專利名稱：一種用于生物發(fā)酵系統(tǒng)的產(chǎn)物收取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種用于生物發(fā)酵的產(chǎn)物收取方法。更為具體地，本發(fā)明為一種方法，該方法用于從生物發(fā)酵容器中取出培養(yǎng)液，通過層析從培養(yǎng)液中分離生物發(fā)酵產(chǎn)物并且將剩余的培養(yǎng)液成分回送至該生物發(fā)酵容器。
背景技術(shù)：
生物發(fā)酵是用于可再生資源的生物催化轉(zhuǎn)換的重要技術(shù)。通過生物發(fā)酵的手段所產(chǎn)生的微生物產(chǎn)物包括氨基酸、乙醇和抗生素。少數(shù)化學(xué)物質(zhì)的生物發(fā)酵生產(chǎn)以及商業(yè)化已經(jīng)有所報(bào)道(W.Crueger and A.Crueger，BiotechnologyA Textbook of Industrial Microbiology，Sinauer AssociatesSunderland，MA.，pp 124-174(1990)；B.Atkinson and F.Mavituna，Biochemical Engineering andBiotechnology Handbook，2nded.；Stockton PressNew York，pp243-364(1991))。然而，同合成方法相比較，生物催化方法經(jīng)常受困于幾個(gè)眾所周知的限制。這些限制包括1)相對(duì)較小的產(chǎn)品范圍；2)低產(chǎn)量、滴度以及產(chǎn)率；以及3)從水溶液中回收和純化產(chǎn)物的難度。
一種生物催化方法的產(chǎn)率可能受到積累的產(chǎn)物多種方式的干擾。在生物化學(xué)水平，產(chǎn)物積累的反饋性抑制可由于抑制效應(yīng)(可能是可恢復(fù)的)或者毒性效應(yīng)(可最終殺死微生物體或者使其生物催化成分不可逆地失活)而限制產(chǎn)率。在細(xì)胞生理學(xué)上，積累的產(chǎn)物可對(duì)生長速率產(chǎn)生不良影響。化學(xué)和物理影響(副產(chǎn)物的積累；pH改變)亦可干擾該生物催化劑的產(chǎn)率。
由于1)由于同該生物催化劑進(jìn)一步作用而降解，2)環(huán)境條件或者3)從該系統(tǒng)中不受控制地除去(即，通過蒸發(fā))，生物催化方法的產(chǎn)物還有可能丟失。
盡管代謝工程本身可解決其中一些限制，整合入的上游代謝工程(即，產(chǎn)物合成)以及下游生物加工工程(即，產(chǎn)物的分離和方法設(shè)計(jì))對(duì)于從工業(yè)生物發(fā)酵中實(shí)現(xiàn)巨大價(jià)值是至關(guān)重要的。
產(chǎn)物原位收取(ISPR)方法是一個(gè)技術(shù)家族，該方法中，在該生物發(fā)酵過程的至少一部分時(shí)間，處于生物發(fā)酵(生物發(fā)酵產(chǎn)物或者其它的特定副產(chǎn)物)中的某種靶分子在合成時(shí)被取出(綜述見Chauhan etal.，Chem Tech 2726-30(1997)；以及Freeman et al.，Biotechnology111007-1012(1993))。由于包括基于不同的揮發(fā)性、溶解度、大小、密度、電荷或者特定元件(或者這些方法的組合)在內(nèi)的多種分離原理可被用于ISPR，因此ISPR技術(shù)具有廣泛的應(yīng)用性。多種ISPR技術(shù)已被引入生物催化方法，這些方法基于Amberlite XAD樹脂，連續(xù)沉淀，反應(yīng)性溶劑萃取，繼之以同步萃取和回萃取(back extraction)，以及一種抽提性中空纖維膜反應(yīng)器(Lye et al.，Trends inBiotechnology 17395-402(1999))。
ISPR在生物發(fā)酵中的成功應(yīng)用的一個(gè)關(guān)鍵在于如何以提高產(chǎn)率的省時(shí)且價(jià)格低廉方式將分離技術(shù)應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)方法。一個(gè)顯著地影響生物發(fā)酵回收的產(chǎn)率和純化系統(tǒng)的生物工程因素是方法操作的模式。該領(lǐng)域的技術(shù)人員明了，對(duì)于一種純粹的分批工藝，依賴連續(xù)分離的方法較為省時(shí)和廉價(jià)。
U.S.6,114,157展示了高效廉價(jià)地使用ISPR技術(shù)所面臨的挑戰(zhàn)。該專利描述了一種用于提高4-羥苯甲酸(PHB)的生物發(fā)酵總產(chǎn)量的ISPR方法。經(jīng)遺傳工程處理的大腸桿菌在該生物發(fā)酵期間產(chǎn)生PHB。對(duì)于該生物發(fā)酵的至少一部分，該生物發(fā)酵培養(yǎng)液以向上的方向通過了一個(gè)陰離子交換珠床。除盡了PHB的生物發(fā)酵培養(yǎng)基隨后返回該生物發(fā)酵容器。該過程每十分種使全部體積的培養(yǎng)物通過珠循環(huán)一次，無需更換培養(yǎng)基。當(dāng)該陰離子交換珠飽和，終止該生物發(fā)酵，并且從該樹脂中以酸性乙醇或者含氯化鈉的水/乙醇混合物提取PHB。
盡管U.S.6,114,157披露了生物發(fā)酵產(chǎn)物的ISPR分離，培養(yǎng)基重復(fù)循環(huán)返回該生物發(fā)酵容器，但是該方法的效率受限于其依賴于膨脹床吸收。膨脹床吸收并非一個(gè)連續(xù)的過程，該過程需要“上樣和洗脫”的策略，這意味著更多的時(shí)間以通過多步驟過程進(jìn)行分離產(chǎn)物。因此該方法對(duì)于大規(guī)模的商業(yè)應(yīng)用并不省時(shí)和廉價(jià)。例如，吸收珠在進(jìn)行洗脫之前需要一次水洗，并且可能還會(huì)需要在每次重新使用之前以磷酸緩沖液進(jìn)行再調(diào)節(jié)。U.S.6,114,157披露了一種膨脹床吸收物，該床吸收物約等于該生物發(fā)酵容器體積的一半。在工業(yè)實(shí)踐中，這將顯著地抬高商業(yè)投資。進(jìn)一步，樹脂和洗脫劑的低效使用將顯著增加大規(guī)模商業(yè)應(yīng)用的成本。特別是，相對(duì)于所回收的產(chǎn)物量，用于洗脫產(chǎn)物的乙醇的體積很大，這些乙醇將在該膨脹床的再生期間逐漸地?fù)]發(fā)。該洗脫還需要等摩爾量的三氯乙酸，這是一種昂貴的添加劑。另外，使用具有高呼吸速度的微生物進(jìn)行的生物發(fā)酵不能使用膨脹床吸收來進(jìn)行產(chǎn)物分離，這是因?yàn)榕蛎浧陂g在該膨脹床中的溶解氧含量很低。這對(duì)于微生物體的存活有嚴(yán)重的損害。除了使用膨脹床吸收所帶來的限制以外，U.S.6,114,157沒有對(duì)分離中性電荷的產(chǎn)物的方法過程進(jìn)行描述，對(duì)于這種產(chǎn)物離子交換的方法通常無效。
一種在加工或者生產(chǎn)規(guī)模上(比較于分析或者制備規(guī)模)具有可操作性并且省時(shí)廉價(jià)的ISPR分離技術(shù)為模擬移動(dòng)床(SMB)層析。這一技術(shù)為一種連續(xù)的層析過程，該過程依賴于逆流層析以完成分離(Levan，M.D.In Perry’s Chemical Engneers’Handbook，7thEdition；p.16-60；Perry，R.H.，D.W.Green，and J.O.Maloney(Eds.)；McGraw-HillNew York；(1997))。該技術(shù)被廣泛認(rèn)為是一種節(jié)省溶劑的高效技術(shù)(U.S.4,851,573，column 11)。SMB層析的操作原理在U.S.2,985,589中有所描述。SMB層析的應(yīng)用現(xiàn)在已是一種用于生產(chǎn)規(guī)模的應(yīng)用的成型技術(shù)。其它的加工層析方法包括，橫向流層析和徑向?qū)游?，但不限于這些。但是，根據(jù)目前的實(shí)踐，加工層析方法不能選擇性地分離生物發(fā)酵產(chǎn)物并且將其它的培養(yǎng)基成分重新循環(huán)入生物發(fā)酵容器。這是由于驅(qū)動(dòng)層析分離所需的洗脫劑的一部分會(huì)在該生物發(fā)酵容器中積累，降低其容積。盡管在生物發(fā)酵的持續(xù)時(shí)間可被延長以增加產(chǎn)率，但連續(xù)的培養(yǎng)基置換提高了用于大規(guī)模生產(chǎn)的成本。當(dāng)該生物發(fā)酵培養(yǎng)基含有昂貴的輔因子或生物催化劑生長所需的其它成分時(shí)尤為如此。
因此，需要解決的問題為缺乏生物加工工程改造方法以在不添加新鮮培養(yǎng)基或者積累洗脫劑于生物發(fā)酵容器之中的情況下選擇性地除去在生物發(fā)酵反應(yīng)期間產(chǎn)生的干擾性的目標(biāo)分子。在理想的情況下，該生物加工工程改造方法應(yīng)當(dāng)1)除去導(dǎo)致該生物過程的毒性抑制或者反饋抑制的目標(biāo)分子，2)對(duì)從ISPR的生物發(fā)酵容器取出的培養(yǎng)基的置換加以改善，以及3)防止洗脫劑在該生物發(fā)酵容器中的積累。這樣一種工藝應(yīng)會(huì)極大地增強(qiáng)生物加工過程的性能，提高該生物催化劑的總生產(chǎn)速率。其結(jié)果是獲得了較高的資本生產(chǎn)力并且可能獲得較高的反應(yīng)產(chǎn)量。
發(fā)明概述本發(fā)明在此提供了一種用于某生物發(fā)酵系統(tǒng)的產(chǎn)物收取方法，該方法包括a)從含有目標(biāo)分子的生物發(fā)酵溶液中除去(在該生物發(fā)酵的至少一部分時(shí)間)生物催化劑的至少大部分；b)從步驟a)中產(chǎn)生的無生物催化劑溶液之中除去一部分水；c)任選在步驟b)之前或者之后從無生物催化劑溶液中除去該目標(biāo)分子之外的其它成分；加入以物質(zhì)通過層析介質(zhì)1)通過步驟b)或c)所產(chǎn)生的無生物催化劑溶液以及2)一種洗脫劑；e)從該層析介質(zhì)釋放的無生物催化劑溶液的第一個(gè)級(jí)分中回收該目標(biāo)分子；f)任選從該無生物催化劑溶液的第二個(gè)級(jí)分以及從該層析介質(zhì)所釋放的無目標(biāo)分子溶液中除去非水性洗脫劑；g)任選在步驟e)或f)之后將在步驟b)中從無生物催化劑溶液中除去的水加入至該無生物催化劑和無目標(biāo)分子的溶液，所加入的量適于回送入生物發(fā)酵系統(tǒng)；以及h)將來自于步驟d)、e)、f)或g)的無生物催化劑和無目標(biāo)分子的溶液回送入生物發(fā)酵系統(tǒng)。
當(dāng)該目標(biāo)分子在除水步驟的溫度下所具有的蒸氣壓高于水時(shí)，產(chǎn)物由本發(fā)明的一個(gè)備擇的實(shí)施方案進(jìn)行收取。這一備擇的實(shí)施方案防止了該目標(biāo)分子在通過加工層析之前的過早蒸發(fā)。
在該方法中所使用的洗脫劑可為從生物發(fā)酵中除去的水或者混合有非水性洗脫劑的水。該非水性洗脫劑為短鏈的醇或者丙酮。在該方法中從無生物催化劑溶液中除去的水在優(yōu)選的情況下為50-80％。本發(fā)明選擇性地從生物發(fā)酵系統(tǒng)中收取任何目標(biāo)分子。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案選擇性地收取1，3-丙二醇。
另外，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案為一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)用于根據(jù)本文描述從一種生物發(fā)酵系統(tǒng)中原位收取目標(biāo)分子。該系統(tǒng)包括a)一種生物催化劑分離裝置，該裝置用于從含有目標(biāo)分子的一部分生物發(fā)酵溶液中除去生物催化劑的至少大部分；b)一種除水裝置，該裝置從通過a)裝置在步驟a)中所產(chǎn)生的無生物催化劑溶液中除去一部分水；c)任選在步驟b)之前或者之后的除去裝置，該裝置從通過b)的除水裝置所產(chǎn)生的無生物催化劑溶液中除去該目標(biāo)分子或水之外的其它成分；d)一種加工層析裝置，除水裝置b)或去除裝置c)所產(chǎn)生的濃縮無生物催化劑溶液以及一種洗脫劑通過了該層析；e)一種目標(biāo)分子回收裝置，該裝置用于從層析裝置d)中釋放的第一個(gè)級(jí)分中回收大部分目標(biāo)分子；f)任選的一種非水性洗脫劑除去裝置，該裝置從d)的加工層析裝置所釋放的第二個(gè)級(jí)分中除去非水性洗脫劑；g)一種加水裝置，該裝置用于將通過b)所產(chǎn)生的水加入產(chǎn)生自e)或f)的無生物催化劑和無目標(biāo)分子的溶液，所加入的量適于回送入生物發(fā)酵系統(tǒng)；以及h)一種培養(yǎng)基再循環(huán)裝置，該裝置用于將來自于d)、e)、f)或g)的無生物催化劑和無目標(biāo)分子的溶液回送入生物發(fā)酵系統(tǒng)。該系統(tǒng)可被加以改進(jìn)以在該目標(biāo)分子在除水步驟的溫度下所具有的蒸氣壓高于水的情況下收取產(chǎn)物。
