專利名稱：細(xì)胞表層結(jié)合性蛋白質(zhì)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞表層結(jié)合性蛋白質(zhì)，具有糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域，且該糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域至少N末端側(cè)或C末端側(cè)結(jié)合有其它蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
細(xì)胞表層定位蛋白質(zhì)是存在并固定于細(xì)胞表層的蛋白質(zhì)。例如α-或a-凝集素，它是一種酵母的絮凝蛋白。這種蛋白質(zhì)具有分泌信號(hào)序列，在這一點(diǎn)上與分泌蛋白相同，但是這種蛋白質(zhì)通過(guò)GPI錨固定在細(xì)胞膜上進(jìn)行輸送，在這一點(diǎn)上又與分泌蛋白不同。一般情況下，細(xì)胞表層定位蛋白質(zhì)在C末端側(cè)具有GPI錨定區(qū)域。細(xì)胞表層定位蛋白質(zhì)在通過(guò)細(xì)胞膜時(shí)，該區(qū)域的一部分(即，GPI錨附著識(shí)別信號(hào)序列)被選擇性切斷，新突出的C末端部分與GPI錨結(jié)合在細(xì)胞膜上，從而固定在細(xì)胞膜上。接著，通過(guò)磷脂酰肌醇依賴性磷脂酶C(PI-PLC)將GPI錨的根部切斷。然后，由細(xì)胞膜使斷開的蛋白質(zhì)嵌入細(xì)胞壁中，固定在細(xì)胞表層，而定位于細(xì)胞表層。其中，GPI錨是指被稱為葡糖基磷脂酰肌醇(GPI)的以乙醇胺磷酸-6甘露糖α1-2甘露糖α1-6甘露糖α1-4葡糖胺α1-6肌醇磷脂質(zhì)為基本結(jié)構(gòu)的糖脂。
GPI錨定區(qū)域通常位于細(xì)胞表層定位蛋白質(zhì)的C末端或其附近。例如，在對(duì)α-凝集素的C末端起320個(gè)氨基酸序列進(jìn)行編碼的序列中，除GPI錨附著識(shí)別信號(hào)序列以外，還具有4個(gè)糖鏈結(jié)合部位。GPI錨用PI-PLC切斷后，通過(guò)這些糖鏈與構(gòu)成細(xì)胞壁的多糖類形成共價(jià)鍵，使得α-凝集素的C末端序列部分與細(xì)胞壁結(jié)合，而將α-凝集素保留在細(xì)胞表層。
利用這種GPI錨定區(qū)域，本發(fā)明人成功地在細(xì)胞表層表達(dá)了脂肪酶(特開平11-290078號(hào)公報(bào))。即，在對(duì)GPI錨定區(qū)域進(jìn)行編碼的DNA的上游設(shè)置脂肪酶的結(jié)構(gòu)基因，再在上游設(shè)置分泌信號(hào)序列，使脂肪酶在細(xì)胞表層表達(dá)，其N末端側(cè)位于細(xì)胞的外側(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
這樣表達(dá)的蛋白質(zhì)只要在N末端側(cè)具有活性中心，就能夠在細(xì)胞表層顯示充分的活性。但是，當(dāng)活性中心位于C末端側(cè)時(shí)，活性中心距細(xì)胞表層過(guò)近，以致有可能引起立體位阻，而不能顯示充分的活性。
因此，本發(fā)明人研究了各種使蛋白質(zhì)在細(xì)胞表層進(jìn)行表達(dá)的方法，結(jié)果出乎意料地發(fā)現(xiàn)，即使喪失了以前認(rèn)為必須的GPI錨定區(qū)域的功能時(shí)，GPI錨定蛋白也能保持在細(xì)胞表層，從而完成了本發(fā)明。也就是說(shuō)，只要至少含有GPI錨定蛋白的絮凝功能區(qū)域，通過(guò)構(gòu)筑可使所需蛋白質(zhì)在其N末端側(cè)或C末端側(cè)任意一方，或者既在N末端側(cè)又在C末端側(cè)表達(dá)的質(zhì)粒，就能夠使所需的蛋白質(zhì)在細(xì)胞表層表達(dá)。
本發(fā)明提供一種細(xì)胞表層結(jié)合性蛋白質(zhì)，它具有糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域，該糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域至少N末端側(cè)或C末端側(cè)結(jié)合有其它蛋白質(zhì)。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，上述糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域是至少含有GPI錨定蛋白的絮凝功能區(qū)域部分。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，上述GPI錨定蛋白是絮凝蛋白。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述絮凝蛋白是選自FLO1、FLO2、FLO4、FLO5、FLO9、FLO10和FLO11的蛋白質(zhì)。
在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，上述其它蛋白質(zhì)結(jié)合在上述糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域的N末端側(cè)。
在更優(yōu)選實(shí)施方式中，上述其它蛋白質(zhì)結(jié)合在上述糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域的C末端側(cè)。
