專利名稱：氨基酮不對稱還原酶及其核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及氨基酮不對稱還原酶、對上述酶進(jìn)行編碼的核酸、產(chǎn)生上述酶的微生物及使用它們制造旋光性氨基醇的方法。
背景技術(shù)：
麻黃堿自古以來就被用于發(fā)汗、解熱、鎮(zhèn)咳等目的，人們還知道其中的d-假麻黃堿具有抗炎癥作用。另外，人們了解到1-麻黃堿具有血管收縮作用、血壓上升作用或發(fā)汗等藥理作用，因此在醫(yī)療上被用作交感神經(jīng)興奮劑。而且，1-麻黃堿還可用于支氣管哮喘的治療。即，制造包含旋光性麻黃堿的旋光性β-氨基醇的方法，在醫(yī)藥或其中間體的制造過程中具有重要意義，因此人們希望獲得有效的制造方法。
目前，就用于制造具有所希望的旋光性的β-氨基醇的方法而言，有這樣一種方法，即，在得到外消旋體的β-氨基醇之后，利用光學(xué)分割或不對稱合成等制造特定旋光體的方法。
但是，由于外消旋體的β-氨基醇的分子內(nèi)有兩個不對稱碳原子，因此，為了得到特定的旋光體就不得不經(jīng)過復(fù)雜的工序。
例如，根據(jù)“Ger.(East)13683，Aug.27，1957”所述，在作為β-氨基醇之一的旋光性麻黃堿的情況下，以苯甲醛為原料并利用酵母的發(fā)酵所得到的旋光性苯乙酰甲醇與甲胺還原縮合，可以制成赤合-1-2-甲胺基-1-苯基-1-丙醇、即1-麻黃堿。
而作為制取假麻黃堿的方法，有文獻(xiàn)(美國專利第4237304號)記載以1-麻黃堿為原料，再利用乙酸酐生成噁唑啉，然后水解，再通過反轉(zhuǎn)為蘇體即d-假麻黃堿，即可實現(xiàn)。
如上所述，為了實現(xiàn)由1-苯基-2-甲胺基-1-丙醇制造具有所希望的旋光性的假麻黃堿，一旦得到旋光性赤合體的麻黃堿后，需要經(jīng)過反轉(zhuǎn)為蘇體的工序，因此存在工序多且復(fù)雜、收率也低的問題。
而且，在上述假麻黃堿的制造中，一方面，在原料酮體還原時，產(chǎn)生相當(dāng)多的非對映(立體)異構(gòu)體副產(chǎn)物，另一方面，作為非對映(立體)異構(gòu)體的原料的回收有困難，經(jīng)濟(jì)上也不利。
另外，盡管根據(jù)特開平8-98697號公報記載的方法，由分子內(nèi)有一個不對稱碳原子的2-氨基-1-苯乙醇化合物為原料并利用特定微生物可以制造旋光性2-氨基-1-苯乙醇衍生物，但對于具有兩個不對稱碳原子的β-氨基醇來說，目前尚沒有一種有效的制造方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)中的問題而完成的發(fā)明，其目的在于，提供一種具有可以以高收率、高選擇性由α-氨基酮化合物或其鹽的對映體混合物制造具有所希望的旋光性的β-氨基醇的作用的氨基酮不對稱還原酶。并且，其目的還在于，提供一種具有氨基酮不對稱還原活性的蛋白質(zhì)、對上述蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的核酸、可由上述核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子、使用上述轉(zhuǎn)化子制造上述蛋白質(zhì)的方法，及上述轉(zhuǎn)化子或上述蛋白質(zhì)的用途。還有一個目的，就是提供一種可由α-氨基酮化合物或其鹽的對映體混合物高效地轉(zhuǎn)化成旋光性β-氨基醇的新微生物。
本發(fā)明的發(fā)明人等，為了達(dá)到上述目的，經(jīng)過反復(fù)的深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過使用由特定的微生物精制而成的氨基酮不對稱還原酶，可僅對α-氨基酮化合物或其鹽的對映體混合物的其中一種對映異構(gòu)體進(jìn)行還原，可有選擇地、以高收率制造與其相應(yīng)的四種β-氨基醇異構(gòu)體中的僅一種異構(gòu)體，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明的蛋白質(zhì)是一種氨基酮不對稱還原酶，具有如下特征其為具有通過作用于1-2-甲胺基苯丙酮而生成d-假麻黃堿的作用，且其理化性質(zhì)為基質(zhì)1-2-甲胺基苯丙酮；適合pH值pH8.1；適合溫度55℃；輔酶NADP；分子量約28500Da的四聚體均聚物。
并且，本發(fā)明的蛋白質(zhì)是以具有序列表的序列號1中所述的氨基酸序列為特征的蛋白質(zhì)。
另外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)或其部分肽，其特征在于，在序列表的序列號1中所述的氨基酸序列中，有一個或多個氨基酸缺損、插入、取代或加成的氨基酸序列，且具有氨基酮不對稱還原活性。
在此，本發(fā)明還包括上述蛋白質(zhì)的鹽、或上述蛋白質(zhì)的部分肽的鹽。
而且，本發(fā)明的核酸是具有如下特征的核酸，即，對具有如序列表的序列號1所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的核酸。
還有，本發(fā)明的核酸是具有如下特征的核酸，即，具有如序列表的序列號2所述的堿基序列的核酸。
再有，本發(fā)明的核酸是具有如下特征的核酸，即，對可在嚴(yán)格的條件下與序列表的序列號2所述的核酸雜交、且具有氨基酮不對稱還原活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的核酸。
在此，本發(fā)明的核酸也可是具有如下特征的核酸，即，由序列表的序列號2所述的堿基序列的一部分構(gòu)成的核酸。
將這些核酸引入胞質(zhì)遺傳體(plasmid)，由此即可得到本發(fā)明的載體。
并且，將上述載體引入宿主，則可得到本發(fā)明的轉(zhuǎn)換子。而本發(fā)明也包括使用這種轉(zhuǎn)換子制造的氨基酮不對稱還原酶或其部分肽。
而且，本發(fā)明提供一種氨基酮不對稱還原酶或其部分肽的制造方法，其特征在于，包括在可使轉(zhuǎn)化子增殖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)工序；由上述培養(yǎng)工序中得到的該轉(zhuǎn)化子精制氨基酮不對稱還原酶或其部分肽的精制工序。
另外，本發(fā)明的氨基酮不對稱還原酶或其部分肽的制造方法，其特征在于，包括對選自屬于摩根氏菌屬(Morganella)、微桿菌屬(Microbacterium)、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)、毛霉菌屬(Mucor)、犁頭霉菌屬(Absidia)、曲霉菌屬(Aspergillus)、青霉菌屬(Penicillium)、灰樹花菌屬(Grifola)、散子囊菌屬(Eurotium)、靈芝菌屬(Ganoderma)、肉座菌屬(Hypocrea)、螺桿狀菌屬(Helicostylum)、輪枝菌屬(Verticillium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、念球菌屬(Tritirachium)、被孢霉菌屬(Mortierella)、蜜環(huán)菌屬(Armillariella)、銹腐菌屬(Cylindrocarpon)、克雷伯菌屬(Klebsiella)、金桿菌屬(Aureobacterium)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、擲孢酵母菌屬(Sporobolomyces)、Sporidiobolus菌屬、紅球菌屬(Rhodococcus)的微生物中的至少一種微生物、且具有可還原1-2-甲胺基苯丙酮而生成d-假麻黃堿的能力的微生物進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)工序；由上述培養(yǎng)工序中得到的微生物對蛋白質(zhì)或其部分肽進(jìn)行精制的精制工序，。
并且，本發(fā)明的微生物的特征在于，是屬于紅球菌屬Rhodococcus、且具有還原1-2-甲胺基苯丙酮而生成d-假麻黃堿的能力的微生物。
其中，上述微生物優(yōu)選為紅串紅球菌Rhodococcus erythropolisMAK-34菌株(FERM BP-7451號)。
并且，本發(fā)明是一種旋光性氨基醇化合物的制造方法，其特征在于使權(quán)利要求1～3中任一項所述的蛋白質(zhì)或其部分肽或它們的鹽作用于用通式(1)表示的α-氨基酮化合物或其鹽的對映體混合物，通式(1) (式中，X表示選自鹵原子、低級烷基、可用保護(hù)基保護(hù)的羥基、硝基及磺?；械闹辽僖环N，可相同也可不同；n表示0～3的整數(shù)；R1表示低級烷基；R2、R3表示選自氫原子和低級烷基中的至少一種，可相同也可不同；*表示不對稱碳原子)生成用通式(2)表示的旋光性氨基醇化合物即具有所希望的旋光性的該化合物，通式(2)
(式中，X、n、R1、R2、R3及*的意義同上所述)。
另外，本發(fā)明是一種旋光性氨基醇化合物的制造方法，其特征在于使上述轉(zhuǎn)化子、選自屬于紅球菌屬的微生物及紅球菌(紅串)Rhodococcus(erythropolis)MAK-34中的任一種微生物作用于用通式(1)表示的α-氨基酮化合物或其鹽的對映體混合物，通式(1) (式中，X表示選自鹵原子、低級烷基、可用保護(hù)基保護(hù)的羥基、硝基及磺?；械闹辽僖环N，可相同也可不同；n表示0～3的整數(shù)；R1表示低級烷基；R2、R3表示選自氫原子和低級烷基中的至少一種，可相同也可不同；*表示不對稱碳原子)生成用通式(2)表示的旋光性氨基醇化合物即具有所希望的旋光性的該化合物，通式(2) (式中，X、n、R1、R2、R3及*的意義同上所述)。
在上述旋光性氨基醇的制造方法中，優(yōu)選為，再添加用通式(3)表示的化合物、或其可用于制藥的鹽或溶劑化物，生成旋光性氨基醇，通式(3) (A表示結(jié)構(gòu)式(Y)或(Z)， (R4表示氫原子、可帶有取代基的碳原子數(shù)為1～3的烷基、與R8結(jié)合而成的碳原子數(shù)為5～10的烴環(huán)或與R8結(jié)合而成的含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架) (R5表示氫原子、碳原子數(shù)為1～3的烷基、或與R6或R9結(jié)合而成的含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架；R6表示氫原子、可帶有取代基的碳原子數(shù)為1～3的烷基、與R8結(jié)合而成的碳原子數(shù)為5～10的烴環(huán)、與R5或R9結(jié)合而成的含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架；R7表示氫原子、可帶有取代基的碳原子數(shù)為1～6的烷基)R8表示氫原子、羧基、可帶有取代基的碳原子數(shù)為1～6的烷基、與R4結(jié)合而成的含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架、與R6結(jié)合而成的碳原子數(shù)為5～10的烴環(huán)；R9表示氫原子、可帶有取代基的碳原子數(shù)為1～6的烷基、可帶有取代基的碳原子數(shù)為1～6的烷氧基羰基、可帶有取代基的?；⑴cR5或R6結(jié)合而成的含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架；R10表示氫原子或可進(jìn)行取代反應(yīng)的碳原子數(shù)為1～6的烷基)。


圖1是本發(fā)明的氨基酮不對稱還原酶的SDS-PAGE得到的電泳相片。
圖2是表示本發(fā)明的氨基酮不對稱還原酶與pH值的關(guān)系的曲線圖。
圖3是表示本發(fā)明的氨基酮不對稱還原酶與溫度的關(guān)系的曲線圖。
具體實施例方式
下面，對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進(jìn)行詳細(xì)地說明。
另外，在本說明書和附圖中，當(dāng)以省略形式表示堿基和氨基酸等時，以IUPAC-IUB委員會生物化學(xué)術(shù)語(Commission on BiochemicalNomenclature)，或該領(lǐng)域中的慣用術(shù)語的意義為基準(zhǔn)。并且，當(dāng)氨基酸中存在旋光體時，除非特別說明，均表示L-體。