附圖、生物保藏物以及序列表的簡述

圖1為一個(gè)方法流程示意圖，該圖顯示了元件的優(yōu)選排列，這些元件用于實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子回收以及無生物催化劑和無目標(biāo)分子的溶液再循環(huán)進(jìn)入該生物發(fā)酵容器。
圖2為一個(gè)方法流程示意圖，該圖以一種備選的實(shí)施方案顯示了本發(fā)明，該備選實(shí)施方案用于在該目標(biāo)分子在除水步驟的溫度下所具有的蒸氣壓高于水的情況下收取產(chǎn)物。
申請(qǐng)人已經(jīng)遵循布達(dá)佩斯條約完成了以下生物保藏保藏者識(shí)別參考 保藏號(hào)保藏日大腸桿菌 ATCC PTA-4216 2002年4月9(Escherichia coli)RJ8n 日本文所使用的“ATCC”指的是位于10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-1109，U.S.A.的美國典型培養(yǎng)物保藏中心?！癆TCCNo.”為ATCC的保藏物的編號(hào)。
所列出的保藏物將會(huì)在所示的國際保藏中心中保持至少三十(30)年并且將會(huì)根據(jù)披露該保藏物的專利的授權(quán)而為公眾所用。一種保藏物的可用性質(zhì)并不成為通過僭越政府法令所保障的專利權(quán)而實(shí)施本發(fā)明的許可。
申請(qǐng)人根據(jù)專利申請(qǐng)中的標(biāo)準(zhǔn)核苷酸和氨基酸序列表示法的規(guī)則(Annexes I and II to the Decision of the President of the EPO，published in Supplement No.2 to OJ EPO，12/1992)、37 C.F.R.1.821-1.825及附錄A和B(對(duì)含有核苷酸和/或氨基酸序列的申請(qǐng)公開的要求)、世界知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織(WIPO)標(biāo)準(zhǔn)ST.25(1998)、及EPO和PCT的序列表要求(管理?xiàng)l例的5.2和49.5(a-bis)條，及208部分和附錄C)。根據(jù)IUPAC-IYUB標(biāo)準(zhǔn)，這些序列描述對(duì)應(yīng)于核苷酸序列含有單字母編碼，對(duì)于氨基酸序列含有三字母編碼，該標(biāo)準(zhǔn)描述于Nucleic Acids Research 133021-3030(1985)以及BiochemicalJournal 219(No.2)345-373(1984)，這些文獻(xiàn)在此引為參考。
SEQ ID NO1為質(zhì)粒pSYCO103的核苷酸序列。
發(fā)明詳述申請(qǐng)人已經(jīng)解決了所述的問題。本發(fā)明提供了一種生物加工工程溶液，該溶液允許在生物發(fā)酵期間通過產(chǎn)物原位收取進(jìn)行目標(biāo)分子的選擇性加工層析收取并且將剩余的無生物催化劑培養(yǎng)液再循環(huán)回到該生物發(fā)酵容器中。通過使用該系統(tǒng)的培養(yǎng)液作為層析洗脫劑的至少一部分來源以及對(duì)培養(yǎng)基的再循環(huán)，本發(fā)明簡化了整個(gè)生物加工過程，降低了對(duì)更換培養(yǎng)基的需求，削弱了反饋抑制或毒性作用對(duì)該生物催化劑的影響，并且/或者防止了洗脫劑在該生物發(fā)酵容器中的積累。
本發(fā)明降低了從用于工業(yè)或者商用生物發(fā)酵培養(yǎng)液中分離目標(biāo)分子的成本，并且通過除去干擾性的目標(biāo)分子而提高了該生物發(fā)酵系統(tǒng)的產(chǎn)率。本發(fā)明利用了相對(duì)簡便的單位并且可以進(jìn)行相對(duì)容易的維持。受益于本發(fā)明的組件體積可在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模到商業(yè)規(guī)模之間變動(dòng)，流速范圍從低至每小時(shí)幾毫升到每小時(shí)數(shù)千加侖。
本申請(qǐng)人的發(fā)明可用于改善任何使用生物催化劑的或者需要簡化產(chǎn)物回收過程的生物發(fā)酵過程的產(chǎn)率，所述的生物催化劑產(chǎn)生的產(chǎn)物由于反饋抑制或者毒性而干擾該生物發(fā)酵，或者由于產(chǎn)物降解、環(huán)境條件或從該系統(tǒng)中的非受控消除而有所丟失。
在本申請(qǐng)中，除非特地申明，否則使用以下的縮寫和定義“產(chǎn)物收取方法”指的是一種方法，通過該方法該生物發(fā)酵系統(tǒng)的一部分在該生物發(fā)酵的至少一部分時(shí)間被從該生物發(fā)酵容器中取出以用于選擇性的產(chǎn)物收取。該產(chǎn)物或者目標(biāo)分子隨后從該培養(yǎng)液中選擇性地收取。
“產(chǎn)物原位收取”被縮寫為ISPR。本發(fā)明中，在一個(gè)分立的加工回路中外部進(jìn)行ISPR。該培養(yǎng)基的一部分通過該加工回路進(jìn)行特異地循環(huán)以用于產(chǎn)物收取。在替代的情況下，ISPR可直接在該生物發(fā)酵容器內(nèi)進(jìn)行。
“生物發(fā)酵系統(tǒng)”或者“生物發(fā)酵”指的是一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過使用某種生物催化劑催化從底物到產(chǎn)物的反應(yīng)。該“生物催化劑”起始或者改變從底物到產(chǎn)物的化學(xué)反應(yīng)的速率。該生物催化劑可以是完整的微生物、分離的酶或者它們的任意組合。出于本申請(qǐng)的目的，“微生物”還包括來自于昆蟲、動(dòng)物或者植物的細(xì)胞。
“培養(yǎng)液”或者“培養(yǎng)基”指的是一種液體溶液，該溶液含有用于培養(yǎng)微生物的營養(yǎng)物。該培養(yǎng)液還可額外含有生物催化劑、生物催化劑所產(chǎn)生的目標(biāo)分子、代謝中間物以及其它培養(yǎng)基成分，例如鹽、維生素、氨基酸、輔因子以及抗生素。
“目標(biāo)分子”指的是任何經(jīng)生物催化產(chǎn)生的產(chǎn)物，該產(chǎn)物通過使用本文所描述的方法而被選擇性地從該生物發(fā)酵系統(tǒng)中收取。該分子可以是該生物催化劑所天然產(chǎn)生的某種化合物，或者非天然的基因可經(jīng)過遺傳工程而進(jìn)入微生物，從而這些基因在該生物發(fā)酵系統(tǒng)中功能性表達(dá)。在這一上下文中，“目標(biāo)分子”還可指該生物發(fā)酵系統(tǒng)的任何副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物可能需要從該生物發(fā)酵系統(tǒng)中選擇性地收取以消除反饋抑制和/或使生物催化活性最大化。
“無生物催化劑溶液”指的是從該生物發(fā)酵系統(tǒng)中收取的培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液中至少已經(jīng)除去了大部分的該生物催化劑物質(zhì)。該無生物催化劑溶液可為一種滲透液(通過將該生物發(fā)酵培養(yǎng)液通過某種膜而產(chǎn)生)或者上清。在無生物催化劑溶液中的成分可包括該生物催化劑所產(chǎn)生的目標(biāo)分子、代謝中間物以及其它培養(yǎng)基成分，例如鹽、維生素、氨基酸、輔因子以及抗生素。
“無生物催化劑和無目標(biāo)分子的溶液”指的是從該生物催化系統(tǒng)中收取的培養(yǎng)液，其中的培養(yǎng)液已經(jīng)除去了至少大部分生物催化劑和無目標(biāo)分子。任選存留于該無生物催化劑和無目標(biāo)分子的溶液的成分可含有含量顯著降低的目標(biāo)分子，以及代謝中間物和其它培養(yǎng)基成分，例如鹽、維生素、氨基酸、輔因子以及抗生素。
“層析介質(zhì)”指的是任何被用作為層析系統(tǒng)的一部分的材料，該層析介質(zhì)用于在輸入的上樣流中分離成分，該輸入的上樣流由一種洗脫劑以及一種無生物催化劑溶液組成。
“體積產(chǎn)率”指的是在給定的體積每單位時(shí)間下一個(gè)生物發(fā)酵容器中所產(chǎn)生的目標(biāo)分子的量，其單位為克/(升小時(shí))(縮寫為g/(Lhr))。該測(cè)量值由該生物催化劑的比活性以及該生物催化劑的濃度所決定。該值通過滴度、運(yùn)行時(shí)間以及該發(fā)酵容器的工作體積進(jìn)行計(jì)算。
“滴度”指的是目標(biāo)分子的濃度，其單位為克/升(縮寫為g/L)。
盡管下文通過一種從無生物催化劑的溶液中有效分離目標(biāo)分子的加工層析來對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述，但在本發(fā)明中多種層析分離方法在加工或者生產(chǎn)的規(guī)模上(同分析或者制備規(guī)模相比)是可操作的。本發(fā)明的這些備選方案包括，模擬移動(dòng)床(SMB)層析、橫向流層析或者徑向?qū)游?，但不限于這些，這些層析方法用于從該生物發(fā)酵培養(yǎng)液中選擇性地分離該目標(biāo)分子。
參照?qǐng)D1，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物發(fā)酵容器(1)設(shè)置有一個(gè)培養(yǎng)液再循環(huán)回路，該回路包括有一個(gè)橫向流過濾單位(2)、一個(gè)除水單位(4)以及一個(gè)加工層析(9)。該設(shè)置允許從該生物發(fā)酵容器(1)中收取培養(yǎng)液并且將該培養(yǎng)液通過該橫向流過濾單位(2)。生物催化劑和一部分培養(yǎng)液回送到該生物發(fā)酵容器(1)，而通過該橫向流過濾單位(2)而產(chǎn)生的無生物催化劑溶液在該除水單位(4)中進(jìn)行濃縮。經(jīng)濃縮的無生物催化劑溶液(5)隨后通過該加工層析(9)，使用在該除水單位(4)中所產(chǎn)生的水洗脫劑(6)。這一層析分離將大部分的目標(biāo)分子(7)同剩余的濃縮無生物催化劑溶液分離。該無生物催化劑和無目標(biāo)分子的溶液(8)通過回送到該生物發(fā)酵容器(1)而進(jìn)行再循環(huán)。
參照?qǐng)D2，在上文所披露的本發(fā)明的一個(gè)備選的實(shí)施方案中，本發(fā)明經(jīng)過改進(jìn)而在該目標(biāo)分子在除水步驟(4)所使用的溫度下具有高于水的蒸氣壓的情況下收取產(chǎn)物。生物發(fā)酵容器(1)設(shè)置有一個(gè)培養(yǎng)液再循環(huán)回路，該回路包括有一個(gè)橫向流過濾單位(2)、一個(gè)除水單位(4)以及一個(gè)加工層析(9)。該設(shè)置允許從該生物發(fā)酵容器(1)中收取培養(yǎng)液并且將該培養(yǎng)液通過該橫向流過濾單位(2)。生物催化劑和一部分培養(yǎng)液回送到該生物發(fā)酵容器(1)，而通過該橫向流過濾單位(2)而產(chǎn)生的無生物催化劑溶液直接進(jìn)入該加工層析(9)，使用在該除水單位(4)中所產(chǎn)生的水洗脫劑(6)。層析分離將大部分的目標(biāo)分子(7)同剩余的無生物催化劑溶液分離。該無生物催化劑和無目標(biāo)分子的溶液(8)隨后在該除水單位(4)進(jìn)行濃縮，該濃縮在該溶液回送到該生物發(fā)酵容器(1)之前進(jìn)行。
技術(shù)人員明白地意識(shí)到，在該目標(biāo)分子在除水步驟所使用的溫度下具有高于水的蒸氣壓的情況下，該方法改進(jìn)對(duì)于防止該目標(biāo)分子在通過該加工層析之前先期蒸發(fā)是必要的。同樣地，如果反向滲透被用作為除水方法并且在該生物發(fā)酵所產(chǎn)生的目標(biāo)分子在該除水步驟所使用的溫度下具有高于水的蒸氣壓的情況下，這一備選的實(shí)施方案也是必需的。對(duì)該基本發(fā)明的改動(dòng)是可被預(yù)期的。這些實(shí)施方案中的多種將在下文進(jìn)行討論。
