞發(fā)根土壤桿菌(Agrobacterium rihzogenes)轉(zhuǎn)化的 根細胞、芹菜細胞、姜細胞、辣根細胞和胡蘿卜細胞。在一個優(yōu)選的實施方案中,植物根細胞為胡蘿卜細胞。應(yīng)當注意的是,本發(fā)明轉(zhuǎn)化 的胡蘿卜細胞生長在懸液中。如上文和實施例中所述,這些細胞用根癌土壤桿菌細胞轉(zhuǎn)化。在另一個實施方案中,包含在本發(fā)明宿主細胞內(nèi)的重組核酸分子,包含編碼溶酶 體酶的第一核酸序列,其與編碼液泡引導(dǎo)信號肽的第二核酸序列可操作性連接,所述第二 核酸序列得自堿性煙草幾丁質(zhì)酶A基因。該液泡信號肽具有由SEQ ID NO :2表示的氨基酸 序列。第一核酸序列可任選與編碼由SEQ ID NO :1表示的ER(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))弓丨導(dǎo)信號肽的第 三核酸序列進一步可操作性連接。在一個實施方案中,包含在本發(fā)明宿主細胞內(nèi)的重組核 酸分子另包含在植物細胞中起作用的啟動子。該啟動子應(yīng)與本發(fā)明的重組分子可操作性連 接。在另一個實施方案中,該重組核酸分子還任選另包含在植物細胞中優(yōu)選起作用的 可操作性連接的終止子。本發(fā)明的重組核酸分子還任選另包含另外的調(diào)控元件、啟動元件 和調(diào)節(jié)元件和/或選擇標記。應(yīng)當注意的是,這些調(diào)節(jié)元件與重組分子可操作性連接。在一個優(yōu)選的實施方案中,由本發(fā)明的宿主細胞產(chǎn)生的目標高甘露糖蛋白可以是 具有暴露出來的甘露糖末端殘基的高甘露糖糖蛋白。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方案,這類高甘露糖蛋白可以是選自以下的溶酶體 酶葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、a-N-乙酰氨基半乳糖苷酶 (a-N-acetylgalactosaminidise)、酸性脂肪酶、a -半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、a-L-艾 杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、a -甘露糖苷酶和唾液酸酶。在一個優(yōu)選的實施方案中, 溶酶體酶可以是人葡糖腦苷脂酶(GOT)或a-半乳糖苷酶A。在下文中,重組G⑶、rG⑶、 rhGCD均是指重組人GCD的各種形式,除非另有說明。因此A_gal、A_gal A、重組A_gal、 rA-gal、rhA-gal均是指重組人a -半乳糖苷酶A的各種形式[Genbank保藏號NM000169 (編 碼序列)和CAA29232 (氨基酸序列)],除非另有說明。如前所述,戈謝病這種最流行的溶酶體貯積病是由hGCD (人葡糖腦苷脂酶)基因 (GBA)的點突變引起的,它導(dǎo)致GlcCer在巨噬細胞溶酶體中積累。把鑒定出G⑶缺陷作為 戈謝病的主要病因?qū)е铝藢⒚钢脫Q療法發(fā)展成為該病的治療策略。然而,糖基化在hGCD活 性和靶細胞攝取中起至關(guān)重要的作用。因此,根據(jù)本發(fā)明其它優(yōu)選的實施方案,優(yōu)選通過在植物細胞培養(yǎng)物中控制hGCD 或h a -半乳糖苷酶A的表達,任選和更優(yōu)選通過提供ER信號和/或另外任選和更優(yōu)選通過阻斷向高爾基體轉(zhuǎn)運,來提供適當糖基化的hGCD或a -半乳糖苷酶A。任選和優(yōu)選hG⑶或a _半乳糖苷酶A具有至少一條包含暴露出來的甘露糖殘基 的寡糖鏈用于預(yù)防或治療戈謝病。再者,在一個具體實施方案中,該優(yōu)選的宿主細胞用重組核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染,所 述重組核酸分子另包含得自花椰菜花葉病毒的35S啟動子、得自根癌土壤桿菌的章魚堿合 酶終止子和TMV (煙草花葉病毒)Q翻譯增強子元件。根據(jù)優(yōu)選的實施方案,該重組核酸分 子包含基本上由SEQ ID NO 13表示的核酸序列,編碼具有基本上由SEQ IDN0 14或15表 示的氨基酸序列的高甘露糖GCD。應(yīng)當了解的是,本發(fā)明進一步提供表達載體,該載體包含編碼有生物活性的溶酶 體酶的核酸分子。在一個優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明的表達載體包含編碼有生物活性的高甘露糖人 葡糖腦苷脂酶(GCD)或a-半乳糖苷酶A的核酸分子。該優(yōu)選的表達載體優(yōu)選包含具有基 本上由SEQ ID NO :13、17或19表示的核酸序列的重組核酸分子。第二方面,本發(fā)明涉及由本發(fā)明的宿主細胞產(chǎn)生的重組高甘露糖蛋白。在一個優(yōu)選的實施方案中,這種高甘露糖蛋白可以是選自以下的有生物活性的高 甘露糖溶酶體酶葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、a -N-乙酰氨基半乳 糖苷酶、酸性脂肪酶、a-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、a-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫 酸酯酶、a-甘露糖苷酶和唾液酸酶。最優(yōu)選這種溶酶體酶可以是人葡糖腦苷脂酶(GOT)。再者,本發(fā)明提供有生物活性的重組高甘露糖溶酶體酶,該酶具有至少一條包含 暴露出來的甘露糖殘基的寡糖鏈。根據(jù)優(yōu)選的實施方案,本發(fā)明的重組溶酶體酶可在靶部位上與靶細胞的甘露糖受 體結(jié)合。優(yōu)選這個部位可在患有溶酶體貯積病的受治療者的體內(nèi)。應(yīng)當注意的是,與天然存在的靶細胞溶酶體酶相應(yīng)的親和力相比,重組溶酶體酶 對靶細胞的親和力提高。在一個具體實施方案中,靶部位的靶細胞可以是受治療者肝中的 枯否氏細胞。在一個優(yōu)選的實施方案中,重組溶酶體酶可選自葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂 酶、氨基己糖苷酶、a-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、a-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂 酶、a-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、a-甘露糖苷酶或唾液酸酶。該重組溶酶體酶最優(yōu)選為葡糖腦苷脂酶(GOT)。第三方面,本發(fā)明涉及產(chǎn)生高甘露糖蛋白的方法。因此,本發(fā)明的方法包括以下步 驟(a)制備重組宿主細胞培養(yǎng)物,所述細胞用編碼目標重組蛋白的重組核酸分子或用包 含該重組核酸分子的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染;(b)在允許蛋白質(zhì)表達的條件下,對由步驟(a) 制備的這些宿主細胞培養(yǎng)物進行培養(yǎng),其中宿主細胞以高甘露糖化的形式產(chǎn)生蛋白質(zhì);(c) 從細胞中回收蛋白質(zhì),并由從(a)得到的培養(yǎng)物中收獲細胞;(d)通過適當?shù)牡鞍踪|(zhì)純化方 法對步驟(c)的蛋白質(zhì)進行純化。根據(jù)優(yōu)選的實施方案,該方法所用的宿主細胞是本發(fā)明的宿主細胞。在另一個優(yōu)選的實施方案中,由本發(fā)明方法產(chǎn)生的高甘露糖蛋白可以是有生物活 性的高甘露糖溶酶體酶,具有至少一條包含暴露出來的甘露糖殘基的寡糖鏈。該重組酶可在靶部位上與靶細胞的甘露糖受體結(jié)合。更特別的是,與天然存在的靶細胞溶酶體酶相應(yīng)的親和力相比,通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的重組酶對靶細胞的親和力提 高。因此,靶部位的靶細胞可以是受治療者肝中的枯否氏細胞。在一個具體實施方案中,這種溶酶體酶可選自葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂 酶、氨基己糖苷酶、a-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、a-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂 酶、a -L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、a _甘露糖苷酶和唾液酸酶。最優(yōu)選這種溶 酶體酶可以是葡糖腦苷脂酶(GCD)或a-半乳糖苷酶A。在另一個優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明方法所采用的宿主細胞可以是選自以下的植 物根細胞發(fā)根土壤桿菌轉(zhuǎn)化的根細胞、芹菜細胞、姜細胞、辣根細胞和胡蘿卜細胞。植物根 細胞最優(yōu)選為胡蘿卜細胞。應(yīng)當特別注意的是在本發(fā)明的方法中,轉(zhuǎn)化的宿主胡蘿卜細胞 生長在懸液中。又一方面,本發(fā)明涉及使用外源重組溶酶體酶治療患有溶酶體貯積病的受治療者 的方法,該方法包括(a)提供重組生物活性形式的溶酶體酶,該溶酶體酶由轉(zhuǎn)化的植物根 細胞純化,能夠有效靶向異常缺乏溶酶體酶的細胞。該有生物活性的重組酶在其附帶的寡 糖上具有暴露出來的末端甘露糖殘基;(b)給予受治療者有效量的有生物活性的重組溶酶 體酶。在一個優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明方法所采用的重組高甘露糖溶酶體酶可由本發(fā)明 的宿主細胞產(chǎn)生。宿主細胞優(yōu)選為胡蘿卜細胞。在另一個優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明方法所采用的溶酶體酶可為高甘露糖酶,該 高甘露糖酶包含至少一條具有暴露出來的甘露糖殘基的寡糖鏈。該重組酶可有在受治療者 體內(nèi)的靶部位與靶細胞的甘露糖受體結(jié)合。與天然存在的靶細胞溶酶體酶相應(yīng)的親和力相 比,更優(yōu)選該重組溶酶體酶對這些靶細胞的親和力提高。更準確地講,本發(fā)明方法所采用的溶酶體酶可選自葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷 脂酶、氨基己糖苷酶、a-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、a-半乳糖苷酶、葡糖腦苷 脂酶、a -L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、a _甘露糖苷酶或唾液酸酶。這種溶酶體 酶優(yōu)選為葡糖腦苷脂酶(GCD)。根據(jù)優(yōu)選的實施方案,本發(fā)明的方法因此可用于治療溶酶體貯積病,特別是戈謝病。在這種情況下,靶部位的靶細胞可以是受治療者肝中的枯否氏細胞。本發(fā)明進一步提供用于治療溶酶體貯積病的藥物組合物,該藥物組合物包含本發(fā) 明限定的活性成分即有生物活性的重組高甘露糖溶酶體酶。本發(fā)明的組合物還任選另包含 藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。在一個具體實施方案中,本發(fā)明的組合物意在用來治療戈謝病。這類組合物可優(yōu) 選包含本發(fā)明限定的有效成分即有生物活性的高甘露糖人葡糖腦苷脂酶(GCD)。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明有生物活性的重組高甘露糖溶酶體酶在制備用于預(yù)防 或治療溶酶體貯積病的藥物中的用途。更特別的是,這類疾病可為戈謝病。因此,這種有生物活性的溶酶體酶是本發(fā)明限定的有生物活性的高甘露糖人葡糖 腦苷脂酶(GOT)。根據(jù)本發(fā)明,提供產(chǎn)生高甘露糖重組蛋白宿主細胞,該細胞包含編碼重組蛋白的 多核苷酸和用來產(chǎn)生重組蛋白(為高甘露糖蛋白)的信號。多核苷酸優(yōu)選包含編碼目標 蛋白質(zhì)的第一核酸序列,其與編碼信號肽的第二核酸序列可操作性連接。信號肽任選包含ER(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))引導(dǎo)信號肽。優(yōu)選多核苷酸另包含編碼液泡引導(dǎo)信號肽的第三核酸序列。優(yōu)選該信號使重組蛋白靶向ER。更優(yōu)選該信號包含用于使重組蛋白靶向ER的信 號肽。最優(yōu)選多核苷酸包含用于編碼信號肽的核酸區(qū)段。任選和優(yōu)選該信號使重組蛋白繞過高爾基體。優(yōu)選該信號包含用于使重組蛋白不 靶向高爾基體的信號肽。更優(yōu)選多核苷酸包含用于編碼信號肽的核酸區(qū)段。任選和優(yōu)選宿主細胞為真核細胞和原核細胞中的任一種。原核細胞任選為細菌細 胞,優(yōu)選為根癌土壤桿菌細胞。優(yōu)選真核細胞為植物細胞。更優(yōu)選植物細胞為選自以下的 植物根細胞發(fā)根土壤桿菌轉(zhuǎn)化的根細胞、芹菜細胞、姜細胞、辣根細胞和胡蘿卜細胞。植物 根細胞最優(yōu)選為胡蘿卜細胞。優(yōu)選重組多核苷酸包含編碼目標蛋白質(zhì)的第一核酸序列,其與編碼液泡引導(dǎo)信號 肽的第二核酸序列可操作性連接,所述第二核酸序列衍生自堿性煙草幾丁質(zhì)酶A基因,所 述液泡信號肽具有由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列,其中第一核酸序列任選與編碼由SEQ ID N0:1表示的ER(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))引導(dǎo)信號肽的第三核酸序列進一步可操作性連接。更優(yōu)選重組多核苷酸另包含在植物細胞中起作用的啟動子,其中該啟動子與重組 分子可操作性連接。最優(yōu)選重組多核苷酸另包含在植物細胞中起作用的終止子,其中該終止子與重組 分子可操作性連接。同樣最優(yōu)選重組多核苷酸任選另包含另外的調(diào)控元件、啟動元件和調(diào)節(jié)元件和/ 或選擇標記,其中所述調(diào)節(jié)元件與重組分子可操作性連接。優(yōu)選高甘露糖蛋白是糖基化的高甘露糖糖蛋白,具有至少一個暴露出來的甘露糖 殘基。更優(yōu)選高甘露糖蛋白是選自以下的有生物活性的高甘露糖溶酶體酶葡糖腦苷脂酶 (GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、a -N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、a -半乳糖 苷酶、葡糖腦苷脂酶、a-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、a-甘露糖苷酶和唾液酸 酶。最優(yōu)選溶酶體酶是人葡糖腦苷脂酶(GCD)。優(yōu)選GOT包含基本由SEQ ID NO 8表示的氨基酸序列,該氨基酸序列由SEQ ID NO: 7表示的核酸序列編碼。更優(yōu)選細胞用重組多核苷酸或用包含該分子的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染,重組多核苷 酸另包含得自花椰菜花葉病毒的35s啟動子、得自根癌土壤桿菌的章魚堿合酶終止子,調(diào)節(jié) 元件是TMV (煙草花葉病毒)Q翻譯增強子元件,具有基本上由SEQ ID N0:13表示的核酸 序列,該核酸序列編碼具有基本上由SEQ ID NO 14或15表示的氨基酸序列的GOT。根據(jù)優(yōu)選的實施方案,提供由上述宿主細胞產(chǎn)生的重組高甘露糖蛋白。優(yōu)選高甘露糖蛋白是選自以下的有生物活性的高甘露糖溶酶體酶葡糖腦苷脂酶 (GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、a-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、a-半乳糖 苷酶、葡糖腦苷脂酶、a-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、a-甘露糖苷酶和唾液酸 酶。更優(yōu)選溶酶體酶是人葡糖腦苷脂酶(GCD)。根據(jù)本發(fā)明其它優(yōu)選的實施方案,提供有生物活性的重組高甘露糖溶酶體酶,該 酶具有至少一條包含暴露出來的甘露糖殘基的寡糖鏈。
根據(jù)另外其它的優(yōu)選實施方案,提供重組蛋白,該重組蛋白包含具有信號肽活性 的第一部分和具有溶酶體酶活性的第二部分,第一部分引起第二部分在植物細胞內(nèi)加工成 具有至少一條包含暴露出來的甘露糖殘基的寡糖鏈。優(yōu)選溶酶體酶包括用于預(yù)防或治療戈謝病的蛋白質(zhì)。更優(yōu)選該蛋白質(zhì)包括hG⑶。在另一個實施方案中,溶酶體酶包括用于預(yù)防或治療法布萊病的蛋白質(zhì)。更優(yōu)選蛋白質(zhì)包括a-半乳糖苷酶A。優(yōu)選第一部分包括植物細胞ER引導(dǎo)信號肽。更優(yōu)選重組酶可在患有溶酶體貯積 病的受治療者體內(nèi)靶部位上與靶細胞的甘露糖受體結(jié)合。最優(yōu)選與天然存在的靶細胞溶酶 體酶相應(yīng)的親和力相比,重組溶酶體酶對靶細胞的親和力提高。靶細胞可以是具有甘露糖 受體的成纖維細胞、巨噬細胞等。同樣最優(yōu)選重組溶酶體酶選自葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷 酶、a -N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、a -半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、a _L_艾杜糖 苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、a-甘露糖苷酶或唾液酸酶。優(yōu)選重組溶酶體酶是葡糖腦苷脂酶(GOT)。同樣優(yōu)選靶部位的靶細胞是受治療者肝中的枯否氏細胞。根據(jù)另外其它的優(yōu)選實施方案,提供在植物細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的重組高甘露糖蛋 白。優(yōu)選該蛋白質(zhì)的特征是使蛋白質(zhì)靶向ER的植物信號肽。更優(yōu)選植物信號肽包含用于使蛋白質(zhì)靶向植物根細胞培養(yǎng)物中的ER的肽。最優(yōu) 選植物根細胞培養(yǎng)物包含胡蘿卜細胞。根據(jù)又一些其它的優(yōu)選實施方案,提供植物根細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的富含甘露糖的 重組hG⑶或a -半乳糖苷酶A蛋白。根據(jù)另外其它的優(yōu)選實施方案,提供用于產(chǎn)生高甘露糖蛋白的植物細胞培養(yǎng)物的 用途。根據(jù)其它優(yōu)選的實施方案,提供產(chǎn)生高甘露糖蛋白的方法,該方法包括制備重組 宿主細胞培養(yǎng)物,該宿主細胞用編碼重組蛋白的重組多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染;在允許蛋白質(zhì) 表達的條件下,對宿主細胞培養(yǎng)物進行培養(yǎng),其中宿主細胞以高甘露糖化的形式產(chǎn)生蛋白 質(zhì)。優(yōu)選宿主細胞培養(yǎng)物培養(yǎng)在懸液中。更優(yōu)選該方法進一步包括對蛋白質(zhì)進行純 化。根據(jù)其它優(yōu)選的實施方案,用如前所述的宿主細胞實施該方法。優(yōu)選高甘露糖蛋 白是有生物活性的高甘露糖溶酶體酶,該溶酶體酶具有至少一條包含暴露出來的甘露糖殘 基的寡糖鏈。更優(yōu)選該重組酶在靶部位上與靶細胞的甘露糖受體結(jié)合。最優(yōu)選與天然存在 的靶細胞溶酶體酶相應(yīng)的親和力相比,該重組酶對靶細胞的親和力提高。優(yōu)選溶酶體酶選自葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、a-N-乙 酰氨基半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、a-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、a-L-艾杜糖苷酸酶、艾 杜糖醛酸硫酸酯酶、a-甘露糖苷酶和唾液酸酶。更優(yōu)選溶酶體酶是葡糖腦苷脂酶(GCD)或a -半乳糖苷酶A。最優(yōu)選靶部位的靶 細胞是成纖維細胞或受治療者肝中的枯否氏細胞。
