專利名稱：光學(xué)活性的丙氧基苯胺衍生物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于制備抗微生物化合物的具有光學(xué)活性的丙氧基苯胺衍生物的制備方法，也涉及其中間體的制備方法。
背景技術(shù)：
S-(-)-9-氟-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪基)-7-氧-2，3-二氫-7H-吡啶并[1，2，3-de][1，4]苯并噁嗪-6-羧酸(左氟沙星，LVFX；JP 62-252790 A)被認為是優(yōu)異的合成抗菌劑。
有一種化合物已知作為制備此合成抗菌劑的中間體，它用下式(V)表示 其中X1和X2分別獨立地代表鹵原子(以下稱為“化合物(V)”；將使用類似的符號標(biāo)記其他結(jié)構(gòu)式)。已知可以通過以下方法制備此化合物(JP 1-250369 A和JP 2-723 A)。

這就是說，可以通過還原化合物(A)合成化合物(V)，通過預(yù)先用四氫吡喃基保護市售可得的乳酸酯的羥基制得化合物(A)、用氫化鋰鋁得到化合物(B)，在氫化鈉存在的條件下處理化合物(B)和化合物(C)得到化合物(D)，然后除去四氫吡喃基，隨后將硝基還原。
乳酸酯作為化合物(A)的原料可以低成本市售得到，但這些酯的光學(xué)純度多數(shù)局限在至多97％ee，所以它們不足以作為左氟沙星化合物的原料，后者需要滿足至少99％ee的高純度。
對于制備化合物(B)，也發(fā)展了另一種不用任何乳酸酯方法(JP2-265701 A)。另一方面，由于安全性問題，大量氫化鋰鋁也難于進行還原操作。上述制備方法也需要較多的步驟。另外也有報道，從化合物(D)除去四氫吡喃基會產(chǎn)生不必要的消旋化(S.Chladek，Chem.Ind.(倫敦)，1719(1964))。
由于上述問題，至今已用化合物((R)-2-芐氧基丙酸酯)進行了一些研究，其結(jié)構(gòu)接近于化合物(A)，但不同之處在于用芐基代替四氫吡喃基。然而，除光學(xué)純度至多達97％ee的低光學(xué)純度的化合物外，尚不能得到其他任何化合物。
左氟沙星作為藥物需要有至少為99％ee的更高的光學(xué)純度，但在中間步驟中非常難于提高光學(xué)純度。光學(xué)純度為97％ee或更低的(R)-2-芐氧基丙酸酯不能作為左氟沙星的原料。
因此，長期以來一直需要開發(fā)不受這些問題影響的制備方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供制備作為抗菌劑的具有光學(xué)活性的丙氧基苯胺衍生物和左氟沙星的一種經(jīng)濟而有效的方法，并提供用于上述過程的中間體的制備方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種有非對稱的酯-水解能力，并通過使具有非對稱酯水解能力的微生物的細胞在高壓下破裂，然后用強陰離子色譜法、疏水性色譜法和強陰離子色譜法連續(xù)純化這樣破裂的細胞所得到的酶。