在進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方式中，上述其它蛋白質(zhì)為脂肪酶。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，上述其它蛋白質(zhì)為抗體。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，上述糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域的N末端側(cè)和C末端側(cè)結(jié)合有相同或不同的其它蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供對(duì)上述細(xì)胞表層結(jié)合性蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的DNA。
本發(fā)明還提供含有上述DNA的質(zhì)粒。
本發(fā)明還提供引入上述DNA或者上述質(zhì)粒，在細(xì)胞表層表達(dá)上述其它蛋白質(zhì)的細(xì)胞。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，上述細(xì)胞為酵母。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，上述其它蛋白質(zhì)為酶。
本發(fā)明還提供上述細(xì)胞的使用方法，使上述其它蛋白質(zhì)與基質(zhì)接觸，以便與該基質(zhì)結(jié)合，或者將該基質(zhì)轉(zhuǎn)變成其它物質(zhì)。
本發(fā)明還提供含有上述細(xì)胞的酶劑。


圖1為制作質(zhì)粒pWIFSpmROL的示意圖。
圖2為各種細(xì)胞表層具有脂肪酶的酵母的繁殖以及脂肪酶活性示意圖。
圖3是為表達(dá)短型FLO1脂肪酶的酵母MT8-1-short和表達(dá)長(zhǎng)型FLO1脂肪酶的酵母MT8-1-long的甲醇分解反應(yīng)活性示意圖。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中，細(xì)胞表層結(jié)合性蛋白質(zhì)是指至少含有糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域以及其它蛋白質(zhì)的融合蛋白，該蛋白質(zhì)通過(guò)糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域固定在細(xì)胞表層。
在本發(fā)明中，糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域是指具有多個(gè)糖鏈，且該糖鏈能夠通過(guò)與細(xì)胞壁中的糖鏈的相互作用或者相互纏繞而留在細(xì)胞表層的區(qū)域。例如，外源凝血素、類外源凝血素蛋白質(zhì)等的糖鏈結(jié)合部位等。其中有代表性的可以列舉出GPI錨定蛋白的絮凝功能區(qū)域。GPI錨定蛋白的絮凝功能區(qū)域是指位于GPI錨定區(qū)域N末端側(cè)，具有多個(gè)糖鏈，且被認(rèn)為是與絮凝相關(guān)的區(qū)域。
在本發(fā)明中，GPI錨定蛋白一般是指細(xì)胞表層定位蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)能夠通過(guò)存在于細(xì)胞膜上的GPI錨而結(jié)合在細(xì)胞膜上。GPI錨定蛋白在N末端具有分泌信號(hào)序列，并在C末端具有GPI錨定區(qū)域。例如，GPI錨定蛋白，可以舉出酵母的絮凝蛋白(α-凝集素、a-凝集素、FLO蛋白質(zhì))、堿性磷酸酶等，但是并不限于此。作為特別適用于本發(fā)明的絮凝蛋白，可以舉出FLO蛋白質(zhì)，如FLO1、FLO2、FLO4、FLO5、FLO9、FLO10和FLO11。
在本發(fā)明中，GPI錨定區(qū)域是指細(xì)胞壁錨定區(qū)域以及GPI錨附著識(shí)別信號(hào)序列。通常位于細(xì)胞表層定位蛋白質(zhì)的C末端或其附近。例如，酵母的α-凝集素中，是C末端起320個(gè)氨基酸的序列。
GPI錨定區(qū)域中GPI錨附著識(shí)別信號(hào)序列是識(shí)別細(xì)胞膜上的GPI錨的部分。將C末端的GPI錨附著識(shí)別信號(hào)序列切斷后，GPI錨與新突出的C末端結(jié)合。接著，結(jié)合的GPI錨的根部通過(guò)PI-PLC切斷，由此蛋白質(zhì)與細(xì)胞膜分離并嵌入細(xì)胞壁中。其中，存在于細(xì)胞壁錨定區(qū)域的糖鏈與細(xì)胞壁中的糖鏈結(jié)合，由此將蛋白質(zhì)固定在細(xì)胞表層。
本發(fā)明的細(xì)胞表層結(jié)合性蛋白質(zhì)包括(1)在糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域的N末端側(cè)與其它蛋白質(zhì)結(jié)合的融合蛋白，(2)在糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域的C末端側(cè)與其它蛋白質(zhì)結(jié)合的融合蛋白，以及(3)在糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域的N末端側(cè)和C末端側(cè)這兩處結(jié)合相同或不同蛋白質(zhì)的融合蛋白。其它蛋白質(zhì)可以直接結(jié)合在糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域，也可以通過(guò)接頭結(jié)合。另外，最靠近N末端側(cè)結(jié)合有分泌信號(hào)序列。
構(gòu)成本發(fā)明的細(xì)胞表層結(jié)合性蛋白質(zhì)的其它蛋白質(zhì)沒有特別的限定，優(yōu)選本來(lái)并非定位于細(xì)胞表層的蛋白質(zhì)，而是以固定在細(xì)胞表層為目的而設(shè)置的蛋白質(zhì)。例如，可以舉出分泌性蛋白質(zhì)、抗體等。作為分泌性蛋白質(zhì)，可以舉出脂肪酶、淀粉酶類(葡糖淀粉酶、α-淀粉酶等)、纖維素酶類、熒光蛋白、A蛋白及其衍生物等。