優(yōu)選宿主細胞是選自以下的植物根細胞發(fā)根土壤桿菌轉(zhuǎn)化的根細胞、芹菜細胞、 姜細胞、辣根細胞和胡蘿卜細胞。在另一個實施方案中,宿主細胞是煙草細胞。更優(yōu)選植物根細胞是胡蘿卜細胞。最優(yōu)選轉(zhuǎn)化的宿主胡蘿卜細胞生長在懸液中。根據(jù)另外其它的優(yōu)選實施方案,提供使用外源重組溶酶體酶治療患有溶酶體貯積 病的受治療者的方法,該方法包括提供有生物活性形式的重組溶酶體酶,該溶酶體酶由轉(zhuǎn) 化的植物根細胞純化,能夠有效靶向異常缺乏溶酶體酶的細胞,其中有生物活性的重組酶 在其附帶的寡糖上具有暴露出來的末端甘露糖殘基;給予受治療者治療有效量的有生物活 性的重組溶酶體酶??扇芜x用如前所述的任何宿主細胞和/或蛋白質(zhì)實施該方法。優(yōu)選重組酶可以在受治療者體內(nèi)的靶部位上與靶細胞的甘露糖受體結(jié)合。更優(yōu)選 與天然存在的靶細胞溶酶體酶相應(yīng)的親和力相比,重組溶酶體酶對靶細胞的親和力提高。 最優(yōu)選溶酶體酶選自葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、ci-N-乙酰氨基 半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、a-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、a-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛 酸硫酸酯酶、a-甘露糖苷酶或唾液酸酶。同樣最優(yōu)選溶酶體酶葡糖腦苷脂酶(GCD)。同樣最優(yōu)選溶酶體貯積病為戈謝病。同樣最優(yōu)選靶部位的靶細胞是受治療者肝中 的枯否氏細胞。在另一個實施方案中,貯積病是法布萊病,溶酶體酶是a-半乳糖苷酶A,靶細胞 是成纖維細胞。根據(jù)另外其它的優(yōu)選實施方案,提供用于治療溶酶體貯積病的藥物組合物,該組 合物包含作為活性成分的上述有生物活性的重組高甘露糖溶酶體酶,該組合物任選另包含 藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。優(yōu)選溶酶體貯積病是戈謝病。更優(yōu)選重組溶酶體 酶是有生物活性的高甘露糖人葡糖腦苷脂酶(GCD)。根據(jù)另外其它的優(yōu)選實施方案,提供上述有生物活性富含甘露糖的重組溶酶體酶 在制備用于預(yù)防或治療溶酶體貯積病的藥物中的用途。優(yōu)選該病是戈謝病。更優(yōu)選有生物 活性的溶酶體酶是有生物活性的高甘露糖人葡糖腦苷脂酶(GCD)。在另一個實施方案中,所述疾病是法布萊病,有生物活性的溶酶體酶是a-半乳 糖苷酶A。本發(fā)明按照下列附圖作進一步的描述,下圖只是示例性的,并不限制同樣由隨附 權(quán)利要求書定義的本發(fā)明的范圍。附圖簡述本發(fā)明參照附圖僅通過舉例進行描述,其中圖 1A-1B1A表示所得到的表達盒,該表達盒包含得自花椰菜花葉病毒的35S啟動子、TMV (煙 草花葉病毒)Q翻譯增強子元件、ER引導(dǎo)信號、人GCD序列(亦由SEQ ID而7表示)、液 泡信號和得自根癌土壤桿菌的章魚堿合酶終止子序列。
圖1B表示pGreenll質(zhì)粒主鏈的示意圖。圖2表示使用抗hGCD特異性抗體進行的hGCD轉(zhuǎn)化細胞提取物的蛋白質(zhì)印跡分 析。標準Cerezyme (泳道1)用作陽性對照,未轉(zhuǎn)化的愈傷組織用作陰性對照(泳道2),各 個選出的愈傷組織提取物見泳道3-8。
圖3A-3C表示在裝填到XK柱(2. 6x20cm)中的強陽離子交換樹脂(Macro-Pr印 high-S support,Bio-Rad)上進行rhGCD純化的第一步。將柱與AKTA prime系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biotech)連接供導(dǎo)電監(jiān)測、pH和280nm下的吸光度檢測之用。用含有600mM NaCl的平衡緩沖液洗脫出rh-GCD。圖3A表示該純化步驟的標準運行。在運行期間收集的 流分通過酶活性測定法監(jiān)測,如圖3B所示,合并具有酶促活性(洗脫峰中)的各管。圖3C 表示活性測定用洗脫流分的考馬斯藍染色。圖3D-3F如同圖3A-3C表示相應(yīng)的圖,但為第二柱的圖。圖4A-C表示在裝填到XK柱(2. 6x20cm)中的疏水相互作用樹脂(TSK凝膠, Toyopearl Phenyl_650C,Tosoh Corp.)上進行重組hGCD的最終純化步驟。將該柱與AKTA prime系統(tǒng)(Amersham PharmaciaBiotech)連接以供導(dǎo)電監(jiān)測、pH和280nm下的吸光度檢 測之用。由之前各柱合并的GCD洗脫液以6ml/分鐘加載,接著用平衡緩沖液洗滌直到UV 吸光度達到基線為止。純的G⑶用含有50%乙醇的10mM檸檬酸緩沖液洗脫。圖4A表示該純化步驟的標準運行。圖4B表示在運行期間通過酶活性測定法監(jiān)測收集的流分。圖4C表示活性測定用洗脫流分的考馬斯藍染色。圖5表示在經(jīng)腹膜巨噬細胞攝取后重組hG⑶的活性(圖5A-5C),而圖5D表示本 發(fā)明重組G⑶的蛋白質(zhì)印跡。圖6表示本發(fā)明rG⑶的糖基化結(jié)構(gòu)與Cerezyme 糖基化結(jié)構(gòu)的比較。圖7表示本發(fā)明rG⑶的糖基化結(jié)構(gòu)。 圖8a_8d表示本發(fā)明rG⑶的其它N_聚糖糖基化結(jié)構(gòu)。圖9a_9b表示本發(fā)明的純化重組人G⑶和哺乳動物CH0細胞中重組產(chǎn)生的市售人 G⑶(Cerezyme )的抗原特征和電泳特征。圖9a是植物產(chǎn)生的本發(fā)明hG⑶(泳道1和泳道 2,分別為5 y g禾口 10 y g蛋白質(zhì))與Cerezyme (泳道3和泳道4,分別為5 y g禾口 10 y g 蛋白質(zhì))的考馬斯藍染色SDS-PAGE分析。圖9b是SDS-PAGE分離的本發(fā)明重組人GCD (泳 道1和泳道2,分別為50ng和long)的蛋白質(zhì)印跡分析與市售Cerezyme 酶的比較。將 SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)點到硝化纖維上(泳道3和泳道4,分別為50ng和lOOng抗原),使 用多克隆抗GCD抗體和過氧化物酶綴合的山羊抗兔HRP第二抗體進行免疫測定。注意本發(fā) 明的植物重組G⑶與哺乳動物細胞(CH0)制備的酶(Cerezyme )之間大小和免疫反應(yīng)性 的一致性。MW=分子量標準標記。圖lOa-lOb是本發(fā)明重組人G⑶的聚糖結(jié)構(gòu)的示意圖。圖10a表示G⑶主要聚糖 結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果,表明所有結(jié)構(gòu)及其基于HPLC、酶陣列消化和MALDI的相對量。對各個聚糖 的保留時間與給出葡萄糖單元(GU)梯的葡聚糖標準部分水解物的保留時間進行比較。圖 10b表示在體外修飾加工之前和之后哺乳動物細胞(CH0)制備的酶(Cerezyme )的聚糖 結(jié)構(gòu)。注意本發(fā)明的重組人GCD中木糖和暴露出來的甘露糖糖苷的優(yōu)勢。圖11是本發(fā)明重組人GCD的聚糖特征的HP-陰離子交換層析分析,顯示批次之間 重組人GOT的聚糖結(jié)構(gòu)是一致且是可再現(xiàn)的。圖12動力學(xué)分析顯示本發(fā)明的重組人G⑶(空心三角形)和哺乳動物細胞(CH0) 制備的酶(Cerezyme )(實心方形)具有相同的催化動力學(xué)特征。在MES緩沖液(50mM,pH 5. 5)中,使用C6-NBDGlcCer對本發(fā)明的重組人GCD和Cerezyme (0. 2 u g)進行了測 定(5分鐘,37°C)。應(yīng)用GraphPad Prism軟件進行了米-曼動力學(xué)分析。數(shù)據(jù)是兩次獨立 實驗的平均值。圖13A和13B曲線圖是煙草植物中表達的人重組a-半乳糖苷酶A分子量的分 析結(jié)果。圖13A表示通過本文所述的凝膠過濾測定的分子量。圖13B表示通過質(zhì)譜法 (MALDI-Tof)測定的分子量。注意在48.6kDa上的主峰(MS上)相當于天然人a -半乳糖 苷酶A的MW。圖14A和圖14B是煙草植物中表達的人重組a -半乳糖苷酶A的PAGE分析和氨 基酸序列。圖14A顯示在PAGE中分離的兩條截然不同的人重組a-半乳糖苷酶A的條帶, 對應(yīng)于62kDa和47. 6kDa。圖14B表示分別從兩條條帶(標記為“上條帶”和“下條帶”)中 得到的氨基酸序列。各條帶中可供測序的多肽部分用紅色表示。不能提供序列數(shù)據(jù)(可能 被聚糖結(jié)構(gòu)掩蔽)的區(qū)域用黑色表示。注意上條帶和下條帶之間已測序區(qū)域完全一致,表 示同一多肽在聚糖結(jié)構(gòu)上可能存在明顯差別。圖15是顯示在煙草植物中表達的人重組a-半乳糖苷酶A的免疫反應(yīng)性的蛋白 質(zhì)印跡照片。從表達靶向液泡的人a-半乳糖苷酶A(a-gal-VaC,泳道“vac”)或者表達 具有ER保留信號(0飛31-1(0£1^泳道“1(0£1/’)的人a-半乳糖苷酶的煙草植物中提取的 蛋白質(zhì)用PAGE分離,點在硝化纖維上,與抗a -半乳糖苷酶A抗體(針對人a -半乳糖苷 酶的氨基酸326-429)反應(yīng),用HRP第二抗體顯色。注意a -gal-vac和a -gal-KDEL表達 的蛋白質(zhì)具有強特異性反應(yīng),而由轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?GFP)提取的蛋白質(zhì)無反應(yīng)性。圖16A和16B曲線圖表示對植物中表達的人重組a -半乳糖苷酶催化性質(zhì)進行的 動力學(xué)分析。圖16A是對植物表達的人重組a -半乳糖苷酶A和市售重組a -半乳糖苷酶 A制劑進行比較的米-曼圖(Michaelis-Menten plot)。圖16B是由圖16A推導(dǎo)的酶動力 學(xué)的Lineweaver-Burke圖,顯示出Km和Vmax (詳情見表中插圖)。綠色表示植物表達的 人重組a-半乳糖苷酶;黑色表示法布瑞酶,藍色表示Replagal。注意植物表達的人重組 a-半乳糖苷酶和市售制劑之間酶動力學(xué)的密切關(guān)系。圖17A和17B是表示在各種溫度下植物中表達的人重組a -半乳糖苷酶穩(wěn)定性 的SDS-PAGE照片。將植物中表達的人重組a-半乳糖苷酶(植物a-Gal)和市售人重組 a -半乳糖苷酶(Replagal)在活性緩沖液(圖17A)或細胞培養(yǎng)基(圖17B)中在指定溫度 下孵育2小時,用SDS-PAGE分離,按照本文所述方法顯色。圖18是成纖維細胞裂解物的蛋白質(zhì)印跡分析照片,顯示在法布萊成纖維細胞中 植物表達的人重組a-半乳糖苷酶的攝取和保留。泳道“植物aGalA”是人法布萊(a-半 乳糖苷酶缺陷型)成纖維細胞與植物表達的人重組a-半乳糖苷酶一起孵育2小時、洗滌 并裂解的成纖維細胞裂解物。最右邊的泳道是Fabrazyme ,介于之中的是分子量梯。圖19是顯示特有聚糖結(jié)構(gòu)峰值的NP-HPLC曲線譜圖以及聚糖本身的示意圖。發(fā)明詳述傳統(tǒng)上在哺乳動物或細菌表達系統(tǒng)中產(chǎn)生用于藥物應(yīng)用的蛋白質(zhì)。在過去幾年 中,在植物中發(fā)現(xiàn)一種有前景的新的表達系統(tǒng)。由于導(dǎo)入新的基因相對簡單,并且可大量產(chǎn) 生蛋白質(zhì)和肽,因此“分子醫(yī)藥農(nóng)業(yè)(molecular pharming) ”作為蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)變得越來
越普遍。
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哺乳動物和植物蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)之間的一個主要差別是由生物合成途徑的不同 所引起的蛋白質(zhì)糖基化序列的變化。研究表明糖基化對活性、折疊、穩(wěn)定性、溶解度、對蛋白 酶的敏感性、血液清除率和蛋白質(zhì)的抗原潛力具有重要作用。因此,植物中產(chǎn)生的任何蛋白 質(zhì)都應(yīng)考慮植物糖基化的潛在分枝。以往在植物中產(chǎn)生有生物活性的哺乳動物蛋白所做的努力都遇到了困難,就充 分說明這一點。例如,Radin等人的美國專利號5,929,304(Crop Tech, Inc)公開了在 煙草植物產(chǎn)生人a-L-艾杜糖醛酸酶(IDUA)和葡糖腦苷脂酶(hGC),該方法通過將有 關(guān)人溶酶體酶編碼序列插入二元質(zhì)粒(binary plasmid)表達盒中用于根癌土壤桿菌 (A. tumefaciens)介導(dǎo)的煙草植物轉(zhuǎn)化。盡管證實了在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生了重組人溶酶體 蛋白質(zhì),并且在重組蛋白中檢測出催化活性,但是沒有披露與靶細胞結(jié)合或者攝取進入靶 細胞內(nèi),而且溶酶體酶的組成仍不適于治療應(yīng)用,據(jù)推測是由于缺乏精確的蛋白質(zhì)糖基化, 而且多肽隨后不能通過特異性受體與它們的靶細胞/組織有效地相互作用。糖部分是一種最常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。蛋白質(zhì)糖基化被分成兩類N聯(lián)和0 聯(lián)。兩個類型的區(qū)別在于聚糖部分在蛋白質(zhì)上所連接的氨基酸一N聯(lián)是與Asn殘基連接, 而0聯(lián)則是與Ser或Thr殘基連接。另外,各個類型的聚糖序列具有獨特的區(qū)別性特征。在 兩個類型中,N聯(lián)糖基化較豐富,對蛋白質(zhì)的作用已得到廣泛深入的研究。另一方面,0聯(lián)聚 糖相對稀少,可獲取的有關(guān)它對蛋白質(zhì)作用的信息較少??色@取的有關(guān)植物中蛋白質(zhì)糖基 化的大部分數(shù)據(jù)集中在N聯(lián)聚糖,而不是0聯(lián)聚糖。本發(fā)明在此描述了基于轉(zhuǎn)基因植物細胞的植物表達系統(tǒng),該系統(tǒng)優(yōu)選為根細胞, 任選和優(yōu)選生長在懸液中。這一表達系統(tǒng)特別設(shè)計用于有效產(chǎn)生目標高甘露糖蛋白。術(shù)語 “高甘露糖”包括具有至少一個暴露出來的甘露糖殘基的糖基化。因此,第一方面,本發(fā)明涉及產(chǎn)生目標高甘露糖重組蛋白的宿主細胞。優(yōu)選重組蛋 白的特征是ER(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))信號肽,更優(yōu)選是ER引導(dǎo)信號肽。又或者,重組蛋白的特征是使 蛋白質(zhì)繞過高爾基體的信號。該信號優(yōu)選能夠使重組蛋白以高甘露糖糖基化為特征,更優(yōu) 選保留這類糖基化,最優(yōu)選靶向ER和/或繞過高爾基體。如本文所詳述,這類信號優(yōu)選作 為信號肽發(fā)揮作用,信號肽更優(yōu)選形成蛋白質(zhì)序列的組成部分,任選和更優(yōu)選通過對蛋白 質(zhì)進行工程改造也使信號肽以作為蛋白質(zhì)的組成部分為特征。應(yīng)當注意的是,信號可任選 為引導(dǎo)信號、保留信號、回避(旁路)信號或其任何組合,或能夠提供所需要的高甘露糖糖 基化結(jié)構(gòu)的任何其它類型的信號。我們無意受一種假設(shè)的限制,但似乎是利用ER引導(dǎo)信號與植物細胞培養(yǎng)物中產(chǎn) 生的重組蛋白能夠阻止向高爾基體的轉(zhuǎn)運,因此保留了所需要的高甘露糖糖基化。任選可 按照本發(fā)明利用能夠產(chǎn)生高甘露糖糖基化的任何機制類型,包括繞過高爾基體的任何機制 類型。ER引導(dǎo)信號肽是本領(lǐng)域眾所周知的;它們是N端信號肽。任選任何合適的ER引導(dǎo) 信號肽均可用于本發(fā)明。本發(fā)明的宿主細胞可任選用編碼目標蛋白質(zhì)的重組核酸分子或用包含該核酸分 子的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染(永久和/或瞬時)。這類核酸分子包含編碼目標蛋白質(zhì)的第一 核酸序列,任選和優(yōu)選與編碼液泡引導(dǎo)信號肽的第二核酸序列可操作性連接。應(yīng)當注意的 是,本文術(shù)語“可操作性(operably) ”連接不必是指體連接(physical linkage)。第一核酸 序列可任選和優(yōu)選與編碼ER(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))引導(dǎo)信號肽的第三核酸序列進一步可操作性連接。在一個實施方案中,本發(fā)明細胞的特征是目標蛋白質(zhì)由細胞以包括至少一個暴露出來的甘 露糖殘基的形式產(chǎn)生,只是優(yōu)選為高甘露糖化的形式。在一個更優(yōu)選的實施方案中,目標蛋 白質(zhì)由細胞以包括暴露出來的甘露糖和至少一個木糖殘基的形式產(chǎn)生,在又一個更優(yōu)選的 實施方案中,是以進一步包括暴露出來的甘露糖和至少一個巖藻糖殘基的形式產(chǎn)生。在一 個最優(yōu)選的實施方案中,蛋白質(zhì)由細胞以包括暴露出來的甘露糖、核心a (1,2)木糖殘基 和核心a_(l,3)巖藻糖殘基的形式產(chǎn)生。術(shù)語“細胞”、“宿主細胞”或“重組宿主細胞”在本文中可互換使用。要理解的是這 類術(shù)語不僅是指具體的受試細胞,而且還是指這類細胞的子代或潛在的子代。因為某些修 飾由于突變或環(huán)境影響可以發(fā)生在隨后的世代中,實際上,這類子代可能與母細胞不相同, 但它仍落入本文所用術(shù)語的范圍內(nèi)。本文所用的“細胞”或“宿主細胞”是指可用采用重組 DNA技術(shù)構(gòu)建的裸DNA或表達載體轉(zhuǎn)化的細胞。本文術(shù)語“轉(zhuǎn)染”是指通過核酸介導(dǎo)的基因 轉(zhuǎn)移將核酸(例如裸DNA或表達載體)導(dǎo)入受體細胞。本文所用“轉(zhuǎn)化”是指這樣一個過 程,其中由于細胞攝入外源DNA或RNA使細胞的基因型發(fā)生改變,并且轉(zhuǎn)化細胞表達例如重 組形式的所需蛋白質(zhì)。應(yīng)當了解的是,抗藥性或其它選擇標記部分意圖在于促進轉(zhuǎn)化體的選擇。另外,選 擇標記(例如抗藥性標記)的存在可用于阻止污染性微生物在培養(yǎng)基中繁殖??赏ㄟ^在誘 導(dǎo)表型存活所必需的條件下培養(yǎng)細胞,來獲得這類轉(zhuǎn)化宿主細胞純的培養(yǎng)物。如上所述,本發(fā)明的宿主細胞可以用核酸分子轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化。本文所用術(shù)語“核酸” 是指多核苷酸,例如脫氧核糖核酸(DNA),且適當時可為核糖核酸(RNA)。該術(shù)語還應(yīng)理解 為包括由核苷酸類似物制備的RNA或DNA的等同物、類似物形式的,并適用于所述實施方案 的單鏈(例如有義或反義)和雙鏈多核苷酸。在又一個實施方案中,本發(fā)明的細胞可用包含重組核酸分子的表達載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn) 化。本文所用“表達載體”包括載體例如質(zhì)粒、病毒、噬菌體、可整合DNA片段和能夠?qū)NA 片段整合到宿主基因組中的其它載體。表達載體通常是自我復(fù)制的DNA或RNA構(gòu)建體,含 有所需要的基因或其片段以及可操作性連接的遺傳調(diào)控元件,該調(diào)控元件在合適宿主細胞 中被識別并使所需基因進行表達。這些調(diào)控元件能夠在合適宿主中進行表達。遺傳調(diào)控元 件一般可包括原核啟動子系統(tǒng)或真核啟動子表達調(diào)控系統(tǒng)。這類系統(tǒng)通常包括轉(zhuǎn)錄啟動 子、任選控制轉(zhuǎn)錄啟始的操縱基因、提高RNA表達水平的轉(zhuǎn)錄增強子、編碼合適核糖體結(jié)合 位點的序列、RNA剪接點(splice junctions)、終止轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列等等。表達載體通常 含有使載體獨立于宿主細胞進行復(fù)制的復(fù)制起點。質(zhì)粒是最常用的載體形式,但是提供等同功能以及作為或成為本領(lǐng)域已知的 其它載體形式也適用于本文。參見例如Pouwels等,Cloning Vectors :a Laboratory Manual (1985 與增刊),Elsevier,N.Y.;以及 Rodriquez 等(主編)Vectors :a Survey of Molecular CloningVectors and their Uses, Buttersworth, Boston, Mass (1988),該文獻 通過引用結(jié)合到本文中。一般而言,這類載體另含有能夠在轉(zhuǎn)化細胞中提供表型選擇的特定基因。還包括 使用原核和真核病毒表達載體以表達編碼本發(fā)明多肽的基因。任選載體可以是通用植物載體(如下面有關(guān)實施例中所述)。或者,載體可任選對 根細胞具有特異性。