發(fā)明公開作為多方面研究的結(jié)果，本發(fā)明已發(fā)現(xiàn)一種方法，其特征在于用有非對稱性酯水解能力的酶處理外消旋的乳酸衍生物，然后具體地水解作為此外消旋衍生物的成對化合物存在的異構(gòu)體的酯部分，并且本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用通過此水解作用得到的化合物作為中間體時，有可能以比任何其他方法更低成本地，并通過較少的步驟，產(chǎn)生光學(xué)活性的丙氧基苯胺衍生物。另外，本發(fā)明已發(fā)現(xiàn)一種將在非對稱的酯水解反應(yīng)過程中作為不利的副產(chǎn)物的光學(xué)異構(gòu)體通過將其外消旋化而再循環(huán)成底物的方法?；谶@些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)可以高效率地制備有高光學(xué)純度的左氟沙星化合物。因此，完成了本發(fā)明。
具體地，本方面發(fā)明提供了制備用下式(I-a)表示的光學(xué)活性化合物的方法 其中R1代表有1-6個碳原子的烷基，R2代表羥基保護基團，該方法包括用有非對稱性酯水解能力的酶、培養(yǎng)的有非對稱性酯水解能力的微生物的培養(yǎng)基、所述微生物的細胞或微生物細胞的加工產(chǎn)物處理用下式(I)代表的化合物，
其中，R1和R2有與上述定義相同的意義，得到混合物，并從混合物中分離和收集光學(xué)活性化合物(I-a)。
本發(fā)明也提供制備用下式(V)代表的化合物的方法 其中X1和X2各自獨立地代表鹵原子，此方法包括用有非對稱性酯水解能力的酶、培養(yǎng)的有非對稱性酯水解能力的微生物的培養(yǎng)基、所述微生物的細胞或所述微生物細胞的加工產(chǎn)物處理用下式(I)代表的化合物， 其中R1和R2有與上述定義相同的意義，得到混合物，并從混合物中分離、收集和得到用下式(I-a)代表的光學(xué)活性化合物 其中R1和R2有與上述定義相同的意義；在有存在于非醇溶劑中的伯醇的條件下，用金屬氫硼化物處理化合物(I-a)，得到用下式(II)代表的化合物 其中R2有與上述定義相同的意義；在有堿存在的條件下處理化合物(II)和用下式(III)代表的化合物 其中X1和X2有與上述定義相同的意義，X3獨立地代表鹵原子，得到用下式(IV)代表的光學(xué)活性化合物 其中R2、X1和X2有與如上定義相同的意義；并且將化合物(IV)中的硝基轉(zhuǎn)化處理成氨基，并同時除去R2。
本發(fā)明也提供了制備用下式(XII)代表的化合物的方法 其中X1有與如上所述相同的意義，此方法包括用有非對稱性酯水解能力的酶、培養(yǎng)的有非對稱性酯水解能力的微生物的培養(yǎng)基、所述微生物的細胞或微生物細胞的加工產(chǎn)物處理用下式(I)代表的化合物， 其中R1和R2有與上述定義相同的意義，
得到混合物，并從混合物中分離、收集和得到用下式(I-a)代表的光學(xué)活性化合物 其中R1和R2有與上述定義相同的意義；在有存在于非醇溶劑中的伯醇的條件下，用金屬氫硼化物處理化合物(I-a)，得到用下式(II)代表的光學(xué)活性化合物 其中R2有與上述定義相同的意義；用堿處理化合物(II)和用下式(III)代表的化合物 其中X1和X2及X3有與上述定義相同的意義，得到用下式(IV)代表的光學(xué)活性化合物 其中R2、X1和X2有與如上定義相同的意義；將化合物(IV)中的硝基轉(zhuǎn)化處理成氨基，并同時除去R2，得到用下式(V)代表的化合物