這種酶可以根據(jù)其特性決定在N末端側(cè)融合還是在C末端側(cè)融合。特別是在C末端側(cè)具有活性中心的蛋白質(zhì)，如脂肪酶，優(yōu)選結(jié)合在糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域的C末端側(cè)。該蛋白質(zhì)可直接結(jié)合在糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域的C末端側(cè)，也可以通過(guò)GPI錨定區(qū)域的一部分結(jié)合。
在N末端側(cè)進(jìn)行融合時(shí)，蛋白質(zhì)優(yōu)選為在分泌信號(hào)序列與糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域之間融合。另外，例如，在糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域的C末端側(cè)還可能含有一部分GPI錨定區(qū)域。但是，這時(shí)不含有GPI錨附著識(shí)別信號(hào)，因此表達(dá)的融合蛋白并不是通過(guò)GPI錨固定在細(xì)胞表層。
分泌信號(hào)序列是一種氨基酸序列，它一般結(jié)合在分泌到細(xì)胞外(包括胞質(zhì))的蛋白質(zhì)(分泌性蛋白質(zhì))的N末端，且含有大量強(qiáng)疏水性氨基酸，通常，在分泌性蛋白質(zhì)由細(xì)胞內(nèi)通過(guò)細(xì)胞膜分泌到細(xì)胞外時(shí)被除去。
在本發(fā)明中，可使用任何分泌信號(hào)序列，只要是能夠?qū)⒈磉_(dá)的融合蛋白導(dǎo)入細(xì)胞膜的分泌信號(hào)序列即可，而不用考慮來(lái)源。例如，作為分泌信號(hào)序列，適于使用葡萄糖淀粉酶的分泌信號(hào)序列、酵母的α-或a-凝集素信號(hào)序列、脂肪酶的分泌信號(hào)序列等。只要不影響細(xì)胞表層結(jié)合性蛋白質(zhì)融合的其它蛋白質(zhì)的活性，分泌信號(hào)序列及部分或全部前序列也可以殘留在N末端。
在本說(shuō)明書中，脂肪酶是指具有能夠使脂肪酸從油脂游離的活性的蛋白質(zhì)(酶)。其中，油脂是指脂肪酸結(jié)合在甘油上得到的物質(zhì)。只要具有這種活性，脂肪酶的來(lái)源并沒有特別的限定，一般可以使用來(lái)源于微生物、植物和動(dòng)物(例如豬胰臟)的脂肪酶。另外，脂肪酶可以是1，3-特異性的脂肪酶，也可以是非特異性脂肪酶。通過(guò)例如使脂肪酶在絮凝性酵母的細(xì)胞表層表達(dá)，可以由廢油等制造生物柴油燃料(biodiesel fuel)。
在本說(shuō)明書中，淀粉酶類是指使淀粉水解的酶。代表性地可以舉出葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，此外還可以舉出β-淀粉酶、異淀粉酶等。
在本說(shuō)明書中，葡糖淀粉酶是指將葡萄糖單元由淀粉的非還原末端切斷的外切型水解酶。只要具有這種活性，其來(lái)源并沒有限定，可以使用來(lái)源于根霉菌屬(Rhizopus)和曲霉菌屬(Aspergillus)等霉菌的葡糖淀粉酶。例如，如植田等人(Appl.Environ.Microbiol.631362-1366(1997))所述，優(yōu)選使用來(lái)源于米根霉(Rhizopus oryzae)的葡糖淀粉酶。例如通過(guò)使葡糖淀粉酶在酵母表層進(jìn)行表達(dá)，能夠在淀粉存在下有效制造乙醇。
在本發(fā)明中，α-淀粉酶是指僅水解淀粉的α1，4-糖苷鍵的內(nèi)切型酶。只要具有這種活性，其來(lái)源并沒有限定，可以使用例如來(lái)源于動(dòng)物(唾液、胰臟等)、植物(麥芽等)以及微生物的α-淀粉酶。例如通過(guò)使α-淀粉酶在酵母表層進(jìn)行表達(dá)，能夠在淀粉存在下有效制造乙醇。如果與上述葡糖淀粉酶組合進(jìn)行表達(dá)，則能夠有效進(jìn)行酒精發(fā)酵。
纖維素酶類一般是指內(nèi)切β1，4-葡聚糖酶，在本發(fā)明中是指內(nèi)切β1，4-葡聚糖酶以及將產(chǎn)生的β1，4-糖苷鍵切斷而由纖維素產(chǎn)生葡萄糖的一組酶(例如纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase)、β-糖苷酶)，稱為纖維素酶。作為纖維素酶類，可以舉出內(nèi)切β1，4-葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-糖苷酶、羧甲基纖維素酶等。只要具有這種活性，其來(lái)源并沒有限定，例如優(yōu)選使用來(lái)源于微生物的酶。
通過(guò)使纖維素酶類單獨(dú)或組合在酵母表層進(jìn)行表達(dá)，能夠由木質(zhì)材料，例如紙、紙漿或這些物質(zhì)的廢棄材料，有效進(jìn)行酒精發(fā)酵。
在本發(fā)明中，使蛋白質(zhì)在細(xì)胞表層進(jìn)行表達(dá)的細(xì)胞只要是細(xì)菌、真菌、植物細(xì)胞等具有細(xì)胞壁的細(xì)胞，就沒有特別的限定。優(yōu)選使用酵母。
本發(fā)明中所用的細(xì)胞是導(dǎo)入DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化、以便在細(xì)胞表層提供所需蛋白質(zhì)的細(xì)胞。導(dǎo)入的DNA至少包括分泌信號(hào)序列、糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域以及編碼所需蛋白質(zhì)的序列。而且，也可以含有編碼所需的另1種蛋白質(zhì)的序列。