該無生物催化劑溶液從該生物發(fā)酵容器(1)中進(jìn)行收取并且在再循環(huán)進(jìn)入該生物發(fā)酵容器之前通過本發(fā)明的加工流的速率對(duì)于將該目標(biāo)分子在該生物發(fā)酵容器中的濃度維持在該生物催化劑的反饋抑制或者毒性閾值之下是關(guān)鍵性的。用于測(cè)定維持該循環(huán)速度的方法為技術(shù)人員所熟知。
本發(fā)明的具體方面在下文更為詳盡地進(jìn)行討論。
生物發(fā)酵培養(yǎng)液的分離當(dāng)培養(yǎng)液從該生物發(fā)酵容器(1)中被取出時(shí)首先進(jìn)行了固體(即生物催化劑)同液體的分離。這一分離產(chǎn)生了一種無生物催化劑溶液，同時(shí)使得生物催化劑物質(zhì)以及一部分上清回送到該生物發(fā)酵容器(1)。多種固液分離方法可供使用，這些方法包括，橫向流過濾、離心和閉端過濾，但不限于這些。使用傳統(tǒng)的過濾也是可能的，進(jìn)行該傳統(tǒng)過濾時(shí)將一種生物相容性濾器輔助單位置于該生物發(fā)酵容器(1)中。
橫向流過濾單位(2)將一個(gè)輸入流分離成為兩個(gè)輸出流。該無生物催化劑溶液(或者滲透液)是穿過膜的流出液體的一部分。第二個(gè)輸出流含有被該膜所阻擋的生物催化劑的細(xì)胞物質(zhì)以及上清。這第二種輸出流被立即回送到該生物發(fā)酵容器(1)。
用于橫向流過濾的特定的膜取決于需從該輸入流中除去的顆粒的大小。典型的大小應(yīng)為常用于微過濾和超濾的大小，其孔大小約為0.2微米或者更小。優(yōu)選的膜包括纖維素膜、聚酰胺膜、聚砜膜以及聚偏二氯乙烯膜。
除膜的選擇之外，還必須仔細(xì)考慮溫度、壓力以及污垢污染的綜合影響以確保橫向流過濾單位的成功操作。在給定的加工流pH下的化學(xué)相容性以及膜穩(wěn)定性也是一些因素。這些條件可由該領(lǐng)域的技術(shù)人員方便地進(jìn)行最優(yōu)化。
無生物催化劑溶液的過濾在該產(chǎn)物收取方法中可以使用一種任選而附加的過濾(3)，該過濾通過第二階段的橫向流過濾單位進(jìn)行，該過濾單位具有選擇性更強(qiáng)的膜或者具有更小的孔徑。這種任選的過濾從該無生物催化劑溶液中除去其它成分，例如蛋白質(zhì)、蛋白片段、二價(jià)鹽、一價(jià)離子或者有機(jī)物。使用第二階段過濾單位可能延長層析吸收劑的壽命。
溫度層析技術(shù)人員熟知，輸入的上樣物的溫度可影響分離。一種熱交換器可任選加入除水單位。這種熱交換器應(yīng)會(huì)輔助層析分離和蒸發(fā)，由此而使該過程在恒定和可預(yù)知的速率下進(jìn)行。
除水蒸餾、反向滲透、蒸氣重壓縮或者簡單的蒸發(fā)可被用于從該無生物催化劑溶液中除去水(4)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該除水步驟應(yīng)從該無生物催化劑溶液中除去約50到80％的水，從而產(chǎn)生一種無生物催化劑溶液，同經(jīng)過從該生物發(fā)酵容器(1)中進(jìn)行的收取后所起始產(chǎn)生的溶液相比該溶液明顯更為濃縮。這種濃縮的無生物催化劑溶液應(yīng)含有目標(biāo)分子。該溶液還應(yīng)含有其它的培養(yǎng)基成分(例如，鹽、維生素、氨基酸、輔因子、抗生素以及代謝中間物)，這些成分最終被送回該生物發(fā)酵容器(1)。作為該生物發(fā)酵的副產(chǎn)物而形成的痕量揮發(fā)物在其沸點(diǎn)接近或者低于水的情況下可從該無生物催化劑溶液中除去。
通過層析介質(zhì)而進(jìn)行的目標(biāo)分子的公離幾乎任何類型的目標(biāo)分子都可通過使用本發(fā)明而從某種生物發(fā)酵溶液中進(jìn)行層析分離。本發(fā)明可適應(yīng)分離中性和帶電的目標(biāo)分子、具有小分子直至大型分泌蛋白的分子量的目標(biāo)分子以及手性分子。對(duì)目標(biāo)分子的高度選擇性分離通過將該無生物催化劑溶液通過該加工層析(9)而進(jìn)行。一種優(yōu)選的目標(biāo)分子為生物加工的1，3-丙二醇(US5,686,276)。
在所有的情況下，該目標(biāo)分子從該無生物催化劑溶液中的分離典型地依賴同層析介質(zhì)或者吸收劑之間的分子相互作用。吸收劑包括，活性碳、沸石、多聚中性樹脂、殼聚糖珠、離子交換樹脂以及固定化的復(fù)合材料，但不限于這些。對(duì)具體的吸收劑的選擇應(yīng)取決于多種因素，這些因素為該領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。這樣的因素包括，目標(biāo)分子的電荷、目標(biāo)分子的大小、吸收和解吸收的速率、同表面的化學(xué)和物理作用、該吸收劑的穩(wěn)定性(例如，沸石同液體中的鹽交換離子)以及該吸收劑的生物毒性，但不限于這些。還應(yīng)考慮的包括具體的應(yīng)用和目標(biāo)分子、培養(yǎng)基穩(wěn)定性、層析的方法以及該加工過程和單位的規(guī)模。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在該目標(biāo)分子并非比水揮發(fā)性高的情況下，第一種級(jí)分(含有該目標(biāo)分子和層析洗脫劑)被從該層析介質(zhì)中釋放。目標(biāo)分子的分離基于目標(biāo)分子對(duì)于該層析介質(zhì)的親和性而進(jìn)行。該目標(biāo)分子結(jié)合/形成復(fù)合體的可逆性通過該目標(biāo)分子同該無生物催化劑溶液中的其它溶質(zhì)相比較具有不同的遷移率而實(shí)現(xiàn)。這樣實(shí)現(xiàn)了從吸收劑中的簡便洗脫。洗脫條件應(yīng)包括同吸收條件所使用的相同范圍的溫度和壓力。從該層析中所回收的目標(biāo)分子-洗脫劑混合物隨后通過該領(lǐng)域所熟知的方法進(jìn)行(例如，蒸餾)。
在替代的情況下，分離可能并非通過目標(biāo)分子同該層析介質(zhì)的親和性而產(chǎn)生。例如，一些同吸收劑之間無相互作用的目標(biāo)分子可首先從層析中釋放，而無生物催化劑溶液中的其它成分可能由于其同吸收劑的親和性而具有較長的持留時(shí)間。該洗脫劑以及稀釋的無生物催化劑和無目標(biāo)分子的溶液的混合物作為第二級(jí)分而從層析中釋放。
層析洗脫以及“培養(yǎng)基再循環(huán)”在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，加入該層析中的洗脫劑為通過除水單位(4)所產(chǎn)生的水。由于除水單位降低了該無生物催化劑溶液中的水含量的約50-80％，上加入該層析的無生物催化劑溶液在溶質(zhì)上同剛從生物發(fā)酵容器(1)中收取的無生物催化劑溶液相比更為濃縮。當(dāng)水洗脫劑隨后被加入至這種濃縮溶液中時(shí)，所產(chǎn)生的總體水含量并不高于剛從生物發(fā)酵容器(1)中收取的無生物催化劑溶液。
使用從除水單位(4)中收集的水作為層析洗脫劑可以帶來眾多方法上的優(yōu)點(diǎn)。這一“培養(yǎng)基再循環(huán)”技術(shù)直接降低了在以額外的新培養(yǎng)基替代從該ISPR生物發(fā)酵容器(1)中收取的無生物催化劑溶液的情況下的成本。這可以使剩余的培養(yǎng)液成分，例如鹽、維生素、氨基酸、輔因子、抗生素和代謝中間物(減去了純化的目標(biāo)分子)被回送到該生物發(fā)酵容器(1)。
進(jìn)一步，由于該無生物催化劑溶液先經(jīng)濃縮而后進(jìn)行再水化，該培養(yǎng)基再循環(huán)過程并不增加該生物發(fā)酵容器中(1)的總體積。這樣消除了對(duì)洗脫劑在該生物發(fā)酵容器(1)中積累的顧慮，該積累很大程度上改變了發(fā)酵的培養(yǎng)液組成并且/或者降低該生物發(fā)酵容器(1)的容積。
該培養(yǎng)基再循環(huán)過程還可被用于從該生物發(fā)酵容器(1)中除去水。該生物發(fā)酵在補(bǔ)料分批的模式下運(yùn)行時(shí)特別有用，該模式下進(jìn)行某種溶于水中的底物的遞增添加。由此而維持了該生物發(fā)酵容器(1)中的整體水平衡。
最后，從該除水單位中收集的水作為層析洗脫劑的再利用減少了該系統(tǒng)中的操作單位的數(shù)量。具體來說，水再利用消除了對(duì)適于進(jìn)入該發(fā)酵系統(tǒng)的無菌水源的需求。由于水再利用避免了構(gòu)建工業(yè)化水處理和純化設(shè)施，操作的成本被進(jìn)一步降低，如果洗脫劑被釋放出該環(huán)境，該水處理和純化設(shè)施是必需的。
在本發(fā)明的一個(gè)備選的實(shí)施方案中，某種非水性的洗脫劑(例如短鏈的醇，乙醇或者丙酮)可被用于(單獨(dú)或者同水一起)層析。從該層析釋放物中回收的目標(biāo)分子-洗脫劑混合物隨后通過本領(lǐng)域所熟知的方法進(jìn)行提純(例如蒸餾)。從加工層析(9)中釋放的含有洗脫劑和稀釋的無生物催化劑和無目標(biāo)分子的混合物的第二種級(jí)分可通過多種分離裝置(例如閃蒸或者填裝的吸收劑基床)以除去非水性洗脫劑。該非水性洗脫劑可經(jīng)再循環(huán)進(jìn)入該層析介質(zhì)，而經(jīng)濃縮的無生物催化劑和無目標(biāo)分子的溶液可任選以水進(jìn)行再水化并且隨后作為“培養(yǎng)基再循環(huán)”回送到該生物發(fā)酵容器(1)。
生物發(fā)酵本發(fā)明可適應(yīng)于多種生物發(fā)酵方法，特別是適于大規(guī)模工業(yè)加工的方法。本發(fā)明可以使用分批、補(bǔ)料分批或者連續(xù)的方法進(jìn)行實(shí)施，但在優(yōu)選的情況下在補(bǔ)料分批的模式下進(jìn)行實(shí)施。
計(jì)算和比較分批方法和連續(xù)方法在加工經(jīng)濟(jì)學(xué)上的差異是可行的。使用標(biāo)準(zhǔn)的一組條件，同分批方法相比較，連續(xù)的系統(tǒng)在產(chǎn)率方面效率高出70倍/在吸收劑和洗脫劑消耗上連續(xù)系統(tǒng)降低了8倍(表1，擷自Rossiter et al.，“Continuous Process SeparationChiral& Chromatographic with CSEPTMand ISEPTM；Advanced SeparationTechnologies.Prep 97 Meeting，Washington，D.C.；p12(1997)”)。
分批和分批補(bǔ)料生物發(fā)酵經(jīng)典的分批生物發(fā)酵為一種封閉的系統(tǒng)，其中培養(yǎng)液組成在該生物發(fā)酵的起始被設(shè)置并且在該生物發(fā)酵期間并不進(jìn)行人工的改動(dòng)。因此，在該生物發(fā)酵起始時(shí)，該培養(yǎng)液被接種以所需的微生物或者生物體，并且該生物發(fā)酵的過程中不對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步的添加。但是，在典型的情況下，“分批”生物發(fā)酵是針對(duì)碳源的添加的分批，并且通常在控制諸如pH和氧含量這樣的因素上采取措施。在分批系統(tǒng)中，該系統(tǒng)的代謝物和生物物質(zhì)的組成穩(wěn)定地提高直至該生物發(fā)酵被終止。在分批培養(yǎng)物中細(xì)胞溫和地通過一個(gè)靜止對(duì)數(shù)期進(jìn)入一個(gè)高生長的對(duì)數(shù)生長期，最終進(jìn)入穩(wěn)定期，在該期生長速度減低或者被終止。如果不進(jìn)行處理，處于穩(wěn)定期的細(xì)胞將最終死亡。處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞通常負(fù)責(zé)最終產(chǎn)物或者中間物的大部分的產(chǎn)生，此時(shí)該產(chǎn)物同生產(chǎn)相關(guān)聯(lián)。
標(biāo)準(zhǔn)分批系統(tǒng)的變化為補(bǔ)料分批系統(tǒng)。本發(fā)明在優(yōu)選的情況下使用了一種生物發(fā)酵的標(biāo)準(zhǔn)批次加入方法。補(bǔ)料分批生物發(fā)酵含有一種典型的分批系統(tǒng)，其例外在于底物隨著該生物發(fā)酵的進(jìn)行而被遞增加入。當(dāng)分解代謝物可對(duì)細(xì)胞的代謝產(chǎn)生抑制的情況時(shí)，以及在需要在培養(yǎng)基中含有限量的底物的情況下，補(bǔ)料分批系統(tǒng)是有用的。在補(bǔ)料分批系統(tǒng)中測(cè)定實(shí)際的底物濃度是困難的，因此在可測(cè)量因素的變化的基礎(chǔ)上進(jìn)行估計(jì)，該可測(cè)量因素的例子如pH、溶解氧以及諸如CO2這樣的廢氣的分壓。分批和補(bǔ)料分批生物發(fā)酵是常用的并且在本領(lǐng)域中為人熟知(Brock，T.D.；BiotechnologyA Textbook of IndustrialMicrobiology，2nded.；Sinauer AssociatesSunderland，MA(1989)；或者Deshpande，Appl.Biochem.Biotechnol.36227(1992))。