其中X1和X2有與上述定義相同的意義，使化合物(V)與用下式(VI)代表的化合物反應(yīng)， 其中Y代表有1-6個碳原子的烷氧基、鹵原子或二(C1-C6烷基)氨基，R3和R4分別獨立地代表有1-6個碳原子的烷基，得到用下式(VII)代表的化合物 其中X1、X2、R3和R4有與上述定義相同的意義；使化合物(VII)與磺?；衔锓磻?yīng)，得到用下式(VIII)代表的化合物 其中R5代表取代或非取代的烷基磺酰基團或取代或非取代的芳香基磺?；鶊F，X1、X2、R3和R4有與上述定義相同的意義；在堿性條件下使化合物(VIII)進行閉環(huán)反應(yīng)，得到用下式(IX)代表的化合物 其中X1、X2、R3和R4有與上述定義相同的意義；在有或無硼化物的條件下加熱化合物(IX)，得到用下式(X)代表的化合物 其中R6代表有1-6個碳原子的烷基或BZ2-其中Z代表鹵原子、C1-C6烷氧基或C2-C7烷基羰基氧基(alkylcarbonyloxy)，X1和X2有與上述定義相同的意義；使化合物(X)與4-甲基丙拉嗪反應(yīng)得到用下式(XI)代表的化合物 其中X1和R6有與上述定義相同的意義；并水解化合物(XI)。
本發(fā)明也提供了有非對稱性酯水解能力的酶，并在高壓下通過使有非對稱性酯水解能力的微生物的細胞破裂，然后用強陰離子色譜、疏水性色譜和強陰離子色譜連續(xù)純化如此破裂的細胞而得到。
實施本發(fā)明的最佳方式根據(jù)本發(fā)明，用有非對稱性酯水解能力的酶、培養(yǎng)的有非對稱性酯水解能力的微生物的培養(yǎng)基、所述微生物的細胞或微生物細胞的加工產(chǎn)物處理化合物(I)，得到混合物。從混合物中分離和收集化合物(I-a)。然后用金屬氫硼化物處理此化合物(I-a)，得到化合物(II)。在堿存在的條件下處理化合物(II)和化合物(III)，得到化合物(IV)。通過還原反應(yīng)，經(jīng)過單一步驟將此化合物(IV)轉(zhuǎn)化成光學(xué)活性丙氧基苯胺衍生物。然后從化合物(IV)制備用作抗菌劑的化合物(XII)。
本發(fā)明從化合物(I)至化合物(XII)的反應(yīng)流程圖如下所示。

以下描述反應(yīng)流程中的取代基。
X1、X2和X3分別獨立地代表鹵原子。作為鹵原子，優(yōu)選氟原子。
R1、R3和R4分別獨立地代表烷基，它可以是線性、分支或環(huán)狀的。其碳數(shù)可優(yōu)選為1-6。特別優(yōu)選的是甲基、乙基和異丁基。
R2代表羥基保護基團。只要此保護性基團是通常使用的種類，對它沒有其他特別的限制。說明性的實例有(取代的)烷氧基羰基、(取代的)芳烷氧基羰基、(取代的)?；?、(取代的)烷基、(取代的)烯基、(取代的)芳烷基和被一或多個烷基和/或芳烷基(可以相同或不同)取代的甲硅烷基[注意本文使用的術(shù)語“(取代的)”在此指化合物可以含有一或多個取代基]。具體的例子可以包括(取代的)烷氧基羰基，例如，叔-丁氧基-羰基和2，2，2-三氯乙氧基羰基；(取代的)芳烷氧基羰基，例如芐氧基羰基、對甲氧基芐氧基羰基和對硝基芐氧基羰基；(取代的)酰基，例如乙?；⒓籽跻阴；⑷阴；?、氯乙?；?、新戊?；⒓柞；捅郊柞；?；(取代的)芳烷基，例如叔丁基、烯丙基(丙烯基)、芐基、對硝基芐基、對甲氧基芐基、三苯甲基和苯乙基；(取代的)烯基和(取代的)芳烷基；醚基，例如甲氧甲基、叔-丁氧基甲基、四氫吡喃基和2，2，2-三氯乙氧甲基；和取代的甲硅烷基，例如三甲基甲硅烷基、異丙基二甲基甲硅烷基、叔-丁基二甲基甲硅烷基、三芐基甲硅烷基和叔-丁基二苯基甲硅烷基。在上述示例性的保護基團中，優(yōu)選R2是(取代的)芳烷基，更優(yōu)選具有芐基結(jié)構(gòu)的(取代的)芳烷基。特別優(yōu)選芐基。
R5代表(取代的)烷基磺?；?取代的)芳基磺酰基，優(yōu)選有1-6個碳原子的烷基磺?；?取代的)苯磺酰基。在這些取代基中，特別優(yōu)選甲磺?；蛯?甲苯磺酰基。