首先，對本發(fā)明的蛋白質(zhì)進(jìn)行說明。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)的特征在于，是具有通過作用于1-2-甲胺基苯丙酮而生成d-假麻黃堿的作用、且具有以下理化性質(zhì)的氨基酮不對稱還原酶基質(zhì)1-2-甲胺基苯丙酮；適合pH值pH8.1；適合溫度55℃；輔酶NADP；分子量約28500Da的四聚體均聚物。
上述蛋白質(zhì)不僅具有通過作用于1-2-甲胺基苯丙酮而生成d-假麻黃堿的作用，而且對1-2-二甲胺基苯丙酮、氨基丙酮、1-氨基-2-丁酮也顯示出還原活性。并且，作用于1-氨基-2-丙醇可生成氨基丙酮。
作為除了上述理化性質(zhì)之外的其它性質(zhì)，研究了各種金屬離子或抑制劑所造成的影響，可以確認(rèn)會因α，α′-聯(lián)吡啶、鄰二氮雜菲、EDTA等而被抑制。
上述蛋白質(zhì)是由培養(yǎng)具有氨基酮不對稱還原活性的微生物后得到的菌體精制而成。
就上述培養(yǎng)方法來說，可使用公知的方法，只要所用方法是在可使所用微生物能夠繁殖的條件下，則沒有特殊限制，通常，使用含有碳源、氮源、其它養(yǎng)分的液體培養(yǎng)基。就培養(yǎng)基的碳源來說，只要可用于上述微生物，就都可使用。具體地說，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、糊精、淀粉、山梨糖醇等糖類；甲醇、乙醇、丙三醇等醇類；富馬酸、檸檬酸、乙酸、丙酸等有機(jī)酸類及其鹽類；石蠟等烴類；或者這些物質(zhì)的混合物等。作為培養(yǎng)基的氮源，只要可用于上述微生物，就都可使用。具體地說，可以使用氯化銨、硫酸銨、磷酸銨等無機(jī)酸銨鹽；富馬酸銨、檸檬酸銨等有機(jī)酸銨鹽；硝酸鈉、硝酸鉀等硝酸鹽；肉膏、酵母提取液、麥芽膏、蛋白胨等無機(jī)或有機(jī)含氮化合物；或是這些物質(zhì)的混合物等。并且，在培養(yǎng)基中也可以適量添加無機(jī)鹽、微量金屬鹽、維生素類等通常用于培養(yǎng)的營養(yǎng)源。并且，根據(jù)需要，在培養(yǎng)基中也可以添加促進(jìn)微生物繁殖的物質(zhì)、可有效保持培養(yǎng)基的pH值的緩沖物質(zhì)。
微生物的培養(yǎng)可以在適于繁殖的條件下進(jìn)行。具體地說，可以在下述這樣的條件下進(jìn)行，即培養(yǎng)基的pH值為3～10，優(yōu)選為4～9；溫度為0～50℃，優(yōu)選為20～40℃。微生物的培養(yǎng)可以在需氧或厭氧的條件下進(jìn)行。培養(yǎng)時間優(yōu)選為10～150小時，但應(yīng)根據(jù)各個微生物來決定適宜的培養(yǎng)時間。
這樣培養(yǎng)而成的微生物可通過對該培養(yǎng)液過濾或離心分離而得到菌體，再用水或緩沖液將該菌體仔細(xì)洗凈。洗凈后的菌體懸濁于適量的緩沖液中，使菌體破碎。對于破碎方法沒有特殊限制，例如，可以舉出乳缽、精磨機(jī)(ダイノミル)、French Press、超聲波粉碎機(jī)等機(jī)械粉碎法。由得到的菌體破碎液中利用過濾或離心分離除去固體物而得到細(xì)胞物質(zhì)提取液中的氨基酮不對稱還原酶可通過常用的酶分離法而提取。
對于這樣的酶分離法沒有特殊的限制，可采用公知的方法，例如，硫酸銨沉淀法等鹽析法；利用葡聚糖凝膠等的凝膠過濾法；使用具有二乙氨基乙基或羧甲基等的載體等的離子交換色譜法；使用具有丁基、辛基、苯基等疏水基的載體等的疏水色譜法；色素凝膠色譜法；電泳法；透析；超濾法；親和色譜法；高速液相色譜法等。
另外，也可將上述酶用作固定酶。對于這樣的方法沒有特殊的限制，可采用公知的方法，可舉出將酶或生酶細(xì)胞固定化的方法，可以利用共價法或吸附法這樣的載體結(jié)合法、交聯(lián)法、遮蓋法等進(jìn)行固定化。并且，根據(jù)需要，還可以使用戊二醛、六甲撐二異氰酸酯、六甲撐二異硫氰酸酯等縮合劑。另外，還可以舉出其它固定方法，例如，由聚合反應(yīng)使單體凝膠化的單體法；使大于通常單體的分子進(jìn)行聚合的預(yù)聚法；使聚合物凝膠化的聚合物法；使用聚丙烯酰胺進(jìn)行的固定化；使用褐藻酸、膠原、明膠、瓊脂、角叉膠等天然高分子等進(jìn)行的固定化；使用光固性樹脂、聚氨酯等合成高分子等進(jìn)行的固定化。
這樣精制而得的酶如通過電泳(SDS-PAGE等)確認(rèn)為單一譜帶，則可以判斷為精制充分。
而作為具有上述氨基酮不對稱還原活性的微生物，優(yōu)選為選自摩根氏菌屬(Morganella)、微桿菌屬(Microbacterium)、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)、毛霉菌屬(Mucor)、犁頭霉菌屬(Absidia)、曲霉菌屬(Aspergillus)、青霉菌屬(Penicillium)、灰樹花菌屬(Grifola)、散子囊菌屬(Eurotium)、靈芝菌屬(Ganoderma)、肉座菌屬(Hypocrea)、螺桿狀菌屬(Helicostylum)、輪枝菌屬(Verticillium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、念球菌屬(Tritirachium)、被孢霉菌屬(Mortierella)、蜜環(huán)菌屬(Armillariella)、銹腐菌屬(Cylindrocarpon)、克雷伯菌屬(Klebsiella)、金桿菌屬(Aureobacterium)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、擲孢酵母菌屬(Sporobolomyces)、Sporidiobolus菌屬、紅球菌屬(Rhodococcus)中的至少一種微生物，更具體地，可以舉出摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)、樹狀微桿菌(Microbacteriumarborescens)、多食鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium multivorum)、簡單類諾卡氏菌(Nocardioides simplex)、Mucor ambiguus菌、Mucor javanicus菌、Mucor fragilis菌、Absidia lichtheimi菌、Aspergillus awamori菌、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、米曲霉菌(Aspergillus oryzae)、白曲霉菌(Aspergillus candidus)、Aspergillus oryzae var.oryzae菌、Aspergillusfoetidus var.acidus菌、草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)、灰樹花菌(栗子蘑)(Grifola frondosa)、木魚酵母菌(Eurotium repens)、赤芝菌(Ganoderma lucidum)、Hypocrea gelatinosa菌、Helicostylum nigricans菌、Verticillium fungicola var.fungicola菌、Fusarium roseum菌、Tritirachium oryzae菌、深黃被孢霉菌(Mortierella isabellina)、蜜環(huán)菌(Armillariella mellea)、Cylindrocarpon sclerotigenum菌、克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、酯香金桿菌(Aureobacteriumesteraromaticum)、Xanthomonas sp.菌、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)、恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)、迪氏分枝桿菌(Mycobacterium diernhoferi)、母牛分枝桿菌(Mycobacterium vaccae)、草分枝桿菌(Mycobacterium phlei)、偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacteriumfortuitum)、氯酚紅分枝桿菌(Mycobacterium chlorophenolicum)、赭色擲孢酵母菌(Sporobolomyces salmonicolor)、Sporobolomyces coralliformis菌、Sporidiobolus johnsonii菌、紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)、紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)。
上述微生物，可以是野生種、變異種、或是用細(xì)胞融合或遺傳基因操作法等手法而衍生成的重組種等任意物種，可以使用至少一種，而且，作為本發(fā)明的具有氨基酮不對稱還原活性的微生物之一，可以舉出特別有效的具有氨基酮不對稱還原活性的新型微生物，即，紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)MAK-34菌株。紅串紅球菌MAK-34菌株是本發(fā)明的發(fā)明人等從自然界中分離出的新型微生物，以FERM BP-7451的委托編號，于平成13年(公元2001年)2月15日保存在‘獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)総合研究所特許生物寄託セんタ一( 305-8566日本國茨城県つくば市1丁目1番地1中央第6)’。
紅串紅球菌MAK-34菌株的菌類學(xué)性質(zhì)如下所示分類學(xué)性質(zhì)(1)形態(tài)性質(zhì)細(xì)胞形狀桿菌細(xì)胞大小1.0×1.5～2.0μm特征V型形成運(yùn)動性-孢子-
(2)培養(yǎng)性質(zhì)培養(yǎng)溫度30℃菌落狀態(tài)圓形、周邊侵食狀、凸?fàn)?、微有光澤、乳白色明膠液化-(3)生理學(xué)性質(zhì)革蘭氏染色+硝酸鹽還原-檸檬酸鹽的利用+尿素酶+氧化酶-過氧化氫酶+對氧的態(tài)度需氧O/F測試-吡嗪酰胺酶(pyrazinamidase)-吡咯烷酮芳酰胺酶(pyrrolidonyl arylamidase)-堿性磷酸酶(alkaline phosphatase)+β-葡糖醛酸酶-β-半乳糖苷酶-α-糖苷酶+N-乙?；?β-氨基葡糖酶-七葉苷(糖苷酶)+糖類的利用性乳糖-麥芽糖+甘露糖+安息香酸鹽+2，3-丁二醇+檸康酸-D-扁桃酸-DL-己氨酸+庚二酸-
精胺-。
(4)對照MicroSeq的數(shù)據(jù)庫對16SrRNA所有堿基序列進(jìn)行解析。
該菌株和與其為近親的菌株的差異性紅串紅球菌 0.56％圓紅球菌 0.76％蘭蒂斯拉維冢村氏菌 2.54％藤黃紅球菌 2.94％根據(jù)上述結(jié)果，可以得知與紅串紅球菌相同率達(dá)99.44％的有最近親緣關(guān)系的菌群。
并且，本發(fā)明的蛋白質(zhì)是具有序列表的序列號1中所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、及、在上述氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸缺損、插入、取代或加成的氨基酸序列、且具有氨基酮不對稱還原活性的蛋白質(zhì)。