在一個優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明的細胞可以是真核細胞或原核細胞。在一個具體實施方案中,本發(fā)明的細胞是原核細胞,優(yōu)選為細菌細胞,最優(yōu)選為根 癌土壤桿菌細胞。這些細胞被用于感染下述優(yōu)選的植物宿主細胞。在另一個優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明的細胞可以是真核細胞,優(yōu)選為植物細胞,最 優(yōu)選為選自以下的植物根細胞發(fā)根土壤桿菌轉(zhuǎn)化的植物根細胞、芹菜細胞、姜細胞、辣根 細胞和胡蘿卜細胞。在一個優(yōu)選的實施方案中,植物根細胞是胡蘿卜細胞。應(yīng)當注意的是,本發(fā)明轉(zhuǎn)化 的胡蘿卜細胞生長在懸液中。如上文和實施例中所述,這些細胞用本發(fā)明的根癌土壤桿菌 細胞轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化本發(fā)明宿主細胞的表達載體或重組核酸分子可按照本領(lǐng)域技術(shù) 人員已知的添加、剔除方法進一步修飾,又或者對肽信號序列進行修飾以改變信號肽切割, 或者增加或改變已表達的溶酶體酶通過植物內(nèi)膜系統(tǒng)的尋靶。例如但不限于可對表達構(gòu)建 體進行特定的工程改造以使溶酶體酶實現(xiàn)分泌或液泡定位或保留內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中。在一個實施方案中,可對表達載體或重組核酸分子進行工程改造,以整合編碼將 溶酶體酶靶向植物液泡的信號的核苷酸序列。例如但不限于,本發(fā)明宿主細胞內(nèi)所包含的 重組核酸分子包含編碼溶酶體酶的第一核酸序列,其與編碼液泡引導(dǎo)信號肽的第二核酸序 列可操作性連接,所述引導(dǎo)信號肽得自堿性煙草幾丁質(zhì)酶A基因。該液泡信號肽具有由SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列。第一核酸序列可任選與編碼ER(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))引導(dǎo)信號肽的第三 核酸序列進一步可操作性連接,該引導(dǎo)信號肽由SEQ ID NO :1表示。在一個實施方案中,本 發(fā)明宿主細胞內(nèi)所包含的重組核酸分子另包含在植物細胞中起作用的啟動子。該啟動子應(yīng) 與本發(fā)明的重組分子可操作性連接。術(shù)語“可操作性連接”在本文中用來表明當?shù)谝缓怂嵝蛄斜环旁谂c第二核酸序列 具有功能關(guān)系的位置上時,第一核酸序列與第二核酸序列可操作性連接。例如,如果啟動 子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達,則啟動子與編碼序列可操作性連接。當必需將兩個蛋白 質(zhì)編碼區(qū)相連接在同一讀框時,任選和優(yōu)選可操作性連接的DNA序列是鄰接(例如體連接 (physically linked))的。因此,DNA序列和調(diào)節(jié)序列以這類方式連接,以便當合適分子 (例如轉(zhuǎn)錄激活蛋白)與調(diào)節(jié)序列結(jié)合時允許基因進行表達。在另一個實施方案中,該重組核酸分子可任選另包含優(yōu)選在植物細胞中起作用的 可操作性連接的終止子。本發(fā)明的重組核酸分子還任選另包含另外的調(diào)控元件、啟動元件 和調(diào)節(jié)元件和/或選擇標記。應(yīng)當注意的是,這些調(diào)節(jié)元件與重組分子可操作性連接??捎糜诒磉_構(gòu)建體的調(diào)節(jié)元件包括可以是與植物細胞同源或異源的啟動子。啟動 子可以是能夠驅(qū)動連接序列在植物細胞和植物中高水平轉(zhuǎn)錄的植物啟動子或非植物啟動 子??捎脕碛行嵤┍景l(fā)明的植物啟動子的非限制性實例包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35S、 rbcS、葉綠素a/b結(jié)合蛋白的啟動子、AdhI、N0S和HMG2或其修飾物或衍生物。啟動子可以 是組成型或誘導(dǎo)型的。例如但不限于,誘導(dǎo)型的啟動子可以是促進表達的啟動子,或者在植 物、植物組織或植物細胞受機械性基因激活(MGA)后增加溶酶體酶核苷酸序列表達的啟動 子??砂凑毡绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的提高或優(yōu)化異源基因在植物和植物細胞中表達的 方法,對用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化本發(fā)明宿主細胞的表達載體進行額外的修飾。這類修飾包括但不限于使DNA調(diào)節(jié)元件突變以提高啟動子強度或改變目標蛋白質(zhì)。在一個優(yōu)選的實施方案中,由本發(fā)明的宿主細胞產(chǎn)生的目標高甘露糖蛋白可以是 富含甘露糖的糖蛋白,該糖蛋白具有至少一個暴露出來的甘露糖殘基(至少一個末端甘露 糖殘基)。在另一個實施方案中,本發(fā)明的糖蛋白中,大部分(大于75%)的甘露糖殘基是 末端暴露出來的甘露糖殘基。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方案,這類高甘露糖蛋白可以是選自以下的溶酶體酶葡 糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、a-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性脂肪 酶、a -半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、a -L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、a -甘露糖 苷酶和唾液酸酶。在本文所用的有關(guān)任何這類溶酶體酶和在本發(fā)明所述植物表達系統(tǒng)中產(chǎn)生的產(chǎn) 物中的術(shù)語“溶酶體酶”,是指由編碼人或動物溶酶體酶的核苷酸序列在轉(zhuǎn)基因植物細胞中 表達的重組肽、經(jīng)修飾的人或動物溶酶體酶或者這類酶的片段、衍生物或修飾物。有益的經(jīng) 修飾的人或動物溶酶體酶包括但不限于具有一個或若干個天然存在的或人工導(dǎo)入的氨基 酸添加、缺失和/或取代的人或動物溶酶體酶??扇苄匀苊阁w酶與分泌性蛋白有共同的生物合成的最初步驟,即在核糖體上合 成,N端信號肽與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)表面結(jié)合,轉(zhuǎn)運至ER腔,在此將信號肽切割,并將寡糖添 加到特定的天冬酰胺殘基上(N聯(lián)),接著新生蛋白質(zhì)在高爾基體內(nèi)進行進一步修飾[von Figura 和 Hasilik, Annu. Rev. Biochem. 55 167-193 (1986) ]。N 聯(lián)寡糖可以是復(fù)雜、多樣和 異源的,可含有高甘露糖殘基。蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后高爾基體前的區(qū)室以及在高爾基體內(nèi)側(cè) 進行進一步加工,形成用于使酶定位于溶酶體的N聯(lián)甘露糖-6-磷酸(M-6-P)寡糖依賴性 識別信號或N聯(lián)M-6-P寡糖非依賴性識別信號[Kornfeld和Mellman,Ann. Rev. CellBiol., 5 483-525 (1989) ;Kaplan 等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 2026 (1977) ]。M_6_P 識別信 號的存在導(dǎo)致酶與M-6-P受體(MPR)結(jié)合。這些結(jié)合酶保留在細胞內(nèi),最終包裝到溶酶體 內(nèi),從而與以分泌為目標或靶向質(zhì)膜的蛋白質(zhì)分隔開來。在一個優(yōu)選的實施方案中,溶酶體酶可以是人葡糖腦苷脂酶(GCD)或人a -半乳 糖苷酶A。再者,在一個具體實施方案中,該優(yōu)選的宿主細胞被重組核酸分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染,該 重組核酸分子另包含得自花椰菜花葉病毒的35S啟動子,優(yōu)選具有由SEQ ID NO :9表示的核 酸序列、根癌土壤桿菌的章魚堿合酶終止子,優(yōu)選具有由SEQ ID NO :12表示的核酸序列和 TMV(煙草花葉病毒)Q翻譯增強子元件。根據(jù)優(yōu)選的實施方案,該重組核酸分子包含基本 上由SEQ ID NO 13表示的核酸序列,編碼具有基本上由SEQ ID NO 14或15表示的氨基酸 序列的高甘露糖GCD。應(yīng)當了解的是,本發(fā)明進一步提供表達載體,該表達載體包含編碼有生物活性的 高甘露糖溶酶體酶的核酸分子。在所述方面的一個優(yōu)選實施方案中,本發(fā)明的表達載體包含編碼有生物活性的高 甘露糖人葡糖腦苷脂酶(GOT)的核酸分子。這種優(yōu)選的表達載體優(yōu)選包含具有基本上由 SEQ ID NO :13表示的核酸序列的重組核酸分子。根據(jù)一個具體的實施方案,優(yōu)選的表達載 體利用下面實施例1中所述的pGREEN II質(zhì)粒。在本發(fā)明另一個實施方案中,表達載體包 含編碼有生物活性的高甘露糖人a-半乳糖苷酶(a-gal-A)的核酸分子。這種優(yōu)選的表達載體優(yōu)選包含重組核酸分子,該分子具有基本上由SEQ ID NO: 17或19表示的核酸序列。 根據(jù)一個具體的實施方案,優(yōu)選的表達載體利用下面實施例5a所述的pICH19170質(zhì)粒。還要注意的是,本發(fā)明提供上述表達載體內(nèi)所包含的表達盒。第二方面,本發(fā)明涉及由本發(fā)明的宿主細胞產(chǎn)生的重組高甘露糖蛋白。在一個優(yōu)選的實施方案中,這種高甘露糖蛋白可以是選自以下的有生物活性的高 甘露糖溶酶體酶葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、a -N-乙酰氨基半乳 糖苷酶、酸性脂肪酶、a-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、a-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫 酸酯酶、a-甘露糖苷酶和唾液酸酶。最優(yōu)選這種溶酶體酶可以是人葡糖腦苷脂酶(GOT)。本文所用的有關(guān)在植物表達系統(tǒng)中產(chǎn)生的任何重組溶酶體酶的術(shù)語“生物活性”, 是指能夠以可檢測水平水解相應(yīng)的人或動物溶酶體酶的天然底物或類似物或合成底物的 重組溶酶體酶。再者,本發(fā)明提供有生物活性富含甘露糖的重組溶酶體酶,該酶具有至少一條包 含暴露出來的甘露糖殘基的寡糖鏈。根據(jù)優(yōu)選的實施方案,本發(fā)明的重組溶酶體酶可在靶部位上與靶細胞的甘露糖受 體結(jié)合。優(yōu)選這個部位可在患有溶酶體貯積病的受治療者的體內(nèi)。任選和更優(yōu)選與天然存在的靶細胞溶酶體酶相應(yīng)的親和力相比,重組溶酶體酶對 靶細胞的親和力提高。在一個具體實施方案中,靶部位的靶細胞可以是受治療者肝中的枯 否氏細胞。在一個優(yōu)選的實施方案中,重組溶酶體酶可選自葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂 酶、氨基己糖苷酶、a-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、a-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂 酶、a-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、a-甘露糖苷酶或唾液酸酶。該重組溶酶體酶最優(yōu)選為葡糖腦苷脂酶(GOT)或a -半乳糖苷酶A。第三方面,本發(fā)明涉及產(chǎn)生高甘露糖蛋白的方法。因此,本發(fā)明的方法包括以下步 驟(a)制備重組宿主細胞培養(yǎng)物,所述細胞用編碼目標重組蛋白的重組核酸分子或用包 含該重組核酸分子的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染;(b)在允許高甘露糖蛋白表達的條件下,將由 步驟(a)制備的宿主細胞培養(yǎng)物培養(yǎng)在懸液中,其中宿主細胞以高甘露糖化的形式產(chǎn)生蛋 白質(zhì);(c)由從(a)得到的培養(yǎng)物中收獲細胞,并從細胞中回收蛋白質(zhì);(d)通過適當?shù)牡?白質(zhì)純化方法對步驟(c)的蛋白質(zhì)進行純化。任選和優(yōu)選可通過將本發(fā)明的植物細胞培養(yǎng)在美國專利第6,391,638號(2002年 5月21日授予專利權(quán),通過引用結(jié)合到本文中如同全部陳述于此一樣)中所述的裝置中,來 制備重組蛋白。用該裝置將植物細胞培養(yǎng)在懸液中的條件參見本發(fā)明的發(fā)明人之一的名稱 為"CELL/TISSUE CULTURING DEVICE, SYSTEM ANDMETH0D (細胞 / 組織培養(yǎng)裝置、系統(tǒng)和方 法)”的美國專利申請,該專利與本申請一樣為共同擁有,通過引用結(jié)合到本文中如同全部 陳述于此一樣,該與本申請同一天提出申請。根據(jù)本發(fā)明實施方案的又一個方面,重組蛋白可以在整株植物或其部分中表達。 因此,本發(fā)明的方法包括以下步驟(a)用編碼目標重組蛋白的重組核酸分子或用包含該 重組核酸分子的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染植物或植物細胞;(b)在允許富含甘露糖的蛋白質(zhì)表 達的條件下,使通過步驟(a)制備的經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的植物或細胞生長,其中植物細胞以具 有暴露出來的末端甘露糖殘基的甘露糖基化形式產(chǎn)生蛋白質(zhì);(c)由從(a)得到的植物或植物組織中收獲植物或組織,并從細胞中回收蛋白質(zhì);(d)通過適當?shù)牡鞍踪|(zhì)純化方法對 步驟(c)的蛋白質(zhì)進行純化。在本發(fā)明另一個實施方案中,用載體轉(zhuǎn)化的植物為穩(wěn)定轉(zhuǎn)化, 在步驟(b)之后對表達目標重組蛋白的植物進行選擇,對選出的轉(zhuǎn)基因植物進行繁殖后, 收獲和回收重組蛋白。對于組成型表達或條件性表達所需要的哺乳動物多肽,用重組表達 載體轉(zhuǎn)化的植物或植物組織(包括但不限于愈傷組織、未成熟胚、花粉、種子、培養(yǎng)物及植 物原位(in planta)中的苗端部分)是本領(lǐng)域眾所周知的,例如,對于根癌土壤桿菌介導(dǎo)的 轉(zhuǎn)化煙草植物使用二元質(zhì)粒(參見美國專利第5,763,748號)、使用共整合載體或者使用轉(zhuǎn) 移載體(mobilization vector)。對用本發(fā)明方法產(chǎn)生的目標高甘露糖蛋白進行回收和純化的具體非限制性實例 可參見下面的實施例。實施例表明本發(fā)明產(chǎn)生的重組h-G⑶預(yù)料不到地與本發(fā)明轉(zhuǎn)化的胡 蘿卜細胞內(nèi)膜結(jié)合,不分泌到培養(yǎng)基中??砂凑毡绢I(lǐng)域已知方法(例如過濾或沉淀),從細 胞碎片和其它不溶性組分中分離出可溶性rh-GCD。例如,在一次凍融循環(huán)之后,細胞遭到破 壞,釋放出胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì),而h-GCD保持與不溶膜碎片結(jié)合。接著對這種可溶和不溶膜 碎片混合物進行離心,除去可溶性流分,從而使純化方法簡化。然后在溫和洗滌劑、蛋白酶 抑制劑和中和氧化試劑存在下通過機械破壞,使膜結(jié)合的h-GCD溶解。可溶性酶可采用層 析技術(shù)進一步純化,例如陽離子交換和疏水相互作用層析柱。在生物反應(yīng)器中生產(chǎn)rh-GCD 期間和純化過程中,可通過一個或多個生化實驗測定h-GCD特征、產(chǎn)量、純度和酶活性。包 括但不限于檢測酶底物或底物類似物的水解、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析和ELISA和蛋 白質(zhì)印跡等免疫分析??赏ㄟ^一個或多個生化實驗,對在整株植物和植物組織中表達的重組蛋白的產(chǎn) 量、純度、酶活性、抗原特性、生物活性以及聚糖特征進行評價,正如下面實施例中所描述的 一樣,實驗包括但不限于檢測酶底物或底物類似物的水解、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析、 ELISA和蛋白質(zhì)印跡等免疫分析、通過糖苷酶和層析法對聚糖進行分析。根據(jù)優(yōu)選的實施方案,本方法所采用的宿主細胞包括本發(fā)明的宿主細胞。在另一個優(yōu)選的實施方案中,由本發(fā)明方法產(chǎn)生的高甘露糖蛋白可以是有生物活 性的高甘露糖溶酶體酶,該酶具有至少一條包含暴露出來的甘露糖殘基的寡糖鏈。該重組酶可在靶部位上與靶細胞的甘露糖受體結(jié)合。更特別的是與天然存在的靶 細胞溶酶體酶相應(yīng)的親和力相比,通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的重組酶對靶細胞的親和力提高。 因此,靶部位的靶細胞可以是受治療者肝中的枯否氏細胞。在一個具體實施方案中,這種溶酶體酶可選自葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂 酶、氨基己糖苷酶、a-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、a-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂 酶、a -L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、a _甘露糖苷酶和唾液酸酶。最優(yōu)選這種溶 酶體酶可以是葡糖腦苷脂酶(GCD)。在另一個優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明方法所采用的宿主細胞可以是選自以下的植 物根細胞發(fā)根土壤桿菌轉(zhuǎn)化的根細胞、芹菜細胞、姜細胞、辣根細胞和胡蘿卜細胞。植物根 細胞最優(yōu)選為胡蘿卜細胞。特別應(yīng)當注意的是轉(zhuǎn)化的宿主胡蘿卜細胞生長在懸液中。又一方面,本發(fā)明涉及通過使用外源重組溶酶體酶來治療患有溶酶體貯積病的受 治療者、優(yōu)選為哺乳動物受治療者的方法。要了解的是,本發(fā)明不局限于已公開和描述的具體實施例、方法步驟和本文所公開的用作這類方法步驟的材料,所述材料可略有變化。還要了解的是,本文所用術(shù)語僅用于 描述具體實施方案的目的,并不是限制性的,因為本發(fā)明的范圍僅受隨附權(quán)利要求書及其 等同內(nèi)容的限制。除非另有說明,否則貫穿本說明書和隨附權(quán)利要求書的術(shù)語“包含”及其變體,應(yīng) 理解為是指包括一個或多個所述整體或步驟,但并不排斥其它任一個或多個的整體或步
馬聚o必須注意的是,本說明書和隨附權(quán)利要求書所用的未加數(shù)詞修飾的單數(shù)形式包括 其復(fù)數(shù)形式,除非文中另有明確說明。下面的實施例是本發(fā)明的發(fā)明人在實施本發(fā)明各方面所采用的代表性技術(shù)。應(yīng)當 了解的是,雖然這些技術(shù)對于實施本發(fā)明是示例性的優(yōu)選實施方案,但是本領(lǐng)域技術(shù)人員 應(yīng)了解根據(jù)本公開內(nèi)容,在不偏離本發(fā)明的精神和既定范圍的情況下可進行多種改動。
實施例實驗方案質(zhì)粒載體*CE-T_由獲自Galili教授的質(zhì)粒CE構(gòu)建[美國專利5,367,110,1994年11月 22 日]。質(zhì)粒CE用Sail消化。使用DNA聚合酶I的大片段將Sail黏性末端制成平端。然后質(zhì)粒用PstI消化, 與編碼得自堿性內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因的ER引導(dǎo)信號的DNA片段連接[擬南芥(Arabidopsis thaiiana)]ATGAAGACTAATCTTTTTCTCTTTCTCATCTTTTCACTTCTCCTATCATTATCCTCGGCCGAATTC,液泡引導(dǎo)信號得自用 Smal 和 PstI 消化的煙 草幾丁質(zhì)酶 A :GATCTTTTAGTCGATACTATG0*pGREENII_ 得自 P. Mullineaux 教授[Roger P. Hellens 等(2000)Plant Mol. Bio. 42 =819-832]。pGREENII載體的表達受得自花椰菜花葉病毒的35S啟動子、TMV(煙草 花葉病毒)Q翻譯增強子元件和得自根癌土壤桿菌的章魚堿合酶終止子序列的控制。cDNAhGCD-得自 ATCC(保藏號 65696),含有葡糖苷酶 3 酸(glucosidase beta acid) [葡糖腦苷脂酶]的GC-2. 2 [GCS-2kb ;入-EZZ- Y 3人]。插入片段長度(kb) 2. 20 ;組織 成纖維細胞WI-38細胞。表達質(zhì)粒的構(gòu)建使用正向弓丨物5’ CAGAATTCGCCCGCCCCTGCA 3, 和反向引物 5,CTCAGATCTTGGCGATGCCACA 3,,對編碼 hGCD 的 cDNA(ATTC 克隆號 65696)進行擴增。純 化的PCR DNA產(chǎn)物用內(nèi)切核酸酶EcoRI和Bglll消化(見引物中有下劃線的識別序列), 并連接到中間載體上,該載體具有用同一酶消化的表達盒E-T。切下表達盒,從中間載體上 洗脫出來,使用限制性內(nèi)切酶Smal和Xbal連接到二元載體pGREENII上,形成最終的表達 載體。通過與PGREEN載體一起獲得的由nos啟動子驅(qū)動的NPTII基因賦予卡那霉素抗性 (圖1B)。所得表達盒由圖1A表示。使用下列測序引物,對所得質(zhì)粒進行測序以確保信號的正確框內(nèi)融合5’ 35S啟