R6代表C1-C6烷基或BZ2，其中Z代表鹵原子、C1-C6烷氧基或C2-C7烷基羰基氧基。有1-6個碳原子的烷氧基的例子可以包括甲氧基、乙氧基、異丙氧基和叔丁氧基。鹵原子的例子可以包括上述與X1、X2和X3相關(guān)的例子。C2-C7烷基羰基氧基的例子可以包括乙酰氧基、丙酰氧基和丁酰氧基(butylyoxy)。其中，R6特別優(yōu)選為BF2。
Y代表有1-6個碳原子的烷氧基、鹵原子或二(C1-C6烷基)氨基。優(yōu)選有1-6個碳原子的烷氧基，特別優(yōu)選甲氧基和乙氧基。
在上述反應(yīng)流程中，僅顯示了一種異構(gòu)體的制備方法。使用與化合物(I-a)相似而構(gòu)型相反的化合物，也可以類似地合成其他異構(gòu)體。另外，使用化合物(I)能得到外消旋形式的化合物(V)。
以下將逐步詳細地描述本發(fā)明。
步驟(a)步驟(a)是用有非對稱酯水解能力的酶、有非對稱酯水解能力的培養(yǎng)的微生物的培養(yǎng)基、微生物的細胞或此微生物細胞的加工產(chǎn)物處理化合物(I)得到化合物(I-a)的步驟。
首先，將化合物(I)懸浮在適宜的緩沖劑中，再加入酶、培養(yǎng)的微生物的培養(yǎng)基、微生物的細胞或此微生物細胞的加工產(chǎn)物。將得到的混合物攪拌進行處理。對在此反應(yīng)中使用的酶沒有特別的限制，只要它具有非對稱酯水解的能力。這類酶的例子是源自微生物、動物或植物的商品酶制劑。
作為本發(fā)明使用的酶，優(yōu)選脂酶。脂酶可以為固定化的形式。
微生物的例子是例如枝孢屬真菌、犁頭霉屬真菌、奈尼茲皮屬真菌、曲霉屬真菌、根霉屬真菌和毛霉菌屬真菌等霉菌；酵母，例如Zygoacus酵母菌、假絲酵母菌和糖酵母屬酵母等；和例如芽孢桿菌屬細菌、微桿菌屬細菌、微球菌屬細菌、假單胞菌屬細菌、棒狀桿菌屬細菌和鏈霉菌屬細菌等細菌。在這些微生物中，優(yōu)選細菌，更優(yōu)選芽孢桿菌屬細菌和微桿菌屬細菌，還更優(yōu)選蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)和產(chǎn)左聚糖微桿菌(Microbac terium laefaniformas)，特別優(yōu)選蠟狀芽孢桿菌(DSC 0007)、蠟狀芽孢桿菌(ATCC 14579)和產(chǎn)左聚糖微桿菌(IFO 14471)。
另一方面，微生物細胞的加工產(chǎn)物的例子是破裂的微生物細胞混合物及其純化產(chǎn)物。
在本發(fā)明中，從反應(yīng)效率的角度優(yōu)選使用這些微生物，特別是從細菌細胞純化得到的酶。特別優(yōu)選的純化酶是通過在高壓下使細胞破裂，并用強陰離子色譜、疏水性色譜和強陰離子色譜連續(xù)純化得到的種類。
這些純化酶可以是通過如上處理細胞得到的，它們也可以在其他宿主例如大腸桿菌中通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。為通過重組DNA技術(shù)得到酶，可以作為例子提到以下過程。首先，用反相色譜進一步純化上述純化酶，并測定其蛋白質(zhì)的氨基酸序列。根據(jù)氨基酸序列，制備探針，并從細胞的DNA片段，克隆出編碼非對稱水解酶活性中心的DNA。然后通過PCR將DNA擴增，制備重組質(zhì)粒。將此重組質(zhì)粒引入大腸桿菌等細菌中。培養(yǎng)大腸桿菌等細菌得到目標(biāo)酶。