對于實施這種缺損、插入、取代、加成的方法沒有特別的限制，可使用公知的方法。例如，可以舉出在‘日本生化學(xué)會編’、“続生化學(xué)実験講座1、遺伝子研究法II”、p105(広瀬進(jìn))、東京化學(xué)同人(1986)；‘日本生化學(xué)會編’、“新生化學(xué)実験講座2、核酸111(組換えDNA技術(shù))”、p233(広瀬進(jìn))、東京化學(xué)同人(1992)；R.Wu，L.Grossman，ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.154，p.350 & p.367，Academic Press，NewYork(1987)；R.Wu，L.Grossman，ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.100，p.457 & p.468，Academic Press，New York(1983)；J.A.Wells et al.，“Gene”，Vol.34，p.315(1985)；T.Grundstroem et al.，“Nucleic Acids Res.”，Vol.13，p.3305(1985)；J.Taylor et al.，“Nucleic Acids Res.”，Vol.13，p.8765(1985)；R.Wu ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.155，p.568，Academic Press，New York(1987)；A.R.Oliphant et al.，“Gene”，Vol.44，p.177(1986)中記載的方法。具體可以舉出，例如，利用合成低核苷酸等的指定位置變異導(dǎo)入法(特殊部位的變異倒入法)、定位誘變法、dNTP[αS](Eckstein)法、使用亞硫酸、亞硝酸等的指定區(qū)域變異導(dǎo)入法等方法。
并且，有時，很多蛋白質(zhì)中加成有糖鏈，可通過取代一個或多個氨基酸而調(diào)節(jié)糖鏈的加成。因此，在序列表的序列號1中所述的氨基酸序列中，只要是經(jīng)過上述糖鏈調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)也具有上述氨基酮不對稱還原活性，就屬于本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
而且，所得到的本發(fā)明的蛋白質(zhì)，還可通過化學(xué)方法對其所含的氨基酸殘基進(jìn)行改性，也可以用肽酶，例如胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、番瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、肽鏈內(nèi)斷酶、肽鏈端解酶等酶進(jìn)行改性或部分分解而改變成其衍生物。
并且，也可以在利用遺傳基因重組法進(jìn)行制造時對作為融合蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)的、在生物體內(nèi)或生物體外與天然氨基酮不對稱還原酶實質(zhì)上具有同等生物活性的物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)化、加工。此時，可采用遺傳工程中常用的融合產(chǎn)生法，這樣制成的融合蛋白質(zhì)也可利用其融合部由親和色譜法等進(jìn)行精制。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改性、改變等，可參考‘日本生化學(xué)會編’、“新生化學(xué)実験講座1、タンパク質(zhì)VII、タンパク質(zhì)工學(xué)”、東京化學(xué)同人(1993)中所記載的方法或其中所引用的文獻(xiàn)中所記載的方法，及實質(zhì)上與其相同的方法來實行。
并且，本發(fā)明也可以是一個以上的氨基酸殘基在同一性上與天然物質(zhì)不同的生成物，也可以是一個以上的氨基酸殘基的位置與天然物質(zhì)不同的生成物。本發(fā)明還包括天然氨基酮不對稱還原酶中所特有的氨基酸殘基缺損一個以上(例如，1～80個，優(yōu)選為1～60個，更優(yōu)選為1～40個，進(jìn)一步優(yōu)選為1～20個，特別優(yōu)選為1～10個等)的缺損類似體；一個以上(例如，1～80個，優(yōu)選為1～60個，更優(yōu)選為1～40個，進(jìn)一步優(yōu)選為1～20個，特別優(yōu)選為1～10個等)的特有的氨基酸殘基被其它殘基取代的取代類似體；一個以上(例如，1～80個，優(yōu)選為1～60個，更優(yōu)選為1～40個，進(jìn)一步優(yōu)選為1～20個，特別優(yōu)選為1～10個等)的氨基酸殘基被加成的加成類似體。優(yōu)選為也包括具有天然氨基酮不對稱還原酶特征的領(lǐng)域結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。并且，還可以舉出具有同質(zhì)的氨基酮不對稱還原酶活性的物質(zhì)。
只要維持有天然氨基酮不對稱還原酶特征的領(lǐng)域結(jié)構(gòu)，則上述每一種變異體都包含于本發(fā)明。而且，可以認(rèn)為，還包括實質(zhì)上與本發(fā)明的天然氨基酮不對稱還原酶具有同等的一次構(gòu)造形態(tài)(conformation)的或其部分構(gòu)造形態(tài)的物質(zhì)，及實質(zhì)上與天然氨基酮不對稱還原酶具有同等的生物活性的物質(zhì)。而且還可以是天然生成的變異體中的一種。這樣得到的本發(fā)明的氨基酮不對稱還原酶，如下所述，可進(jìn)行分離、精制處理。另一方面，這樣，本發(fā)明也包括上述對多肽進(jìn)行編碼的DNA序列，而且還包括對具有全部天然特性或部分天然特性的氨基酮不對稱還原酶的多肽、及其類似體或衍生物進(jìn)行編碼的DNA序列。還可以對該氨基酮不對稱還原酶的堿基序列進(jìn)行改性(例如，加成、消去、取代等)，這種經(jīng)過改性的產(chǎn)物也屬于本發(fā)明范圍。
下面，對本發(fā)明的核酸進(jìn)行說明。
本發(fā)明的核酸的特征在于，對具有序列表的序列號1所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼。
即，由于存在多個對一個氨基酸進(jìn)行編碼的堿基序列(密碼)，所以存在很多對具有序列表的序列號1所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的核酸。因此，本發(fā)明所述核酸也包括這種核酸。在此，“對蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼”是指當(dāng)DNA為雙鏈時，互補(bǔ)的雙鏈中的任一方含有對蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的堿基序列，因此，本發(fā)明的核酸還包括由對序列表的序列號1所述的氨基酸序列直接進(jìn)行編碼的堿基序列構(gòu)成的核酸或由其配對堿基序列構(gòu)成的核酸。
并且，本發(fā)明的核酸的特征在于，具有序列表的序列號2所述的堿基序列。
序列表的序列號2所述的堿基序列是由下述方法得到的DNA堿基序列，即，使用由上述微生物中提取出染色體DNA、根據(jù)氨基酮不對稱還原酶的氨基酸序列設(shè)計的合成低核苷酸引物，由PCR(Polymerasechain reaction聚合酶鏈反應(yīng))法得到的DNA堿基序列。
在此，對于由上述微生物中提取出染色體DNA的方法沒有特別的限制，例如，將培養(yǎng)而得的微生物(例如，紅串紅球菌MAK-34菌株)菌體破碎，由通常的方法對染色體DNA進(jìn)行離心分離，然后分解除去RNA，進(jìn)行蛋白質(zhì)脫除操作，對DNA進(jìn)行精制。關(guān)于這些操作，可參照“植物バイオテクノロジ一実験マニユアル農(nóng)村文化社、252頁”。而只要是屬于紅球菌屬的具有氨基酮不對稱還原酶產(chǎn)生能力的微生物，即可適用作DNA源。
另外，作為上述用于PCR的低核苷酸引物的制造方法，可采用公知的方法，根據(jù)氨基酮不對稱還原酶的氨基酸信息制作合成低核苷酸引物。
例如，可根據(jù)由上述微生物、且具有氨基酮不對稱還原酶產(chǎn)生能力的微生物得到的精制氨基酮不對稱還原酶的氨基酸信息，制作合成低核苷酸引物。一般地，根據(jù)氨基酸序列制作變性簡并引物等。引物的制作可采用本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行，例如，使用DNA自動合成裝置，由磷酸二酯法、磷酸三酯法、磷酰胺法等合成。具體來說，由在培養(yǎng)基中培養(yǎng)紅串紅球菌而得到的菌體進(jìn)行氨基酮不對稱還原酶的精制，根據(jù)需要，通過肽水解酶等形成片段，收集該酶的氨基酸序列的信息。由如此得到的氨基酸序列信息，制作優(yōu)選的合成低核苷酸引物。使用該引物，形成氨基酮不對稱還原酶的染色體DNA模版，進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)可使用該領(lǐng)域的公知方法或與其實質(zhì)上相同的方法或其改進(jìn)法進(jìn)行，例如可按照R.Saiki，et al.，Science，Vol.230，pp.1350(1985)；R.Saiki，et al.，Science，Vol.239，pp.487(1988)；Henry A.Erlich，PCR Technology，Stockton Press等中所述的方法進(jìn)行。反應(yīng)可利用例如市售的藥劑套件、試劑等進(jìn)行。
對所得的放大DNA片段進(jìn)行排序，確認(rèn)其含有與精制酶的氨基酸序列相同的序列，然后用同位素對其進(jìn)行標(biāo)識用作此后實驗等中的探試器。堿基序列的確定可采用雙脫氧序列分析法，例如M13雙脫氧序列分析法等、Maxam-Gilbert法(化學(xué)測序法)等，也可以使用市售排序套件，例如Taq雙引物環(huán)形排序套件等，或自動堿基序列確定裝置，例如熒光DNA定序器裝置等。以放射性同位素等標(biāo)記標(biāo)識物等時，可使用市售標(biāo)識套件，例如隨機(jī)待測DNA標(biāo)識套件(Boehringer Mannhaim)等進(jìn)行。
并且，本發(fā)明的氨基酮不對稱還原酶遺傳基因可采用例如下述方法進(jìn)行克隆。具體地說，遺傳基因重組技術(shù)可采用例如T.Maniatis et al.，“Molecular Cloning”，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，Cold Spring Harbor，N.T.(1989)；‘日本生化學(xué)會編’、“続生化學(xué)実験講座1、遺伝子研究法II”、東京化學(xué)同人(1986)；‘日本生化學(xué)會編’、“新生化學(xué)実験講座2、核酸III(組換えDNA技術(shù))”、東京化學(xué)同人(1992)；R.Wu ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.68，Academic Press，New York(1980)；R.Wu et al.ed.，“Methods inEnzymology”，Vol.100 & 101，Academic Press，New York(1983)；R.Wu etal.ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.153，154 & 155，Academic Press，New York(1987)等中所述的方法或這些文獻(xiàn)中所引用的文獻(xiàn)中所述的方法，或與這些方法實質(zhì)上同樣的方法或改進(jìn)的方法。這些方法也可在公知的方法基礎(chǔ)上進(jìn)行獨(dú)立的改變、改善，只要其與本發(fā)明的目的相符。
并且，本發(fā)明的核酸的特征在于，是對在嚴(yán)格的條件下與具有序列表的序列號2所述的堿基序列的核酸雜交、且具有氨基酮不對稱還原活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的核酸。
在此，本發(fā)明的“在嚴(yán)格條件下雜交”的意義是兩個DNA片段在Sambrook，J.等人的“大腸菌中克隆遺傳基因的發(fā)現(xiàn)(Expression ofcloned genes in E.coli)”(Molecular CloningAlaboratory manual(1989))Cold Spring harbor Laboratory Press，New York，USA，9.47-9.62和11.45-11.61中所述的雜交條件下相互雜交。
更具體地說，“嚴(yán)格條件”是指在溫度約45℃、6.0×SSC的條件下進(jìn)行的雜交。為了進(jìn)行嚴(yán)格選擇，可將洗凈工序中的鹽濃度選在例如由作為低嚴(yán)格度的約2.0×SSC、50℃到高嚴(yán)格度的約0.1×SSC、50℃的范圍內(nèi)。而且，可將洗凈工序的溫度由低嚴(yán)格度條件的室溫約22℃增大到高嚴(yán)格度條件的約65℃。
另外，本發(fā)明的核酸的特征在于，由序列表的序列號2所述的堿基序列構(gòu)成。