23動子5,CTCAGAAGACCAGAGGGC 3,,3,終止子5,CAAAGCGGCCATCGTGC 3,。建立胡蘿卜愈傷組織和細胞懸浮培養(yǎng)物我們按照Torres K. C.之前所描述的方法,建立了胡蘿卜愈傷組織和細胞懸浮培 養(yǎng)物(Tissue culture techniques for horticular crops,第 111 頁,169)。胡蘿卜細胞的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化細胞的分離通過前述方法的修改方法,使用土壤桿菌屬轉(zhuǎn)化進行胡蘿卜細胞的轉(zhuǎn)化 [ffurtele, E. S.和 Bulka,K. Plant Sci. 61 :253_262 (1989)]。在整個方法中使用生長在 液體培養(yǎng)基中的細胞而不是愈傷組織。調(diào)整孵育和生長時間以適應(yīng)細胞液體培養(yǎng)物的轉(zhuǎn) 化。簡單地說,土壤桿菌通過電穿孔用PGREENII載體轉(zhuǎn)化[den Dulk_Ra,A.和Hooykaas, P. J. (1995)Methods Mol. Biol. 55 :63_72],然后使用 30mg/ml 巴龍霉素(paromomycine)抗 生素進行選擇。胡蘿卜細胞在液體培養(yǎng)基中用土壤桿菌轉(zhuǎn)化,使用60mg/ml巴龍霉素抗生 素選擇。篩選轉(zhuǎn)化的胡蘿卜細胞用于分離表達高水平GOT的愈傷組織轉(zhuǎn)化后14天,將得自培養(yǎng)物的細胞按3%壓緊細胞體積的稀釋度接種到固體培養(yǎng) 基上,以便由各個細胞聚簇形成愈傷組織。當各愈傷組織直徑達到l_2cm時,將細胞在SDS 樣品緩沖液中勻漿,所得蛋白質(zhì)提取物用SDS-PAGE分離[Laemmli U.,(1970) Nature227 680-685]后,轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜(hybond C硝化纖維,0. 45微米,得自Amersham Life Science目錄號RPN203C)上。使用多克隆抗hG⑶抗體,對G⑶進行蛋白質(zhì)印跡檢測(如 下文中所述)。使表達顯著水平G⑶的愈傷組織擴增后,轉(zhuǎn)移在液體培養(yǎng)基中生長用于規(guī)模 放大、蛋白質(zhì)純化和分析。制備多克隆抗體將75微克重組G⑶(Cerezyme )懸浮于3ml完全弗氏佐劑中,給兩只兔子的每一 只注射。2周后給每只兔子加強注射。加強注射后10天左右給兔子抽血,按一周間隔再次 加強注射直到抗體效價開始下降。除去血塊后,將血清分成等分量并保存在-20°C下。生長在生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)物的規(guī)模放大將約1cm(單位直徑)經(jīng)遺傳修飾含有rh-G⑶基因的胡蘿卜細胞的愈傷組織 接種到Murashige和Skoog(MS) 9cm直徑瓊脂培養(yǎng)板上,培養(yǎng)板含有4. 4gr/l MSD培養(yǎng) 基(Duchefa)、9. 9mg/l 鹽酸硫胺素(Duchefa)、0. 5mg 葉酸(Sigma)、0. 5mg/l 生物素 (Duchefa)、0. 8g/l酪蛋白水解物(Dueifa)、糖30g/l和激素2-4D(Sigma)。使愈傷組織在 25°C下生長14天。正如本領(lǐng)域所熟知的一樣,通過將轉(zhuǎn)化的愈傷組織在含有0. 2mg/l 2,4- 二氯乙 酸)的MSD液體培養(yǎng)基(Murashige和Skoog (1962))中進行繼代培養(yǎng)來制備懸浮細胞培養(yǎng) 物。在25°C下,將懸浮細胞在250ml錐形瓶(工作體積始于25ml,7天后增至50ml)中培 養(yǎng),振蕩速度為60rpm。隨后,在相同條件下,通過將工作體積加到300ml,將細胞培養(yǎng)物體 積加大至1L錐形瓶。通過加入400ml得自兩個培養(yǎng)7天的1L錐形瓶的懸浮細胞,獲得裝 有4L MSD培養(yǎng)基的小生物反應(yīng)器(10L)[參見W098/13469]的接種物。在25°C下用lLpm 通氣培養(yǎng)一周后,將MDS培養(yǎng)基加到高達10L,在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)。再培養(yǎng)5天后,收獲 大部分細胞,使細胞培養(yǎng)基通過80 y網(wǎng)后收集。擠出多余的培養(yǎng)基,將壓緊的細胞濾餅保 存在-70°C下。
生物反應(yīng)器裝置的更多詳情可參見2002年5月21日授予專利權(quán)的美國專利第 6,391,638號,之前已通過引用予以結(jié)合。蛋白質(zhì)純化為了分離培養(yǎng)基中的不溶性GCD,將含有約100g濕重細胞的冷凍細胞濾餅融化, 接著將融化的細胞在4°C下以17000xg離心20分鐘。將不溶性物質(zhì)和完整細胞重新懸浮于 100ml洗滌緩沖液(20mM磷酸鈉(pH 7. 2), 20mM EDTA)中進行洗滌,然后在4°C下以17000g 離心20分鐘使之沉淀。提取rh-G⑶(重組人GOT),在200ml提取緩沖液(20mM磷酸鈉(pH 7. 2)、20mM EDTAUmM PMSF、20mM抗壞血酸、3. 8g聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、lmM DTT和 曲通-x-100)中使沉淀勻漿增溶。然后在室溫下使勻漿振蕩30分鐘,在4°C下以17000xg 離心20分鐘澄清。棄去沉淀后,加入濃檸檬酸調(diào)節(jié)上清液的pH至pH 5.5。在上述相同條 件下,將PH調(diào)節(jié)后所形成的混濁液通過離心澄清。進一步的純化用層析柱方法如下進行將200ml澄清的培養(yǎng)基加到在25mM檸檬酸 鈉緩沖液(pH 5. 5)平衡的裝入XK柱(2. 6x20cm)的20ml強陽離子交換樹脂(Macro-Prep high-S support, Bio-Rad)上。將柱與 AKTA (prime 系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biotech) 連接以供監(jiān)測傳導(dǎo)率、pH和280nm下的吸光度之用。樣品以20ml/分鐘加載,之后用平衡緩 沖液(25mM檸檬酸鈉緩沖液(pH 5.5))以12ml/分鐘的流速洗滌柱,直到UV吸光度達到基 線為止。rh-G⑶用含有200mMNaCl的平衡緩沖液預(yù)洗脫,用含有600mM NaCl的平衡緩沖液 得到洗脫液。在運行期間收集的流分通過酶活性測定法進行監(jiān)測,合并具有酶促活性(洗 脫峰處)的管。合并的樣品用含有5%乙醇的水稀釋(1 5)后,用NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0。 將含有rh-GCD的樣品加到第二根XK柱(1. 6x20cm)上,第二根柱裝有10ml與前述柱相同 的樹脂。此柱的樹脂用含有5%乙醇的20mM檸檬酸鹽緩沖液((pH 6.0))平衡。加載樣品 后,用平衡緩沖液洗滌柱,G⑶通過洗脫緩沖液(20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)、5%乙醇和 1M NaCl)從柱中洗脫出來。合并洗脫步驟中吸收峰的流分,加到第三根柱上。最終的純化步驟在裝有8ml疏水相互作用樹脂(TSK凝膠,Toyopearl Phenyl-650C, Tosoh Corp.)的XK柱(1. 6x20cm)上進行。樹脂用含有5%乙醇的10mM檸 檬酸鹽緩沖液(PH 6.0)平衡。將由之前各柱合并的G⑶洗脫液以6ml/分鐘加樣后,用平 衡緩沖液洗滌直到UV吸收達到基線。純的GCD用含有50%乙醇的10mM檸檬酸緩沖液洗 脫,合并后保存在-20°C下。測定蛋白質(zhì)濃度采用牛血清白蛋白標準(流分V Sigma),通過Lowry/Bradford法(Bio Rad蛋白 質(zhì)測定法)[Bradford,M.,Anal. Biochem. (1976)72 :248],對細胞提取物和流分中的蛋白 質(zhì)濃度進行測定?;蛘撸ㄟ^280nm下的吸收求出勻質(zhì)蛋白質(zhì)樣品的濃度,lmg/ml = 1.40. D28Q。純度通過280/260nm比率求出。G⑶酶活性測定法采用對硝基苯基-0 -D-吡喃葡萄糖苷(Sigma)作為底物,測定GOT的酶促活性。 測定緩沖液含有60mM磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液(pH = 6)、4mM 0 -巰基乙醇、1. 3mM EDTA、 0. 15%曲通X-100、0. 125%?;悄懰徕c。測定在96孔ELISA板中進行,將0-50微升的樣品 與250微升測定緩沖液一起孵育,將底物加至終濃度為4mM。使反應(yīng)物在37°C下孵育60分 鐘。通過405nm下的吸光度檢測產(chǎn)物(對硝基苯基;pNP)的形成。在t = 0和在終點時監(jiān)測405nm下的吸光度。60分鐘后,將6微升5N NaOH加到各孔中,再次監(jiān)測405nm下的吸光 度。平行測定的參比標準曲線,用來定量測定受試樣品中GCD的濃度[Friedman等,(1999) Blood,93(9) :2807-16]。動力學(xué)研究:對于動力學(xué)研究,按照上述方法做一些改動,使用葡糖神經(jīng)酰胺的熒光短酰基鏈 類似物N-[6-[(7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑-4-基)氨基]己?;鵠-D赤-葡糖鞘氨 醇(C6-NBD-D-赤-GlcCer)來測定 GCD 的活性。按照 Schwarzmann 和 Sandhoff (1987)所 述方法,使用6-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3- 二唑-4-基)氨基己酸琥珀酰亞胺酯使葡糖鞘 氨醇N?;?,來合成C6-NBD-GlcCer。使用最終體積為200 u 1 MES緩沖液(50mM,(pH5. 5)) 中的0. 2 i! g Cerezyme 或0. 2 y g本發(fā)明的植物GOT進行測定。C6-NBD-GlcCer的濃度介 于0.25-100 iiM。在37°C下繼續(xù)進行反應(yīng)5分鐘,加入1.5ml氯仿/甲醇(1 2,體積/體 積)停止反應(yīng)后,提取熒光脂質(zhì)并進行分析。生化分析凝膠中的蛋白酶解和質(zhì)譜法分析用干凈的剃須刀片切割凝膠中染色的蛋白質(zhì)條帶,凝膠中的蛋白質(zhì)用10mM DTT還 原后,用100mM碘乙酰胺的10mM碳酸氫銨溶液修飾。凝膠切段用50%乙腈的10mM碳酸氫 銨溶液處理以將蛋白質(zhì)脫色,然后將凝膠切段干燥。干燥的凝膠切段用含有約0. 1 y g胰蛋 白酶/樣品的10%乙腈的10mM碳酸氫銨溶液再水化。使凝膠切段在37°C下孵育過夜后, 所得肽用含0. 三氟乙酸鹽的60%乙腈回收。胰蛋白酶消化的肽段用反相層析法分離(用多孔R2 (Perspective)自行充填的 0. IX 300-mm熔融硅膠毛細管(J&W,內(nèi)徑100微米))。以1 y 1/分鐘的流速,用線性梯度 含0. 乙酸的5-95%乙腈水溶液洗脫肽段80分鐘。將過柱液體電噴霧到離子阱質(zhì)譜儀 (LCQ, Finnegan, San Jose, CA)中。以陽離子模式采用重復(fù)性完全MS掃描,接著通過選自 第一次MS掃描的最主要離子的碰撞誘導(dǎo)解離(CID)來進行質(zhì)譜法分析。應(yīng)用Sequest軟 件[J. Eng 禾口 J. Yates,University of Washingtonand Finnegan,San Jose],將質(zhì)譜數(shù)據(jù) 與NR-NCBI數(shù)據(jù)庫中模擬蛋白酶解和蛋白質(zhì)的CID進行比較。按照產(chǎn)品說明書,在肽測序儀(P印tide Sequencer)494A(PerkinElmer)上對蛋白 質(zhì)的氨基端進行測序。腹膜巨噬細胞的G⑶攝取 已知將GOT靶向并攝入巨噬細胞是由甘露糖/N-乙酰基葡糖胺受體介導(dǎo)的,可按 照 Stahl P.和 Gordon S.所描述的方法[J. Cell Biol. (1982)93(1) :49_56],使用從小鼠 中獲得的巰基乙酸鹽誘導(dǎo)的腹膜巨噬細胞來測定。簡單地說,經(jīng)腹膜內(nèi)給小鼠(雌性,品系 C57-B6)注射不含葡萄糖的2. 5ml 2. 4%細菌用巰基乙酸鹽(Bacto-thioglycolate)培養(yǎng) 基(Difco目錄號0363-17-2)。4-5天后,經(jīng)處理的小鼠通過頸脫位法處死,腹膜腔用磷酸緩 沖鹽溶液沖洗。將細胞通過離心(lOOOxg 10分鐘)沉淀后,重新懸浮于含有10%胎牛血清 的DMEM(Beit Haemek, Israel)中。然后將細胞以l_2xl05細胞/孔接種到96孔組織培養(yǎng) 板上,在37°C下孵育。90分鐘后,未貼壁細胞使用PBS洗滌三次后,在酵母甘露聚糖(2-10, 5mg/ml)存在和不存在下,將貼壁巨噬細胞在含有規(guī)定量的rhGCD的培養(yǎng)基中于37°C孵育 90分鐘,最終體積的范圍為200微升中0-40微克。孵育后,棄去含有過量rGCD的培養(yǎng)基,細胞用PBS洗滌三次,然后用裂解緩沖液(10mM Tris(pH = 7. 3)、lmM MgCl2、0. 5% NP-40和 蛋白酶抑制劑)裂解。對細胞裂解物進行上述體外糖苷酶測定法以測定由細胞攝入的rGCD 的活性。實施例1表汰質(zhì)粒的構(gòu)建就以下各實施例而言,本實施例更詳細地描述了所用示例性表達質(zhì)粒的構(gòu)建。使用正向引物5’ CAGAATTCGCCCGCCCCTGCA 3 ’(亦由 SEQ ID NO 1 表示)和反向引 物5,CTCAGATCTTGGCGATGCCACA 3,(亦由 SEQ ID NO 2 表示),使編碼 hGCD 的 cDNA(ATTC 克隆號65696)進行擴增。純化的PCR DNA產(chǎn)物用內(nèi)切核酸酶EcoRI和Bglll消化(見引物中有下劃線的識 別序列),并連接到中間載體上,該載體具有用同一酶消化的表達盒CE-T。CE-T包括得自 堿性內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因[擬南芥]的ER引導(dǎo)信號MKTNLFLFLIFSLLLSLSSAEA(亦由SEQ ID NO :3表示)及得自煙草幾丁質(zhì)酶A的液泡引導(dǎo)信號DLLVDTM* (亦由SEQ ID NO :4表示)。切下表達盒,從中間載體上洗脫出,使用限制性內(nèi)切酶Smal和Xbal連接到二元載 體pGREENII上,形成最終的表達載體。通過由nos啟動子驅(qū)動的NPTII基因連同pGREEN 載體一起賦予卡那霉素抗性(圖1B)。所得表達盒由圖1A表示。使用下列測序引物,對所得質(zhì)粒進行測序以確保信號的正確框內(nèi)融合得自5,35S 啟動子的引物5,CTCAGAAGACCAGAGGGC 3,(亦由 SEQ ID NO 5 表示) 和3’終止子5’ CAAAGCGGCCATCGTGC3’(亦由SEQ ID NO 6表示)。經(jīng)證實的克隆hGCD編 碼序列由SEQID N0 7表示。實施例2轉(zhuǎn)化胡蘿卜細胞和篩詵表汰rhGCD的轉(zhuǎn)化細胞本實施例描述了轉(zhuǎn)化本發(fā)明胡蘿卜細胞的示例性方法,同樣用于以下實施例中。通過前述土壤桿菌屬轉(zhuǎn)化法[Wurtele和Bulka(1989),出處同上],進行了胡蘿卜 細胞的轉(zhuǎn)化。將經(jīng)遺傳修飾的胡蘿卜細胞接種在Murashige和Skoog(MS)瓊脂培養(yǎng)基上, 其中具有用于選擇轉(zhuǎn)化體的抗生素。如圖2所示,使用抗hGCD抗體,通過蛋白質(zhì)印跡分析, 對由所產(chǎn)生的愈傷組織中制備的提取物的GCD表達進行了測定,與Cerezyme標準(陽性對 照)和非轉(zhuǎn)化細胞提取物(陰性對照)進行了比較。所測試的各個愈傷組織中,選出一個 愈傷組織(編號22)用于規(guī)模放大生長和蛋白質(zhì)純化。如下進行蛋白質(zhì)印跡法。對于該測定法,所獲得樣品的蛋白質(zhì)用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,轉(zhuǎn)移 到硝化纖維上。為此,如下制備SDS聚丙烯酰胺凝膠。SDS凝膠由層積膠和分離膠組成 (按照 Laemmli, UK 1970, Cleavage of structural proteins during assembly of the head ofbacteriphage T4 (噬菌體T4頭部裝配期間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的切割),Nature227, 680-685)。分離膠的組成如下12%丙烯酰胺(Bio-Rad)、每10ml凝膠溶液4微升TEMED (N, N, N',N'-四甲基乙二胺;Sigma 目錄號 T9281)、0. SDS、375mM Tris-HCl(pH 8.8) 和0.1%過硫酸銨(APS)。在這種情況下,TEMED和過硫酸銨用作聚合的自由基引發(fā)劑 (freeradical starter)。在開始聚合之后約20分鐘,將層積膠(3%丙烯酰胺、0. 1% SDS、 126mM Tris-HCl (pH 6. 8)、0. 1% APS和5微升TEMED/5ml層積膠溶液)倒在分離膠之上,
27插入12或18個間隔梳以形成樣品孔。陽極槽和陰極槽加載了相同的緩沖液溶液含有SDS(Bi0rad,目錄號161-0772) 的Tris甘氨酸緩沖液(pH 8. 3)。含抗原的材料用0.5體積的加樣緩沖液(30ml甘油(Sigma 目錄號69012)、9%505、151111巰基乙醇(Sigma 目錄號M6250)、187. 5mM Tris_HCl(pH 6.8)、 500微升溴酚藍,每100ml樣品緩沖液的所有組分的體積)處理,然后將混合物在100°C下 加熱5分鐘后,加到層積膠中。電泳在室溫下進行適當?shù)臅r間,例如對于大小為13x9cm的凝膠,采用50_70伏特 的恒定電流強度進行45-60分鐘,接著在180-200伏特下進行45-60分鐘。然后將抗原轉(zhuǎn) 移到硝化纖維(Schleicher 和 Schuell, Dassel)上?;旧习凑毡疚乃龇椒ㄟM行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移。將凝膠與相貼的硝化纖維一起放在 Whatmann 3匪濾紙、0. 5cm厚的傳導(dǎo)性泡沫材料和通過鉬電極導(dǎo)電的電極絲之間。濾紙、泡 沫材料和硝化纖維用轉(zhuǎn)移緩沖液(得自Biorad的TG緩沖液,目錄號161-0771,用甲醇和水 緩沖液(20%甲醇)稀釋10倍)充分浸泡。轉(zhuǎn)移在4°C下以100伏特進行90分鐘。轉(zhuǎn)移之后,使硝化纖維上的游離結(jié)合位點在4°C下用封閉緩沖液過夜飽和,封閉緩 沖液含有奶粉(Dairy America)和用磷酸鹽緩沖液(Riedel deHaen,目錄號30435)稀 釋的0.1%吐溫20(518111£1目錄?1379)。將印跡條帶與抗體(按1 6500在上述含有 奶粉和0. 吐溫20的磷酸鹽緩沖液中稀釋,pH 7. 5)在37°C下一起孵育1小時。與抗體孵育之后,洗滌印跡三次,每次用PBS(磷酸鹽緩沖的磷酸鈉緩沖液 (Riedel deHaen,目錄號30435))洗滌10分鐘。印跡條帶然后與按1 3000用緩沖液稀 釋的合適的第二抗體(山羊抗兔(完整分子)HRP(Sigma目錄號A-4914))在室溫下孵育1 小時,該緩沖液含有奶粉(Dairy America)和用磷酸鹽緩沖液(Riedel deHaen,目錄號 30435)稀釋的0. 吐溫20 (Sigma目錄號P1379)。用PBS洗滌幾次后,印跡條帶用ECL顯 影劑(Amersham RPN 2209)染色。將印跡浸入ECL試劑之后,將印跡暴露于X光片F(xiàn)UJI Super RX18x24,用 FUJI-ANAT0MIX顯影劑和定影劑(FUJI-X fix目錄號FIXRTU兩者之一)顯影。特載有被抗 體結(jié)合的蛋白質(zhì)的條帶在此處理后顯現(xiàn)出來。在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)物的規(guī)模放大將轉(zhuǎn)化的愈傷組織在液體培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng),獲得愈傷組織22的懸浮培養(yǎng)物。 將細胞在振蕩的錐形瓶中培養(yǎng),直到總體積足以接種到生物反應(yīng)器(如本實驗方案所述) 中為止。經(jīng)遺傳修飾的轉(zhuǎn)基因胡蘿卜細胞可以培養(yǎng)數(shù)月,可在5-7天的循環(huán)中收獲細胞(未 顯示數(shù)據(jù))。在培養(yǎng)的第7天,胡蘿卜細胞中產(chǎn)生的rh-G⑶的量達到峰值時,使培養(yǎng)物通過 100目網(wǎng)來收獲細胞。應(yīng)當注意的是,細胞可通過本領(lǐng)域已知方法收獲,例如過濾或離心。 壓緊后的細胞濾餅(提供用于純化h-GCD至均質(zhì)的材料)可保存在冷凍溫度下。實施例3得自轉(zhuǎn)化的胡蘿卜細胞的重組活性hGCD蛋白的純化發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)化的胡蘿卜細胞中表達的重組h-GCD與細胞的內(nèi)膜結(jié)合,不分泌到培養(yǎng) 基中。機械性破壞細胞使rGCD保持與不溶膜碎片結(jié)合(未顯示數(shù)據(jù))。rGCD然后用溫和 洗滌劑溶解,從細胞碎片和其它不溶性組分中分離出來。可溶性酶采用本實驗方案所述的 層析技術(shù)(包括陽離子交換和疏水相互作用層析柱)進一步純化。