通過上述處理，選擇性地水解以下化合物(I)的一種光學(xué)異構(gòu)體 其中R1和R2有與以上定義相同的意義，形成下述化合物(I-b) 其中R2有與以上定義相同的意義，可以從混合物中分離出以下未反應(yīng)的化合物(I-a)
其中R1和R2有與以上定義相同的意義。
特別說明，可以向混合物中加入有機溶劑如乙酸乙酯或氯仿，然后進行處理，例如攪拌和分離，而分離并收集化合物(I-a)。順便地，可以通過過濾或類似方法在提取化合物(I-a)之前優(yōu)選去除在處理過程使用的酶、細胞等物質(zhì)。
這些水解和分離的各自的處理溫度一般可以在5℃-60℃的范圍內(nèi)，優(yōu)選20℃-40℃的范圍。各種處理溶液的pH可以在4-9范圍內(nèi)，優(yōu)選6-8的范圍。每個處理時間可以在1小時-7天的范圍內(nèi)，優(yōu)選1小時-30小時的范圍。一般將各處理溶液中化合物(I)的濃度控制在0.1％-10％重量，優(yōu)選0.5％-5％重量的范圍內(nèi)進行處理。不特別限定酶、培養(yǎng)的微生物的培養(yǎng)基、微生物的細胞或微生物細胞的加工產(chǎn)物的用量，但按干重相當(dāng)于化合物(I)的0.05倍至0.5倍的重量比使用酶、培養(yǎng)的微生物的培養(yǎng)基、微生物的細胞或微生物細胞的加工產(chǎn)物是適宜的。
另一方面，可以回收利用從反應(yīng)混合物中分離的化合物(I-b)，在酯化后使化合物(I-b)經(jīng)過其外消旋化再接受非對稱酯水解反應(yīng)。
步驟(b)步驟(b)是在有存在于非醇溶劑中的伯醇存在下，用金屬氫硼化物處理化合物(I-a)，得到化合物(II)的過程。
金屬氫硼化物的例子是硼氫化鈉、硼氫化鋰、硼氫化鈣、硼氫化鉀、硼氫化鋅、硼氫化鎂和氰基硼氫化鈉。其中優(yōu)選硼氫化鈉。金屬氫硼化物的用量可以為化合物(I-a)摩爾數(shù)的1-5倍，優(yōu)選1.1-2倍。
溶劑的例子是烴類溶劑，例如正己烷、正戊烷、環(huán)己烷和環(huán)戊烷；芳香烴溶劑，例如苯、甲苯和二甲苯；醚類溶劑，例如乙醚、異丙醚(IPE)、甲基叔丁醚(MTBE)、四氫呋喃(THF)、二甲氧基乙烷和1，4-二氧雜環(huán)乙烷；和鹵代烴類溶劑，例如氯仿、二氯甲烷和1，2-二氯乙烷(EDC)。另外，也可以使用水、醋酸酯等溶劑?？梢詥为毣蚵?lián)合使用這些溶劑。在這些溶劑中，優(yōu)選芳香烴溶劑，例如甲苯和二甲苯。
對伯醇沒有特別的限定，但優(yōu)選甲醇。伯醇的用量可以在相當(dāng)于化合物(I-a)摩爾數(shù)的3-15倍的范圍內(nèi)，優(yōu)選4-8倍左右。
根據(jù)所用溶劑的不同，反應(yīng)溫度可以不同，但可在-78℃至溶劑沸點的范圍內(nèi)，優(yōu)選10℃至溶劑的沸點。反應(yīng)時間可以在1-24小時的范圍內(nèi)，優(yōu)選2-16小時。
步驟(c)步驟(c)是在溶劑中有堿的條件下處理化合物(II)得到化合物(III)的步驟。
可使用各種溶劑作為溶劑。溶劑的例子是烴類溶劑，例如正己烷、正戊烷；芳香烴溶劑，例如苯、甲苯和二甲苯；醇類溶劑，例如甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇(IPA)、正丁醇和叔丁醇；醚類溶劑，例如乙醚、異丙醚(IPE)、甲基叔丁醚(MTBE)、四氫呋喃(THF)、二甲氧基乙烷和1，4-二氧雜環(huán)乙烷；酰胺類溶劑，例如N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和N，N-二甲基乙酰胺(DMAC)；和鹵代烴類溶劑，例如氯仿、二氯甲烷和1，2-二氯乙烷(EDC)。另外，也可以使用水、乙腈、醋酸酯、丙酮等溶劑?？梢詥为毣蚵?lián)合使用這些溶劑。在這些溶劑中，優(yōu)選芳香烴溶劑，例如甲苯和二甲苯。