下面，對本發(fā)明的載體進(jìn)行說明。
本發(fā)明的載體的特征在于，含有上述核酸。
在此，作為加入上述核酸的胞質(zhì)遺傳體，只要是在遺傳基因工程學(xué)中常用的宿主細(xì)胞(例如，大腸菌、枯草菌等原核細(xì)胞宿主、酵母等真核細(xì)胞宿主)中可發(fā)現(xiàn)能被上述核酸編碼的蛋白質(zhì)的胞質(zhì)遺傳體，則無論何種胞質(zhì)遺傳體均可采用。在這樣的序列內(nèi)，也可以例如引入適于由所選宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的密碼、或設(shè)計限制酶的部位。并且，還可含有用于容易發(fā)現(xiàn)作為目的的遺傳基因的控制序列、促進(jìn)序列等、對結(jié)合作為目的的遺傳基因起作用的接頭、接合體等、及或?qū)δ涂咕匦缘冗M(jìn)行控制、或?qū)Υx進(jìn)行控制、并有益于菌體的揀選的序列等。
作為含于上述胞質(zhì)遺傳體中的啟動子(promoter)，在以大腸菌為宿主的胞質(zhì)遺傳體中，可以舉出，例如色氨酸(trp)啟動子、乳糖(lac)啟動子、色氨酸·乳糖(tac)啟動子、脂蛋白(lpp)啟動子、λ噬菌體PL啟動子，在以酵母為宿主的胞質(zhì)遺傳體中，可以舉出，例如GAL1、GAL10啟動子。
并且，作為以大腸菌為宿主的胞質(zhì)遺傳體，可以舉出，例如，pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pVC119、pSP64、pSP65、pTZ-18R/-18U、pTZ-19R/-19U、pGEM-3、pGEM-4、pGEM-3Z、pGEM-4Z、pGEM-5Zf(-)、pBluescript KSTM(Stratagene)。作為發(fā)現(xiàn)適于在大腸菌中的胞質(zhì)遺傳體載體，可以舉出pAS、pKK223(Pharmacia)、pMC1403、pMC931、pKC30等。
作為以酵母為宿主的胞質(zhì)遺傳體，可以舉出，例如，YIp型載體、YEp型載體、YRp型載體、YCp型載體、pGPD-2。
作為宿主細(xì)胞，在大腸菌的情況下，例如宿主細(xì)胞可以舉出來自大腸菌K12菌株的宿主細(xì)胞，具體可以舉出NM533 XL1-Blue、C600、DH1、HB101、JM109等。
在本發(fā)明的基因工程學(xué)方法中，可以使用作為用于對適于克隆該領(lǐng)域已知的或被廣泛應(yīng)用的限制酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA片段的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改性或改變的酶的DNA改性·分解酶、DNA聚合酶、末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶、DNA連接酶等。作為限制酶，可以舉出例如R.J.Roberts，NucleicAcids Res，Vol.13，r165(1985)；S.Linn et al.ed.Nucleases，p.109，ColdSpring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，New York，1982中所述的限制酶。作為逆轉(zhuǎn)錄酶，可以舉出例如來自莫洛尼鼠類白血病毒(mouseMoloney leukemia virus；MMLV)的逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)、來自鳥類成髓細(xì)胞型白血病病毒(avian myeloblastosis virus；AMV)的逆轉(zhuǎn)錄酶，特別是可優(yōu)選使用RNase H缺損體。作為DNA聚合酶，可以舉出例如大腸菌DNA聚合酶及作為其衍生物的克列諾片段、大腸菌噬菌體T4DNA聚合酶、大腸菌噬菌體T7DNA聚合酶、耐熱菌DNA聚合酶。
作為末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，可以舉出例如R.Wu et al.ed.，“Methods inEnzymology”，Vol.100，p.96，Academic Press.New York(1983)中所述的將脫氧核苷酸(dNMP)加成在3′-OH末端的脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TDTase)。
作為DNA改性·分解酶，例如可以舉出核酸外切酶、核酸內(nèi)切酶，具體來說，可以舉出，例如，蛇毒磷酸二酯酶、脾臟磷酸二酯酶、大腸菌DNA核酸外切酶I，大腸菌DNA核酸外切酶III、大腸菌DNA核酸外切酶VII、λ核酸外切酶、DNase I、核酸酶S1、細(xì)球菌(Micrococcus)核酸酶。
作為DNA連接酶，可以舉出，例如大腸菌DNA連接酶、T4DNA連接酶。
作為適于克隆DNA遺傳基因構(gòu)筑DNA基因庫的載體，可以舉出，例如胞質(zhì)遺傳體、λ噬菌體、粘粒、P1噬菌體、F因子、YAC。其中，優(yōu)選為來自λ噬菌體的載體，具體來說，可以舉出，例如卡隆(Charon)4A、卡隆21A、λgt10、λgt11、λDASH II、λFIX II、λEMBL3、λZAP IITM(Stratagene)。
通過將本發(fā)明的載體導(dǎo)入如上所述的宿主細(xì)胞中，就可以得到能夠產(chǎn)生本發(fā)明的氨基酮不對稱還原酶的微生物或動物細(xì)胞等的轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明也包括這種轉(zhuǎn)化子。
對于上述轉(zhuǎn)化方法沒有特別的限制，可以使用公知的方法進(jìn)行。例如，在氯化鈣、聚乙二醇等的存在下，使DNA與使用適當(dāng)?shù)募?xì)胞壁溶解酶調(diào)制而成的原質(zhì)化細(xì)胞接觸的方法；磷酸鈣法；脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、電穿孔法(例如，E.Neumann et al.，“EMBO J”，Vol.，pp.841(1982))、微注射法、由基因槍打入的方法。
并且，通過使用上述轉(zhuǎn)化子，就能夠?qū)⒈景l(fā)明的蛋白質(zhì)制成重組蛋白質(zhì)。本發(fā)明也包括這種重組蛋白質(zhì)的制造方法。
并且，在得到本發(fā)明的蛋白質(zhì)內(nèi)含物的情況下，也可以通過溶液化處理，例如，用鹽酸胍、尿素等變性劑，并根據(jù)需要在2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇等還原劑的存在下進(jìn)行處理，精制成活性酶。可以直接將產(chǎn)生酶的細(xì)胞作為酶而使用。
作為用于制造上述重組蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化子，可以舉出例如具有導(dǎo)入氨基酮不對稱還原酶基因的載體(pKK223-3)的大腸菌(JM109)MAK-EX41(BP-7452)。根據(jù)布達(dá)佩斯條約，MAK-EX41菌株是本發(fā)明的發(fā)明人等從自然界中分離出的新型微生物，自平成13年(公元2001年)2月15日(原始保存日)，以BP-7452的委托編號，保存在‘日本國茨城県つくば市東1丁目1番3號’(郵編305-8566)的‘経済產(chǎn)業(yè)省產(chǎn)業(yè)技術(shù)総合研究所生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(NIBH)’。
下面，說明本發(fā)明的旋光性氨基醇的制造方法。
本發(fā)明的旋光性氨基醇化合物的制造方法是一種旋光性氨基醇化合物的制造方法，其特征在于使權(quán)利要求1～3中任一項所述的蛋白質(zhì)或其部分肽或它們的鹽作用于用通式(1)表示的α-氨基酮化合物或其鹽的對映體混合物，通式(1) (式中，X表示選自鹵原子、低級烷基、可用保護(hù)基保護(hù)的羥基、硝基及磺?；械闹辽僖环N，可相同也可不同；n表示0～3的整數(shù)；R1表示低級烷基；R2、R3表示選自氫原子和低級烷基中的至少一種，可相同也可不同；*表示不對稱碳原子)生成用通式(2)表示的旋光性氨基醇化合物即具有所希望的旋光性的該化合物，通式(2) (式中，X、n、R1、R2、R3及*的意義同上所述)。
首先，對本發(fā)明所涉及的、以通式(1)表示的α-氨基酮進(jìn)行說明。
上述通式(1)所示的α-氨基酮化合物或其鹽的對映體混合物是具有如下所述結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，即，X表示選自鹵原子、低級烷基、可由保護(hù)基保護(hù)的羥基、硝基及磺?；械闹辽僖环N，可相同也可不同；n為0～3的整數(shù)；R1為低級烷基；R2、R3為選自氫原子和低級烷基中的至少一種，可相同也可不同；*表示不對稱碳原子。
下面，對上述α-氨基酮化合物中所含有的取代基X進(jìn)行說明。作為上述鹵原子來說，可以舉出氟原子、氯原子、溴原子及碘原子等。
并且，作為低級烷基來說，優(yōu)選為碳原子數(shù)為1～6的烷基，可以舉出甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基及己基等。這些基團(tuán)可以是直鏈狀或支鏈狀的任一種結(jié)構(gòu)。并且，還可以帶有氟原子或氯原子等鹵原子、羥基、烷基、氨基或烷氧基等作為取代基。
羥基也可以由保護(hù)基保護(hù)，作為這種保護(hù)基，可以舉出用水處理能除去的、用酸或弱堿能除去的、加氫能除去的、路易斯酸催化劑及硫脲等能除去的等保護(hù)基，在上述保護(hù)基中，包括可以帶有取代基的?；?、可以帶有取代基的甲硅烷基、烷氧烷基、可以有取代基的低級烷基、芐基、對甲氧基苯甲基、2，2，2-三氯乙氧基羰基、烯丙氧羰基及三苯甲基等。
另外，在上述?；校ㄒ阴；?、氯乙酰基、二氯乙酰基、三甲基乙?；⒈锦；皩ο趸锦；?。另外，還可帶有羥基、烷基、烷氧基、硝基及鹵素原子等取代基。在上述硅烷基中，包括三甲基硅烷基、叔丁基二甲硅烷基及三芳基硅烷基等。并且，還可帶有烷基、芳基、羥基、烷氧基、硝基及鹵原子等取代基作為取代基。在上述烷氧烷基中，包括甲氧基甲基及2-甲氧基乙氧基甲基等。上述低級烷基中包括碳原子數(shù)為1～6的烷基，可以舉出甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基及己基等。這些基團(tuán)可以是直鏈狀或支鏈狀的任一種結(jié)構(gòu)。并且，還可以帶有氟原子或氯原子等鹵原子、羥基、烷基、氨基及烷氧基等取代基。
并且，上述X可以是硝基或磺酰基，具體地可以舉出甲基磺?；?。
而且，上述X的數(shù)值n為0～3的整數(shù)，優(yōu)選為0。
并且，上述通式(I)中的R1表示低級烷基。這種低級烷基優(yōu)選為碳原子數(shù)為1～6的烷基，具體可以舉出甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基及己基等。這些基團(tuán)可以是直鏈狀或支鏈狀的任一種結(jié)構(gòu)。
R2、R3表示氫原子或低級烷基。在上述低級烷基中，包括碳原子數(shù)為1～6的烷基，可以舉出甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基及己基等。這些基團(tuán)可以是直鏈狀或支鏈狀的任一種結(jié)構(gòu)。
并且，就上述α-氨基酮化合物的鹽來說，可以舉出α-氨基酮化合物的鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽等無機(jī)酸鹽或者乙酸鹽、檸檬酸鹽等有機(jī)酸鹽。
上述α-氨基酮，很容易通過下述方法合成，即，將所對應(yīng)的1-苯基酮衍生物的α碳原子鹵化后，例如溴化，再將溴基等鹵素置換為胺(Ger.(East)11，332，Mar.12，1956)。
而且，本發(fā)明的旋光性氨基醇的制造方法是一種旋光性氨基醇化合物的制造方法，其特征在于使上述轉(zhuǎn)化子、選自屬于紅球菌屬的微生物及紅球菌(紅串)Rhodococcus(erythropolis)MAK-34中的任一種微生物作用于用通式(1)表示的α-氨基酮化合物或其鹽的對映體混合物，通式(1) (式中，X表示選自鹵原子、低級烷基、可用保護(hù)基保護(hù)的羥基、硝基及磺?；械闹辽僖环N，可相同也可不同；n表示0～3的整數(shù)；R1表示低級烷基；R2、R3表示選自氫原子和低級烷基中的至少一種，可相同也可不同；*表示不對稱碳原子)生成用通式(2)表示的旋光性氨基醇化合物即具有所希望的旋光性的該化合物，通式(2)