包括上述各種序列的DNA的合成以及結(jié)合可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員通?？梢圆捎玫募夹g(shù)進(jìn)行。
上述DNA優(yōu)選是質(zhì)粒的形態(tài)。基于使DNA的獲得更為簡(jiǎn)便的觀點(diǎn)，優(yōu)選為與大腸桿菌形成的穿梭載體。該DNA的原料更優(yōu)選具有例如酵母的2μm質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)(Ori)和ColE1的復(fù)制起點(diǎn)，而且還具有酵母選擇標(biāo)記(例如耐藥基因、TRP、LEU2等)以及大腸桿菌的選擇標(biāo)記(耐藥基因等)。另外，為了使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行表達(dá)，優(yōu)選還含有調(diào)節(jié)該基因表達(dá)的操縱基因、啟動(dòng)子、終止子、增強(qiáng)子等所謂的調(diào)節(jié)序列。例如可以舉出GAPDH(甘油醛3’-磷酸脫氫酶)啟動(dòng)子以及GAPDH終止子。作為這種原料的質(zhì)粒的實(shí)例，可以舉出含有GAPDH(甘油醛3’-磷酸脫氫酶)啟動(dòng)子序列以及GAPDH終止子序列的質(zhì)粒pYGA2270或pYE22m，或者含有UPR-ICL(異檸檬酸脂肪酶上游區(qū)域)序列以及Term-ICL(異檸檬酸脂肪酶的終止子區(qū)域)序列的質(zhì)粒pWI3等。
如果在質(zhì)粒pYGA2270或pYE22m的GAPDH啟動(dòng)子序列和GAPDH終止子序列之間，或者質(zhì)粒pWI3的UPR-ICL序列和Term-ICL序列之間，插入編碼所需蛋白質(zhì)的DNA，可以制造用于導(dǎo)入酵母的質(zhì)粒。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用多拷貝型的質(zhì)粒pWIFS或pWIFL，制造例如pWIFSpmROL或pWIFLpmROL。
作為宿主的酵母，可以使用任何酵母，從反應(yīng)后分離簡(jiǎn)單的方面、或者為了簡(jiǎn)單固定能夠進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)的方面考慮，優(yōu)選絮凝性酵母?；蛘?，作為糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域，使用絮凝功能區(qū)域時(shí)，能夠?qū)θ魏谓湍纲x予強(qiáng)絮凝性。
作為絮凝性酵母，可以舉出糖化糖酵母(Saccharomyces diastaticus)ATCC60715、糖化糖酵母ATCC60712、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)IFO1953、釀酒酵母CG1945、釀酒酵母HF7C等。另外，也可以構(gòu)筑新的絮凝性酵母。例如，如下述實(shí)施例1所示，按照M.D.Rose等人(Methods in Yeast Genetics，1990，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)的方法，由絮凝性酵母ATCC60712和非絮凝性酵母W303-1B接合而成的二倍體，能夠得到絮凝性酵母YF207以及與其具有相同性質(zhì)的酵母。本發(fā)明人等獲得的絮凝性酵母YF207株，質(zhì)粒的穩(wěn)定性優(yōu)良，而且發(fā)酵能力非常強(qiáng)。因此，為了使所需的蛋白質(zhì)，例如α-淀粉酶和葡糖淀粉酶單獨(dú)或兩者在細(xì)胞表層進(jìn)行表達(dá)，使用重組的絮凝性酵母YF207株時(shí)，由淀粉進(jìn)行酒精發(fā)酵的效率變得非常高。
本發(fā)明的方法中使用的細(xì)胞可以通過(guò)將上述DNA導(dǎo)入細(xì)胞中得到。DNA的導(dǎo)入是指將DNA導(dǎo)入細(xì)胞中使之表達(dá)。DNA的導(dǎo)入方法有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染、共轉(zhuǎn)染、電穿孔等方法，具體有使用醋酸鋰的方法、原生質(zhì)體法等。
導(dǎo)入的DNA可以是上述質(zhì)粒的形態(tài)，也可以插入宿主的基因中，或與宿主的基因進(jìn)行同宗重組并入染色體中。
導(dǎo)入了DNA的細(xì)胞可以通過(guò)用選擇標(biāo)記(例如TRP)選擇，測(cè)定表達(dá)的蛋白質(zhì)活性進(jìn)行選擇。蛋白質(zhì)固定在細(xì)胞表層可以通過(guò)使用抗蛋白質(zhì)抗體與FITC標(biāo)記抗IgG抗體的免疫抗體法確認(rèn)。
本發(fā)明中使用的細(xì)胞也可以固定在載體上。例如為酵母時(shí)，如果進(jìn)行了固定，就便于在反復(fù)分次發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵中使用。
在本說(shuō)明書中，載體是指能夠固定細(xì)胞的物質(zhì)，優(yōu)選對(duì)水或某種特定溶劑不溶的物質(zhì)。作為本發(fā)明中能夠使用的載體材料，優(yōu)選聚乙烯醇、泡沫聚氨酯、泡沫聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇縮甲醛樹脂多孔體、泡沫硅氧烷、纖維素多孔體等發(fā)泡體或樹脂。如果考慮繁殖以及活性低的細(xì)胞或死細(xì)胞的脫落等，優(yōu)選多孔性的載體。多孔體的開口部大小根據(jù)細(xì)胞有所不同，優(yōu)選細(xì)胞能夠充分進(jìn)入，且能夠繁殖的大小。優(yōu)選為50μm～1000μm，但是對(duì)此并沒有限定。