根據(jù)所用的堿和溶劑的不同，反應(yīng)溫度可以不同，但在-78℃至溶劑沸點的范圍內(nèi)，優(yōu)選-10℃至溶劑的沸點。
堿可以是有機或無機堿?？梢允褂玫膲A的例子可以包括堿金屬或堿土金屬-例如鈉、鉀、鋰、鎂和鈣的氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽、醇鹽等；金屬氫化物，例如氫化鈉、氫化鉀和氫化鋰；烷基鋰試劑，例如正丁基鋰、甲基鋰和二異丙基酰胺鋰；叔胺，例如三乙胺和N，N-二異丙基乙胺；還有雜環(huán)化合物，例如1，8-重氮化二環(huán)[5，4，0]十一-7-烯(DBU)、1，8-重氮化二環(huán)[4，3，0]壬-5-烯(DBN)、二甲基苯胺和N-甲基嗎啉。為促進反應(yīng)，在某些情況下，可以在有以下物質(zhì)的條件下進行反應(yīng)季銨鹽例如四丁基溴化銨或芐基三乙基氯化銨；堿金屬或堿土金屬碘化物，例如碘化鉀或碘化鈉；或冠醚。在這些堿中，優(yōu)選堿金屬或堿土金屬碳酸鹽，例如碳酸鉀；堿金屬或堿土金屬氫氧化物，例如氫氧化鉀；和堿金屬醇鹽，例如叔丁氧基鈉和叔丁氧基鉀。另外，也可以聯(lián)合使用堿金屬或堿土金屬碳酸鹽-例如碳酸鉀，和堿金屬或堿土金屬氫氧化物-例如氫氧化鉀。堿的用量在相當(dāng)于化合物(III)摩爾數(shù)的0.1-15倍的范圍內(nèi)，優(yōu)選1-5倍左右。
步驟(d)步驟(d)是通過還原反應(yīng)將化合物(IV)中的硝基轉(zhuǎn)化成氨基，并且同時除去R2，得到化合物(V)的過程。
可以通過通常的氫化反應(yīng)完成還原反應(yīng)。例如，可以是有催化劑的催化氫化反應(yīng)。在此過程中可以使用的催化劑的例子為通常使用的金屬催化劑。在這些金屬催化劑中，優(yōu)選鈀-炭、阮內(nèi)鎳，和阮內(nèi)鈷。
只要不抑制反應(yīng)進行，不特別限定溶劑。溶劑的例子可以包括烴類溶劑，如正己烷、正戊烷、苯、甲苯和二甲苯；和醇類溶劑，例如甲醇、乙醇、丙醇、丙醇、異丙醇(IPA)、正丁醇和叔丁醇。醚類溶劑的例子是乙醚、異丙醚(IPE)、甲基叔丁醚(MTBE)、四氫呋喃(THF)、二甲氧基乙烷和1，4-二氧雜環(huán)乙烷。酰胺類溶劑的例子是N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和N，N-二甲基乙酰胺(DMAC)。鹵代烴類溶劑的例子是氯仿、二氯甲烷和1，2-二氯乙烷(EDC)。另外，也可以使用水、乙腈、醋酸酯、丙酮等溶劑。可以單獨或聯(lián)合使用這些溶劑。在這些溶劑中，優(yōu)選醇類溶劑，例如甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇(IPA)；芳香烴溶劑，例如甲苯和二甲苯；和這些溶劑與水的混和溶劑。
作為氫的來源，也可以用甲酸銨代替氫氣。甲酸銨的量可以在相當(dāng)于化合物(IV)摩爾數(shù)的1-15倍，優(yōu)選2-5倍左右的范圍內(nèi)。
根據(jù)所用堿和溶劑，反應(yīng)溫度可以不同，但可以在-78℃至溶劑沸點的范圍內(nèi)，優(yōu)選室溫至80℃。反應(yīng)時間可以在1-24小時，優(yōu)選2-16小時的范圍內(nèi)。