(式中，X、n、R1、R2、R3及*的意義同上所述)。
而本發(fā)明的蛋白質(zhì)為如上所述的蛋白質(zhì)。
即，本發(fā)明的蛋白質(zhì)是一種氨基酮不對稱還原酶，具有如下特征它具有通過作用于1-2-甲胺基苯丙酮而生成d-假麻黃堿的作用，且其具有以下的理化性質(zhì)基質(zhì)1-2-甲胺基苯丙酮；適合pH值pH8.1；適合溫度55℃；輔酶NADP；分子量約28500Da的四聚體均聚物。
并且，上述蛋白質(zhì)是具有序列表的序列號1中所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，是具有在上述蛋白質(zhì)的氨基酸序列中有一個或多個氨基酸缺損、插入、取代或加成的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
而在本發(fā)明的旋光性氨基醇的制造方法中，可以采用直接在反應(yīng)系統(tǒng)中添加上述轉(zhuǎn)化子、屬于紅球菌屬的微生物及紅球菌(紅串)Rhodococcus(erythropolis)MAK-34(FERM BP-7451號)以替代上述蛋白質(zhì)來制造旋光性氨基醇化合物。
下面，對本發(fā)明的以通式(2)表示的旋光性氨基醇進(jìn)行說明。
在上述通式(2)中，X、n、R1、R2、R3及*的意義與上述通式(1)相同。而且就具有所期望的光學(xué)活性的β-氨基醇來說，可以舉出(1S，2S)氨基醇。
就進(jìn)行上述反應(yīng)時的反應(yīng)條件來說，可以是，例如，收集在液態(tài)培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)而得的轉(zhuǎn)化菌，在得到的菌體中加入氨基酮水溶液(濃度0.1～10％)，將pH值調(diào)整到6～8，同時在溫度10～40℃下反應(yīng)數(shù)小時～1天。反應(yīng)結(jié)束后，將菌體分離，將反應(yīng)溶液中的生成物分離出來，這樣，就可以得到旋光性氨基醇。在此，同樣也可由轉(zhuǎn)化菌的處理菌體(干燥菌體、固定菌體等)或轉(zhuǎn)化菌得到的酶、或固定酶等進(jìn)行反應(yīng)。
并且，在本發(fā)明的旋光性氨基醇的制造方法中，在反應(yīng)體系中再加入由通式(3)所示的化合物、或其可用于制藥的鹽或溶劑化作用產(chǎn)物，就可以更高效率生成旋光性氨基醇，其中，在通式(3)中， 上述式中A表示結(jié)構(gòu)式(Y)或(Z)， (R4表示氫原子、可帶有取代基的碳原子數(shù)為1～3的烷基、與R8結(jié)合而成的碳原子數(shù)為5～10的烴環(huán)或與R8結(jié)合而成的含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架。) (R5表示氫原子、碳原子數(shù)為1～3的烷基、或與R6或R9結(jié)合而成的含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架；R6表示氫原子、可帶有取代基的碳原子數(shù)為1～3的烷基、與R8結(jié)合而成的碳原子數(shù)為5～10的烴環(huán)、與R5或R9結(jié)合而成的含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架；R7表示氫原子、可帶有取代基的碳原子數(shù)為1～6的烷基；R8表示氫原子、羧基、可帶有取代基的碳原子數(shù)為1～6的烷基、與R4結(jié)合而成的含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架、與R6結(jié)合而成的碳原子數(shù)為5～10的烴環(huán)；R9表示氫原子、可帶有取代基的碳原子數(shù)為1～6的烷基、可帶有取代基的碳原子數(shù)為1～6的烷氧基羰基、可帶有取代基的?；?、與R5或R6結(jié)合而成的含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架；R10表示氫原子或可進(jìn)行取代反應(yīng)的碳原子數(shù)為1～6的烷基。)在上述通式(3)中，作為碳原子數(shù)為1～3的烷基來說，可以是直鏈狀、支鏈狀中的任一種結(jié)構(gòu)，具體來說，可以舉出甲基、乙基、正丙基、異丙基等。并且，作為碳原子數(shù)為1～6的烷基來說，可以是直鏈狀、支鏈狀中的任一種結(jié)構(gòu)，具體來說，可以舉出甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基及己基等。作為碳原子數(shù)為5～10的烴環(huán)來說，可以舉出環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、環(huán)壬基及環(huán)癸基等。
在含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架中，作為雜原子來說，可以舉出氮原子、氧原子、硫原子等，特別優(yōu)選為氮原子、氧原子；就5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架來說，可以舉出吡咯烷、哌啶、咪唑烯、哌嗪、四氫呋喃、四氫吡喃、四氫噻吩及嗎啉等。
并且，就碳原子數(shù)為1～6的烷氧基羰基來說，可以舉出甲氧基羰基、乙氧基羰基、異丙氧基羰基、異丁氧基羰基及叔丁氧基羰基等。作為酰基來說，可以舉出甲?；⒁阴；?、丙?；?、丁?；?、異丁?；?、三甲基乙酰基、苯?；拔祯；?。當(dāng)上述碳原子數(shù)為1～3或碳原子數(shù)為1～6的烷基、碳原子數(shù)為1～6的烷氧基羰基或酰基有取代基時，對于取代基的種類、取代位置及取代基的數(shù)量沒有限制，作為取代基來說，可以舉出例如氟原子或氯原子等鹵原子、羥基、烷基、羧基、氨基、烷氧基、硝基及芳基等。另外，作為可用于制藥的鹽來說，可以舉出鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等無機(jī)酸鹽；醋酸鹽、檸檬酸鹽等有機(jī)酸鹽；鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、銨鹽等無機(jī)堿鹽及三乙胺、環(huán)己胺等有機(jī)堿鹽。
作為如通式(3)所示的化合物來說，可以舉出例如1-乙酰胺基-2-羥丙烷、1-甲胺基-2-羥丙烷、1-氨基-2-羰丙烷、1-氨基-2-羥基環(huán)戊烷、1-氨基-2，3-二羥丙烷、L-蘇氨酸、4-氨基-3-羥丁酸、1-氨基-2-羰基環(huán)己烷、嗎啉、3-羥基吡咯烷、3-羥基哌啶、2-氨甲基四氫呋喃、1-(2-羥丙基)氨基-2-羥丙烷、1-叔丁氧基羰基氨基-2-羥丙烷、2-氨基-3-羥丁烷、DL-絲氨酸、1-氨基-2-羥丙烷、1-氨基-2-羥丁烷、1-氨基-2-羥基環(huán)己烷。其中，在具有不對稱碳原子的化合物中，不特別限于所述化合物，即可以是旋光體，也可以是外消旋體。
通過將這些活性誘導(dǎo)劑添加到培養(yǎng)基中，誘發(fā)微生物的活性，其后的旋光性β-氨基醇的生成，比不添加活性誘導(dǎo)劑時更高效地進(jìn)行?；钚哉T導(dǎo)劑既可以各自單獨(dú)使用，也可以以多種誘導(dǎo)劑的混合物的形式使用。這樣的活性誘導(dǎo)劑的添加量，相對于培養(yǎng)基而言，優(yōu)選為0.01～10重量％。
如上所述，對將天然的氨基酮不對稱還原酶例如來自紅串紅球菌的天然的氨基酮不對稱還原酶或?qū)嵸|(zhì)上與其具有同等活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因結(jié)構(gòu)做出了明確的闡示，可期待在由含有對上述蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的堿基序列的DNA實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、使用該宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)的制造方法、及使用這些蛋白質(zhì)及宿主細(xì)胞制造旋光性氨基醇等方面有飛躍性的進(jìn)展，而且，有可能利用氨基酮不對稱還原酶的改性使酶活性得到飛躍性的提升。
實施例以下，根據(jù)實施例對本發(fā)明作更具體的說明。但是，本發(fā)明并不局限于下述實施例。
實施例1(氨基酮不對稱還原酶的精制)向含有組成(pH7.0)為葡萄糖1％、磷酸氫二鉀0.3％、硫酸鎂·7水合物0.02％、胨1.5％、氯化鈉0.2％、酵母提取液0.1％的5ml培養(yǎng)基的試管中植入紅串紅球菌MAK-34，在28℃下進(jìn)行3天的振蕩培養(yǎng)，將得到的試品接種到具有上述組成的500ml培養(yǎng)基中，在28℃下進(jìn)行3天的振蕩培養(yǎng)。將該前培養(yǎng)液接種到上述組成中添加有1-氨基-2-羥丙烷0.1％的501培養(yǎng)基中，在28℃下進(jìn)行2天的培養(yǎng)。
用離心分離機(jī)對上述培養(yǎng)液進(jìn)行處理，得到濕菌體3785g。在該菌體的1kg中，加入含有10％甘油、1mM氯化鎳、1mM煙酸的10mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液1000ml(pH8.5)，經(jīng)過90～100分鐘的超聲波粉碎后，再用超離心分離(33,000rpm，60分鐘)得到759ml的無細(xì)胞提取液。將該無細(xì)胞提取液對上述緩沖液作透析。將該酶液770ml注入DEAE-Sephacel柱(5.6×20cm)，利用氯化鈉的直線濃度梯度(0.15→0.8M)進(jìn)行洗提。將上述洗提出的酶活性部分173ml對上述緩沖液作透析。將該酶液173ml加入Mono Q HR 10/10柱(1.0×10cm)，利用氯化鈉的直線濃度梯度(0→0.6M)進(jìn)行洗提。將上述洗提出的酶活性部分28ml對不含有煙酸的上述緩沖液作透析。將該酶液28ml注入HiTrapBlue(1ml)，用含有10％甘油、1mM氯化鎳、2mM煙酸、1.0M氯化鈉、0.024％NADP+的10mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(pH8.5)洗凈交換柱，得到洗提出的酶活性部分8.7ml。在得到的酶液8.7ml中加入1.2M硫酸銨，然后將其注入至Phenyl Superose HR 5/5(0.5×5cm)，利用硫酸銨的直線濃度梯度(1.2→0M)進(jìn)行洗提。用Amicon(アミコン)YM10超濾洗提出的2.12ml酶活性部分，再將得到的酶濃縮液150μl注入至Superose 12 HR 10/30(1.0×30cm)，用含有10％甘油、1mM氯化鎳、1mM煙酸、0.15M氯化鈉的10mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(pH8.5)進(jìn)行洗提。將洗提出的酶活性部分1.45ml對含有10％甘油、1mM氯化鎳、1mM煙酸的10mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(pH8.5)作透析，結(jié)果，就能得到含有精制酶293μg的精制酶液。
這樣精制而得的氨基酮不對稱還原酶具有如下所述的性質(zhì)。
(1)基質(zhì)特性和酶活性將1M三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(pH8.0)10μl、16mMNAPD+25μl、精制酶液215μl保存在43℃，再加入1-氨基-2-羥丙烷1μl，生成氨基丙酮。根據(jù)340nm波長下的吸光度的變化測定隨著反應(yīng)NADPH的增減。酶活性的測定是以一分鐘內(nèi)1μmol的1-氨基-2-羥丙烷被氧化作為1單位(U)的酶活性。其結(jié)果，總活性為126mU，比活性為432mU/mg，活性收率為0.22％。
同樣，可以確認(rèn)，可作用于1-2-甲胺基苯丙酮、1-2-二甲胺基苯丙酮、1-氨基-2-丁酮。