為將培養(yǎng)基與不溶性GCD分離,將含有約100g濕重細胞的冷凍細胞餅融化,接著 在4°C下以17000xg離心20分鐘。將不溶性物質(zhì)和完整細胞重新懸浮于100ml洗滌緩沖液 (20mM磷酸鈉(pH 7. 2), 20mM EDTA)進行洗滌后,在4°C下以17000g離心20分鐘使之沉淀。 將 200ml 提取緩沖液(20mM 磷酸鈉(pH 7. 2)、20mM EDTA、lmMPMSF、20mM 抗壞血酸、3. 8g 聚 乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、ImM DTT、1 %曲通-x-100 (Sigma))中的沉淀進行勻漿,提取rGCD 并增溶。使勻漿在室溫下振蕩30分鐘后,在4°C下以17000g離心20分鐘澄清。棄去沉淀 后,加入濃檸檬酸調(diào)節(jié)上清液的pH至pH 5.5。將調(diào)節(jié)pH后所形成的混濁液在上述相同條 件下離心澄清。進一步的純化通過層析柱如下進行在最初階段,將200ml澄清的提取物加到用 25mM檸檬酸鈉緩沖液(pH 5.5)平衡的裝填在XK柱(2.6x20cm)中的20ml強陽離子交 換豐對月旨(Macro-Pr印 high-Ssupport, Bio-Rad)上。將柱與 AKTA prime 系統(tǒng)(Amersham PharmaciaBiotech)連接以供監(jiān)測傳導(dǎo)率、pH和280nm下的吸光度之用。樣品以20ml/分鐘 加載,之后用平衡緩沖液(25mM檸檬酸鈉緩沖液(pH 5. 5))以12ml/分鐘的流速洗滌柱,直 到UV吸光度達到基線為止。Rh-G⑶用含有200mM NaCl的平衡緩沖液預(yù)洗脫,用含有600mM NaCl的平衡緩沖液得到洗脫液。在運行期間收集的流分通過酶活性測定法進行監(jiān)測,合并 具有酶促活性(在洗脫峰中)的管。合并的樣品用含有5%乙醇的水稀釋(1 5),用NaOH 調(diào)節(jié)pH至6.0。圖3A表示該純化階段的標準運行。在運行期間收集的流分通過酶活性測定法監(jiān) 測,如圖3B所示,圖3C表示活性測定用洗脫流分的考馬斯藍染色。將含有rG⑶的洗脫流分加到第二根XK柱(1. 6x20cm)用于第二純化階段,第二根 柱裝有10ml與前述柱相同的樹脂。此柱的樹脂用含有5%乙醇的20mM檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)平衡。加載樣品后,柱用平衡緩沖液洗滌,rG⑶通過洗脫緩沖液(20mM檸檬酸鹽緩沖 液(pH 6.0)、5%乙醇和說NaCl)從柱中洗脫出來。圖3D表示該純化階段的標準運行。在 運行期間收集的流分通過酶活性測定法監(jiān)測,如圖3E所示,圖3F顯示活性測定用洗脫流分 的考馬斯藍染色。合并洗脫步驟中吸收峰的流分,加到第三根柱上用于第三純化階段。第三純化階 段在裝填8ml疏水相互作用樹脂(TSK凝膠,ToyopearlPhenyl-650C, Tosoh Corp.)的XK 柱(1. 6x20cm)上進行。樹脂用含有5%乙醇的10mM檸檬酸鹽緩沖液(pH 6. 0)平衡。由之 前各柱合并的GCD洗脫液以6ml/分鐘加載,接著用平衡緩沖液洗滌,直到UV吸光度達到基 線。純的G⑶用含有50%乙醇的10mM檸檬酸緩沖液洗脫,合并后保存在-20°C下。圖4A表示該純化階段的標準運行。在運行期間收集的流分通過酶活性測定法監(jiān) 測(圖4B),圖4C顯示活性測定用洗脫流分的考馬斯藍染色。在被加工細胞的批純化中,rGCD蛋白被純化到大于95%的水平;如果只進行第一 和第三階段,則純度達到約80%的水平(結(jié)果未顯示)。生化分析為了證實純化的rhGCD的特性,進行了 Mass-Spec Mass-Spec (MSMS)分析。所得結(jié) 果顯示,與基于表達盒DNA的預(yù)期的氨基酸序列相匹配的蛋白質(zhì)序列的覆蓋率(coverage) 為49 %,所述表達盒包括前導(dǎo)肽和前導(dǎo)序列。prG⑶的表征和測序為了進一步表征本發(fā)明植物產(chǎn)生的人重組G⑶,在抗氧化劑
29存在下,用曲通X-100使rhGCD增溶,并通過陽離子交換和疏水層析法純化至均質(zhì)(圖9a)。 對本發(fā)明植物產(chǎn)生的人重組GCD進行的氨基酸測序表明rhGCD序列(SEQ ID NO 15)相當 于人G⑶的序列(Swiss Prot P04062,蛋白質(zhì)編號AAA35873),并包括得自用于信號肽融合 的接頭N端的2個額外氨基酸(EF)(相應(yīng)地標為-2和-1),以及得自液泡引導(dǎo)信號C端的 7個額外氨基酸(標為497-503)。通過對SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)與Cerezyme 蛋白進行了蛋白質(zhì)印跡法(圖 9b),用抗GOT多克隆抗體對經(jīng)純化的植物產(chǎn)生的本發(fā)明人重組GOT進行了免疫檢測,證實 了植物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和CH0產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的抗原特性。重組hGCD的酶促活性使用熒光GlcCer類似物,對本發(fā)明植物產(chǎn)生的人重組GOT的活性與Cerezyme 的活性進行了比較。圖12顯示得到類似的比活,其中對于prG⑶,Vmax值為0. 47 士 0. 08Kmol 形成的C6-NBD-神經(jīng)酰胺/分鐘/mg蛋白質(zhì),對于Cerezyme 為0. 43士0. 06,Km值相似 (,對于本發(fā)明的GOT為20. 7士0. 7KM,對于Cerezyme 為15. 2士4. 8KM)。因此,這些動力 學(xué)研究表明本發(fā)明植物產(chǎn)生的人重組GOT的活性類似于CH0表達的酶的活性。腹膜巨噬細胞中重組hG⑶的攝取和活性為了確定胡蘿卜中產(chǎn)生的rhG⑶是否被正確地糖基化并可被靶細胞攝取,從而可 用于治療戈謝病,緊接著對rhGCD與巨噬細胞結(jié)合的能力以及被巨噬細胞攝入的能力進行 了測定。rhGCD靶向巨噬細胞是由甘露糖/N-乙?;咸前?Man/GlcNAc)受體介導(dǎo)的,可 使用巰基乙酸鹽誘導(dǎo)的腹膜巨噬細胞來測定。如圖5所示,rGCD被細胞以高水平攝取。圖 5A顯示與甘露聚糖濃度相關(guān)的被細胞攝取的本發(fā)明rGCD。圖5A表示在與Cerezyme (該制劑僅通過上述第一和第三階段的純化過程制備成 80%純度)相當水平上的攝取。圖5B和5C表示以比Cerezyme 高的水平攝取rGCD,該制劑通過上述所有三個階 段的純化過程制備成95%的純度。至于圖5C,顯然4mg/ml甘露聚糖抑制的占總活性的比活百分比,對于本發(fā)明的 G⑶(rG⑶或重組人G⑶)大于現(xiàn)有的市售產(chǎn)品G⑶(CB-mixl,這是本發(fā)明的rG⑶)-75%、 Cerezyme-65%。此外,如圖所示,加入甘露聚糖明顯抑制細胞與rG⑶的結(jié)合。在2mg/ml 甘露聚糖的濃度下,抑制rG⑶的結(jié)合達50%。這些結(jié)果表明,即使沒有聚糖結(jié)構(gòu)重塑,由轉(zhuǎn)化的胡蘿卜細胞表達和純化的rhG⑶ 都可通過Man/GlcNAc受體靶向巨噬細胞而被特異性攝取。此外,該重組rhG⑶具有酶促活 性。圖5D表示rhG⑶還被蛋白質(zhì)印跡中的抗GOT抗體識別;rG⑶是指本發(fā)明的蛋白 質(zhì),而GCD標準(每泳道顯示為5ng、10ng和25ng)是市售GCD (Cerezyme )。實施例4毒性試驗按照標準毒性試驗方案(Guidance for Industry on Single DoseAcute Toxicity Testing for Pharmaceuticals,Center for Drug Evaluationand Research(藥 品單劑量急性毒性試驗產(chǎn)業(yè)指導(dǎo)原則),藥品評價和研究中心(Center for Drug Evaluation and Research, CDER) PT 1 (61FR43934,1996 年 8 月 26 日)以及 ICH M3 (M)藥品人臨床試驗的非臨床安全性研究規(guī)范CPMP/ICH/286/95修改(Non-clinical Safety Studiesfor the Conduct of Human Clinical Trials for PharmaceuticalsCPMP/ ICH/286/95 modification),2000年11月16日),對按照上述純化方法得到的產(chǎn)物進行了
試驗o按下述方法給小鼠注射初期劑量1. 8mg/kg(臨床劑量)之后,使用9mg/kg和 18mg/kg的劑量。試驗組包括6只小鼠(ICR⑶-1 ;3只雄性和3只雌性),接受本發(fā)明的 rG⑶(溶于特征是25mM檸檬酸鹽緩沖液、150mM NaCl、0. 01%吐溫80、5%乙醇的液體載體 中),另外6只小鼠只用載體處理作為對照組。然后觀察小鼠14天并使之安樂死。在另一項研究中,僅將載體溶液,或?qū)藴逝R床劑量(60單位/kg)的1、5或10倍 劑量的prG⑶給予ICR (CD-I )小鼠。動物(每組6只,3只雄性和3只雌性),按10ml/ kg體積藥物靜脈內(nèi)給予。兩項毒性研究未顯示明顯的與治療有關(guān)的不良反應(yīng),即使在最高給藥劑量下也未 觀察到大的病理學(xué)發(fā)現(xiàn)、體重變化和死亡發(fā)生。此外,對取自給予臨床劑量10倍的高劑量 組動物的血樣進行了血液學(xué)和臨床化學(xué)測試。所有血液學(xué)值和臨床化學(xué)值都在正常范圍 內(nèi)。另外,對高劑量治療的動物的肝、脾和腎進行了組織病理學(xué)檢查,沒有發(fā)現(xiàn)宏觀或微觀 的組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)。實施例5糖基化分析對存在于按照前述實施例產(chǎn)生的rG⑶上的聚糖結(jié)構(gòu)進行了分析。正如下面更詳 細的描述一樣,結(jié)果表明大部分聚糖含有末端甘露糖殘基及高甘露糖結(jié)構(gòu)。有利的是,發(fā)現(xiàn) 這種高甘露糖產(chǎn)物具有生物活性,因此對于其活化無需更多的步驟。采用下述方法確定按照上述實施例產(chǎn)生的重組hG⑶的糖基化結(jié)構(gòu)。簡單地說,采 用水解和GC-MS策略,測定N-聚糖和0-聚糖的單糖鍵。該方法對糖類與肽的鍵合類型和 糖蛋白的總體單糖組成進行了估算。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)及各種單糖之間的比率,該方法可表明 糖蛋白上聚糖的類型。這一信息對于估計蛋白質(zhì)上存在的可能的聚糖結(jié)構(gòu)十分重要。另一方法以N-聚糖群的寡糖分析為特征。進行了 FAB-MS和MALDI-T0F MS,用胰 蛋白酶和肽N-糖苷酶F(PNGaseF)消化等分量的樣品,并使聚糖全甲基化。使用該方法從 酶消化的糖蛋白上剝離和分離N聯(lián)糖類。測定分離聚糖混合物中聚糖群的質(zhì)量,并根據(jù)單 糖組成分析將其質(zhì)量與數(shù)據(jù)庫已知結(jié)構(gòu)進行比較。所提出的結(jié)構(gòu)還基于源生物體的糖基化 方式。另一方法包括在還原消除胰蛋白酶和PNGase F處理的糖肽、脫鹽和全甲基化后, 對0-聚糖群進行分析。PNGase F不會釋放出0_聚糖,因此,保持與肽連接的聚糖很可能是 0聯(lián)聚糖。然后通過還原消除釋放出這些聚糖,并分析其質(zhì)量。單糖組成分析(有關(guān)概述見下文)揭示了植物糖基化特有的己糖、己糖胺和戊糖 的特征性分布。GlcNac和甘露糖的比率,表明了特征性N聯(lián)結(jié)構(gòu)是主要的聚糖群。對來自上述方法產(chǎn)生的hGCD的N-聚糖質(zhì)譜分析,表明了主要的N-聚糖群具有單 糖組成 Pent. deoxyHex. Hex3. HexNAc2。材料與方法利用氣相層析_質(zhì)譜法(GC-MS)、快速原子轟擊-質(zhì)譜法(FAB-MS)和延遲引出-基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜法(DE-MALDI-TOF MS)聯(lián)用,進行了分析。對于寡糖分析,在用胰蛋白酶和肽N-糖苷酶F(PNGaseF)消化等分量的樣品并使 聚糖全甲基化之后,用FAB-MS和MALDI-TOF MS對N-聚糖群進行了分析。在還原消除胰蛋 白酶和PNGase F處理的糖肽、脫鹽和全甲基化后,對0_聚糖群進行了分析。采用水解、衍生化GC-MS策略,對N-聚糖和0_聚糖兩者的單糖鍵進行了測定。實驗描述MM如下給所接收的樣品小瓶編上唯一編號(表1)表 1 樣品保存在-10°C和-30°C之間備用。蛋白質(zhì)化學(xué)完整樣品的透析將1個小瓶(裝有1ml標示濃度為0. 8mg/ml的蛋白質(zhì))注入Slide-A-Lyzer透 析盒(lOkDa截留分子量),在4°C下在水中透析24小時,換水3次。在透析之后,從盒中取 出樣品后凍干。月夷gs肖仆,的完nnpM^mmfm按照SOP B001和SOP B003,將經(jīng)透析的凍干樣品重新懸浮于50mM碳酸氫銨緩沖 液中,用10%氨水調(diào)整至pH 8.4,用了 0(處理的胰蛋白酶在371下消化4小時。放在95°C 加熱塊上2分鐘終止反應(yīng)后凍干。糖化學(xué)肽N-糖苷酶A消化胰蛋白酶裂解的糖蛋白樣品的肽/糖肽混合物用酶肽N-糖苷酶A(PNGaseA)在 乙酸銨緩沖液(PH 5.5)中于37°C處理15小時。通過冷凍干燥停止反應(yīng)。所得產(chǎn)物使用 C18Sep-Pak柱體純化。還原消除將含有可能的0聯(lián)糖肽的S印-Pak流分溶于10mg/ml硼氫化鈉的0. 05M氫氧化鈉 溶液,在45°C下孵育16小時。加入冰醋酸終止反應(yīng)。還原消除產(chǎn)物的脫鹽按照SOP B022,使用Dowex小珠粒進行脫鹽。將樣品加載到柱上,用4ml 5%乙酸 水溶液洗脫。將所收集的流分凍干。
釋出糖的全甲基化用5%乙酸水溶液洗脫的N聯(lián)糖S印-Pak流分以及通過還原消除釋放的可能的0 聯(lián)聚糖,采用氫氧化鈉(NaOH)/甲基碘(Mel)方法(S0PB018)全甲基化。通過FAB-MS和 MALDI-TOF MS對一部分全甲基化N聯(lián)聚糖混合物進行分析,剩余的進行連接分析。N聯(lián)糖的連接分析衍?;瘜⒁鹊鞍酌负蚉NGase A消化或還原消除后獲得的全甲基化聚糖樣品混合物水解 (2M TFA,120°C下2小時)并還原(硼氘化鈉(NaBD4)的2M NH40H溶液,室溫下2小時,SOP B025)。通過3次加入甲醇含于冰醋酸的混合物(90 10),除去分解硼氘化物所產(chǎn)生的硼 酸鹽后凍干。樣品然后用乙酸酐(100°C下1小時)乙酰化。通過萃取到氯仿中將乙?;瘶?品純化。然后用氣相層析/質(zhì)譜法(GC/MS)對部分甲基化糖醇乙酸酯(alditol acetate) 進行分析。部分甲基化糖醇乙酸酯的標準混合物和空白對照也在相同條件下進行分析。氣液層析法/質(zhì)譜法(GC/MS)在下列條件下,采用 Perkin Elmer Turbomass Gold 質(zhì)譜儀與 Autosystem XL 氣 相色譜儀和Dell數(shù)據(jù)系統(tǒng),通過GC/MS對溶于己烷的等分量(liU)的衍生化糖樣品進行 分析氣相層析柱DB5注射柱上注射器溫度40°C程序40°C下1分鐘,然后70。C /分鐘至100°C,保持在100°C 1分鐘,然 后8°C /分鐘至290°C,最終保持在290°C 5分鐘。載氣氦質(zhì)譜法電離電壓70eV獲取模式掃描質(zhì)量范圍35_450道爾頓MS分辨率單位完整葡糖腦苷脂酶的糖分析衍生化將相當于500 yg葡糖腦苷脂酶的等分量與10 yg阿糖醇作為內(nèi)標一起凍干。然 后使之在80°C下進行甲醇分解過夜后,在氮氣下干燥。按照SOP B023,使用甲醇、吡啶和乙 酸酐的溶液,使釋放出的單糖再次N-乙酰化,再次在氮氣下干燥后,轉(zhuǎn)化成其三甲基甲硅 烷基(TMS)衍生物。TMS衍生物在氮氣下減少體積,溶于2ml己烷后,超聲處理3分鐘。然 后將樣品在4°C下平衡過夜。平行制備含有l(wèi)Oyg阿糖醇的空白對照以及含有巖藻糖、木 糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙?;肴樘前?、N-乙?;咸前贰-乙?;窠?jīng)氨酸和阿 糖醇各10 u g的標準單糖混合物。然后用氣相層析/質(zhì)譜法(GC/MS)對TMS衍生物進行了 分析。氣液層析/質(zhì)譜法
(GC/MS)在下列條件下,采用 Perkin Elmer Turbomass Gold 質(zhì)譜儀與 Autosystem XL 氣 相色譜儀和Dell數(shù)據(jù)系統(tǒng),通過GC/MS對溶于己烷的等分量(liU)的衍生化糖樣品進行 了分析氣相層析柱DB5注射 柱上注射器溫度 40°C程序90°C下1分鐘,然后25°C /分鐘至140°C,5°C /分鐘至220°C, 最終10°C /分鐘至300°C,并保持在300°C 5分鐘。載氣氦質(zhì)譜法電離電壓70eV獲取模式掃描質(zhì)量范圍50_620道爾頓MS分辨率單位延識引Ml-某質(zhì)輔助激光解吸申i離ilH普法(DE-MALDI-MS)和快諫原子轟擊_i1H普 法(FAB-MS)采用 Voyager STR Biospectrometry Research Station 激光解吸質(zhì)譜儀與延遲 引出(DE)聯(lián)用,進行MALDI-T0F質(zhì)譜法分析。將干的全甲基化聚糖溶于甲醇水(80 20),使用2,5-二羥基苯甲酸的基質(zhì)進 行分析。緩激肽、血管緊張素和ACTH用作外標。陽離子快速原子轟擊質(zhì)譜分析在M-Scan' s VG AutoSpecE質(zhì)譜儀上進行,對于 完全靈敏度的4500質(zhì)量范圍,在Vacc = 8kV下操作,分辨率約為2500。使用銫離子槍在 30kV操作以產(chǎn)生光譜。應(yīng)用Opus軟件,用VAX數(shù)據(jù)系統(tǒng)3100M76記錄光譜。將干的全甲基化聚糖溶于甲醇,并加到之前用2-4iU硫代甘油作為基質(zhì)涂片的 屏極上后插入源(source)中。在第二組糖基化分析中,采用類似方法確定糖基化模式,并鑒定出由本發(fā)明胡蘿 卜細胞懸浮培養(yǎng)物產(chǎn)生的主要的糖基化產(chǎn)物。由國家生物工程學(xué)學(xué)院糖生物學(xué)中心(Glycobiology Center of theNational Institute for Biotechnology (Ben Gurion University, BeerSheba, Israel))用各禾中夕卜 切糖苷酶依次消化,對糖基化模式進行分析以確定聚糖結(jié)構(gòu)和相對含量。將本發(fā)明的植物 GOT樣品在SDS-PAGE上電泳,切取61KDa條帶,與PNGase A孵育,或者依次與胰蛋白酶與 PNGase A孵育以釋放出N聯(lián)聚糖。用氨基苯甲酰胺(anthranilamide) (2AB)對聚糖進行熒 光標記,并用正相HPLC過柱。通過依次用各種外切糖苷酶消化,接著進行HPLC分析,獲得標記的聚糖庫的順 序。將各聚糖的保留時間與給出葡萄糖單元(GU)梯的葡聚糖標準部分水解物的保留時間 進行了比較。將未標記的聚糖進行進一步純化,并通過MALDI質(zhì)譜法進行分析。所用外切糖 苷酶牛腎(Bovine kidney)_-巖藻糖苷酶(消化_1_6和_1_3核心巖藻糖,Prozyme)、矮刀豆(Jack bean)甘露糖苷酶(消除_1_2,6 > 3甘露糖,Prozyme)、黃單胞菌屬0 1,2_木 糖苷酶(僅在除去__聯(lián)甘露糖后消除_1_2木糖,Calbiochem)。牛睪丸-半乳糖苷酶(水解非還原末端半乳糖_1_3和_1_4鍵,Prozyme)、肺炎 鏈球菌(Str印tococcus pneumoniae)氨基己糖苷酶(消化 _1_2,3,4,6GalNAc 和 GlcNAc, Prozyme)。采用氣相層析質(zhì)譜法(GC-MS)、快速原子轟擊-質(zhì)譜法(FAB-MS)和延遲引出-基 質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜法(DE-MALDI-TOF MS),通過M_Scan (Berkshire, England)對糖基化進行了進一步的分析。對于寡糖測定,樣品在用胰蛋白酶和PNGase A消 化并使聚糖全甲基化后,通過FAB-MS和MALDI-TOF MS對N-聚糖群進行了分析。在還原消 除胰蛋白酶和PNGase A處理的糖肽、脫鹽和全甲基化之后,對0_聚糖進行了分析。為了證實prG⑶批次之間的一致性,在用胰蛋白酶和PNGase A消化之后,通過高 效陰離子交換層析法與脈沖安培檢測法(HPAEC-PAD,Dionex方法)對不同批次prGCD的 N-聚糖的相似性進行了分析,得到從糖蛋白中釋放出的寡糖的層析圖譜。該方法允許以定 性和定量的方式對寡糖模式進行層析法比較。結(jié)果與討論葡糖腦苷脂酶的TMS糖分析N聯(lián)寡糖篩詵完整糖蛋白進行透析后,進行胰蛋白酶消化,凍干產(chǎn)物使用PNGase A消化,然后采 用C18S印-Pak純化。使5%乙酸水溶液(含N聯(lián)寡糖)流分全甲基化,用片段離子的低質(zhì) 量范圍中的一部分衍生化寡糖獲得FAB質(zhì)譜,用分子離子的高質(zhì)量范圍中的一部分衍生化 寡糖,獲得DE-MALDI-T0F質(zhì)譜。得自葡糖腦苷脂酶的N-聚糖的分析表1列出存在于FAB譜的主要片段離子和存在于MALDI譜的分子離子。分子離 子區(qū)(附錄III中所示)含有主要信號m/z 1505. 8 (對于具有組成Pent. deoxyHex. Hex3. HexNAc2的結(jié)構(gòu),與[M+Na]+準分子離子一致)。還檢測到與復(fù)雜的高甘露糖結(jié)構(gòu)一致的多 種強度較低準分子離子。檢出的高甘露糖結(jié)構(gòu)的范圍大小自Hex5.HexNAC2的m/zl579.8 到Hex8. HexNAc2的m/z 2193.0。由不太廣泛加工的N-聚糖例如m/z 1331. 7(對于具有 組成Pent.HeX3.HexNAc2的結(jié)構(gòu),與[M+Na]+準分子離子一致)或者以下較大的N-聚糖 產(chǎn)生綜合信號(complexsignal)例如 m/z 1751. 0 (對于具有組成 Pent. deoxyHex. Hex3. HexNAc3的結(jié)構(gòu),與[M+Na] +準分子離子一致)、m/z 2375. 4 (對于具有組成Pent. deoxyHex2. Hex4. HexNAc4的結(jié)構(gòu),與[M+Na]+準分子離子一致)和m/z 2753. 6 (對于具有組成Pent. deoxyHex3. Hex5. HexNAc4 的結(jié)構(gòu),與[M+Na]+ 準分子離子一致)。FAB質(zhì)譜通過質(zhì)譜低質(zhì)量區(qū)的片段離子提供有關(guān)天線結(jié)構(gòu)的信息(未顯示數(shù)據(jù))。 檢測所述信號,將己糖(m/z 219處)和HexNAc (m/z260處)鑒定為N-聚糖中非還原末端 的單糖。表2 胰蛋白酶和肽N-糖苷酶A消化后全甲基化葡糖腦苷脂酶(參考號62996)光 譜中觀察到的質(zhì)量 一號柱的所有質(zhì)量都均為單同位素的,除非另有說明。質(zhì)量數(shù)可能不與原始數(shù)據(jù) 直接有關(guān),因為該軟件常常為13C同位素峰,特別是1700Da以上的質(zhì)量的13C同位素峰賦予