另外，不問(wèn)載體的形狀如何。如果考慮載體的強(qiáng)度、培養(yǎng)效率等，優(yōu)選為球狀或立方體狀，關(guān)于其大小，在球狀的場(chǎng)合，優(yōu)選直徑為2mm～50mm，在立方體的場(chǎng)合，優(yōu)選邊長(zhǎng)為2mm～50mm。
在本說(shuō)明書中，細(xì)胞的固定化是指細(xì)胞處于非游離的狀態(tài)，例如細(xì)胞結(jié)合或附著在載體上或者嵌入載體內(nèi)部的狀態(tài)等。細(xì)胞的固定可以適用例如載體結(jié)合法、交聯(lián)法、摻入法(包括法)等本領(lǐng)域技術(shù)人員通常采用的方法。其中，對(duì)于絮凝性酵母的固定，載體結(jié)合法最為合適。載體結(jié)合法包括使之吸附在離子交換性樹脂上的化學(xué)吸附法或者物理吸附法。
例如，本發(fā)明中可以使用的絮凝性酵母具有盡管固定在載體上仍然能夠繁殖、而且如果活性降低就自然脫落的性質(zhì)。因此，結(jié)合在載體上的酵母具有活菌數(shù)能夠幾乎保持一定、活性高的特征。如果考慮這一特征，對(duì)載體的結(jié)合最優(yōu)選物理吸附。物理吸附不需要特別的手段。通過(guò)將絮凝性或粘附性的細(xì)胞與上述多孔性的載體簡(jiǎn)單混合進(jìn)行培養(yǎng)，就可使細(xì)胞進(jìn)入多孔體的開口部而附著在載體上。
在本說(shuō)明書中，絮凝性是指浮游或分散在液體中的酵母等細(xì)胞聚集成塊(聚集體)的性質(zhì)，粘附性是指細(xì)胞之間粘附或結(jié)合形成聚集體的性質(zhì)。
在本說(shuō)明書中，活性降低是指雖然細(xì)胞本身沒有死亡但是細(xì)胞整體的活性減弱的狀態(tài)，或者例如絮凝所涉及的活性降低、或在對(duì)涉及絮凝的酶編碼的DNA水平上活性減弱等不能絮凝的狀態(tài)。
另外，在本發(fā)明中，絮凝性或粘附性酵母也可以是通過(guò)導(dǎo)入與絮凝或粘附有關(guān)的基因而得到絮凝性或粘附性的酵母。
絮凝或粘附的相關(guān)基因是指與絮凝或粘附有關(guān)的物質(zhì)，例如可以舉出對(duì)酵母的殼多糖、外源凝血素等進(jìn)行編碼的結(jié)構(gòu)基因，作為絮凝性的相關(guān)基因，可以舉出FLO1〔J.Watari等，Agric.Biol.Chem.，551547(1991)；G.G.Stewart等，Can.J.Microbiol.，23441(1977)；I.Russell等，J.Inst.Brew.，86120(1980)；C.W.Lewis等，J.Inst.Brew.，82158(1976)〕、FLO5〔I.Russell等，J.Inst.Brew.，8595(1979)〕、FLO8〔I.Yamashita等，Agric.Biol.Chem.，48131(1984)〕等基因。
這些絮凝或粘附相關(guān)基因整合到上述原料的質(zhì)粒中，與為了在細(xì)胞表層提供所需蛋白質(zhì)而設(shè)計(jì)的DNA一起導(dǎo)入細(xì)胞中。
這樣得到的固定后的細(xì)胞也能夠以附著在載體上的狀態(tài)、游離狀態(tài)進(jìn)行培養(yǎng)，或者填充到柱等中，用作生物反應(yīng)器。即使在連續(xù)或分次(批)反復(fù)進(jìn)行培養(yǎng)和反應(yīng)時(shí)，由于活性降低或死細(xì)胞脫落，作為細(xì)胞的活性也不會(huì)降低，而能夠有效利用。
如上所述得到的本發(fā)明的細(xì)胞，可以用于使在細(xì)胞表層表達(dá)的蛋白質(zhì)與基質(zhì)接觸而與該基質(zhì)結(jié)合，或者使該基質(zhì)轉(zhuǎn)變成其它物質(zhì)。例如，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為酶時(shí)，該細(xì)胞也可以作為包含表達(dá)酶的細(xì)胞的酶劑提供。具體而言，作為本發(fā)明的酶劑，可以舉出含有本發(fā)明的細(xì)胞以及能夠維持細(xì)胞的培養(yǎng)基的懸濁液，和將本發(fā)明的細(xì)胞冷凍保存或冷凍干燥以及低溫干燥的物質(zhì)。
而且，本發(fā)明的細(xì)胞也可以通過(guò)將各種隨機(jī)引入變異的蛋白質(zhì)表現(xiàn)在其它細(xì)胞表層而用作組合文庫(kù)。也能夠由這種文庫(kù)，迅速且簡(jiǎn)便地選擇具有符合目的的最適性質(zhì)的克隆體。這里所說(shuō)的組合文庫(kù)是指在基因水平隨機(jī)引入變異，人為擴(kuò)大蛋白質(zhì)的多樣性而得到的各種變異體的集合。
以下，結(jié)合實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但是本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限定。
(實(shí)施例1依次具有FLO1的5’區(qū)域以及脂肪酶原結(jié)構(gòu)基因的DNA的制作)AFLO1的5’區(qū)域(信號(hào)序列以及絮凝功能區(qū)域)基因的獲得如下所述獲得FLO1的基因。首先，由釀酒酵母(S.cerevisiae)ATCC 60715提取染色體DNA。接著，將其作為模板，使用序列號(hào)1和序列號(hào)2記載的核苷酸序列作為引物，進(jìn)行PCR放大，用BamHI和BglII消化，得到約3300bp長(zhǎng)度的BamHI-BglII片段(BamHI-BglIIFLO1 3300bp片段)。可認(rèn)為該3300bp片段具有FLO1的5’側(cè)的序列(分泌信號(hào)序列以及FLO1絮凝功能區(qū)域)。