(2)分子量用超濾法測定時約為105,000，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定時約為28,500(圖1)。由此推測，本發(fā)明的酶是由分子量約為28,500的4個亞單元構(gòu)成的四聚體蛋白質(zhì)。
(3)適合pH值將精制酶液10μL、水420μL、1M三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液20μL、16mM NADP+水溶液50μL混合，在45℃下培養(yǎng)，再加入2μL的1-氨基-2-丙醇進(jìn)行反應(yīng)。根據(jù)用分光光度計在340nm的吸光度隨時間的變化算出活性(圖2)。其結(jié)果，適合pH值為約8.1。
(4)適合溫度將精制酶液10μL、水420μL、0.1M PIPES緩沖溶液(pH7.5)20μL、16mM NADP+水溶液50μL混合，在各種溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，再加入2μL的1-氨基-2-丙醇進(jìn)行反應(yīng)。根據(jù)用分光光度計在340nm的吸光度隨時間的變化算出活性(圖3)。其結(jié)果，適合溫度為55℃。
(5)抑制劑、金屬離子的影響1mM濃度α，α′-聯(lián)吡啶、1mM濃度的鄰二氮雜菲、1mM濃度的EDTA都會抑制酶的活性。
實施例2(氨基酮不對稱還原酶基因的克隆和在大腸菌中的發(fā)現(xiàn))(1)精制酶的氨基酸部分序列確定將1nmol的凍結(jié)干燥的氨基酮不對稱還原酶(亞單元分子量約為28,500)在50μl的含有8M尿素的50mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(pH8.6)中溶解，在37℃下經(jīng)1小時得到改性。然后再添加50μl的50mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(pH8.6)，使尿素濃度為4M。再添加0.5μl(0.006nmol，E/S＝1/167)的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶(和光純藥)，在30℃下，經(jīng)6小時消化。將得到的消化肽由逆相柱(Amersham Biosciences)分取，用ABI公司476A蛋白質(zhì)序列測定儀對氨基酸序列進(jìn)行分析。結(jié)果如下。
①M(fèi)FNSIEGRSVVVTGGSK(N末端)(序列號3)②RLGEMTSEDMDSVFGVNVK (序列號4)③AAQMGFIRTAAIELAPK (序列號5)④XXILAVQAMMPXL (序列號6)⑤XITINAVLPGNVITEGLDGLGQEYLDQM(序列號7)上述肽的分取條件如下所示。
系統(tǒng)SMART system交換柱μRPC C2/C18 SC2.1/10流速100μl/min提取液A，0.1％TFAB，0.1％TFA/80％CH3CN洗提條件0-15min(100％A)→15-75min(100％A→100％B)的梯度提取。
柱溫室溫檢測波長214nm及280nm(2)染色體DNA的制作由離心分離機(jī)收集對數(shù)增殖期后期的菌體(MAK-34)。將得到的菌體懸濁于TES buffer(5mM Tris，1mM EDTA，2.5％蔗糖，pH8.0)。在該懸濁液中添加EDTA、水、溶菌酶和蛋白酶K，在37℃下，緩緩攪拌2.5小時。然后，在添加SDS后，對攪拌后的溶菌樣品依次用苯酚、苯酚/氯仿、氯仿進(jìn)行處理，以除去蛋白質(zhì)。在其中添加3M醋酸鈉1/10容積、乙醇2.5倍容積，用玻璃棒卷取DNA。然后，依次用70％、80％、90％的乙醇洗凈，將風(fēng)干后的DNA溶解在TE緩沖液(10mM Tris，1mM EDTA，pH7.8)中，將經(jīng)過核糖核酸酶(RNase)A處理過的樣品依次用苯酚、苯酚/氯仿、氯仿進(jìn)行處理，以除去蛋白質(zhì)。在其中添加3M醋酸鈉1/10容積、乙醇2.5倍容積，使DNA沉淀，此后，用70％的乙醇洗凈、風(fēng)干后溶解在TE緩沖液中，得到染色體DNA溶液(36ng/μ)。
(3)氨基酮不對稱還原酶基因的放大根據(jù)氨基酮不對稱還原酶的內(nèi)部肽的氨基酸序列(序列號3～7)，分別合成具有如下的堿基序列的、與N-末端氨基酸序列的有義鏈相對應(yīng)的有義引物MAK-Sensel(序列號8)和與內(nèi)部肽序列的反義鏈相對應(yīng)的反義引物MAK-Antil(序列號9)。MAK-Sensel和MAK-Antil均是簡并引物(degenerate primer)，在堿基序列中，y表示T或C，s表示C或G，h表示T或C或A，r表示A或G，m表示C或A，w表示A或T，n表示A或C或G或T。
MAK-Sensel
Met Phe Asn Ser Ile Glu Gly Arg(序列號3的一部分)ATG TTy AAy wsn ATh GAr GGn mG(序列號8)MAK-AntilMet Gln Asp Leu Tyr Glu Gln Gly Leu(序列號7的一部分)CAT yTG rTC nAr rTA yTC yTG nCC nA(序列號9)以氨基酮不對稱還原酶的染色體DNA為模版，在下述條件下進(jìn)行PCR。PCR的放大采用例如R.Sakai，et al.，Science，Vol.230，pp.1350(1985)；R.Sakai，et al.，Science，Vol.239，pp.487(1988)；PCR Technology，Stockton Press(1989)等中所述的方法實施。由PCR的放大，得到約0.6kb的放大DNA片段。
以下示出PCR的條件染色體DNA(36ng/μl) 5μl有義引物(49μM) 3μl反義引物(41μM) 3μldNTP(各2.5mM)4μlExTaq聚合酶(TAKARA) 0.3μlExTaq聚合酶緩沖液5μlH2O 29.7合計 50μl并且，溫度條件如下所示94℃/4分鐘94℃/1分鐘、50℃/1分鐘、72℃/1.5分鐘35循環(huán)72℃/10分鐘在確定所得的放大DNA片段的堿基序列后，改變氨基酸序列時，結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)與氨基酮不對稱還原酶的內(nèi)部肽的部分氨基酸序列相同的部分。
在確定堿基序列時，為了確定堿基序列不明區(qū)域的堿基序列，進(jìn)行反向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(inverse PCR)。反向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可如H.Ochman，et al.，Genetics，Vol.120，pp.621(1988)等中所述的方法進(jìn)行。
首先，對染色體DNA溶液進(jìn)行限制酶(BglII)處理、苯酚氯仿處理、乙醇沉淀而得到DNA片段，對得到的DNA片段用T4DNA連接酶(TAKARA)處理，然后進(jìn)行自身連接。然后，對其進(jìn)行苯酚氯仿處理、乙醇沉淀，將這樣得到的環(huán)狀化DNA作為模版，使用由堿基序列已知的部分設(shè)計的有義引物(IPCR-S1)和反義引物(IPCR-A1)，在下述條件下進(jìn)行PCR。由PCR放大，得到約2kb放大的DNA片段。
IPCR-A1(向上流動流)AATACCCGGACCATTCCCAAGCCGAT(序列號10)IPCR-S1(向下流動流)TCGAAACTTCTGGGCGTGGAAGGGTT(序列號11)PCR條件如下所示環(huán)狀化DNA(500ng)有義引物(100μM) 0.5μl反義引物(100μM) 0.5μldNTP(各2.5mM)4μlExTaq聚合酶(TAKARA) 0.5μlExTaq聚合酶緩沖液5μlH2O 39.5μl合計 50μl并且，PCR時的溫度條件如下所示。
94℃/4分鐘94℃/1分鐘、60℃/1分鐘、72℃/4分鐘30循環(huán)72℃/10分鐘確定所得的放大DNA片段的堿基序列后，可確認(rèn)含有原來的堿基序列、由780bp構(gòu)成的ORF。由此判明，氨基酸序列變換的結(jié)果是包含氨基酮不對稱還原酶基因的全長(序列號1)。
(4)氨基酮不對稱還原酶基因在大腸菌中的發(fā)現(xiàn)根據(jù)如上所述而闡明的氨基酮不對稱還原酶基因的堿基序列，設(shè)計附加有限制酶部位的引物。下面表示其序列。
ExSGATGAATTCCAAATGTTCAACTCCATTGA(序列號12)EcoR I StartEsA
TGAAGCTTTCGTCGCTTGTCTTACAGTTC(序列號13)HindIII Stop使用這些引物，以染色體DNA為模版，在下述條件下進(jìn)行PCR。其結(jié)果是，得到約0.8kb的放大DNA片段。PCR的條件如下所示。
染色體DNA(36ng/μl) 5μl(180ng)有義引物(100μM) 0.5μl反義引物(100μM) 0.5μldNTP(各2.5mM)8μlLA-Taq聚合酶(TAKARA) 0.5μlLA-Taq聚合酶緩沖液 5μlMg2+5μlH2O 25.5μl合計 50μlPCR時的溫度條件如下所示。
94℃/4分鐘94℃/1分鐘、60℃/1分鐘、72℃/1.5分鐘25循環(huán)72℃/10分鐘由于這樣得到的PCR產(chǎn)物的兩端分別有EcoRI和HindIII的限制酶部位，因此，在由QIA quick PCR Purification Kit(QIAGEN)進(jìn)行精制后，進(jìn)行限制酶(EcoRI、HindIII)處理。在瓊脂糖電泳后，對經(jīng)過處理的產(chǎn)物進(jìn)行染色體帶的切出，用GFX PCR DNA，Gel BandPurification Kit進(jìn)行精制。將其與完成限制酶(EcoR I、HindIII)處理的胞質(zhì)遺傳體pKK223-3進(jìn)行連接反應(yīng)(Ligation Kit，TAKARA)，構(gòu)筑發(fā)現(xiàn)載體。然后，使該載體依照“Molecular Cloning”second ed.，1989，ed.by J.Sambrook et al.，Cold Spring Habor Laboratory Press中所述方法，對E.coli JM 109的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，完成轉(zhuǎn)化操作。另外，該轉(zhuǎn)化子通過菌落PCR反應(yīng)選擇具有抗安比西林性的菌株，轉(zhuǎn)化處理按照氯化鈣法進(jìn)行。
用含有胰胨1％、酵母提取液0.5％、氯化鈉0.5％、安比西林100μg/mL、IPTG 1mM的500mL培養(yǎng)液在37℃下，將該重組大腸菌MAK-EX41振蕩培養(yǎng)16小時。將得到的菌體用水洗凈，然后利用超聲波處理除去不溶物，調(diào)制成10mL粗酶提取液。在該粗酶提取液的0.1mL中，加入并混合2-甲胺基-1-苯丙酮鹽酸鹽1mg、水、0.02mL的1M三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液pH7.5、葡萄糖10mg、葡糖脫氫酶0.1mg、NADP+0.1mg，制成1mL的反應(yīng)溶液，在37℃下，進(jìn)行24小時的反應(yīng)。反應(yīng)后，由反應(yīng)溶液中除去不溶物，將上清液加入至HPLC(μBondapakphenyl Waters公司制，直徑4mm，長300mm，洗提液為0.05M磷酸鈉緩沖溶液(含乙腈7％)，pH6.5，流速0.8mL/分鐘，檢測光波長UV220nm)進(jìn)行分析，結(jié)果確認(rèn)生成了0.5mg的假麻黃堿。再經(jīng)HPLC(スミキラルAGP，住化分析中心社制，直徑4mm，長150mm，洗提液為0.03M磷酸鈉緩沖溶液，pH7，流速0.5mL/分鐘，檢測光波長UV220nm)分析，結(jié)果可以確認(rèn)，所得到的假麻黃堿都是d-假麻黃堿。
保有將上述氨基酮不對稱還原酶的基因?qū)氲妮d體的大腸菌MAK-EX41于平成13年(公元2001年)2月15日(原始保存日)，以FERMBP-7452的委托編號，保存在‘獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)総合研究所特許生物寄託セんタ一( 305-8566日本國茨城県つくば市1丁目1番地1中央第6)’。