連續(xù)生物發(fā)酵在一個(gè)連續(xù)的生物發(fā)酵系統(tǒng)中，一種確定的生物發(fā)酵溶液被連續(xù)加入一個(gè)生物反應(yīng)器中，并且等量的生物發(fā)酵溶液同時(shí)被收取以用于加工。連續(xù)的生物發(fā)酵通常將該培養(yǎng)物維持在穩(wěn)定的高密度下，在該密度下細(xì)胞主要處于對(duì)數(shù)期生長。該方法允許對(duì)影響細(xì)胞生長或者終產(chǎn)物濃度的一種因素或者任何數(shù)量的因素進(jìn)行調(diào)節(jié)。例如，某種方法以固定的速率維持某種限制性的營養(yǎng)物質(zhì)并且允許所有其它的參數(shù)被調(diào)節(jié)，該限制性的營養(yǎng)物質(zhì)的例子如碳源或者氮水平。在其它的系統(tǒng)中，影響生長的多種因素可被連續(xù)地改變，此時(shí)根據(jù)培養(yǎng)基濁度而測(cè)定的細(xì)胞濃度保持恒定。連續(xù)的系統(tǒng)力求在穩(wěn)態(tài)生長條件下進(jìn)行操作并且對(duì)細(xì)胞的損失進(jìn)行平衡，該損失由于隨著該生物發(fā)酵系統(tǒng)中的細(xì)胞生長速率而對(duì)生物發(fā)酵溶液進(jìn)行的收取而導(dǎo)致。為連續(xù)的生物發(fā)酵過程而調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子的方法以及用于使產(chǎn)物的形成速度最大化的技術(shù)在工業(yè)微生物學(xué)中是為人所熟知的(Brock，上文)。
生物催化劑該生物催化劑可以為完整的微生物或者處于分離的酶催化劑形式。完整的微生物細(xì)胞可被用作為生物催化劑而無須任何諸如透化這樣的預(yù)處理?；蛘撸@些完整的細(xì)胞可通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的方法進(jìn)行透化(例如，以甲苯、去污劑或者凍融進(jìn)行處理)以提高物質(zhì)擴(kuò)散進(jìn)入和離開細(xì)胞的速率。
經(jīng)質(zhì)粒pSYCO103轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株RJ8n被用作為1，3-丙二醇的生物生產(chǎn)的生物催化劑。
RJ8n含有(a)一組三個(gè)內(nèi)源基因，每個(gè)基因具有一個(gè)使其失活的突變，該組基因的組成為(i)glpk，一種編碼甘油激酶的基因，(ii)gldA，一種編碼甘油脫氫酶的基因，以及(iii)tpiA，一種編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因，RJ8n還含有(b)至少一種編碼非特異性催化活性的內(nèi)源基因，該活性足以將3-羥基丙醛轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇。質(zhì)粒pSYCO103(SEQ ID NO1)含有一組七個(gè)外源基因(i)編碼甘油脫水酶的三個(gè)基因(E.C.4.2.1.30)，(ii)編碼一種脫水酶反應(yīng)因子的兩個(gè)基因(WO 01/12833 A3)(iii)一種編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的基因(E.C.1.1.1.8)以及(iv)一種編碼甘油-3-磷酸酶的基因(E.C.3.1.3.21)。
除上文所提及的大腸桿菌菌株之外，可用于本發(fā)明的微生物還可包括，細(xì)菌(如腸道細(xì)菌埃希氏菌和沙門氏菌，例如芽孢桿菌、不動(dòng)桿菌、鏈霉菌、甲基細(xì)菌、紅球菌以及假單胞菌；藍(lán)細(xì)菌(如紅細(xì)菌和Synechocystis)；酵母(例如啤酒糖酵母、接合糖酵母、克魯維氏酵母、假絲酵母、漢森酵母、德巴利氏酵母、毛霉菌、畢赤氏酵母以及擬酵母)；絲狀真菌(例如曲霉菌和節(jié)從孢)和藻類，但不限于這些。技術(shù)人員還應(yīng)了解，本發(fā)明還可被應(yīng)用于對(duì)來自昆蟲、植物和動(dòng)物的細(xì)胞的培養(yǎng)。
該酶類生物催化劑可被固定化于一種聚合物基質(zhì)中(例如，藻酸鹽、角叉膠、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺凝膠(PAG)顆粒)或者固定化于某種可溶或者不溶的支持物之上(例如硅藻土)以輔助該生物催化劑的回收和再利用。用于將生物催化劑固定化于聚合物基質(zhì)或者可溶或者不溶的支持物之上的方法已被廣泛地報(bào)道并且為該領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。
培養(yǎng)條件適用于微生物培養(yǎng)物的維持和生長的材料和方法為微生物領(lǐng)域或者生物發(fā)酵科學(xué)領(lǐng)域中的人士所熟知(Bailey，J.E.and Ollis，D.F.，Biochemical Engineering Fundamentals，2ndEdition；McGraw-HillNY(1986))。根據(jù)用于所需的功能性基因表達(dá)的微生物的具體要求，必須對(duì)于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基、pH、溫度以及通氧、微需氧或者厭氧條件的要求加以仔細(xì)考慮。
培養(yǎng)基和碳底物大規(guī)模的微生物生長和功能性基因表達(dá)可以使用廣泛的簡單或者復(fù)雜的碳水化合物、有機(jī)酸和醇以及飽和的烴。本發(fā)明中的生物發(fā)酵培養(yǎng)基必須含有適當(dāng)?shù)奶嫉孜?，該底物的選擇根據(jù)該生物催化劑的需求進(jìn)行。適當(dāng)?shù)牡孜锟砂▎翁?例如葡萄糖和果糖)、二糖(例如乳糖或者蔗糖)，寡糖和多糖(例如淀粉或者纖維素或其混合物)或者來自可更新的給料(例如奶酪乳清滲透物、玉米漿、甜菜糖蜜和大麥芽)的未經(jīng)純化的混合物，但不限于這些。該碳底物還可為單碳底物(例如二氧化碳、甲醇或者甲烷)。
除適當(dāng)?shù)奶荚粗猓锇l(fā)酵培養(yǎng)基必須還含有適當(dāng)?shù)牡V物質(zhì)、鹽、輔因子、緩沖液以及其它成分，這些成分為該領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知(Bailey，J.E.and Ollis，D.F.，Biochemical EngineeringFundamentals，2ndEdition，PP383-384和620-622；McGraw-HillNY(1986))。這些添加物適于該生物催化劑的生長并且可促進(jìn)產(chǎn)生該生物發(fā)酵產(chǎn)物所必需的酶學(xué)途徑。對(duì)于本發(fā)明，上文所描述的碳源和其它成分被同目標(biāo)分子進(jìn)行分離并且回送到該生物發(fā)酵容器。
最后，表達(dá)某種用于工業(yè)的產(chǎn)物的功能性基因可通過具體的生長條件(例如，氮、磷、硫、氧、碳或者包括無機(jī)小離子在內(nèi)的痕量微營養(yǎng)物質(zhì)的形成及其量)進(jìn)行調(diào)控、抑制或者去抑制。對(duì)功能性基因的調(diào)控可通過特定的調(diào)控分子(例如非必需(安慰)誘導(dǎo)物)的存在與消失而進(jìn)行，這些調(diào)控分子被加入培養(yǎng)物中，并且在典型的情況下并不被認(rèn)作為營養(yǎng)物或者能量源。生長速度也可為基因表達(dá)中的一個(gè)重要的調(diào)控因素。
實(shí)施例本發(fā)明在下文的實(shí)施例中進(jìn)行進(jìn)一步的定義。盡管這些實(shí)施例指出了本發(fā)明的一些優(yōu)選的實(shí)施方案，但這些實(shí)施例的給出應(yīng)被理解為僅僅是闡釋性的。通過上文描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可確定本發(fā)明的基本特征，并且在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可對(duì)本發(fā)明做出多種變化和修改以使其適應(yīng)于不同的應(yīng)用和條件。
縮寫的含義如下“h”指小時(shí)，“min”指分鐘，“sec”指秒，“d”指天，“mL”指毫升，“L”指升，“g”指克，“kg”指千克，“atm”指大氣壓。
通用方法適于細(xì)菌培養(yǎng)物的維持和生長的材料和方法為本領(lǐng)域所熟知。適用于以下的實(shí)施例的技術(shù)的描述見Manual of Methods for GeneralBacteriology；Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg andG.Briggs Phillips，eds.，American Society for MicrobiologyWashington，D.C.(1994)或者見BiotechnologyA Textbook ofIndustrial Microbiology；Brock，T.D.，2nded.；SinauerAssociatesSunderland，Massachusetts(1989)。
實(shí)施例2展示了穩(wěn)態(tài)過程的計(jì)算機(jī)模擬，該模擬使用來自AspenTechnology，Inc.，Cambridge，MA的AspenplusTM軟件10.1釋放版進(jìn)行。AspenplusTM并不具有用于加工層析的特異的單位操作。使用EXTRACT模塊(block)進(jìn)行模擬移動(dòng)床(SMB)加工層析的建模，該模塊一般被用于逆流液-液萃取。十二烷被用作為液相之一以對(duì)固相進(jìn)行模擬。液-液平衡常數(shù)的設(shè)置見表2，該設(shè)置根據(jù)分批層析實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行，只有一處例外。具體為，用于水和十二烷的液-液平衡常數(shù)分別被設(shè)定為任意高和任意低的值。
實(shí)施例1對(duì)比例(無培養(yǎng)基再循環(huán))本實(shí)驗(yàn)出于比較的目的進(jìn)行實(shí)施以展示在不進(jìn)行培養(yǎng)基再循環(huán)的情況下的體積產(chǎn)率。
使用葡萄糖作為底物運(yùn)行一個(gè)批次加入生物發(fā)酵系統(tǒng)以產(chǎn)生1，3-丙二醇。經(jīng)質(zhì)粒pSYCO103轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株RJ8n在該生物加工中被用作為生物催化劑。
大腸桿菌菌株RJ8n(ATCC PTA-4216)含有(a)一組三個(gè)內(nèi)源基因，每個(gè)基因具有一個(gè)使其失活的突變，該組基因的組成為(i)glpk，一種編碼甘油激酶的基因，(ii)gldA，一種編碼甘油脫氫酶的基因，以及(iii)tpiA，一種編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因，RJ8n還含有(b)至少一種編碼非特異性催化活性的內(nèi)源性基因，該活性足以將3-羥基丙醛轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇。質(zhì)粒pSYCO103(SEQ ID NO1)含有一組七個(gè)外源基因(i)編碼甘油脫水酶的三個(gè)基因(E.C.4.2.1.30)，(ii)編碼一種脫水酶反應(yīng)因子的兩個(gè)基因(WO 01/12833 A3)(iii)一種編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的基因(E.C.1.1.1.8)以及(iv)一種編碼甘油-3-磷酸酶的基因(E.C.3.1.3.21)。
使用本領(lǐng)域已知的成分和方法而制備一個(gè)10升工作體積的生物發(fā)酵容器。使用本領(lǐng)域已知的成分(例如，水、鹽、酵母抽提物)和方法而制備培養(yǎng)基。使用本領(lǐng)域已知的方法在搖瓶中制備接種物。
在接種之后使發(fā)酵運(yùn)轉(zhuǎn)68小時(shí)。通過每兩個(gè)小時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行分析并且基于10g葡萄糖/L的目標(biāo)對(duì)葡萄糖溶液加入速度進(jìn)行調(diào)整，從而對(duì)葡萄糖進(jìn)行控制。