質(zhì)量數(shù)。胃自麵■■旨隱N-纏_接俯在PNGase A消化、Sep-Pak純化和全甲基化之后,對釋出的N聯(lián)糖類進行了連接 分析。由一些來自衍生化試劑的含雜質(zhì)峰獲得綜合層析圖。將保留時間和光譜與標準混 合物進行比較,以供表3中所列含有糖的峰的臨時排布。夷蛋白酶和肽N-糖苷酶A消化后葡糖腦苷脂酶(參考號62996)的GC-MS分 析中測出作為其部分甲基化糖醇乙酸酯的不同聯(lián)接單糖的保留時間 4. 30聯(lián)寡糖篩詵在胰蛋白酶和PNGase A消化之后,對來自葡糖腦苷脂酶S印-Pak純化的60 % 2_丙醇流分(可能的0聯(lián)糖肽流分)進行還原消除。終止反應(yīng)后使樣品脫鹽,并在除去硼酸后,使樣品全甲基化。使用片段離子的低質(zhì)量范圍中的一部分衍生化寡糖得到FAB質(zhì)譜, 使用分子離子的高質(zhì)量范圍中的一部分衍生化寡糖得到DE-MALDI-T0F質(zhì)譜。未觀察到與 存在0聯(lián)聚糖一致的信號(未顯示數(shù)據(jù))。舶麵■■旨_0-胃_連接俯連接分析在全甲基化后還原消除的產(chǎn)物上進行。未觀察到與典型0聯(lián)聚糖存在一 致的信號(未顯示數(shù)據(jù))。圖6表示一些示例性聚糖結(jié)構(gòu),作為得自CH0(中國倉鼠卵巢)細胞(為哺乳動物 細胞)的G⑶(Cerezyme )與得自本發(fā)明的胡蘿卜細胞G⑶的比較。如圖所示,這些結(jié)構(gòu)的 重塑需要得到由于Cerezyme 而暴露的甘露糖殘基。相比之下,對于得自本發(fā)明的植物細 胞的GCD,這類暴露出來的甘露糖殘基可直接獲得,無需例如用糖基化酶進一步操作。圖7表示存在于rGCD中的主要聚糖結(jié)構(gòu)。圖7表示以下的擬定結(jié)構(gòu)a)胡蘿卜細 胞懸液中表達的hGC上發(fā)現(xiàn)的主要寡糖群(1505. 7m/z) ;b)典型的N聯(lián)核心;c)巖藻糖化 的植物N聯(lián)核心。N聯(lián)聚糖通過天冬酰胺以及通過圖右側(cè)GlcNac殘基上的還原末端(GN) 與蛋白質(zhì)偶聯(lián)。植物N糖基化模式,巖藻糖殘基可以是核心結(jié)構(gòu)的組成部分,用a (1-3)糖 苷鍵與第一 GlcNac結(jié)合,而哺乳動物結(jié)構(gòu)通常采用a (1-6)糖苷鍵。圖8A-8D表示所有本發(fā)明rG⑶蛋白上檢出的N_聚糖的可能結(jié)構(gòu)。鑒定出的主要聚糖結(jié)構(gòu)是核心聚糖結(jié)構(gòu),存在于豌豆、水稻、玉米和其它食用植物 等大多數(shù)植物糖蛋白中。該結(jié)構(gòu)含有核心木糖殘基以及核心a-(l,3)_巖藻糖。Bardor等 人所做的研究(33)表明50%的非變應(yīng)性血液捐獻者(nonallergic blood donor)在他們 的血清中具有核心木糖特異性抗體,25%具有抗核心a _(1,3)_巖藻糖特異性抗體。然而 還是對這類抗體是否會引起植物衍生的生物制藥糖蛋白的使用受限制進行了研究。上述方法產(chǎn)生的hG⑶的次要聚糖群主要是高甘露糖結(jié)構(gòu)HeX4HeXNAC2至 Hex8HexNAc2。在所顯示的復(fù)雜結(jié)構(gòu)中,檢出較少比例的例如Pent. deoxyHex2. Hex4. HexNAc3 和 Pent. deoxyHex3. Hex5. HexNAc3. Pent. Hex3. HexNAc2 的結(jié)構(gòu)。主要的末端單糖是己糖(甘露糖或半乳糖)和N-乙?;禾前罚@與高甘露糖結(jié) 構(gòu)和部分加工的復(fù)雜結(jié)構(gòu)的存在一致。至于0聯(lián)寡糖篩選,未觀察到與典型的0聯(lián)聚糖一致的信號。本領(lǐng)域已知GCD不 具有0聯(lián)寡糖,使得這些結(jié)果與得自包括天然GOT和在哺乳動物培養(yǎng)物系統(tǒng)中產(chǎn)生的重組 GCD在內(nèi)的其它細胞系統(tǒng)的GCD的已知糖基化一致。然而,單糖組成中,未檢測到與阿拉伯
糖一致的信號。有關(guān)本發(fā)明的一個重點在于,hGCD蛋白N-聚糖組成分析表明大部分的N_聚糖終 止于甘露糖殘基。這符合對以甘露糖結(jié)尾的N-聚糖的需要,該聚糖有助于通過巨噬細胞甘 露糖受體攝取治療性hG⑶。然而,在哺乳動物細胞中產(chǎn)生的天然GOT和重組GOT都不是高 甘露糖。因此,本發(fā)明克服了商業(yè)化生產(chǎn)hG⑶蛋白的重大缺點,原因在于這種蛋白是_ 飽而終止于甘露糖的,與上述產(chǎn)生的蛋白質(zhì)不一樣。對植物細胞中制備的純化的人重組葡糖腦苷脂酶進行了進一步的糖基化分析。用 各種外切糖苷酶依次消化,對糖基化進行了分析(國家生物工程學(xué)學(xué)院糖生物學(xué)中心(Ben Gurion University, Beer Sheba,Israel)以確定聚糖結(jié)構(gòu)和聚糖的定量比率(參見上述 方法)。在該分析中,發(fā)現(xiàn)N聯(lián)聚糖具有兩個GlcNAc殘基和1-4聯(lián)甘露糖的主要核心,與另
38外兩個甘露糖殘基以_1-3和_1_6鍵連接。存在的另外的殘基如圖10a中所示,該圖表示 所有結(jié)構(gòu)及其基于HPLC、酶陣列消化和MALDI的相對含量。圖10b顯示在體外酶加工之前 和之后Cerezyme 的聚糖結(jié)構(gòu)。值得注意的是,本發(fā)明GCD的聚糖結(jié)構(gòu)分析揭示> 90%的 聚糖是富含甘露糖的帶有暴露出來的末端甘露糖殘基(圖10a),而在Cerezyme 的情況 下,甘露糖殘基只是在復(fù)雜的體外方法之后才暴露出來(圖10b)。本發(fā)明GCD中的主要聚 糖是存在于大多數(shù)糖蛋白中的核心結(jié)構(gòu),該糖蛋白自豌豆、水稻、玉米和其它食用植物中純 化。該結(jié)構(gòu)含有核心_- (1,2)-木糖殘基以及核心__ (1,3)-巖藻糖(圖10a)。DE-MALDI-MS 數(shù)據(jù)不含有與典型0聯(lián)聚糖一致的信號。為了評價胡蘿卜細胞系統(tǒng)中產(chǎn)生的GCD在批次之 間的再現(xiàn)性,對得自不同生產(chǎn)批次的本發(fā)明GCD的聚糖圖譜進行了進一步的分析。如圖11 中所示,本發(fā)明的植物GCD的聚糖群在批次之間具有高度的再現(xiàn)性。實施例5a植物細胞中有生物活性的a-半乳糖苷酶的表達
對人a -半乳糖苷酶A進行了測序和克隆,該酶在X連鎖溶酶體貯積病即法布萊 病中病變。為了檢測能否在植物細胞產(chǎn)生適于治療性應(yīng)用的a-半乳糖苷酶A,使包括靶向 植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的人a-半乳糖苷酶A編碼序列的載體在植物細胞中表達,對植物衍生的重組 人a “半乳糖苷酶A的多肽序列、生物活性和聚糖結(jié)構(gòu)進行了評價。人a-半乳糖苷酶A表達載體構(gòu)建了含有人a _半乳糖苷酶A編碼序列和用 于將翻譯的蛋白質(zhì)靶向植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)分泌系統(tǒng)N端蘋果果膠酶前導(dǎo)肽(SEQ ID NO 16-MALKTQLLWSFVVVFVVSFSTTSCSG)的載體??寺×藘蓚€不同的構(gòu)建體,帶有設(shè)計成能將翻 譯的蛋白質(zhì)保持在特定細胞區(qū)室中的不同的C端序列。一個構(gòu)建體(a-gal-vac,SEQ ID NO 17)含有C端液泡引導(dǎo)信號(DLLVDTM,SEQ ID NO :4),設(shè)計成能用于將蛋白質(zhì)從ER轉(zhuǎn) 運到植物液泡保留起來。第二個構(gòu)建體(a-gal-KDEL,SEQ IDN0 19)缺乏C端液泡引導(dǎo)信 號,而含有C端ER保留序列(KDEL,SEQ ID NO :23),設(shè)計成能使蛋白質(zhì)從高爾基體內(nèi)側(cè)逆 轉(zhuǎn)運回 ER 保留起來(參見 Rayon 等,Journal of Experimental Botany,第 49 卷,第 326 期,第 1463-1472 頁,1998 ;Evron 等,2007FASEB J)。a —gal—vac 通過GENEART AG. (Regensburg ;Germany) (SEQ ID NO: 17)對人 a-gal 編 碼序列進行人工合成。a-gal-vac序列包括蘋果果膠酶前導(dǎo)序列(SEQ ID NO 16) (MALKTQLLWSFVVVFVVSFSTTSCSG)、成熟a -半乳糖苷酶序列(SEQ ID NO 24)和液泡保留信 號(SEQ ID N0:4)。合成的基因周圍是限制位點以利于亞克隆。用NC0I 和 Hindlll 把該基因克隆到由 ICON genetics (Halle, Germany)開發(fā)的載 體中,用于在煙草(Nicotiana benthamiana)植物中瞬時表達。a -Ral-KDEL 克隆為了構(gòu)建具有C端ER保留信號的克隆,通過加入置換Bglll-Hindlll片段的磷酸 化接頭(SEQ ID NO :21和22),用ER保留信號置換液泡信號。磷酸化接頭編碼ER保留信 號,并具有與用酶Bglll和Hindlll形成的末端相容的黏性末端SEKDEL**GATCTTAGTGAGAAGGACGAGCTCTGATAA (SEQ ID NO 21)AATCACTCT TCC TGCTCGAGACTAT TTCGA (SEQ ID NO 22)
Sac I為了產(chǎn)牛 a-gal-KDEL 構(gòu)津體,使 a-gal_vac 構(gòu)津體(SEQ ID NO :17)用 Bglll 和Hindlll消化后,與上述接頭連接。通過SacI限制性切割,證實接頭的插入。然后將所 得構(gòu)建體克隆到本文所述的ICON載體,用于在煙草中瞬時表達。煙草中的瞬時表汰系統(tǒng)在這種情況下選擇使用植物病毒載體作為轉(zhuǎn)基因植物的替代,便于蛋白質(zhì)在整株 植物中進行快速的高水平瞬時表達。目標蛋白質(zhì)由強復(fù)制的病毒啟動子(例如外被蛋白亞基因組啟動子)進行表達。 系統(tǒng)依靠通過土壤桿菌屬遞送到植物的病毒載體瞬時擴增(土壤桿菌感染法)。在土壤桿 菌感染法中,植物功能性啟動子和RNA病毒cDNA作為T-DNA自土壤桿菌屬轉(zhuǎn)移進入植物細 胞。T-DNA在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生可啟動自我復(fù)制的有生物活性的病毒RNA。這種方法可供各種蛋白質(zhì)變體快速裝配和表達。這種方法不僅是通用的,而且還 能在僅僅幾天內(nèi)提供毫克量的蛋白質(zhì)。整株植物的轉(zhuǎn)染在長日照(16小時光照/8小時避光)光照方案(50PE)下,使煙草植物 (N. Benthamiana)在補充了顆粒狀長效肥(Scott Marysville,OH)的市售混合土壤 (Givaat Ada, IL)中在24°C _25°C下萌發(fā)和生長。對于瞬時表達,按照文獻所述方法(Gleba等,Vaccine 232042-2048,2005),使用 由ICON genetics (ffeinbergweg, Germany)開發(fā)的三載體重組系統(tǒng),載體之一被插入a-半 乳糖苷酶cDNA,另外兩個載體含有構(gòu)建完整病毒復(fù)制子的基因(RdRp和整合酶),因此產(chǎn)生 可以起動自我復(fù)制的有生物活性的病毒RNA。應(yīng)用電穿孔(2500V,5msec) [den Dulk-Ra, A.和 Hooykaas, P. J. (1995)Methods Mol. Biol. 55:63-72],用含有質(zhì)粒的a -半乳糖苷酶載體轉(zhuǎn)化土壤桿菌。按本領(lǐng)域已知 的標準方法通過真空浸潤,用含有3IC0N質(zhì)粒的土壤桿菌浸潤植物。簡單地說,通過將所 有空氣中的植物器官浸入細菌懸液中并放在真空室中,將生長5-6周的煙草植物浸潤。使 用-0. 8巴真空1分鐘,之后迅速回到大氣壓。將植物送回溫室在相同條件再保持5-7天。蛋白質(zhì)純化將煙草葉冷凍后,用研缽和研杵研磨。按1 1體積重量比,將磨碎葉重新懸浮于 含有 20mM Tris、20mM EDTA、20mM 抗壞血酸、ImM DTTUmM PMSF(pH 7.2)的提取緩沖液中。 此后,使細胞破碎后勻漿。用切刀勻漿器,使懸液進一步勻漿。使細胞懸液通過微流細胞破 碎機,將所得制備物離心。棄去沉淀后,上清液用硫酸銨處理后離心。然后將沉淀溶于檸檬 酸鹽緩沖液(20mM pH 6),將溶液進一步酸化(pH 5. 5),離心,過濾(0. 45 y M)。把濾液加 載到疏水相互作用層析柱中,合并洗脫的流分,加載到陽離子交換層析法柱。合并洗脫的流 分,分析催化活性。蛋白質(zhì)印跡法采用多克隆兔抗a-gal A抗體,進行蛋白質(zhì)印跡法以鑒定來自轉(zhuǎn)化煙草植物的 a-半乳糖苷酶分子。基本上按照本文所述方法進行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移。簡單地說,從凝膠向硝化纖維轉(zhuǎn)移 在4°C下于100伏特進行90分鐘。轉(zhuǎn)移之后,印跡用封閉緩沖液(1%奶粉,0.1%吐溫20 (Sigma目錄號P1379)的磷酸鹽緩沖液)封閉。然后,通過與抗體孵育,洗滌,與合適的第 二抗體(Jackson-Labs HRP綴合的山羊抗兔Ab)反應(yīng),對印跡進行免疫檢測。然后用ECL 顯影劑(Amersham RPN 2209)對印跡進行顯影,并放射自顯影用于顯現(xiàn)。a -半乳糖苷酶酶活性的測定對濃度范圍為200-12. 5ng/ml的市售a -半乳糖苷酶法布瑞酶(Genzyme, Cambridge, Mass)的活性繪制標準曲線,根據(jù)標準曲線求出植物a -半乳糖苷酶A的活性 水平。使用對硝基苯基-D-吡喃半乳糖苷(Sigma)作為水解底物,測定活性。測定緩沖 液含有20mM檸檬酸、30mM磷酸鈉、0. BSA和0. 67%乙醇(pH 4.6)。實驗在96孔ELISA 板(Greiner#655061,96W)中進行,將50微升樣品與150微升測定緩沖液一起孵育,加入30 微升底物至終濃度8mM。將反應(yīng)混合物在37°C下孵育90分鐘,結(jié)果對標準結(jié)果作圖。通過 405nm下的吸光度檢測產(chǎn)物(對硝基苯基;pNP)形成。在t = 0和在終點時監(jiān)測405nm下 的吸光度。90分鐘后,將100微升1. 98M碳酸鈉加到各孔中,再次監(jiān)測405nm下的吸光度。動力學(xué)研究:為了求出Km,使對硝基苯基pNP (Sigma)的濃度在1000 ii M至45000 ii M的范圍 內(nèi)變化。使含有25ng/mL a -半乳糖苷酶和不同濃度的底物的反應(yīng)混合物在37°C下反應(yīng) 85-105分鐘的時段。反應(yīng)樣品用飽和碳酸鈉猝滅,在430nm下檢測對硝基苯酚產(chǎn)物的吸光度。生化分析來自PAGE的蛋白質(zhì)條帶的胰蛋白酶消化由Smoler蛋白質(zhì)組學(xué)中心(Smoler Proteomics Center) (Technion, Haifa, IL)進行。簡單地說,用干凈的剃須刀片切取凝膠 中經(jīng)染色的蛋白質(zhì)條帶,凝膠中的蛋白質(zhì)用10mM DTT還原后,用100mM碘乙酰胺的10mM碳 酸氫銨溶液修飾。凝膠切段用50%乙腈的10mM碳酸氫銨溶液處理以將蛋白質(zhì)脫色后,將凝 膠切段干燥。干燥的凝膠切段用含有約0. ly g胰蛋白酶/樣品的10%乙腈的10mM碳酸氫 銨溶液再水化。使凝膠切段在37°C下孵育過夜后,所得肽用含0. 三氟乙酸鹽的60%乙 腈回收。胰蛋白酶消化的肽段用反相層析法分離(用多孔R2 (Perspective)自行充填的 0. IX 300-mm熔融硅膠毛細管(J&W,內(nèi)徑100微米))。以1 yl/分鐘的流速,用含0. 1 % 乙酸水溶液的線性梯度5-95%乙腈洗脫肽段80分鐘。將過柱的液體電噴霧到離子阱質(zhì)譜 儀(LTQ Orbitrap, ffaltham, MA) 0以陽離子方式采用重復(fù)性完全MS掃描,接著通過選自 第一次MS掃描最主要離子的碰撞誘導(dǎo)解離(CID)來進行質(zhì)譜法分析。應(yīng)用Sequest軟件 [J. Eng and J. Yates, University of Washingtonand Finnegan, San Jose],將質(zhì)譜法數(shù)據(jù) 與NR-NCBI數(shù)據(jù)庫中模擬蛋白酶解和蛋白質(zhì)的CID進行比較。按照產(chǎn)品說明書,在肽測序儀494A(Perkin Elmer)上對蛋白質(zhì)氨基端進行測序。 MALDI-T0F 按照本領(lǐng)域已知方法,采用MALDI T0F T0F 4700 (AppliedBiosystems),在 Smoler 蛋白質(zhì)組學(xué)中心(Technion,Haifa, IL)進行了 MALDI-T0F質(zhì)譜法。凝膠過濾凝膠過濾層析法以大小為基礎(chǔ)對蛋白質(zhì)進行分離。分子通過多孔小珠粒移動,擴 散到小珠粒中,較小的分子進一步擴散到小珠粒的微孔中,因此較慢地通過該空間移動,而較大的分子較少進入或完全不進入,因此較快地通過該空間移動。分子量和三維形狀都能 影響保留程度。將植物a-半乳糖苷酶樣品重新懸浮于分析緩沖液(50mM磷酸鈉,(pH = 6.0)),按流速0. 5ml/分鐘,將 100 ii g 樣品加載到柱(-TSK Gel-2000, Tosoh Bioscience, San Francisco, CA)上。成纖維細胞的a -半乳糖苷酶攝取對得自法布萊病患者的人成纖維細胞(分類編號GM02775COrnell Institute)進 行了 a-半乳糖苷酶的尋靶和攝取試驗。將成纖維細胞在補充了 12%FBS、5ml L_谷氨酰 胺、5ml MEM Eagle維生素溶液、10ml MEM氨基酸溶液、5ml MEM Eagle非必需氨基酸溶液 和5mlPen-Str印溶液的DMEM培養(yǎng)基(目錄號D5546,Sigma)中培養(yǎng),所有補充成分都得自 Biological Indusries (Beit Haemek,IL)。使細胞與 300 ii g/ml 植物 a-半乳糖苷酶 A — 起在補充了 12% FBS的PBS中孵育4小時,然后洗滌并裂解(20mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)、 0. 1 %曲通+蛋白酶抑制劑混合物(Sigma P-2714),通過兩次凍融循環(huán))。將20 yl樣品加 載到12% SDS凝膠上,通過蛋白質(zhì)印跡法進行分析(見上文)。SDS-PAGE 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)主要通過分子量 對蛋白質(zhì)進行分離。另外,該技術(shù)提供有關(guān)蛋白質(zhì)純度和組成的大量信息。按照標準凝膠 分離方案,采用考馬斯亮藍染色,通過SDS-PAGE分析對由煙草植物產(chǎn)生的a _半乳糖苷酶 的分子量特性和蛋白質(zhì)雜質(zhì)模式進行了研究。簡言之,SDS凝膠由層積膠(3% )和分離膠 (12%)組成。電泳緩沖液為Tris/SDS(pH 8. 3),加樣緩沖液為甘油-Tris-巰基乙醇(pH 6. 8)。結(jié)果圖13A和圖13B表示通過本發(fā)明方法用凝膠過濾(圖13A)和質(zhì)譜法(圖13B)對 在煙草植物表達和產(chǎn)生的植物衍生的重組a-半乳糖苷酶分子量的表征。質(zhì)譜圖顯示植物 表達的a-半乳糖苷酶的分子量估計值由48_52KDa范圍的若干群組成。由于a Gal是非共 價二聚體,所以MALDI-T0F的能量引起二聚體解離為單體。該分子量反映了貢獻出46. 3kDa 的407個氨基酸,以及用以保持分子量的聚糖結(jié)構(gòu)的加入。質(zhì)譜法證實蛋白質(zhì)為48. 6kDa, 這些結(jié)果恰好在天然人a-半乳糖苷酶(約51kDa)分子量的范圍內(nèi)。凝膠過濾標準曲線 顯示對應(yīng)于植物a-半乳糖苷酶主峰保留時間(18. 41分鐘)的分子量為76. 56kDa,這表示 是二聚體。按照標準曲線在20. 403分鐘處的非常小的峰相當于單體(43. 27kDa)。由于凝 膠過濾分析在溫和條件下進行,所以能夠觀察到蛋白質(zhì)的二聚體形式。經(jīng)PAGE分析對重組a -半乳糖苷酶進行的解析顯示出兩條主帶(圖14A),表明 成熟重組酶的糖基化中的差異。對PAGE的分離條帶進行測序,表明情況的確如此,因為可 供測序的多肽區(qū)(即未被聚糖掩蔽),雖然沒有相同地位于兩條帶上,但是在重疊處顯示出 100%同一性(參見圖14B,紅色測序部分)。圖14B (下條帶)顯示序列完全相同的去糖基 化a -半乳糖苷酶[使用PNGase F (Sigma)進行去糖基化]。紅色序列表明之前鑒定的序 列。綠色序列表明在脫去聚糖后可用于測序的序列。黑色序列表明尚未鑒定出的序列。天 然糖基化位點用黃色來突出表示。用抗KDEL抗體(Santa Cruz,CA)證實了 C端KDEL???之,這些結(jié)果表明本發(fā)明方法表達的a-半乳糖苷酶蛋白質(zhì)與預(yù)期的克隆序列相同。植物表達的人重組a -半乳糖苷酶與天然重組a _半乳糖苷酶的抗原性相同通過對蛋白質(zhì)印跡上植物表達的a-半乳糖苷酶的免疫檢測,對本發(fā)明構(gòu)建體在植物重組系統(tǒng)中精確表達人溶酶體酶的適宜性提供了進一驗證。