B脂肪酶基因的獲得如下所述，獲得米根霉的脂肪酶基因。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，首先由R.oryzae(米根霉)IFO4697提取染色體DNA。接著，以其作為模板，使用序列號(hào)3和序列號(hào)4記載的核苷酸序列作為引物，進(jìn)行PCR放大，用BamHI和SalI消化，得到約1100bp長(zhǎng)度的BamHI-SalI片段(BamHI-SalI脂肪酶片段)。該脂肪酶片段具有脂肪酶的前序列和成熟蛋白質(zhì)序列，與Beer等的報(bào)告(Biochim Biophys Acta，1399173-180 1998)中記載的序列幾乎一致。
C依次具有FLO的5’區(qū)域以及脂肪酶原結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒的制作具有目的DNA的質(zhì)粒可以通過(guò)將上述由A得到的FLO1的5’區(qū)域基因以及由上述B得到的脂肪酶原基因連接得到。為了制作FLO1衍生物與脂肪酶的融合蛋白，進(jìn)行以下操作。制作的示意圖如圖1所示。
首先，用BglII將多拷貝型質(zhì)粒pWI3消化，脫磷酸化后，插入上述由A得到的BamHI-BglII FLO1 3300bp片段，得到質(zhì)粒pWIFS。接著，用BglII和XhoI將該質(zhì)粒pWIFS消化，插入由上述B得到的BamHI-SalI脂肪酶片段，得到pWIFSpmROL。將由插入該質(zhì)粒pWIFSpmROL中的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)命名為短(short)型FLO1脂肪酶。
(實(shí)施例2依次具有包含細(xì)胞壁錨定區(qū)域的FLO1的5’區(qū)域以及脂肪酶原結(jié)構(gòu)基因的DNA的制作)與上述實(shí)施例1同樣，提取FLO1的染色體DNA。以其作為模板，使用序列號(hào)1和序列號(hào)5記載的核苷酸序列作為引物，進(jìn)行PCR放大，用BamHI和BglII消化，得到約4500bp長(zhǎng)度的BamHI-BglII片段(BamHI-BglII FLO1 4500bp片段)?？烧J(rèn)為該4500bp片段具有FLO1的5’側(cè)的序列(分泌信號(hào)序列和FLO1絮凝功能區(qū)域)。
使用得到的BamHI-BglII FLO1 4500bp片段，進(jìn)行與實(shí)施例1同樣的操作。即，不是將實(shí)施例1的BamHI-BglII FLO1 3300bp片段而是將該4500bp片段插入pWI3中，得到質(zhì)粒pWIFL。接著，與實(shí)施例1同樣將上述BamHI-SalI脂肪酶片段插入該質(zhì)粒pWIFL中，得到pWIFLpmROL。將由插入該質(zhì)粒pWIFLpmROL中的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)命名為長(zhǎng)(long)型FLO1脂肪酶。
(實(shí)施例3細(xì)胞表層具有脂肪酶的酵母的制作)使用絮凝性酵母中的糖化糖酵母ATCC60712(MATa leu2-3，112his2 lys2 stal FLO8)以及非絮凝性酵母W303-1B(MATαura3-52 trp1Δ2 leu2-3，112 his3-11 ade2-1 can1-100)，按照M.D.Rose等人(如上所述)的方法，得到色氨酸營(yíng)養(yǎng)需求型的新絮凝性菌株釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YF207(MATa ura3-52 trp1Δ2 his ade2-1can1-100 stal FLO8)。
按照使用Yeast Maker(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)的醋酸鋰法，將由上述實(shí)施例1得到的質(zhì)粒pWIFSpmROL以及實(shí)施例2得到的質(zhì)粒pWIFLpmROL導(dǎo)入非絮凝性酵母釀酒酵母(S.cerevisiae)MT8-1(MATa ade his3 leu2 trp1 ura3)(Tajima等，Yeast，167-77，1985)以及絮凝性酵母YF207中。使用不含有L-色氨酸且補(bǔ)充了適當(dāng)氨基酸和堿基的SD-W瓊脂選擇培養(yǎng)基(6.7％Yeast nitrogen base w/o aminoacids(Difco Laboratories制)，2％葡萄糖，2％瓊脂粉末)對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)。選擇繁殖的酵母，將表達(dá)短(short)型FLO1脂肪酶的酵母分別命名為MT8-1-short和YF207-short，并將表達(dá)長(zhǎng)(long)型FLO1脂肪酶的酵母分別命名為MT8-1-long和YF207-long。
用SDC液體培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的酵母，離心分離，分成培養(yǎng)基和菌體，分別測(cè)定脂肪酶活性。作為對(duì)照，使用分別在釀酒酵母(S.cerevisiae)MT8-1中導(dǎo)入了質(zhì)粒pWI3的酵母。結(jié)果，關(guān)于對(duì)照，確認(rèn)培養(yǎng)基和菌體均沒有脂肪酶活性。另外，在轉(zhuǎn)化體MT8-1-short、YF207-short、MT8-1-long和YF207-long的培養(yǎng)上清液中幾乎見不到脂肪酶活性，但是這些酵母菌體本身均具有脂肪酶活性(圖2)。另外，脂肪酶活性的測(cè)定使用脂肪酶試劑盒S(大日本制藥制)進(jìn)行。