為避免過度充滿該發(fā)酵容器，在接種之后40h從該發(fā)酵容器中取出3.44L培養(yǎng)液。
該發(fā)酵容器的體積產(chǎn)率通過測(cè)量該發(fā)酵容器中的1，3-丙二醇滴度并且計(jì)算在發(fā)酵容器中液體體積加上被取出的液體體積下產(chǎn)生滴度時(shí)所產(chǎn)生的1，3-丙二醇量而進(jìn)行計(jì)算，該1，3-丙二醇滴度的測(cè)量通過液相色譜進(jìn)行。
1，3-丙二醇可通過將該培養(yǎng)基直接進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析而進(jìn)行鑒定。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方法中，發(fā)酵培養(yǎng)基通過離子緩和分配色譜(ion moderated partition chromatography)(IMP)進(jìn)行，該色譜中使用0.01N的硫酸作為流動(dòng)相并且在恒溶劑方式下進(jìn)行。在所有這些實(shí)施例中，3G的濃度通過HPLC來進(jìn)行測(cè)定。
為進(jìn)行1，3-丙二醇的定量，將一個(gè)Shodex HPLC柱(SH101糖柱，300mm×8mm)配備以一臺(tái)Waters 715自動(dòng)收樣器，Waters溫控模塊(設(shè)溫度為50℃)，Waters 410折光率檢測(cè)儀以及Waters 486UV檢測(cè)儀(波長＝210nm)。流動(dòng)相為0.005摩爾的硫酸，處于0.5mL/min的恒溶劑流中。使用新戊酸作為內(nèi)標(biāo)。在這些條件下，1，3-丙二醇在25.9分鐘被洗脫。
最大的體積產(chǎn)率為15.85kg/m3/yr，該產(chǎn)率在接種后41.85小時(shí)后被觀測(cè)到。該體積產(chǎn)率通過將所產(chǎn)生的1，3-丙二醇的量(滴度乘以發(fā)酵容器中和被取出的總培養(yǎng)液體積)除以所產(chǎn)生的培養(yǎng)液的總體積并進(jìn)一步除以自接種起的時(shí)間加上18小時(shí)(用于批次之間的轉(zhuǎn)變)。在接種之后41.85小時(shí)，1，3-丙二醇的滴度為108.25g/L，培養(yǎng)液體積為6.168L。
對(duì)剩余成分回送到該生物發(fā)酵容器的模擬通過從生物發(fā)酵容器中收取無催化劑培養(yǎng)基并且向該發(fā)酵容器中加入一種物流(構(gòu)成培養(yǎng)基)，從而模擬本發(fā)明對(duì)于進(jìn)行生物發(fā)酵容器的操作以產(chǎn)生1，3-丙二醇的影響，該物流近似于應(yīng)從該分離系統(tǒng)中返回該生物發(fā)酵容器的物流的組成。
該生物發(fā)酵容器、培養(yǎng)基和接種物的制備同上文對(duì)比例。
構(gòu)成培養(yǎng)基的制備構(gòu)成培養(yǎng)基使用正常的生物發(fā)酵容器培養(yǎng)基配料和方法進(jìn)行制備，其例外在于1)省略了酵母抽提物，2)所有其它的非水成分的濃度降低50％，以及3)加入了15g/L的甘油和10g/L的葡萄糖。消毒后對(duì)該培養(yǎng)基的添加物，例如抗生素，亦在正常配料濃度的50％水平。
發(fā)酵在接種后24h開始，從該生物發(fā)酵容器中收取1L/min的全細(xì)胞培養(yǎng)液并將該液通過一種橫向流過濾單位。該橫向流過濾單位由一個(gè)Pellicon-2微型支持器(Millipore公司目錄號(hào)#XX42PMINI)組成，該支持器含有一種Pellion PLC系列再生纖維素膜(Millipore公司目錄號(hào)##P2C01MV01)。該膜的面積為0.1m2并且其標(biāo)定的分子量限制為1000千道爾頓。從該橫向流過濾單位中收取20mL/min的無生物催化劑溶液，而細(xì)胞物質(zhì)和剩余的培養(yǎng)液被送回該生物發(fā)酵容器。
在開始進(jìn)行無生物催化劑物流的收取的同時(shí)，18.5mL的構(gòu)成培養(yǎng)基被加入該生物發(fā)酵容器。為避免對(duì)該生物發(fā)酵容器的過度充滿，3.2L的全細(xì)胞培養(yǎng)液在接種之后38.28h被從該生物發(fā)酵容器中取出并且2.65L在接種之后46.81h被取出。
在52.8小時(shí)該發(fā)酵容器中的滴度為75.7g/L，該生物發(fā)酵容器中的培養(yǎng)液的體積為8.3L。在接種之后52.8h有2018g的1，3-丙二醇在從橫向流過濾單位中收取的無生物催化劑物流中被收集。培養(yǎng)液的總體積為8.3+3.2+2.65＝14.15L。由此，所產(chǎn)生的1，3-丙二醇的總體積為75.7×14.15+2018＝3089g。在接種之后52.8h的體積產(chǎn)率為27kg/L/yr。由于該生物發(fā)酵容器中抑制性目標(biāo)分子濃度降低的原因，該產(chǎn)物形成速率增加了70％。
實(shí)施例2具有培養(yǎng)基再循環(huán)的AspenplusTM計(jì)算機(jī)模擬在本實(shí)施例中進(jìn)行了一種穩(wěn)態(tài)計(jì)算機(jī)模擬，以根據(jù)該模擬中存在的化合物的已知物理性質(zhì)來預(yù)測(cè)物質(zhì)流量。
構(gòu)建了一種AspenplusTM模擬以對(duì)細(xì)胞分離步驟、除水步驟以及SMB加工層析進(jìn)行模型構(gòu)建。生物發(fā)酵培養(yǎng)液加入物質(zhì)組成被預(yù)設(shè)含有9.606％的1，3-丙二醇(目標(biāo)分子)、4.73％的干細(xì)胞、0.48％的葡萄糖、0.961％的甘油、0.048％的乙酸、0.169％的磷酸鉀以及平衡的水。該生物發(fā)酵的細(xì)胞分離步驟除去了5％的上清液體作為無生物催化劑溶液并且將細(xì)胞和該上清的剩余物回送入該生物發(fā)酵容器。將該無生物催化劑溶液加入一種過程至過程(process-to-process)熱交換器，該熱交換器在約0.196atm下工作。將離開該熱交換器的液體和蒸氣分開。該液體是該加工層析的主要加入物。離開該熱交換器的蒸氣主要為水并且被壓縮至約0.2562atm并加入該過程至過程熱交換器的另一側(cè)，該蒸氣在該側(cè)冷凝。該冷凝物被用作為SMB加工層析的洗脫劑的主要成分。該洗脫劑的平衡物為從離開加工層析的產(chǎn)物流分離出的水。
該加工層析被建模作為一種50理論平板SMB(50 theoreticalplate SMB)，其中新的吸收劑被加入平板1并且洗脫劑被加入平板50。液體加入物在平板12，目標(biāo)分子流被從平板37收取。從平板37中收取的富含目標(biāo)分子的物流中的水被同有機(jī)物進(jìn)行分離并且同來自于過程至過程熱交換器的冷凝物合并以組成用于該加工層析的洗脫劑。在平板1中離開層析的液體為無生物催化劑和無目標(biāo)分子的溶液。該溶液同來自于細(xì)胞分離步驟的細(xì)胞和液體合并并且隨后回送到該生物發(fā)酵容器以進(jìn)行培養(yǎng)基再循環(huán)。選擇流的結(jié)果見表3。
表2十二烷相中的液體活性系數(shù)同水相中的活性系數(shù)的比值
表3
對(duì)比例不具有培養(yǎng)基再循環(huán)的AspenplusTM計(jì)算機(jī)模擬在本例中，進(jìn)行了與實(shí)施例2相同的一種穩(wěn)態(tài)計(jì)算機(jī)模擬；但是本例中無培養(yǎng)基再循環(huán)。在實(shí)施例2中1，3-丙二醇從該生物發(fā)酵容器中收取的凈速度為0.455kg/sec。構(gòu)建了一個(gè)模擬程序用來模擬相同的1，3-丙二醇從生物發(fā)酵容器中的收取速度，但是無生物催化劑溶液中的培養(yǎng)液成分(除1，3-丙二醇之外的)通過以相同的速度添加新的(非循環(huán)的)培養(yǎng)基來進(jìn)行補(bǔ)充。
構(gòu)建了一種AspenplusTM模擬程序以對(duì)細(xì)胞分離步驟以進(jìn)行模型構(gòu)建。生物發(fā)酵培養(yǎng)液加入物質(zhì)組成被預(yù)設(shè)含有9.606％的1，3-丙二醇(目標(biāo)分子)、4.73％的干細(xì)胞、0.48％的葡萄糖、0.961％的甘油、0.048％的乙酸、0.169％的磷酸鉀以及平衡的水。該生物發(fā)酵培養(yǎng)液的細(xì)胞分離步驟以4.512kg/sec除去了上清液體以作為無生物催化劑溶液，并且將細(xì)胞和該上清的剩余物回送入該生物發(fā)酵容器。這一無生物催化劑溶液流含有0.455kg/sec的1，3-丙二醇以及4.057kg/sec的除1，3-丙二醇之外的培養(yǎng)液成分。因此必須以4.057kg/sec(或者350,525kg/d)的速度向該生物發(fā)酵容器中添加新培養(yǎng)基以維持該生物發(fā)酵容器中的其它培養(yǎng)液成分的濃度。
序列表<110>納幕爾杜邦公司<120>一種用于生物發(fā)酵系統(tǒng)的產(chǎn)物收取方法<130>CL1813 PCT<150>US 60/285,555<151>2001-04-21<160>1<170>Microsoft Office 97<210>1<211>13543<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>質(zhì)粒<400>1tagtaaagcc ctcgctagat tttaatgcgg atgttgcgat tacttcgcca actattgcga60taacaagaaa aagccagcct ttcatgatat atctcccaat ttgtgtaggg cttattatgc120acgcttaaaa ataataaaag cagacttgac ctgatagttt ggctgtgagc aattatgtgc180ttagtgcatc taacgcttga gttaagccgc gccgcgaagc ggcgtcggct tgaacgaatt240gttagacatt atttgccgac taccttggtg atctcgcctt tcacgtagtg gacaaattct300tccaactgat ctgcgcgcga ggccaagcga tcttcttctt gtccaagata agcctgtcta360gcttcaagta tgacgggctg atactgggcc ggcaggcgct ccattgccca gtcggcagcg420
acatccttcg gcgcgatttt gccggttact gcgctgtacc aaatgcggga caacgtaagc480actacatttc gctcatcgcc agcccagtcg ggcggcgagt tccatagcgt taaggtttca540tttagcgcct caaatagatc ctgttcagga accggatcaa agagttcctc cgccgctgga600cctaccaagg caacgctatg ttctcttgct tttgtcagca agatagccag atcaatgtcg660atcgtggctg gctcgaagat acctgcaaga atgtcattgc gctgccattc tccaaattgc720agttcgcgct tagctggata acgccacgga atgatgtcgt cgtgcacaac aatggtgact780tctacagcgc ggagaatctc gctctctcca ggggaagccg aagtttccaa aaggtcgttg840atcaaagctc gccgcgttgt ttcatcaagc cttacggtca ccgtaaccag caaatcaata900tcactgtgtg gcttcaggcc gccatccact gcggagccgt acaaatgtac ggccagcaac960gtcggttcga gatggcgctc gatgacgcca actacctctg atagttgagt cgatacttcg1020gcgatcaccg cttccctcat gatgtttaac tttgttttag ggcgactgcc ctgctgcgta1080acatcgttgc tgctccataa catcaaacat cgacccacgg cgtaacgcgc ttgctgcttg1140gatgcccgag gcatagactg taccccaaaa aaacagtcat aacaagccat gaaaaccgcc1200actgcgccgt taccaccgct gcgttcggtc aaggttctgg accagttgcg tgagcgcata1260cgctacttgc attacagctt acgaaccgaa caggcttatg tccactgggt tcgtgccttc1320atccgtttcc acggtgtgcg tcacccggca accttgggca gcagcgaagt cgaggcattt1380ctgtcctggc tggcgaacga gcgcaaggtt tcggtctcca cgcatcgtca ggcattggcg1440gccttgctgt tcttctacgg caaggtgctg tgcacggatc tgccctggct tcaggagatc1500ggaagacctc ggccgtcgcg gcgcttgccg gtggtgctga ccccggatga agtggttcgc1560