圖15表示得自 a-gal-vac (泳道“vac”)和a-gal-KDEL(泳道“KDEL”)構(gòu)建體在煙草植物中表達的多 肽包括用兔多克隆抗體檢測出的流分,該抗體是針對天然人a "半乳糖苷酶氨基酸326和 429間所表示的多肽片段產(chǎn)生的。用GFP(泳道“GFP”)轉(zhuǎn)化的對照植物,無法產(chǎn)生任何免 疫反應(yīng)性條帶。重組a -半乳糖苷酶的動力學(xué)分析為了評價植物表達的人重組a-半乳糖苷酶的適宜性,對得自煙草植物的純化的 重組a-半乳糖苷酶進行了動力學(xué)分析,并求出Km和Vmax值。圖16A和圖16B表示與市 售重組人a -半乳糖苷酶Fabmzyme (黑色標記)和Replagal (藍色標記)相比,重 組a -半乳糖苷酶(紅色標記)的動力學(xué)特征。Km和Vmax的計算值表明靶向ER并在ER 中表達的本發(fā)明的重組a -半乳糖苷酶具有與市售酶十分相似的Km和Vmax參數(shù),其中比 起Replagal 具有較高的Vmax和較低的Km,比起Fabrazyme 具有較大的Vmax和略高的 Km,這就表明在植物中可精確表達和加工多肽,并具有適于臨床應(yīng)用的催化活性。在大溫度范圍內(nèi)植物表達的重組人a "半乳糖苷酶保持穩(wěn)定為了進一步評價按照本發(fā)明的一個實施方案從植物中表達和純化的重組人 a-半乳糖苷酶,對一定溫度范圍(4°C-37°C)內(nèi)多肽的穩(wěn)定性進行了測定。圖17A和 圖17B顯示,植物表達的重組人a-半乳糖苷酶(植物a-Gal)的電泳遷移率未發(fā)生任何 改變,在所測試的所有溫度下,即使不比市售的得自哺乳動物細胞的重組a "半乳糖苷酶 (Replagal )更穩(wěn)定,也與之一樣穩(wěn)定。不論是在活性緩沖液(圖17A)還是在細胞培養(yǎng)基 緩沖液(圖17B)中孵育,重組a-半乳糖苷酶的穩(wěn)定性都是顯而易見的。人成纖維細胞主動攝入植物表達的重組a -半乳糖苷酶為了確定煙草中產(chǎn)生的重組a-半乳糖苷酶是否可被靶細胞攝取,從而可用來 治療法布萊病,對重組人a -半乳糖苷酶與成纖維細胞的結(jié)合能力以及被成纖維細胞 攝取的能力進行了實驗。如圖18所示,重組a-半乳糖苷酶被細胞攝取(泳道“植物 a GalA”表示取自成纖維細胞裂解物20 yl樣品中的a Gal與作為標準的20ng市售重組 06&1(1 印1叫31,右起第一泳道)一起電泳的免疫檢測)。之間為分子量標記梯。這些結(jié)果表明,即使沒有聚糖結(jié)構(gòu)重塑,自轉(zhuǎn)化的煙草植物表達和純化的重組 a-半乳糖苷酶可經(jīng)過攝取以靶向a-半乳糖苷酶缺陷型成纖維細胞。此外,重組a-半乳 糖苷酶具有酶促活性。植物表達的重組人a -半乳糖苷酶的聚糖圖譜對按照前述實施例中所述方法產(chǎn)生的人a -半乳糖苷酶中存在的聚糖結(jié)構(gòu)進行 了分析。正如下面更為詳細的描述,結(jié)果表明大部分聚糖含有末端甘露糖殘基以及高甘露 糖結(jié)構(gòu)。有利的是,發(fā)現(xiàn)這種高甘露糖產(chǎn)物具有生物活性,因此其活化無需更多的步驟。在胰蛋白酶消化,聚糖用熒光標記,以及用外切糖苷酶BKF、JBM、XYL和JBH依次消 化,接著HPLC之后,在對鑒定為人a -半乳糖苷酶的PAGE分離的條帶進行測序時,便可辨 別糖基化的特征模式(圖19,87分鐘)。具有暴露出來的甘露糖的聚糖結(jié)構(gòu)占優(yōu)勢。單糖組成分析(參見圖19)顯示植物糖基化特有的己糖、己糖胺和戊糖分布。 GlcNac和甘露糖之比表明特征性N聯(lián)結(jié)構(gòu)是主要的聚糖群。實施例6
本發(fā)明的治療根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的重組蛋白優(yōu)選包含由植物細胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的適當糖基化的蛋 白質(zhì),例如,該蛋白質(zhì)優(yōu)選為溶酶體酶和/或高甘露糖糖基化蛋白。根據(jù)本文優(yōu)選的實施方案,根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的蛋白質(zhì)適于治療溶酶體酶相關(guān)疾 病,例如溶酶體貯積病等。治療方法任選和優(yōu)選包括(a)提供生物活性形式的重組溶酶體酶,該溶酶體酶 由轉(zhuǎn)化的植物根細胞純化,能夠有效靶向異常缺乏溶酶體酶的細胞。該有生物活性的重組 酶在其附帶的寡糖上具有暴露出來的末端甘露糖殘基;(b)給予受治療者有效量的有生物 活性的重組溶酶體酶或包含所述重組溶酶體酶的組合物。在一個優(yōu)選的實施方案中,本發(fā) 明方法所采用的重組高甘露糖溶酶體酶可由本發(fā)明的宿主細胞產(chǎn)生。宿主細胞優(yōu)選為胡蘿 卜細胞。所謂“哺乳動物受治療者”或“哺乳動物患者”是指需要基因療法的任何哺乳動物, 包括人、牛、馬、犬和貓受治療者,最優(yōu)選為人受治療者。應(yīng)當注意的是,術(shù)語“治療”也包括改善或減輕病理病癥和/或其一種或多種癥 狀、治療這類病癥或者預(yù)防這類病癥的發(fā)生。在另一個優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明方法所采用的溶酶體酶可為高甘露糖酶,該 高甘露糖酶包含至少一條具有暴露出來的甘露糖殘基的寡糖鏈。該重組酶可在受治療者體 內(nèi)的靶部位與靶細胞上的甘露糖受體結(jié)合。更優(yōu)選與天然存在的靶細胞溶酶體酶相應(yīng)的親 和力相比,該重組溶酶體酶對這些靶細胞的親和力提高。因此,各劑量取決于靶向異常缺乏 GCD的細胞的有效性,這中形式的GCD的各個劑量基本上小于另以類似方式給予以達到治 療效果的天然存在的GCD的劑量。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案,該蛋白質(zhì)適于治療溶酶體貯積病,使得本發(fā)明還包 括用于治療這類疾病的方法。溶酶體貯積病是一組超過40種病癥的疾病,該病是分解細胞 溶酶體內(nèi)糖脂或多糖廢棄物的酶的編碼基因發(fā)生缺陷的結(jié)果。酶解產(chǎn)物,例如糖和脂質(zhì)然 后經(jīng)重新循環(huán)成為新的產(chǎn)物。這些病癥的每一種是由影響溶酶體中酶水平的遺傳性常染色 體或X連鎖隱性性狀導(dǎo)致的。在受累個體的細胞和組織中,受影響的酶一般沒有生物或功 能活性。在這類疾病中,酶功能的缺乏造成體內(nèi)細胞溶酶體內(nèi)脂質(zhì)或糖底物逐步系統(tǒng)性沉 積,最終引起器官機能喪失和死亡。Scriver等人詳細描述了溶酶體貯積病的遺傳病因、臨 床表現(xiàn)、分子生物學(xué)和可能性[Scriver等主編,The Metabolic andMolecular Basis of Inherited Disease,第 7 版,第 II 卷,McGraw Hill, (1995)]。溶酶體貯積病(及其相關(guān)的缺陷型酶)的實例包括但不限于法布萊病(a -半乳 糖苷酶)、法伯病(Farber disease)(神經(jīng)酰胺酶)、戈謝病(葡糖腦苷脂酶)、Gffll神經(jīng)節(jié) 苷脂沉積癥(0-半乳糖苷酶)、泰-薩病(Tay-Sachs disease)⑶-氨基己糖苷酶)、尼 曼-皮克病(Niemann-Pickdisease)(鞘磷脂酶)、Schindler病(a-N-乙酰半乳糖苷酶)、 亨特綜合征(Hunter syndrome)(艾杜糖醛酸_2硫酸酯酶)、斯賴綜合征(Slysyndrome) (3-葡糖醛酸糖苷酶)、胡爾勒綜合征與胡爾勒-沙伊綜合征(Hurler and Hurler/Scheie syndrome)(艾杜糖苷酸酶)以及I-細胞/桑菲利波綜合征(San Filipo syndrome)(甘露 糖6-磷酸轉(zhuǎn)運蛋白(transporter))。戈謝病是最常見的人的溶酶體貯積病,德系猶太人群中發(fā)病的頻率最高。美國
44有大約 5,000-10, 000 人患有此病[Grabowski,Adv. Hum. Genet. 21 :377_441 (1993)]。 戈謝病由葡糖腦苷脂酶(hGCD;葡糖神經(jīng)酰胺酶)缺乏引起。這種缺乏導(dǎo)致酶底物葡 糖腦苷脂在骨髓、脾和肝的網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞內(nèi)積累,引起明顯的骨骼并發(fā)癥例如骨髓膨脹 (bonemarrow expansion)和骨退化,以及脾功能亢進、肝腫大、血小板減少、貧血和肺部并 發(fā)癥[Grabowski (1993),出處同上;Lee, Prog. Clin. Biol. Res. 95 :177-217 (1982)]。更具體而言,本發(fā)明方法所采用的溶酶體酶可選自葡糖腦苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷 脂酶、氨基己糖苷酶、a-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、a-半乳糖苷酶、葡糖腦苷 脂酶、a -L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、a _甘露糖苷酶或唾液酸酶。優(yōu)選如果受 治醫(yī)病是戈謝病,則本發(fā)明方法所采用的溶酶體酶是葡糖腦苷脂酶(GCD)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可用來生產(chǎn)藥物組合物。因此,根據(jù)本發(fā)明另一個方面,提供包括 作為其活性成分的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。本文所用“藥物組合物”是 指一種或多種本文所述活性成分(例如重組蛋白)與其它化學(xué)組分(例如傳統(tǒng)藥物)、生理 上適宜的載體和賦形劑的制劑。藥物組合物的目的是便于將蛋白質(zhì)或細胞給予生物體???通過本領(lǐng)域眾所周知的方法,例如通過常規(guī)混合、溶解、制粒、制錠劑、磨細、乳化、包囊、包 埋或凍干工序,來制備本發(fā)明的藥物組合物。在一個優(yōu)選的實施方案中,術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指經(jīng)過聯(lián)邦政府或州政府管 理機構(gòu)批準或者在美國藥典或其它普遍公認的藥典中列出以用于動物,更特別用于人。下 文中,術(shù)語“生理上適宜的載體”和“藥學(xué)上可接受的載體”可互換使用,是指經(jīng)批準的載體 或稀釋劑不會對生物造成嚴重刺激,不削弱生物活性和所給予的綴合物的性質(zhì)。術(shù)語“載體”是指與治療藥一同給予的稀釋劑、輔助劑、賦形劑或載體。這類藥用 載體可為水和油等無菌液體,包括石油、動物、植物或合成來源,例如花生油、大豆油、礦物 油、芝麻油等。當靜脈內(nèi)給予藥物組合物時,水是優(yōu)選的載體。鹽溶液、葡萄糖水溶液和甘 油溶液也可用作液體載體,特別是用于注射溶液。合適藥用賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、 蔗糖、明膠、麥芽、水稻、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂 奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。需要時,組合物還可含有少量的潤濕劑或乳化劑或PH 緩沖劑。這些組合物可呈溶液劑、混懸劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、散劑、緩釋制劑等形式。 組合物可用傳統(tǒng)的粘合劑和載體(例如甘油三酯)配成栓劑??诜┬涂砂藴瘦d體, 例如藥用級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適的藥用載體的實 例參見 E. ff. Martin 的 “Remington' s PharmaceuticalSciences”。這類組合物可含有治 療有效量的蛋白質(zhì)(優(yōu)選為純化形式)以及適量的載體,使得能提供用于適于給予患者的 形式。劑型應(yīng)適合于給藥方式。本文術(shù)語“賦形劑”是指加到藥物組合物中以更利于活性成分加工和給藥的惰性 物質(zhì)。賦形劑的實例包括而不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和淀粉類型、纖維素衍生物、明 膠、植物油和聚乙二醇?;钚猿煞值闹苽浜徒o藥的更多技術(shù)可參見“Remington,sPharmaceutical Sciences”,Mack Publishing Co.,Easton,PA,最新版本,該文獻通過引用結(jié)合到本文中如 同全部陳述于此一樣。本文所述的藥物組合物還可包含合適的固相或凝膠相載體或賦形劑。這類載體或 賦形劑的實例包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠和聚合物例
45如聚乙二醇。合適的給藥途徑可包括例如口服、直腸、經(jīng)黏膜、經(jīng)皮、經(jīng)腸或胃腸外遞送,包括肌 內(nèi)、皮下和髓內(nèi)注射以及鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射。用于本發(fā)明的藥物組合物因此可以常規(guī)方式使用一種或多種藥學(xué)上可接受的載 體配制,所述載體包含可以用于制藥的有利于將活性成分加工成制劑的賦形劑和助劑。合 適的劑型取決于所選擇的給藥途徑。對于注射,本發(fā)明的活性成分可以在水溶液中制備,優(yōu)選在生理上相容的緩沖液 例如Hank溶液、林格氏液(Ringer’ s solution)或生理鹽水緩沖液中制備。對經(jīng)黏膜給 藥,劑型中可使用滲透劑。這類滲透劑是本領(lǐng)域普通已知的。對于口服給藥,活性成分可任選配制成能通過給予產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)(例如G⑶ 或a-半乳糖苷酶等)的完整細胞的形式?;钚猿煞诌€可通過將活性成分和/或細胞與本 領(lǐng)域眾所周知的藥學(xué)上可接受的載體相混合來配制。這類載體能夠使本發(fā)明的活性成分配 制成片劑、丸劑、錠劑、膠囊劑、液體、凝膠劑、糖漿劑、膏劑、混懸劑等,用于患者口服服用。 口服使用的藥物制劑可用固體賦形劑制備,任選研磨所得混合物,加工成顆?;旌衔?,如有 需要在加入合適助劑后,得到片劑或錠劑芯。合適賦形劑特別為填充劑,例如糖,包括乳糖、 蔗糖、甘露醇或山梨醇;纖維素制劑,例如玉米淀粉、小麥淀粉、水稻淀粉、馬鈴薯淀粉、明 膠、西黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉;和/或生理上可接受的聚 合物,例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如有需要,可加入崩解劑,例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊 脂或海藻酸或其鹽,例如藻酸鹽。錠劑芯與合適的包衣一起提供。為此,可使用濃糖溶液,其中可任選含有阿拉 伯膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝膠、聚乙二醇、二氧化鈦、清漆溶液(lacquer solution)和合適的有機溶劑或溶劑混合物??蓪⑷玖匣蝾伭霞拥狡瑒┗蝈V劑包衣中用于 區(qū)分或表征不同組合的活性成分劑量。可以口服使用的藥物組合物包括由明膠制成的推入配合膠囊劑以及由明膠和增 塑劑(例如甘油或山梨醇)制成的密封軟膠囊劑。推入配合膠囊劑可含有活性成分以及與 之混合的填充劑(例如乳糖)、粘合劑(例如淀粉)、潤滑劑(例如滑石粉或硬脂酸鎂),任 選穩(wěn)定劑。在軟膠囊劑中,活性成分可溶于或懸浮于合適液體中,例如脂肪油、液狀石臘或 液體聚乙二醇。另外,可加入穩(wěn)定劑。口服給藥的所有劑型應(yīng)為適于所選給藥途徑的劑量。對于口含給藥,組合物可呈以常規(guī)方式配制的片劑或糖錠劑的形式。對于吸入給藥,便于以其中使用合適拋射劑的加壓包裝或噴霧器產(chǎn)生的噴霧劑外 觀形式遞送用于本發(fā)明用途的活性成分,拋射劑例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟 乙烷或二氧化碳。在壓縮氣霧劑的情況下,劑量單位可通過提供給出計量量的閥來確定???以制成例如用于吸入器或吹入器的明膠的容器和藥筒,其中裝有活性成分和合適的粉狀基 質(zhì)(例如乳糖或淀粉)的粉狀混合物??膳渲票疚乃龌钚猿煞钟糜谖改c外給藥,例如通過推注或連續(xù)輸注。用于注射 的劑型可呈單位劑型,例如在安瓿或多劑量容器中,任選加入防腐劑。組合物可以是油性載 體或水性載體中的混懸劑、溶液劑或乳劑,并可含有調(diào)配劑(formulatory agent),例如助 懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。用于胃腸外給藥的藥物組合物包括水溶形式的活性制劑的水溶液。另外,活性成分的混懸劑可制成合適的油性注射混懸劑。合適的親脂性溶劑或載體包括脂肪油(例如芝 麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯、甘油三酯)或脂質(zhì)體。水性注射混懸劑可含有增 加混懸劑粘度的物質(zhì),例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。任選混懸劑還可含有合適的 穩(wěn)定劑或增加活性成分溶解度的物質(zhì)以供制備高濃縮溶液劑。在一個優(yōu)選的實施方案中,按照常規(guī)方法將組合物配制成適于人類靜脈內(nèi)給藥的 藥物組合物。靜脈內(nèi)給藥的藥物組合物通常是無菌等滲含水緩沖液形式的溶液劑。各成分 一般是單獨的或混合在單位劑型中提供,例如作為干燥凍干粉或無水濃縮劑,裝在標明活 性劑含量的密封容器中,例如安瓿或小袋。如果組合物通過輸注給予,則可分散在裝有無菌 藥用級水或鹽水的輸液瓶中。如果組合物通過注射給予,可提供安瓿裝的無菌注射水或鹽 水,以便可在給藥前將各成分混合??蓪⒈景l(fā)明的藥物組合物配制成中性形式或鹽的形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括與 陰離子形成的鹽和與陽離子形成的鹽,與陰離子形成的鹽例如由鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒 石酸等得到的鹽,與陽離子形成的鹽例如由鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙 基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等得到的鹽。本發(fā)明的活性成分還可使用例如常用的栓劑基質(zhì)例如可可脂或其它甘油脂,配制 成直腸組合物,例如栓劑或滯留型灌腸劑。本文所述的藥物組合物還可包含凝膠相載體或賦形劑的合適固體。這類載體或賦 形劑的實例包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠和聚合物例如
聚乙二醇。任選使用局部途徑,并輔以局部載體。局部載體是通常適于局部給予活性成分的 載體,包括本領(lǐng)域已知的任何這類物質(zhì)。選擇這樣的局部載體以便提供所需形式的組合物, 例如作為液體載體或非液體載體、洗劑、乳膏劑、糊劑、凝膠劑、散劑、軟膏劑、溶劑、液體稀 釋劑、滴劑等,局部載體可由天然存在的或合成來源的材料組成。所選擇的載體不得不利地 影響局部劑型的活性劑或其它組分,且對于局部劑型所有組分是穩(wěn)定的,這無疑是絕對必 需的。合適的用于本文的局部載體的實例包括水、醇和其它無毒有機溶劑、甘油、礦物油、硅 酮、石油膏、羊毛脂、脂肪酸、植物油、對羥基苯甲酸酯、蠟等。本文優(yōu)選的劑型是無色無味的 軟膏劑、液體制劑、洗劑、乳膏劑和凝膠劑。軟膏劑通常是基于凡士林或其它石油衍生物的半固體制劑。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員 應(yīng)了解的一樣,所采用的具體軟膏劑基質(zhì),是可提供最佳活性成分遞送的基質(zhì),優(yōu)選還可提 供其它所需的特征,例如軟化性等。與其它載體或溶媒一樣,軟膏劑基質(zhì)應(yīng)是惰性穩(wěn)定的, 無刺激性,無致敏性。有關(guān)詳述參見 Remington :The Science and Practice of Pharmacy, 第 19 版(Easton,Pa. :Mack Publishing Co.,1995),第 1399-1404 頁。軟膏劑基質(zhì)可分成 四類油脂性基質(zhì)、可乳化基質(zhì)(emulsifiable base)、乳劑基質(zhì)(emulsion base)、水溶性 基質(zhì)。油脂性軟膏劑基質(zhì)包括例如植物油、從動物中獲得的脂肪和從石油獲得的半固體烴。 可乳化軟膏劑基質(zhì),亦稱吸收軟膏劑基質(zhì),含有少量水或不含水,包括例如硫酸羥基甘油三 硬脂酸酯、無水羊毛脂和親水性礦脂。乳劑軟膏劑基質(zhì)為油包水(W/0)乳劑或水包油(0/W) 乳劑,包括例如鯨蠟醇、單硬脂酸甘油酯、羊毛脂和硬脂酸。優(yōu)選的水溶性軟膏劑基質(zhì)由不 同分子量的聚乙二醇制備;更多信息同樣可參考《雷明頓制藥科學(xué)與實踐》(Remington The Science and Practice of Pharmacy)。