(實(shí)施例4細(xì)胞表層具有脂肪酶的酵母的功能確認(rèn))對(duì)于實(shí)施例3得到的表達(dá)短(short)型FLO1脂肪酶的酵母MT8-1-short和YF207-short，以及表達(dá)長(zhǎng)(long)型FLO1脂肪酶的酵母MT8-1-long和YF207-long，分別通過(guò)波長(zhǎng)600nm處的吸光度測(cè)定菌體的繁殖?？梢缘弥魏我环N酵母均在培養(yǎng)基中與對(duì)照相同程度地順利繁殖(未顯示數(shù)據(jù))。
接著，測(cè)定表達(dá)短(short)型FLO1脂肪酶的酵母MT8-1-short和表達(dá)長(zhǎng)(long)型FLO1脂肪酶的酵母MT8-1-long的甲醇分解反應(yīng)活性。在30ml小瓶中，向由培養(yǎng)基100ml收集的各酵母中加入反應(yīng)液(0.1M磷酸緩沖液(pH7.0)2ml，大豆油9.65g，甲醇0.35g)，在35℃下每分鐘振蕩150次，按照Kaieda等的方法(J.Biosci.Bioeng.，88627-631，1999)測(cè)定甲酯的產(chǎn)量。其結(jié)果如圖3所示。
任何一種酵母與以前的酵母(α-凝集素的N末端側(cè)結(jié)合脂肪酶在細(xì)胞表層進(jìn)行表達(dá)的酵母(特開平11-290078號(hào)公報(bào)))相比，均產(chǎn)生了更多的甲酯。特別是如圖3所示，表達(dá)短(short)型FLO1脂肪酶的菌株MT8-1-short(○)以及表達(dá)長(zhǎng)(long)型FLO1脂肪酶的酵母MT8-1-long(△)，甲酯的生產(chǎn)活性非常高。
另外，對(duì)于這些菌株，按照Smit等的方法(Smit等，Appl.Environ.Microbiol.，583709-3714(1992))測(cè)定其絮凝能力。結(jié)果，對(duì)于絮凝型的菌株，與導(dǎo)入質(zhì)粒前相比，表達(dá)長(zhǎng)(long)型FLO1脂肪酶的菌株顯示與轉(zhuǎn)化前同樣強(qiáng)的絮凝能力。但是，表達(dá)短(short)型FLO1脂肪酶的菌株，絮凝能力變?nèi)?。可認(rèn)為這是由于短(short)型FLO1脂肪酶沒有細(xì)胞壁錨定區(qū)域，而是絮凝區(qū)域埋入細(xì)胞壁中，因此不能充分發(fā)揮絮凝功能。
(實(shí)施例5隨機(jī)變異脂肪酶的組合文庫(kù)的構(gòu)建及其利用)對(duì)于對(duì)由上述實(shí)施例1B得到的米根霉的脂肪酶的前序列以及成熟蛋白質(zhì)序列(366個(gè)氨基酸的脂肪酶原(ProROL))進(jìn)行編碼的1098bp的基因，采用Error-prone PCR法，隨機(jī)引入變異，使之包含約3個(gè)堿基的變異(每1分子ProROL引入1個(gè)氨基酸的變異)，得到各種引入了變異的脂肪酶基因。與上述實(shí)施例1C時(shí)同樣，將得到的引入了變異的脂肪酶基因分別插入具有FLO1的5’區(qū)域的質(zhì)粒pWIFS中，得到pWIFSProROL文庫(kù)。將這些質(zhì)粒與實(shí)施例3同樣地分別導(dǎo)入酵母YF207株，制作由在細(xì)胞表層表現(xiàn)具有各種變異的脂肪酶的713株構(gòu)成的酵母組合文庫(kù)。
如下所述，由得到的酵母組合文庫(kù)選擇具有酯交換活性的克隆體。將713株的文庫(kù)在SD板(0.67％Yeast nitrogen base w/o amino acids，0.5％葡萄糖和2％瓊脂粉末)上培養(yǎng)3天。接著，在該板上疊加高壓滅菌后保持在45℃下的含有熒光色素的軟瓊脂SD培養(yǎng)基(SD培養(yǎng)基+2.5％大豆油、0.001％若丹明B、50％甲醇和0.8％瓊脂粉末)。1天后，對(duì)板進(jìn)行紫外線照射，選擇菌體周圍顯出橙色熒光的克隆體，得到在甲醇分解反應(yīng)基質(zhì)，即甲醇存在下生存的克隆體(80克隆體)。
這些克隆體的脂肪酶活性，與上述實(shí)施例4同樣，利用甲醇分解反應(yīng)測(cè)定酯交換活性的初速度，并利用脂肪酶試劑盒S(大日本制藥制)測(cè)定水解活性而測(cè)得。其中，與表達(dá)未引入變異的脂肪酶的菌株(野生型菌株)相比，可以見到酯交換活性以及水解活性改變的菌株，其結(jié)果如表1所示。
表1

可觀察到S334T株具有比野生型菌株稍高的酯交換活性。另外，由酯交換活性與水解活性的比值可以得知，P2S/F293Y株顯示出獨(dú)特的水解反應(yīng)高催化能力，而K326R株則顯示出酯交換反應(yīng)高催化能力。由這些結(jié)果可以得知，能夠在酵母細(xì)胞表層制作組合文庫(kù)，篩選符合目的的變異體。
產(chǎn)業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的細(xì)胞表層結(jié)合性蛋白質(zhì)能夠在細(xì)胞表層表達(dá)所需的蛋白質(zhì)。該所需的蛋白質(zhì)能夠根據(jù)活性中心的位置，使其相反側(cè)與糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域融合，由此進(jìn)行表達(dá)，使之顯示出充分的活性。因此，特別是在細(xì)胞表層表達(dá)C末端側(cè)具有活性的蛋白質(zhì)時(shí)，非常有用。另外，能在糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域的兩端結(jié)合相同或不同的蛋白質(zhì)，從而可以有效地表達(dá)更多的蛋白質(zhì)?？衫眠@種細(xì)胞表層的蛋白質(zhì)的有效表達(dá)，在細(xì)胞表層上制作改性蛋白質(zhì)的組合文庫(kù)，并容易進(jìn)行篩選。