atcctcggtt ttctggaagg cgagcatcgt ttgttcgccc agcttctgta tggaacgggc1620atgcggatca gtgagggttt gcaactgcgg gtcaaggatc tggatttcga tcacggcacg1680atcatcgtgc gggagggcaa gggctccaag gatcgggcct tgatgttacc cgagagcttg1740gcacccagcc tgcgcgagca ggggaattaa ttcccacggg ttttgctgcc cgcaaacggg1800ctgttctggt gttgctagtt tgttatcaga atcgcagatc cggcttcagc cggtttgccg1860gctgaaagcg ctatttcttc cagaattgcc atgatttttt ccccacggga ggcgtcactg1920gctcccgtgt tgtcggcagc tttgattcga taagcagcat cgcctgtttc aggctgtcta1980tgtgtgactg ttgagctgta acaagttgtc tcaggtgttc aatttcatgt tctagttgct2040ttgttttact ggtttcacct gttctattag gtgttacatg ctgttcatct gttacattgt2100cgatctgttc atggtgaaca gctttgaatg caccaaaaac tcgtaaaagc tctgatgtat2160ctatcttttt tacaccgttt tcatctgtgc atatggacag ttttcccttt gatatgtaac2220ggtgaacagt tgttctactt ttgtttgtta gtcttgatgc ttcactgata gatacaagag2280ccataagaac ctcagatcct tccgtattta gccagtatgt tctctagtgt ggttcgttgt2340ttttgcgtga gccatgagaa cgaaccattg agatcatact tactttgcat gtcactcaaa2400aattttgcct caaaactggt gagctgaatt tttgcagtta aagcatcgtg tagtgttttt2460cttagtccgt tatgtaggta ggaatctgat gtaatggttg ttggtatttt gtcaccattc2520atttttatct ggttgttctc aagttcggtt acgagatcca tttgtctatc tagttcaact2580tggaaaatca acgtatcagt cgggcggcct cgcttatcaa ccaccaattt catattgctg2640taagtgttta aatctttact tattggtttc aaaacccatt ggttaagcct tttaaactca2700
tggtagttat tttcaagcat taacatgaac ttaaattcat caaggctaat ctctatattt2760gccttgtgag ttttcttttg tgttagttct tttaataacc actcataaat cctcatagag2820tatttgtttt caaaagactt aacatgttcc agattatatt ttatgaattt ttttaactgg2880aaaagataag gcaatatctc ttcactaaaa actaattcta atttttcgct tgagaacttg2940gcatagtttg tccactggaa aatctcaaag cctttaacca aaggattcct gatttccaca3000gttctcgtca tcagctctct ggttgcttta gctaatacac cataagcatt ttccctactg3060atgttcatca tctgagcgta ttggttataa gtgaacgata ccgtccgttc tttccttgta3120gggttttcaa tcgtggggtt gagtagtgcc acacagcata aaattagctt ggtttcatgc3180tccgttaagt catagcgact aatcgctagt tcatttgctt tgaaaacaac taattcagac3240atacatctca attggtctag gtgattttaa tcactatacc aattgagatg ggctagtcaa3300tgataattac tagtcctttt cctttgagtt gtgggtatct gtaaattctg ctagaccttt3360gctggaaaac ttgtaaattc tgctagaccc tctgtaaatt ccgctagacc tttgtgtgtt3420ttttttgttt atattcaagt ggttataatt tatagaataa agaaagaata aaaaaagata3480aaaagaatag atcccagccc tgtgtataac tcactacttt agtcagttcc gcagtattac3540aaaaggatgt cgcaaacgct gtttgctcct ctacaaaaca gaccttaaaa ccctaaaggc3600ttaagtagca ccctcgcaag ctcgggcaaa tcgctgaata ttccttttgt ctccgaccat3660caggcacctg agtcgctgtc tttttcgtga cattcagttc gctgcgctca cggctctggc3720agtgaatggg ggtaaatggc actacaggcg ccttttatgg attcatgcaa ggaaactacc3780cataatacaa gaaaagcccg tcacgggctt ctcagggcgt tttatggcgg gtctgctatg3840
tggtgctatc tgactttttg ctgttcagca gttcctgccc tctgattttc cagtctgacc3900acttcggatt atcccgtgac aggtcattca gactggctaa tgcacccagt aaggcagcgg3960tatcatcaac aggcttaccc gtcttactgt cgggaattca tttaaatagt caaaagcctc4020cgaccggagg cttttgactg ctaggcgatc tgtgctgttt gccacggtat gcagcaccag4080cgcgagatta tgggctcgca cgctcgactg tcggacgggg gcactggaac gagaagtcag4140gcgagccgtc acgcccttga ctatgccaca tcctgagcaa ataattcaac cactaaacaa4200atcaaccgcg tttcccggag gtaaccaagc ttgcgggaga gaatgatgaa caagagccaa4260caagttcaga caatcaccct ggccgccgcc cagcaaatgg cggcggcggt ggaaaaaaaa4320gccactgaga tcaacgtggc ggtggtgttt tccgtagttg accgcggagg caacacgctg4380cttatccagc ggatggacga ggccttcgtc tccagctgcg atatttccct gaataaagcc4440tggagcgcct gcagcctgaa gcaaggtacc catgaaatta cgtcagcggt ccagccagga4500caatctctg4t acggtctgca gctaaccaac caacagcgaa ttattatttt tggcggcggc4560ctgccagtta tttttaatga gcaggtaatt ggcgccgtcg gcgttagcgg cggtacggtc4620gagcaggatc aattattagc ccagtgcgcc ctggattgtt tttccgcatt ataacctgaa4680gcgagaaggt atattatgag ctatcgtatg ttccgccagg cattctgagt gttaacgagg4740ggaccgtcat gtcgctttca ccgccaggcg tacgcctgtt ttacgatccg cgcgggcacc4800atgccggcgc catcaatgag ctgtgctggg ggctggagga gcagggggtc ccctgccaga4860ccataaccta tgacggaggc ggtgacgccg ctgcgctggg cgccctggcg gccagaagct4920cgcccctgcg ggtgggtatc gggctcagcg cgtccggcga gatagccctc actcatgccc4980
agctgccggc ggacgcgccg ctggctaccg gacacgtcac cgatagcgac gatcaactgc5040gtacgctcgg cgccaacgcc gggcagctgg ttaaagtcct gccgttaagt gagagaaact5100gaatgtatcg tatctatacc cgcaccgggg ataaaggcac caccgccctg tacggcggca5160gccgcatcga gaaagaccat attcgcgtcg aggcctacgg caccgtcgat gaactgatat5220cccagctggg cgtctgctac gccacgaccc gcgacgccgg gctgcgggaa agcctgcacc5280atattcagca gacgctgttc gtgctggggg ctgaactggc cagcgatgcg cggggcctga5340cccgcctgag ccagacgatc ggcgaagagg agatcaccgc cctggagcgg cttatcgacc5400gcaatatggc cgagagcggc ccgttaaaac agttcgtgat cccggggagg aatctcgcct5460ctgcccagct gcacgtggcg cgcacccagt cccgtcggct cgaacgcctg ctgacggcca5520tggaccgcgc gcatccgctg cgcgacgcgc tcaaacgcta cagcaatcgc ctgtcggatg5580ccctgttctc catggcgcga atcgaagaga ctaggcctga tgcttgcgct tgaactggcc5640tagcaaacac agaaaaaagc ccgcacctga cagtgcgggc tttttttttc ctaggcgatc5700tgtgctgttt gccacggtat gcagcaccag cgcgagatta tgggctcgca cgctcgactg5760tcggacgggg gcactggaac gagaagtcag gcgagccgtc acgcccttga ctatgccaca5820tcctgagcaa ataattcaac cactaaacaa atcaaccgcg tttcccggag gtaaccaagc5880ttcacctttt gagccgatga acaatgaaaa gatcaaaacg atttgcagta ctggcccagc5940gccccgtcaa tcaggacggg ctgattggcg agtggcctga agaggggctg atcgccatgg6000acagcccctt tgacccggtc tcttcagtaa aagtggacaa cggtctgatc gtcgaactgg6060acggcaaacg ccgggaccag tttgacatga tcgaccgatt tatcgccgat tacgcgatca6120