實施例3(d-(1S，2S)-假麻黃堿的生成)在含有葡萄糖1％、胨0.5％、酵母提取液0.3％的5ml培養(yǎng)基中植入表1所示各微生物，在30℃下進(jìn)行48小時的振蕩培養(yǎng)。在對培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離而得到菌體后，將菌體放入試管，然后在其中加入0.1M磷酸鈉緩沖溶液(pH7.0)1ml并懸濁化。再在該懸濁液中加入d1-2-甲胺基-苯丙酮鹽酸鹽1mg，在30℃下振蕩24小時以進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液離心分離而除去菌體，將上清液加入HPLC，得到旋光性假麻黃堿(μBondapakphenyl Waters公司制，直徑4mm，長300mm，洗提液為0.05M磷酸鈉緩沖溶液(含乙腈7％)，pH5.0，流速0.8ml/分鐘，檢測光波長UV220nm)。
絕對配置和光學(xué)純度用HPLC(住化分析中心制カラムスミキラルAGP，直徑4mm，長150mm，0.03M磷酸鈉緩沖溶液，pH7.0，流速0.5ml/分鐘，檢測光波長220nm)測定。其結(jié)果如表1和表2所示，僅選擇性地得到d-假麻黃堿。
生成的d-假麻黃堿的光學(xué)純度及生成量如表1和表2所示。以下的生成量都換算成鹽酸鹽的量來表示。
表1

表2

實施例4在含有葡萄糖1％、胨0.5％、酵母提取液0.3％的培養(yǎng)基中植入摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)IFO 3848，在30℃、需氧環(huán)境下進(jìn)行48小時振蕩培養(yǎng)。將該培養(yǎng)液5ml離心分離得到菌體，然后風(fēng)干，將得到的干燥菌體放入1ml的0.05M三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(pH7.5)中懸濁化。在上述干燥菌體懸濁液中加入葡萄糖50mg、葡糖脫氫酶0.2mg、NADP 0.6mg、NAD 0.6mg、d 1-2-甲胺基-苯丙酮鹽酸鹽10mg，在28℃、300rpm條件下反復(fù)振蕩。反應(yīng)48小時后，與上述實施例3相同，利用HPLC測定反應(yīng)液的假麻黃堿生成量和光學(xué)純度。
其結(jié)果是，生成0.79mg/ml的d-假麻黃堿鹽酸鹽，其光學(xué)純度為100％。
實施例5(添加誘導(dǎo)劑所造成的影響(1))在培養(yǎng)基1(表3)中，添加5ml的1-氨基-2-羥基丙烷到試管中，使其濃度為5g/l，用硅橡膠塞封閉，在高壓鍋內(nèi)、121℃的條件下進(jìn)行30分鐘的殺菌。在該培養(yǎng)基中和沒有添加誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基中，分別植入紅串紅球菌MAK-34菌株，在30℃、300rpm條件下進(jìn)行48小時振蕩培養(yǎng)。將培養(yǎng)液0.5ml在10000G條件下，進(jìn)行20分鐘離心分離，除去上清液后得到菌體，再在其中加水懸濁化，從而得到均勻的懸濁液。在此懸濁液中加入水、緩沖溶液、d 1-2-甲胺基-苯丙酮鹽酸鹽10mg，取出上述混合液1ml加入試管中，在30℃、150rpm條件下進(jìn)行12小時振蕩反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，利用離心分離除去菌體，將上清液加入至HPLC，測定假麻黃堿的生成量。(HPLC條件μBondapakphenyl Waters公司制，直徑4mm，長300mm，洗提液為0.05M磷酸鈉緩沖溶液(含乙腈7％)，pH6.5，流速0.8ml/分鐘，檢測光波長UV220nm)其結(jié)果如表4所示，添加誘導(dǎo)劑培養(yǎng)后的假麻黃堿的生成量，與沒添加誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)相比顯著增加。
表3

表4

實施例6(添加誘導(dǎo)劑所造成的影響(2))除使用表4所示的微生物及培養(yǎng)基以代替實施例5的微生物之外，其它方面與實施例5一樣地進(jìn)行培養(yǎng)、反應(yīng)。菌體的分離，通過離心分離或由培養(yǎng)液過濾(No.(3)及No.(6)～No.(13))進(jìn)行。其結(jié)果如表4所示，添加1-氨基-2-羥丙烷進(jìn)行培養(yǎng)的情況下的d-假麻黃堿的生成量與沒有添加誘導(dǎo)劑的情況相比，明顯增大。
實施例7(添加誘導(dǎo)劑所造成的影響(3))除使用1-氨基-2-羥丁烷代替實施例5的1-氨基-2-羥丙烷以外，其它與實施例5一樣進(jìn)行培養(yǎng)、反應(yīng)。菌體的分離，通過離心分離或由培養(yǎng)液過濾來進(jìn)行。其結(jié)果如表5所示，添加有化合物進(jìn)行培養(yǎng)的情況下的假麻黃堿的生成量與沒有添加化合物的情況相比，明顯增大。
表5

實施例8(添加誘導(dǎo)劑所造成的影響(4))除使用1-氨基-2-環(huán)己烷代替實施例5的1-氨基-2-羥丙烷以外，其它與實施例5一樣進(jìn)行培養(yǎng)、反應(yīng)。菌體的分離，通過離心分離或由培養(yǎng)液過濾來進(jìn)行。其結(jié)果如表6所示，添加有化合物進(jìn)行培養(yǎng)的情況下的假麻黃堿的生成量與沒有添加化合物的情況相比，明顯增大。
表6

實施例9(添加誘導(dǎo)劑所造成的影響(5))在含有蔗糖1.0％、玉米浸漬液0.5％、磷酸二氫鉀0.1％、磷酸氫二鉀0.3％、對氨基安息香酸0.01％、各種誘導(dǎo)劑0.1％的pH7.0的培養(yǎng)基5ml中植入紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)MAK-34，在30℃條件下進(jìn)行48小時振蕩培養(yǎng)。對培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離而得到菌體后，放入試管，在該試管中加入0.2M磷酸鈉緩沖液(pH7.0)1.0ml而懸濁化。然后在該懸濁液中加入d 1-2-甲胺基苯丙酮鹽酸鹽10mg、葡萄糖20mg，在30℃條件下進(jìn)行16小時的振蕩反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，對反應(yīng)液進(jìn)行離心分離以除去菌體，將上清液加入至HPLC，得到旋光性假麻黃堿(μBondaspherephenyl Waters公司制，直徑4mm，長150mm，洗提液為0.05M磷酸鈉緩沖溶液(含乙腈7％、pH6.5)，流速0.8ml/分鐘，檢測光波長220nm)。其生成量如表7所示，與沒有添加誘導(dǎo)劑的情況相比，明顯地顯示出高的值。
表7

產(chǎn)業(yè)上的可利用性如上所述，根據(jù)本發(fā)明的氨基酮不對稱還原酶、蛋白質(zhì)、核酸及微生物，能夠提供一種具有可以以高收率、高選擇性由α-氨基酮化合物或其鹽的對映體混合物制造具有所希望的旋光性的β-氨基醇的作用的氨基酮不對稱還原酶。并且，還能提供一種具有氨基酮不對稱還原活性的蛋白質(zhì)、對上述蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的核酸、可由上述核酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子、使用上述轉(zhuǎn)化子制造蛋白質(zhì)的方法及上述轉(zhuǎn)化子或上述蛋白質(zhì)的用途。而且，能夠提供可由α-氨基酮化合物或其鹽的對映體混合物高效地轉(zhuǎn)化成旋光性β-氨基醇的新型微生物。
序列表<110>第一精密化學(xué)股份有限公司<120>氨基酮不對稱還原酶及其核酸<130>FP02-0052-00<140>
<141>
<150>JP2001-58698<151>2001年3月2日<160>13<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>259<212>PRT<213>紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)<400>1Met Phe Asn Ser Ile Glu Gly Arg Ser Val Val Val Thr Gly Gly Ser1 5 10 15Lys Gly Ile Gly Leu Gly Met Val Arg Val Phe Ala Arg Ala Gly Ala20 25 30Asn Val Leu Met Thr Ala Arg Asp Ala Leu Thr Leu Glu Arg Ala Ala35 40 45Glu Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Ala Val Ser Thr Leu Gln Val Asp50 55 60
Val Thr Asn Pro Asp Ser Leu Ala Gly Met Ala Glu Val Ala Ala Glu65 70 75 80Arg His Gly Gly Ile Asp Val Leu Cys Ala Asn Ala Gly Ile Phe Pro85 90 95Ser Lys Arg Leu Gly Glu Met Thr Ser Glu Asp Met Asp Ser Val Phe100 105 110Gly Val Asn Val Lys Gly Thr Ile His Ala Val Gln Ala Cys Met Pro115 120 125Trp Leu Glu Thr Ser Gly Arg Gly Arg Val Val Val Thr Ser Ser Ile130 135 140Thr Gly Pro Val Thr Gly Tyr Pro Gly Trp Ser His Tyr Gly Ala Ser145 150 155 160Lys Ala Ala Gln Met Gly Phe Ile Arg Thr Ala Ala Ile Glu Leu Ala165 170 175Pro Lys Arg Ile Thr Ile Asn Ala Val Leu Pro Gly Asn Val Ile Thr180 185 190Glu Gly Leu Asp Gly Leu Gly Gln Glu Tyr Leu Asp Gln Met Ala Ser195 200 205Ser Val Pro Ala Gly Ser Leu Gly Ser Val Glu Asp Ile Ala Asn Ala210 215 220Ala Leu Phe Phe Ala Leu Asp Glu Ala Ala Tyr Ile Thr Gly Gln Ser225 230 235 240Leu Ile Val Asp Gly Gly Gln Val Leu Pro Glu Ser Ala Met Ala Leu245 250 255
Gly Glu Leu<210>2<211>780<212>DNA<213>紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)<400>2atgttcaact ccattgaagg tcgttcggtc gtcgtcaccg gcggtagcaa gggcatcggc 60ttgggaatgg tccgggtatt cgcgcgcgca ggggccaatg tgctcatgac cgcgcgagac 120gctctgactc tcgaacgtgc cgcggagggt ttgaatggtc ttcctggcgc ggtctccaca 180cttcaagtcg acgtcacgaa tcctgactcc ttggccggta tggcagaagt tgcggccgag 240cgacacggag gaatcgacgt gttgtgcgcg aacgctggga tcttcccgtc gaagcggttg 300ggagagatga cctcggagga catggacagc gtattcggcg tcaacgtcaa ggggaccatc 360cacgccgtgc aagcgtgcat gccgtggctc gaaacttctg ggcgtggaag ggttgtcgtg 420acatcgtcga tcaccggacc cgtaaccggt tatccgggtt ggtcgcacta cggggcaagc 480aaggctgcgc agatgggctt catccgaact gctgccattg agttggcacc gaagaggatc 540acgatcaacg ccgtcttgcc cggcaacgtg atcaccgagg ggctcgacgg tttgggacag 600gaatatctcg accaaatggc gtccagcgtc ccggccggca gtctgggcag cgtcgaggat 660atcgccaatg ccgcactgtt ctttgcactg gacgaagccg cgtacatcac cggtcagtcg 720ttgatcgtag atggtggaca ggttcttccg gagtcggcga tggcgctcgg cgaactgtaa 780<210>3<211>17<212>PRT<213>紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)<400>3Met Phe Asn Ser Ile Glu Gly Arg Ser Val Val Val Thr Gly Gly Ser1 5 10 15Lys