洗劑是不用磨擦而用于皮膚表面的制劑,通常是液體或半液體制劑,其中包括活 性劑在內(nèi)的固體顆粒存在于水或醇基質(zhì)中。洗劑通常是固體的混懸劑,可包括水包油型的 液體油性乳劑。洗劑是本文用于治療大身體面積的優(yōu)選劑型,因為易于使用較為流動的組 合物。洗劑中不溶性物質(zhì)一般必需是細碎的。洗劑通??珊袘腋┮援a(chǎn)生更好的分散作 用以及在與皮膚接觸時用于將活性劑定位并保持住的活性成分,例如甲基纖維素、羧甲基 纖維素鈉等。含有所選活性成分的乳膏劑是本領(lǐng)域已知的水包油或油包水的黏性液體或半固 體乳劑。乳膏劑基質(zhì)是水洗型的,含有油相、乳化劑和水相。油相,有時亦稱“內(nèi)”相,一般 由凡士林和脂肪醇(例如鯨蠟醇或硬脂醇)組成;水相的體積通常(盡管不是必需)超過 油相,一般含有濕潤劑。乳膏劑型中的乳化劑(參見Remington,同上)一般為非離子表面 活性劑、陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑或兩性表面活性劑。凝膠劑型優(yōu)選應(yīng)用于頭皮。正如局部活性成分制劑領(lǐng)域工作人員了解的一樣,凝 膠劑為半固體、混懸型系統(tǒng)。單相凝膠含有基本均勻分布在整個載體液體中的有機大分子, 通常是含水的,但也優(yōu)選含有醇,并任選含有油。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種添加劑可包括在本發(fā)明的局部劑型中。例如可以使用 溶劑使某些活性成分物質(zhì)增溶。其它任選添加劑包括皮膚滲透促進劑、遮光劑、抗氧化劑、 膠凝劑、增稠劑、穩(wěn)定劑等。還可使用常規(guī)皮膚型貼劑或制品遞送本發(fā)明的局部組合物,其中活性成分組合物 包含在層狀結(jié)構(gòu)中,層狀結(jié)構(gòu)用作貼附在皮膚上的遞藥裝置。在這類結(jié)構(gòu)中,活性成分組合 物包含在上部襯底層之下的藥層或“貯庫”中。層狀結(jié)構(gòu)可含有單個貯庫,或者可含有多個 貯庫。在一個實施方案中,貯庫包含藥學(xué)上可接受的接觸膠黏材料的聚合物基質(zhì),用于在活 性成分遞送期間將該系統(tǒng)貼附在皮膚上。合適的皮膚接觸膠黏物質(zhì)的實例包括但不限于聚 乙烯、聚硅氧烷、聚異丁烯、聚丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯等。所選的具體聚合物黏合劑將取決 于具體的活性成分、溶媒等,也就是說,黏合劑必需與含有活性成分的組合物中的所有組分 相容?;蛘?,含有活性成分的貯庫和皮膚接觸膠黏劑存在于完全不同的獨立片層,在這種情 況下,在貯庫之下的黏合劑可以是如上所述的聚合物基質(zhì),或者可以是液體或水凝膠貯庫, 或者可呈某種其它形式。用作該裝置上表面的這些片層的襯底層,起層狀結(jié)構(gòu)主要結(jié)構(gòu)元件的作用,并為 該裝置提供大量柔性。應(yīng)如此選擇選用于襯底材料的材料,以使得它基本上不能透過活性 成分和含有活性成分的組合物的任何其它組分,從而防止任何組分通過該裝置的上表面喪 失。襯底層可以是封閉或非封閉的,這取決于在活性成分遞送期間皮膚是否需要被水化。襯 底優(yōu)選由優(yōu)選的柔性高彈性材料片層或薄膜制成。適用于襯底層的聚合物的實例包括聚乙 烯、聚丙烯和聚酯。在貯存期間以及使用之前,層狀結(jié)構(gòu)包括釋放襯墊。臨用前,從裝置撕去該層暴露 出其基底面,即活性成分貯庫或獨立的接觸膠黏劑層,使得該系統(tǒng)可以黏附在皮膚上。釋放 釋放襯墊應(yīng)由防止活性成分/溶媒滲漏的材料制備。這類裝置可用本領(lǐng)域已知常規(guī)技術(shù)制造,例如將膠黏劑、活性成分和溶媒的液體 混合物澆到襯底層上,接著壓上釋放襯墊。同樣,可將膠黏劑混合物澆到釋放襯墊上,接著 壓上襯底層?;蛘撸梢栽诓淮嬖诨钚猿煞只蛸x形劑時制備活性成分貯庫,然后通過“浸泡”在活性成分/溶媒混合物中加載。如同本發(fā)明的局部劑型的情形一樣,包含在這些片層系統(tǒng)的活性成分貯庫內(nèi)的活 性成分組合物可含有多種組分。在一些情況下,活性成分可以被“凈”遞送,也就是說不存 在其它液體。然而,在大多數(shù)情況下,可將活性成分溶于、分散于或懸浮于合適藥學(xué)上可接 受的溶媒(通常為溶劑或凝膠劑)中。可存在的其它組分包括防腐劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑寸。應(yīng)當注意的是,本發(fā)明的蛋白質(zhì),例如高甘露糖溶酶體酶,優(yōu)選按有效量給予有需 要的患者。本文所用“有效量”是指達到特定結(jié)果所必需的量。例如,可選擇有效量的本發(fā) 明組合物用于治療溶酶體貯積病。適用于本發(fā)明用途的藥物組合物包括其中所包含的活性成分是獲得既定目的的 有效量的組合物。更準確地講,治療有效量是指有效預(yù)防、減輕或改善疾病癥狀或延長受治 療者生存的活性成分的量。治療有效量的確定盡在本領(lǐng)域技術(shù)人員掌握之中,尤其是根據(jù)本文提供的詳細公 開內(nèi)容。對于用于本發(fā)明方法的任何活性成分,可由動物活性測定法對治療有效量或劑量 作出初步估計。例如,可以在動物模型中調(diào)配劑量以達到包括由活性測定法測出的IC5(I在 內(nèi)的循環(huán)濃度范圍。本文所述活性成分的毒性和治療功效可通過實驗動物的標準藥學(xué)規(guī)程測定,例如 通過測定主題活性成分的ic5(l和LD5CI(引起受試動物50%死亡的致死劑量)。從這些活性 測定法和動物研究得到的數(shù)據(jù)可用來調(diào)配用于人的劑量范圍。例如,可以從使用這些疾病 的動物模型進行的實驗確定適于治療遺傳疾病的治療有效劑量。劑量可根據(jù)所使用的劑型和所采用的給藥途徑而變化??捎筛麽t(yī)師根據(jù)患者的病 況來選擇確切的劑型、給藥途徑和劑量(參見例如Fingl等,1975,"The Pharmacological Basis of Therapeutics,,,第 1 章,第 1 頁)。可以各別調(diào)整劑量和劑量間隔以提供足以維持調(diào)節(jié)作用的活性部分的血漿水平, 其被稱為最小有效濃度(MEC)。對于各制劑,MEC可發(fā)生變化,但可任選由全體動物數(shù)據(jù)作 出估計。劑量間隔還可用MEC值確定。任選可采用在特定時間的10-90%、優(yōu)選介于 30-90%之間、最優(yōu)選為50-90%內(nèi)維持MEC以上血漿水平的方案,來給予制劑。根據(jù)待治療疾病的嚴重程度和反應(yīng)性,劑量方案還可以是一次給予上文所述的緩 釋組合物,其中療程持續(xù)數(shù)天到數(shù)周,或者直到治療產(chǎn)生效果,或者疾病狀況減輕。如有需要,本發(fā)明的組合物可以藥包或配藥裝置(dispenser device)形式提供, 例如FDA批準的藥盒,其中可裝有一個或多個含有活性成分的單位劑型。例如,藥包可裝有 金屬或塑料薄片,例如泡罩包裝。藥包或配藥裝置可附有給藥說明書。藥包或配藥器還可 附加附在容器中的說明書,該說明書由管理藥品生產(chǎn)、使用或銷售的政府機構(gòu)規(guī)定格式,該 說明書上反映出組合物的形式或者人用藥物或獸用藥物已獲政府機構(gòu)批準。例如,這類說 明書可以是由美國食品與藥物管理局批準用于處方藥的標簽,或是獲準的產(chǎn)品插頁。還可 制備包含在相容的藥用載體中配制的本發(fā)明活性成分的組合物,將該組合物放入合適的容 器中,并標明用于指定疾病的治療。
本文術(shù)語“調(diào)節(jié)”包括基本上抑制、減緩或逆轉(zhuǎn)疾病的進程,基本上改善疾病或病 癥的臨床癥狀,或者基本上預(yù)防疾病或病癥臨床癥狀的出現(xiàn)。因此,“調(diào)節(jié)劑”包括調(diào)節(jié)疾病 或病癥的藥劑。其它實施方案要了解的是,雖然結(jié)合詳細描述對本發(fā)明進行了說明,但是前面的描述旨在舉例 說明,并不限制本發(fā)明的范圍,該范圍由隨附權(quán)利要求書限定。其它方面、優(yōu)勢和改動都落 入隨附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。參考文獻1. Ma, J. K. C. ,Drake, P. M. ff.禾口 Christou,P. (2003) Nature reviews4, 794-8052. Lerouge, P. , Cabanes-Macheteau, M, Rayon, C, Fischette-Laine, A. C. , Gomord, V, Faye, L. (1998)Plant Mol Biol 38,31-483. Lee, R. E. (1982)Prog Clin Biol Res 95,177-2174. Grabowski, G. (1993) Adv Hum Genet. 21,377-4415.Grabowski,G. A.禾口Hopkin,R. J. (2003)Annual Review ofGenomics and Human Genetics 4,403-4366. Sorge, J. ff. , C. ,ffestwood,B. ,Beutler,E. (1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 7289-72937. Berg-Fussman, A. , Grace, M. , Ioannou, Y.禾口 Grabowski, G. (1993) J. Biol. Chem. 268,14861-148668. Grace, M. ,Grabowski, GA. (1990)Biochem Biophys ResCommun 168,771-7779. Grace, M. , Newman, K. , Scheinker, V. , Berg-Fussman, A.禾口 Grabowski, G. (1994) J. Biol. Chem. 269,2283-229110. Barton, N. ff. ,Brady, R. 0. ,Dambrosia, J. M. ,Di Bisceglie, A. M. ,Doppelt, S. H. ,Hill,S. C. ,Mankin,H. J. ,Murray,G. J. ,Parker, R. I. ,Argoff,C. E.等(1991)N Engl J Med. 324,1464-147011. Grabowski, G. A. , Barton, N. ff. , Pastores, G. , Dambrosia, J. M. , Banerjee, T. K.,McKee,M.A. , Parker, C. , Schiffmann, R.,Hill,S.C. ^PBrady, R. 0. (1995) Ann Intern Med 122,33-3912. Pastores, G. M.,Sibille, A. R. , Grabowski, G. A. (1993)Blood82,408—41613. ffeinreb, N. J. , Charrow, J, Andersson, H. C. , Kaplan, P, Kolodny, E. H., Mistry, P, Pastores, G, Rosenbloom, B. E. , Scott, C. R. , ffappner, R. S. , Zimran, A. (2002) Am J Med 113,112-11914. Bijsterbosch, M. K. , Donker, ff, van de Bilt, H, van ffeely, S, van Berkel, T.J. , Aerts, JM. (1996) Eur J Biochem 237,344-34915. Friedman, B. , Vaddi,K. , Preston, C. ,Mahon,E. , Cataldo, J. R.禾口 McPherson, J. M. (1999)Blood 93,2807-281616. Furbish, F. S. , Steer, C. J. , Krett, N. L. , Barranger, J. A. (1981)Biochim Biophys Acta 673,425-43417. Doebber, T. , ffu, M. , Bugianesi, R. , Ponpipom, M. , Furbish, F. , Barranger,
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一種分離核酸序列,所述核酸序列編碼與C端液泡引導(dǎo)信號和N端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽鄰接連接的人溶酶體蛋白,其中所述人溶酶體蛋白是人α-半乳糖苷酶。
2.一種分離核酸序列,所述核酸序列編碼與C端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號和N端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽 鄰接連接的人溶酶體蛋白,其中所述人溶酶體蛋白是人a-半乳糖苷酶。
3.權(quán)利要求1或2的分離核酸,其中所述人a-半乳糖苷酶如SEQ ID NO 24所示。
4.權(quán)利要求1的分離核酸構(gòu)建體,其中所述液泡引導(dǎo)信號是SEQID N0:4。
5.權(quán)利要求2的分離核酸構(gòu)建體,其中所述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號是SEQID N0:23(KDEL)。
6.權(quán)利要求2的分離核酸構(gòu)建體,所述構(gòu)建體如SEQID NO 19所示。
7.權(quán)利要求1的分離核酸構(gòu)建體,所述構(gòu)建體如SEQID NO 17所示。
8.權(quán)利要求1的分離核酸構(gòu)建體,其中所述人溶酶體蛋白是人a-半乳糖苷酶。
9.權(quán)利要求1的分離核酸構(gòu)建體,其中所述人溶酶體蛋白如SEQIDNO :24所示。
10.一種能夠在植物細胞內(nèi)表達的核酸構(gòu)建體,所述構(gòu)建體包含權(quán)利要求1的分離核酸。
11.一種能夠在植物細胞內(nèi)表達的核酸構(gòu)建體,所述構(gòu)建體包含權(quán)利要求2的分離核酸。
12.一種細胞,所述細胞包含權(quán)利要求10的核酸構(gòu)建體。
13.一種細胞,所述細胞包含權(quán)利要求11的核酸構(gòu)建體。
14.權(quán)利要求13的細胞,所述細胞經(jīng)重組產(chǎn)生所述人溶酶體酶。
15.權(quán)利要求13的細胞,其中所述人溶酶體蛋白是重組產(chǎn)生的,以致具有至少一個木 糖和至少一個暴露出來的甘露糖殘基。
16.權(quán)利要求13的細胞,其中所述人溶酶體蛋白是重組產(chǎn)生的,以致具有至少一個核 心a-(l,2)木糖和至少一個核心a-(l,3)巖藻糖。
17.權(quán)利要求13的細胞,其中所述細胞是植物細胞。
18.權(quán)利要求17的細胞,其中所述植物細胞是選自以下的植物根細胞發(fā)根土壤桿菌 (Agrobacterium rihzogenes)轉(zhuǎn)化的根細胞、芹菜細胞、姜細胞、辣根細胞和胡蘿卜細胞。
19.權(quán)利要求18的細胞,其中所述植物細胞是煙草細胞。
20.權(quán)利要求13的細胞,其中所述細胞是根癌土壤桿菌細胞(Agrobacterium tumefaciens)0
21.權(quán)利要求13的細胞,其中所述人溶酶體蛋白具有至少一個核心a-(l,2)木糖和至 少一個核心a-(l,3)巖藻糖。
22.—種人溶酶體蛋白,所述溶酶體蛋白包含至少一個暴露出來的甘露糖殘基和至少 一個具有a (1-3)糖苷鍵的巖藻糖殘基。
23.權(quán)利要求22的人溶酶體蛋白,所述溶酶體蛋白另包含至少一個木糖殘基。
24.權(quán)利要求23的人溶酶體蛋白,其中所述木糖殘基是核心a_(l,2)木糖殘基。
25.權(quán)利要求22的人溶酶體蛋白,其中所述溶酶體酶是葡糖腦苷脂酶。
26.權(quán)利要求22的人溶酶體蛋白,其中所述溶酶體酶是a-半乳糖苷酶。
27.權(quán)利要求22的人溶酶體蛋白,其中所述人溶酶體蛋白與C端液泡引導(dǎo)信號鄰接連接。
28.權(quán)利要求22的人溶酶體蛋白,其中所述人溶酶體蛋白與C端液泡引導(dǎo)信號和N端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽鄰接連接。
29.權(quán)利要求22的人溶酶體蛋白,其中所述人溶酶體蛋白與C端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號和N 端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽鄰接連接。
30.權(quán)利要求27的人溶酶體蛋白,其中所述液泡引導(dǎo)信號是堿性煙草幾丁質(zhì)酶A基因 液泡引導(dǎo)信號。
31.權(quán)利要求30的人溶酶體蛋白,其中所述液泡引導(dǎo)信號如SEQID N0:2所示。
32.權(quán)利要求28的人溶酶體蛋白,其中所述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽如SEQID NO 1或SEQ ID NO 16所示。
33.權(quán)利要求25的人溶酶體蛋白,其中所述人葡糖腦苷脂酶包含如SEQID NO :8所示 的氨基酸序列。
34.權(quán)利要求25的人溶酶體蛋白,其中所述人溶酶體蛋白包含如SEQID N0:15所示的氨基酸序列。
35.權(quán)利要求26的人溶酶體蛋白,其中所述人葡糖腦苷脂酶包含如SEQID NO :24所 示的氨基酸序列。
36.權(quán)利要求26的人溶酶體蛋白,其中所述人溶酶體蛋白包含如SEQID N0:18或20 所示的氨基酸序列。
37.權(quán)利要求22的人溶酶體蛋白,其中所述溶酶體蛋白具有生物活性。
38.權(quán)利要求37的人溶酶體蛋白,其中所述生物活性是攝入到巨噬細胞內(nèi)。
39.權(quán)利要求37的人溶酶體蛋白,其中所述生物活性是攝入到成纖維細胞內(nèi)。
40.權(quán)利要求37的人溶酶體蛋白,其中所述生物活性是酶促活性。
41.權(quán)利要求37的人溶酶體蛋白,所述溶酶體蛋白與天然存在的溶酶體蛋白對所述巨 噬細胞的相應(yīng)親和力相比,對所述巨噬細胞的親和力提高。
42.一種藥物組合物,所述組合物包含權(quán)利要求22的人溶酶體蛋白和藥學(xué)上可接受的 載體。
43.一種植物細胞制備物,所述細胞制備物包含人溶酶體蛋白,所述溶酶體蛋白包含至 少一個暴露出來的甘露糖殘基和至少一個具有a (1-3)糖苷鍵的巖藻糖殘基。
44.權(quán)利要求43的植物細胞制備物,所述細胞制備物另包含至少一個木糖殘基。
45.權(quán)利要求44的植物細胞制備物,其中所述木糖是核心a_(l,2)木糖。
46.權(quán)利要求45的植物細胞制備物,其中所述溶酶體蛋白是人葡糖腦苷脂酶。
47.權(quán)利要求46的植物細胞制備物,其中所述人溶酶體蛋白包含如SEQID NO :8所示 的氨基酸序列。
48.權(quán)利要求46的植物細胞制備物,其中所述人溶酶體蛋白包含如SEQID N0:15所示的氨基酸序列。
49.權(quán)利要求45的植物細胞制備物,其中所述溶酶體蛋白是人a-半乳糖苷酶。
50.權(quán)利要求49的植物細胞制備物,其中所述人葡糖腦苷脂酶包含如SEQID NO :24所 示的氨基酸序列。
51.權(quán)利要求49的植物細胞制備物,其中所述人溶酶體蛋白包含如SEQID N0:18或 20所示的氨基酸序列。
52.權(quán)利要求43的植物細胞制備物,其中所述人溶酶體蛋白與C端液泡引導(dǎo)信號鄰接連接。
53.權(quán)利要求43的植物細胞制備物,其中所述人溶酶體蛋白與C端液泡引導(dǎo)信號和N 端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽鄰接連接。
54.權(quán)利要求43的植物細胞制備物,其中所述人溶酶體蛋白與C端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號和 N端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽鄰接連接。
55.權(quán)利要求54的植物細胞制備物,其中所述液泡引導(dǎo)信號是堿性煙草幾丁質(zhì)酶A基 因液泡引導(dǎo)信號。
56.權(quán)利要求55的植物細胞制備物,其中所述液泡引導(dǎo)信號如SEQID N0:2所示。
57.權(quán)利要求55的植物細胞制備物,其中所述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽如SEQID NO :1或SEQ ID NO 16所示。
58.權(quán)利要求43的植物細胞制備物,其中所述具有至少一個暴露出來的甘露糖殘基的 人溶酶體蛋白包含如連接分析中所測定的所述溶酶體蛋白的主要流分。
59.一種藥物組合物,所述藥物組合物包含權(quán)利要求43的植物細胞制備物和藥學(xué)上可 接受的載體。
60.權(quán)利要求37的有生物活性的溶酶體酶在制備用于治療溶酶體貯積病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在植物培養(yǎng)物中產(chǎn)生糖基化蛋白、特別是具有高甘露糖糖基化的蛋白質(zhì),同時使這類蛋白質(zhì)靶向ER信號和/或繞過高爾基體的裝置、系統(tǒng)和方法。本發(fā)明另涉及使用轉(zhuǎn)基因植物根,特別是胡蘿卜細胞表達和產(chǎn)生有酶促活性的高甘露糖溶酶體酶的載體和方法。更具體的講,本發(fā)明涉及宿主細胞,特別是轉(zhuǎn)基因的懸浮胡蘿卜細胞,用于高產(chǎn)量地表達和產(chǎn)生有生物活性的高甘露糖葡糖腦苷脂酶(GCD)的載體和方法。本發(fā)明進一步提供用于治療溶酶體貯積病的組合物和方法。
文檔編號C12P21/00GK101855232SQ200880023217
公開日2010年10月6日 申請日期2008年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月30日
發(fā)明者A·勒科夫斯基, D·巴特費爾德, G·鮑姆, S·哈什米利, Y·沙爾蒂爾 申請人:普羅塔里克斯有限公司