acgttgagcg cacagagcag gcaatgcgcc tggaggcggt ggaaatagcc cgtatgctgg6180tggatattca cgtcagccgg gaggagatca ttgccatcac taccgccatc acgccggcca6240aagcggtcga ggtgatggcg cagatgaacg tggtggagat gatgatggcg ctgcagaaga6300tgcgtgcccg ccggaccccc tccaaccagt gccacgtcac caatctcaaa gataatccgg6360tgcagattgc cgctgacgcc gccgaggccg ggatccgcgg cttctcagaa caggagacca6420cggtcggtat cgcgcgctac gcgccgttta acgccctggc gctgttggtc ggttcgcagt6480gcggccgccc cggcgtgttg acgcagtgct cggtggaaga ggccaccgag ctggagctgg6540gcatgcgtgg cttaaccagc tacgccgaga cggtgtcggt ctacggcacc gaagcggtat6600ttaccgacgg cgatgatacg ccgtggtcaa aggcgttcct cgcctcggcc tacgcctccc6660gcgggttgaa aatgcgctac acctccggca ccggatccga agcgctgatg ggctattcgg6720agagcaagtc gatgctctac ctcgaatcgc gctgcatctt cattactaaa ggcgccgggg6780ttcagggact gcaaaacggc gcggtgagct gtatcggcat gaccggcgct gtgccgtcgg6840gcattcgggc ggtgctggcg gaaaacctga tcgcctctat gctcgacctc gaagtggcgt6900ccgccaacga ccagactttc tcccactcgg atattcgccg caccgcgcgc accctgatgc6960agatgctgcc gggcaccgac tttattttct ccggctacag cgcggtgccg aactacgaca7020acatgttcgc cggctcgaac ttcgatgcgg aagattttga tgattacaac atcctgcagc7080gtgacctgat ggttgacggc ggcctgcgtc cggtgaccga ggcggaaacc attgccattc7140gccagaaagc ggcgcgggcg atccaggcgg ttttccgcga gctggggctg ccgccaatcg7200ccgacgagga ggtggaggcc gccacctacg cgcacggcag caacgagatg ccgccgcgta7260
acgtggtgga ggatctgagt gcggtggaag agatgatgaa gcgcaacatc accggcctcg7320atattgtcgg cgcgctgagc cgcagcggct ttgaggatat cgccagcaat attctcaata7380tgctgcgcca gcgggtcacc ggcgattacc tgcagacctc ggccattctc gatcggcagt7440tcgaggtggt gagtgcggtc aacgacatca atgactatca ggggccgggc accggctatc7500gcatctctgc cgaacgctgg gcggagatca aaaatattcc gggcgtggtt cagcccgaca7560ccattgaata aggcggtatt cctgtgcaac agacaaccca aattcagccc tcttttaccc7620tgaaaacccg cgagggcggg gtagcttctg ccgatgaacg cgccgatgaa gtggtgatcg7680gcgtcggccc tgccttcgat aaacaccagc atcacactct gatcgatatg ccccatggcg7740cgatcctcaa agagctgatt gccggggtgg aagaagaggg gcttcacgcc cgggtggtgc7800gcattctgcg cacgtccgac gtctccttta tggcctggga tgcggccaac ctgagcggct7860cggggatcgg catcggtatc cagtcgaagg ggaccacggt catccatcag cgcgatctgc7920tgccgctcag caacctggag ctgttctccc aggcgccgct gctgacgctg gagacctacc7980ggcagattgg caaaaacgct gcgcgctatg cgcgcaaaga gtcaccttcg ccggtgccgg8040tggtgaacga tcagatggtg cggccgaaat ttatggccaa agccgcgcta tttcatatca8100aagagaccaa acatgtggtg caggacgccg agcccgtcac cctgcacatc gacttagtaa8160gggagtgacc atgagcgaga aaaccatgcg cgtgcaggat tatccgttag ccacccgctg8220cccggagcat atcctgacgc ctaccggcaa accattgacc gatattaccc tcgagaaggt8280gctctctggc gaggtgggcc cgcaggatgt gcggatctcc cgccagaccc ttgagtacca8340ggcgcagatt gccgagcaga tgcagcgcca tgcggtggcg cgcaatttcc gccgcgcggc8400
ggagcttatc gccattcctg acgagcgcat tctggctatc tataacgcgc tgcgcccgtt8460ccgctcctcg caggcggagc tgctggcgat cgccgacgag ctggagcaca cctggcatgc8520gacagtgaat gccgcctttg tccgggagtc ggcggaagtg tatcagcagc ggcataagct8580gcgtaaagga agctaagcgg aggtcagcat gccgttaata gccgggattg atatcggcaa8640cgccaccacc gaggtggcgc tggcgtccga ctacccgcag gcgagggcgt ttgttgccag8700cgggatcgtc gcgacgacgg gcatgaaagg gacgcgggac aatatcgccg ggaccctcgc8760cgcgctggag caggccctgg cgaaaacacc gtggtcgatg agcgatgtct ctcgcatcta8820tcttaacgaa gccgcgccgg tgattggcga tgtggcgatg gagaccatca ccgagaccat8880tatcaccgaa tcgaccatga tcggtcataa cccgcagacg ccgggcgggg tgggcgttgg8940cgtggggacg actatcgccc tcgggcggct ggcgacgctg ccggcggcgc agtatgccga9000ggggtggatc gtactgattg acgacgccgt cgatttcctt gacgccgtgt ggtggctcaa9060tgaggcgctc gaccggggga tcaacgtggt ggcggcgatc ctcaaaaagg acgacggcgt9120gctggtgaac aaccgcctgc gtaaaaccct gccggtggtg gatgaagtga cgctgctgga9180gcaggtcccc gagggggtaa tggcggcggt ggaagtggcc gcgccgggcc aggtggtgcg9240gatcctgtcg aatccctacg ggatcgccac cttcttcggg ctaagcccgg aagagaccca9300ggccatcgtc cccatcgccc gcgccctgat tggcaaccgt tccgcggtgg tgctcaagac9360cccgcagggg gatgtgcagt cgcgggtgat cccggcgggc aacctctaca ttagcggcga9420aaagcgccgc ggagaggccg atgtcgccga gggcgcggaa gccatcatgc aggcgatgag9480cgcctgcgct ccggtacgcg acatccgcgg cgaaccgggc acccacgccg gcggcatgct9540
tgagcgggtg cgcaaggtaa tggcgtccct gaccggccat gagatgagcg cgatatacat9600ccaggatctg ctggcggtgg atacgtttat tccgcgcaag gtgcagggcg ggatggccgg9660cgagtgcgcc atggagaatg ccgtcgggat ggcggcgatg gtgaaagcgg atcgtctgca9720aatgcaggtt atcgcccgcg aactgagcgc ccgactgcag accgaggtgg tggtgggcgg9780cgtggaggcc aacatggcca tcgccggggc gttaaccact cccggctgtg cggcgccgct9840ggcgatcctc gacctcggcg ccggctcgac ggatgcggcg atcgtcaacg cggaggggca9900gataacggcg gtccatctcg ccggggcggg gaatatggtc agcctgttga ttaaaaccga9960gctgggcctc gaggatcttt cgctggcgga agcgataaaa aaatacccgc tggccaaagt10020ggaaagcctg ttcagtattc gtcacgagaa tggcgcggtg gagttctttc gggaagccct10080cagcccggcg gtgttcgcca aagtggtgta catcaaggag ggcgaactgg tgccgatcga10140taacgccagc ccgctggaaa aaattcgtct cgtgcgccgg caggcgaaag agaaagtgtt10200tgtcaccaac tgcctgcgcg cgctgcgcca ggtctcaccc ggcggttcca ttcgcgatat10260cgcctttgtg gtgctggtgg gcggctcatc gctggacttt gagatcccgc agcttatcac10320ggaagccttg tcgcactatg gcgtggtcgc cgggcagggc aatattcggg gaacagaagg10380gccgcgcaat gcggtcgcca ccgggctgct actggccggt caggcgaatt aaacgggcgc10440tcgcgccagc ctctaggtac aaataaaaaa ggcacgtcag atgacgtgcc ttttttcttg10500tctagcgtgc accaatgctt ctggcgtcag gcagccatcg gaagctgtgg tatggctgtg10560caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc gctcaaggcg cactcccgtt ctggataatg10620ttttttgcgc cgacatcata acggttctgg caaatattct gaaatgagct gttgacaatt10680