<210>4<211>19<212>PRT<213>紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)<400>4Arg Leu Gly Glu Met Thr Ser Glu Asp Met Asp Ser Val Phe Gly Val1 5 10 15Asn Val Lys<210>5<211>17<212>PRT<213>紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)<400>5Ala Ala Gln Met Gly Phe Ile Arg Thr Ala Ala Ile Glu Leu Ala Pro1 5 10 15Lys<210>6<211>13<212>PRT<213>紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)<400>6Xaa Xaa Ile Leu Ala Val Gln Ala Met Met Pro Xaa Leu1 5 10
<210>7<211>28<212>PRT<213>紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)<400>7Xaa Ile Thr Ile Asn Ala Val Leu Pro Gly Asn Val Ile Thr Glu Gly1 5 10 15Leu Asp Gly Leu Gly Gln Glu Tyr Leu Asp Gln Met20 25<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成多核苷酸簡并引物<400>8atgttyaayw snathgargg nmg23<210>9<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成多核苷酸簡并引物<400>9catytgrtcn arrtaytcyt gnccna26<210>10<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成多核苷酸<400>10aatacccgga ccattcccaa gccgat 26<210>11<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成多核苷酸<400>11tcgaaacttc tgggcgtgga agggtt 26<210>12<211>29<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成多核苷酸<400>12gatgaattcc aaatgttcaa ctccattga 29<210>13<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成多核苷酸<400>13tgaagctttc gtcgcttgtc ttacagttc 29
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，其特征在于其為具有通過作用于1-2-甲胺基苯丙酮生成d-假麻黃堿的作用、且具有以下的理化性質(zhì)的氨基酮不對稱還原酶基質(zhì)1-2-甲胺基苯丙酮；適合pH值pH8.1；適合溫度55℃；輔酶NADP；分子量約28500Da四聚體均聚物。
2.一種具有序列表的序列號1中所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
3.一種具有在序列表的序列號1中所述的氨基酸序列中有一個或多個氨基酸缺損、插入、取代或加成的氨基酸序列的、且具有氨基酮不對稱還原活性的蛋白質(zhì)或它們的部分肽。
4.一種如權(quán)利要求1～3中任一項所述的蛋白質(zhì)的鹽、或所述蛋白質(zhì)的部分肽的鹽。
5.一種對具有序列表的序列號1所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的核酸。
6.一種具有序列表的序列號2所述的堿基序列的核酸。
7.一種對在嚴(yán)格的條件下與權(quán)利要求5所述的核酸雜交、且具有氨基酮不對稱還原活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的核酸。
8.一種由序列表的序列號2所述的堿基序列的一部分構(gòu)成的核酸。
9.一種含有權(quán)利要求5～8中任一項所述的核酸的載體。
10.一種保有權(quán)利要求9所述的載體的轉(zhuǎn)化子。
11.一種在權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)化子中發(fā)現(xiàn)并得到的蛋白質(zhì)或其部分肽。
12.一種氨基酮不對稱還原酶或其部分肽的制造方法，其特征在于包括在可使權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)化子增殖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)工序；由所述培養(yǎng)工序中得到的該轉(zhuǎn)化子精制氨基酮不對稱還原酶或其部分肽的精制工序。
13.一種氨基酮不對稱還原酶或其部分肽的制造方法，其特征在于包括對選自屬于摩根氏菌屬(Morganella)、微桿菌屬(Microbacterium)、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)、毛霉菌屬(Mucor)、犁頭霉菌屬(Absidia)、曲霉菌屬(Aspergillus)、青霉菌屬(Penicillium)、灰樹花菌屬(Grifola)、散子囊菌屬(Eurotium)、靈芝菌屬(Ganoderma)、肉座菌屬(Hypocrea)、螺桿狀菌屬(Helicostylum)、輪枝菌屬(Verticillium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、念球菌屬(Tritirachium)、被孢霉菌屬(Mortierella)、蜜環(huán)菌屬(Armillariella)、銹腐菌屬(Cylindrocarpon)、克雷伯菌屬(Klebsiella)、金桿菌屬(Aureobacterium)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、擲孢酵母菌屬(Sporobolomyces)、Sporidiobolus菌屬、紅球菌屬(Rhodococcus)的微生物中的一種微生物、且具有可還原1-2-甲胺基苯丙酮生成d-假麻黃堿能力的微生物進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)工序；由所述培養(yǎng)工序中得到的微生物對權(quán)利要求1～3中任一項所述的蛋白質(zhì)或其部分肽進(jìn)行精制的精制工序。
14.一種屬于紅球菌屬Rhodococcus、且具有還原1-2-甲胺基苯丙酮生成d-假麻黃堿能力的微生物。
15.如權(quán)利要求14所述的微生物，其特征在于所述微生物是紅球菌(紅串)Rhodococcus(erythropolis)MAK-34菌株(FERM BP-7451號)。
16.一種旋光性氨基醇化合物的制造方法，其特征在于使權(quán)利要求1～3中任一項所述的蛋白質(zhì)或其部分肽或它們的鹽作用于用通式(1)表示的α-氨基酮化合物或其鹽的對映體混合物，通式(1) (式中，X表示選自鹵原子、低級烷基、可用保護(hù)基保護(hù)的羥基、硝基及磺?；械闹辽僖环N，可相同也可不同；n表示0～3的整數(shù)；R1表示低級烷基；R2、R3表示選自氫原子和低級烷基中的至少一種，可相同也可不同；*表示不對稱碳原子)生成用通式(2)表示的旋光性氨基醇化合物即具有所希望的旋光性的該化合物，通式(2) (式中，X、n、R1、R2、R3及*的意義同上所述)。
17.一種旋光性氨基醇化合物的制造方法，其特征在于使權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)化子、選自權(quán)利要求14所述的微生物及權(quán)利要求15所述的微生物中的任一種微生物作用于用通式(1)表示的α-氨基酮化合物或其鹽的對映體混合物，通式(1) (式中，X表示選自鹵原子、低級烷基、可用保護(hù)基保護(hù)的羥基、硝基及磺?；械闹辽僖环N，可相同也可不同；n表示0～3的整數(shù)；R1表示低級烷基；R2、R3表示選自氫原子和低級烷基中的至少一種，可相同也可不同；*表示不對稱碳原子)生成用通式(2)表示的旋光性氨基醇化合物即具有所希望的旋光性的該化合物，通式(2) (式中，X、n、R1、R2、R3及*的意義同上所述)。
18.如權(quán)利要求17所述的旋光性氨基醇的制造方法，其特征在于再添加用通式(3)表示的化合物、或其可用于制藥的鹽或溶劑化作用產(chǎn)物，生成旋光性氨基醇，通式(3) (A表示結(jié)構(gòu)式(Y)或(Z)， (R4表示氫原子、可帶有取代基的碳原子數(shù)為1～3的烷基、與R8結(jié)合而成的碳原子數(shù)為5～10的烴環(huán)或與R8結(jié)合而成的含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架) (R5表示氫原子、碳原子數(shù)為1～3的烷基、或與R6或R9結(jié)合而成的含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架；R6表示氫原子、可帶有取代基的碳原子數(shù)為1～3的烷基、與R8結(jié)合而成的碳原子數(shù)為5～10的烴環(huán)、與R5或R9結(jié)合而成的含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架；R7表示氫原子、可帶有取代基的碳原子數(shù)為1～6的烷基)R8表示氫原子、羧基、可帶有取代基的碳原子數(shù)為1～6的烷基、與R4結(jié)合而成的含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架、與R6結(jié)合而成的碳原子數(shù)為5～10的烴環(huán)；R9表示氫原子、可帶有取代基的碳原子數(shù)為1～6的烷基、可帶有取代基的碳原子數(shù)為1～6的烷氧基羰基、可帶有取代基的?；⑴cR5或R6結(jié)合而成的含有1～3個雜原子的5～8元環(huán)的雜環(huán)狀骨架；R10表示氫原子或可進(jìn)行取代反應(yīng)的碳原子數(shù)為1～6的烷基)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)及對上述蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的核酸，其為具有通過作用于1－2－甲胺基苯丙酮生成d－假麻黃堿的作用、且具有以下的理化性質(zhì)的氨基酮不對稱還原酶基質(zhì)1－2－甲胺基苯丙酮；適合pH值pH 8.1；適合溫度55℃；輔酶NADP；分子量約28500Da四聚體均聚物。
文檔編號C12N9/04GK1610745SQ0280882
公開日2005年4月27日 申請日期2002年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月2日
發(fā)明者坂本惠司, 北伸二, 津崎和也, 森川忠則, 清水昌, 片岡道彥 申請人:第一精密化學(xué)股份有限公司