序列表<110>關(guān)西化學(xué)機(jī)械制作株式會(huì)社<120>細(xì)胞表層結(jié)合性蛋白質(zhì)及其應(yīng)用<130>P2-01K02245<160>5<210>1<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>1acatggatcc atgacaatgc ctcatcgcta tatgtttttg 40<210>2<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>2gatagatctg gtgatttgtc ctgaagatga tgatgacaaa 40<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>3ctccggatcc atggttcctg tttctggtaa atctggatct 40<210>4<211>25
<212>DNA<213>人工序列<400>4cgatgtcgac ttacaaacag cttcc 25<210>5<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>5aatgcctcga gttaaataat tgccagcaat aaggacgcaa tgaag 4權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞表層結(jié)合性蛋白質(zhì)，其特征在于，具有糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域，且所述糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域的至少N末端側(cè)或C末端側(cè)結(jié)合有其它蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞表層結(jié)合性蛋白質(zhì)，其特征在于，所述糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域是至少含有GPI錨定蛋白的絮凝功能區(qū)域部分。
3.如權(quán)利要求2所述的細(xì)胞表層結(jié)合性蛋白質(zhì)，其特征在于，所述GPI錨定蛋白是絮凝蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的細(xì)胞表層結(jié)合性蛋白質(zhì)，其特征在于，所述絮凝蛋白是選自FLO1、FLO2、FLO4、FLO5、FLO9、FLO10和FLO11的蛋白質(zhì)。
5.如權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的細(xì)胞表層結(jié)合性蛋白質(zhì)，其特征在于，所述其它蛋白質(zhì)結(jié)合在所述糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域的N末端側(cè)。
6.如權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的細(xì)胞表層結(jié)合性蛋白質(zhì)，其特征在于，所述其它蛋白質(zhì)結(jié)合在所述糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域的C末端側(cè)。
7.如權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的細(xì)胞表層結(jié)合性蛋白質(zhì)，其特征在于，所述糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域的N末端側(cè)和C末端側(cè)結(jié)合有相同或不同的其它蛋白質(zhì)。
8.對(duì)權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)所述的細(xì)胞表層結(jié)合性蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的DNA。
9.含有權(quán)利要求8所述的DNA的質(zhì)粒。
10.引入權(quán)利要求8所述的DNA或者權(quán)利要求9所述的質(zhì)粒，在細(xì)胞表層表達(dá)上述其它蛋白質(zhì)的細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求10所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞為酵母。
12.如權(quán)利要求10或11所述的細(xì)胞，其特征在于，所述其它蛋白質(zhì)為酶。
13.如權(quán)利要求10～12任一項(xiàng)所述的細(xì)胞的使用方法，其特征在于，使所述其它蛋白質(zhì)與基質(zhì)接觸而與該基質(zhì)結(jié)合，或者將所述基質(zhì)轉(zhuǎn)變成其它物質(zhì)。
14.含有權(quán)利要求12所述細(xì)胞的酶劑。
全文摘要
為表達(dá)糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域與所需蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)，構(gòu)筑質(zhì)粒，引入細(xì)胞，而在細(xì)胞表層表達(dá)該蛋白質(zhì)。特別適用于在細(xì)胞表層表達(dá)C末端側(cè)具有活性的蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N1/15GK1708510SQ0280830
公開日2005年12月14日 申請(qǐng)日期2002年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月19日
發(fā)明者福田秀樹, 近藤昭彥, 松本健史, 野田秀夫 申請(qǐng)人:關(guān)西化學(xué)機(jī)械制作株式會(huì)社