aatcatccgg ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac10740agaccatgac tagtaaggag gacaattcca tggctgctgc tgctgataga ttaaacttaa10800cttccggcca cttgaatgct ggtagaaaga gaagttcctc ttctgtttct ttgaaggctg10860ccgaaaagcc tttcaaggtt actgtgattg gatctggtaa ctggggtact actattgcca10920aggtggttgc cgaaaattgt aagggatacc cagaagtttt cgctccaata gtacaaatgt10980gggtgttcga agaagagatc aatggtgaaa aattgactga aatcataaat actagacatc11040aaaacgtgaa atacttgcct ggcatcactc tacccgacaa tttggttgct aatccagact11100tgattgattc agtcaaggat gtcgacatca tcgttttcaa cattccacat caatttttgc11160cccgtatctg tagccaattg aaaggtcatg ttgattcaca cgtcagagct atctcctgtc11220taaagggttt tgaagttggt gctaaaggtg tccaattgct atcctcttac atcactgagg11280aactaggtat tcaatgtggt gctctatctg gtgctaacat tgccaccgaa gtcgctcaag11340aacactggtc tgaaacaaca gttgcttacc acattccaaa ggatttcaga ggcgagggca11400aggacgtcga ccataaggtt ctaaaggcct tgttccacag accttacttc cacgttagtg11460tcatcgaaga tgttgctggt atctccatct gtggtgcttt gaagaacgtt gttgccttag11520gttgtggttt cgtcgaaggt ctaggctggg gtaacaacgc ttctgctgcc atccaaagag11580tcggtttggg tgagatcatc agattcggtc aaatgttttt cccagaatct agagaagaaa11640catactacca agagtctgct ggtgttgctg atttgatcac cacctgcgct ggtggtagaa11700acgtcaaggt tgctaggcta atggctactt ctggtaagga cgcctgggaa tgtgaaaagg11760agttgttgaa tggccaatcc gctcaaggtt taattacctg caaagaagtt cacgaatggt11820
tggaaacatg tggctctgtc gaagacttcc cattatttga agccgtatac caaatcgttt11880acaacaacta cccaatgaag aacctgccgg acatgattga agaattagat ctacatgaag11940attagattta ttggatccag gaaacagact agaattatgg gattgactac taaacctcta12000tctttgaaag ttaacgccgc tttgttcgac gtcgacggta ccattatcat ctctcaacca12060gccattgctg cattctggag ggatttcggt aaggacaaac cttatttcga tgctgaacac12120gttatccaag tctcgcatgg ttggagaacg tttgatgcca ttgctaagtt cgctccagac12180tttgccaatg aagagtatgt taacaaatta gaagctgaaa ttccggtcaa gtacggtgaa12240aaatccattg aagtcccagg tgcagttaag ctgtgcaacg ctttgaacgc tctaccaaaa12300gagaaatggg ctgtggcaac ttccggtacc cgtgatatgg cacaaaaatg gttcgagcat12360ctgggaatca ggagaccaaa gtacttcatt accgctaatg atgtcaaaca gggtaagcct12420catccagaac catatctgaa gggcaggaat ggcttaggat atccgatcaa tgagcaagac12480ccttccaaat ctaaggtagt agtatttgaa gacgctccag caggtattgc cgccggaaaa12540gccgccggtt gtaagatcat tggtattgcc actactttcg acttggactt cctaaaggaa12600aaaggctgtg acatcattgt caaaaaccac gaatccatca gagttggcgg ctacaatgcc12660gaaacagacg aagttgaatt catttttgac gactacttat atgctaagga cgatctgttg12720aaatggtaac ccgggctgca ggcatgcaag cttggctgtt ttggcggatg agagaagatt12780ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct12840ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt12900agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat12960
aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa13020cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc13080cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata aactgccagg catcaaatta agcagaaggc13140catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct acaaactcca gctggatcgg gcgctagagt13200atacatttaa atggtaccct ctagtcaagg ccttaagtga gtcgtattac ggactggccg13260tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag13320cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc13380aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc13440tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat13500agttaagcca gccccgacac ccgccaacac ccgctgacga gct 1354權(quán)利要求
1.一種在生物發(fā)酵系統(tǒng)中使用的產(chǎn)物收取方法，該方法包括a)在生物發(fā)酵的至少一部分時(shí)間從一部分含有目標(biāo)分子的生物發(fā)酵溶液中收取至少大部分生物催化劑；b)從步驟a)所產(chǎn)生的無生物催化劑溶液中除去一部分水；c)任選在步驟b)之前或者之后從該無生物催化劑溶液中除去目標(biāo)分子之外的成分；d)加入以下成分通過層析介質(zhì)1)由步驟b)或者c)所產(chǎn)生的無生物催化劑溶液，以及2)一種洗脫劑；e)從該層析介質(zhì)釋放的無生物催化劑溶液的第一個(gè)級(jí)分中回收該目標(biāo)分子；f)任選從該層析介質(zhì)釋放的無生物催化劑和無目標(biāo)分子溶液的第二個(gè)級(jí)分中除去非水性洗脫劑；g)任選將在步驟b)中從無生物催化劑溶液中收取的水加入至步驟e)或者f)之后的無生物催化劑和無目標(biāo)分子溶液之中，所加入的量適于向該生物發(fā)酵系統(tǒng)的回送；以及h)將來自于步驟d)、e)、f)或者g)中任意步驟的無生物催化劑和無目標(biāo)分子溶液回送入該生物發(fā)酵系統(tǒng)。
2.一種在生物發(fā)酵系統(tǒng)中使用的產(chǎn)物收取方法，該方法包括a)在生物發(fā)酵的至少一部分時(shí)間從一部分含有目標(biāo)分子的生物發(fā)酵溶液中收取至少大部分生物催化劑，該目標(biāo)分子比水揮發(fā)性高；b)任選在步驟c)之前從步驟a)所產(chǎn)生的無生物催化劑溶液中除去目標(biāo)分子之外的成分；c)加入以下成分通過層析介質(zhì)1)步驟a)或者b)的無生物催化劑溶液，以及2)一種洗脫劑；d)從該層析介質(zhì)釋放的無生物催化劑溶液的第一個(gè)級(jí)分中回收該目標(biāo)分子；e)從該層析介質(zhì)釋放的無生物催化劑和無目標(biāo)分子溶液的第二個(gè)級(jí)分中除去一部分水；f)任選，在步驟e)之前或者之后從該層析介質(zhì)釋放的無生物催化劑和無目標(biāo)分子溶液的第二個(gè)級(jí)分中除去非水性洗脫劑；以及g)將來自于步驟e)或者f)中的無生物催化劑和無目標(biāo)分子溶液回送入該生物發(fā)酵系統(tǒng)。
3.權(quán)利要求1或者2的產(chǎn)物收取方法，其中該洗脫劑含有分別通過除水步驟b)或者e)所產(chǎn)生的水。
4.權(quán)利要求3的產(chǎn)物收取方法，其中該洗脫劑含有水和非水性洗脫劑的混合物。
5.權(quán)利要求4的產(chǎn)物收取方法，其中該非水性洗脫劑為一種短鏈醇或者丙酮。
6.權(quán)利要求3的產(chǎn)物收取方法，其中該洗脫劑為水。
7.權(quán)利要求1的產(chǎn)物收取方法，其中大約50-80％的水被從步驟(a)的無生物催化劑溶液中除去。
8.權(quán)利要求1的產(chǎn)物收取方法，其中在步驟(g)中添加的適量的水使該無生物催化劑和無目標(biāo)分子溶液的水含量恢復(fù)至大約等于在步驟(b)之前的無生物催化劑溶液中的水含量。
9.權(quán)利要求1的產(chǎn)物收取方法，其中在步驟g)中添加的適量的水使該無生物催化劑和無目標(biāo)分子溶液的水含量恢復(fù)至低于在步驟(b)之前的無生物催化劑溶液中的水含量。
10.權(quán)利要求2的產(chǎn)物收取方法，其中大約50-80％的水被從步驟(e)的無生物催化劑和無目標(biāo)分子溶液中除去。
11.權(quán)利要求2的產(chǎn)物收取方法，其中在步驟(g)中添加的適量的水使該無生物催化劑和無目標(biāo)分子溶液的水含量恢復(fù)至大約等于在步驟(c)之前的無生物催化劑溶液中的水含量。
12.權(quán)利要求2的產(chǎn)物收取方法，其中在步驟g)中添加的適量的水使該無生物催化劑和無目標(biāo)分子溶液的水含量恢復(fù)至低于在步驟(c)之前的無生物催化劑溶液中的水含量。
13.權(quán)利要求1的產(chǎn)物收取方法，其中該目標(biāo)分子為1，3-丙二醇。
14.一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)用于在目標(biāo)分子的生物發(fā)酵的至少一部分時(shí)間進(jìn)行原位產(chǎn)物收取，該系統(tǒng)包括a)一種生物催化劑分離裝置，該裝置用于從一部分含有目標(biāo)分子的生物發(fā)酵溶液中收取至少大部分生物催化劑；b)一種除水裝置，該裝置用于從a)的生物催化劑分離裝置中產(chǎn)生的無生物催化劑溶液中除去一部分水；c)任選在步驟b)之前或者之后的一種除去裝置，該除去裝置從由b)的除水裝置產(chǎn)生的無生物催化劑溶液中除去目標(biāo)分子或水之外的成分；d)一種加工層析裝置，由b)的除水裝置或者c)的除去裝置所產(chǎn)生的無生物催化劑溶液和一種洗脫劑通過該裝置；e)一種目標(biāo)分子回收裝置，該裝置從d)的加工層析裝置所釋放的第一個(gè)級(jí)分中回收該目標(biāo)分子；f)任選的一種非水性洗脫劑除去裝置，該裝置從d)的加工層析裝置所釋放的第二個(gè)級(jí)分中除去非水性洗脫劑；g)一種加水裝置，該裝置將b)產(chǎn)生的水加入至e)或者f)所產(chǎn)生的無生物催化劑和無目標(biāo)分子溶液之中，所加入的量適于向該生物發(fā)酵系統(tǒng)的回送；以及h)一種再循環(huán)裝置，該裝置將來自于d)、e)、f)或者g)中的無生物催化劑和無目標(biāo)分子溶液回送入該生物發(fā)酵系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及到一種生物加工過程溶液，該溶液用于一種產(chǎn)物收取方法，該方法用于一種生物發(fā)酵。本發(fā)明披露了一種方法，該方法用于在生物發(fā)酵的至少一部分時(shí)間從該生物發(fā)酵容器中取出一份培養(yǎng)液，收取生物催化劑和水，使用水作為洗脫劑通過層析從所取出的培養(yǎng)液中分離生物發(fā)酵產(chǎn)物，并且將該培養(yǎng)液的剩余成分回送入該生物發(fā)酵容器。該加工層析允許進(jìn)行該目標(biāo)分子的高選擇性分離，防止了對(duì)該生物發(fā)酵的反饋抑制。
文檔編號(hào)C12M1/12GK1503846SQ02808578
公開日2004年6月9日 申請(qǐng)日期2002年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月20日
發(fā)明者A·E·維爾金斯, A E 維爾金斯, D·J·羅維, 羅維 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司