步驟(e)步驟(e)是通過使化合物(V)與式(VI)的亞甲基丙二酸酯化合物反應(yīng)得到化合物(VII)的步驟。
可以使用的亞甲基丙二酸酯化合物(VI)可以包括乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯和甲氧基亞甲基丙二酸二甲酯。
可以優(yōu)選用與化合物(V)等摩爾或更多的亞甲基丙二酸酯化合物(VI)進行此反應(yīng)，然后在無溶劑狀態(tài)中，在100-180℃左右將其攪拌加熱，或在適當(dāng)溶劑中將其回流加熱。
只要對于反應(yīng)是惰性的，不特別限定進行上述反應(yīng)的溶劑。溶劑的例子是烴，例如苯、甲苯、二甲苯、正己烷、環(huán)己烷和正戊烷；低級醇溶劑，例如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇；醚，例如乙醚、四氫呋喃、二氧雜環(huán)乙烷和1，2-二甲氧基乙烷；酰胺類，例如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺和N-甲基-2-吡咯烷酮；和非質(zhì)子(aprotonic)極性溶劑，例如二甲基亞砜和環(huán)丁砜。當(dāng)使用某種溶劑時，可以在不高于溶劑沸點的溫度下進行反應(yīng)。
步驟(f)步驟(f)是通過使磺?；衔锱c化合物(VII)反應(yīng)得到化合物(VIII)的步驟。
可以使用的磺?；衔锟梢园▽?甲苯磺酰氯、甲磺酰氯和氯代甲磺酰氯。
可以優(yōu)選在有堿的條件下進行反應(yīng)。堿的例子是叔胺，例如三乙胺、三丁胺和N，N-二異丙基乙胺；二烷基苯胺，例如N，N-二甲基苯胺和N，N-二乙基苯胺；雜環(huán)胺，例如嘧啶、N，N-二甲基氨基嘧啶和N-甲基嗎啉；和1，8-重氮化二環(huán)[5，4，0]十一碳烯。
當(dāng)使用溶劑時，需要非質(zhì)子(aprotonic)溶劑。非質(zhì)子(aprotonic)溶劑的例子是醚，例如乙醚、四氫呋喃、二氧雜環(huán)乙烷和1，2-二甲氧基乙烷；酰胺類溶劑，例如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺和N-甲基-2-吡咯烷酮；和氯化烴類溶劑，例如二氯甲烷、氯仿和1，2-二氯乙烷。反應(yīng)溫度可以優(yōu)選0-100℃左右。
步驟(g)步驟(g)是通過使化合物(VIII)在堿性條件下發(fā)生環(huán)閉合反應(yīng)得到化合物(IX)的步驟。
在環(huán)合反應(yīng)中可以使用的堿可以是無機堿或有機堿。無機堿的例子可以包括金屬氫氧化物，例如氫氧化鋰、氫氧化鈉和氫氧化鉀；金屬碳酸鹽，例如碳酸鋰、碳酸鈉和碳酸鉀；和金屬碳酸氫鹽，例如碳酸氫鈉和碳酸氫鉀。另一方面，有機酸的例子包括叔烷基胺，例如三乙胺、三丁胺和N，N-二異丙基乙胺；二烷基苯胺，例如N，N-二甲基苯胺和N，N-二乙基苯胺；雜環(huán)胺，例如嘧啶、N，N-二甲基氨基嘧啶和N-甲基嗎啉；金屬醇鹽，例如甲醇鈉、乙醇鈉、異丙醇鈉和叔丁醇鉀；另外還有1，8-重氮化二環(huán)[5，4，0]十一碳烯和N-芐基三甲基氫氧化銨。
反應(yīng)溶劑的例子是低級醇，例如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇；醚，例如乙醚、四氫呋喃、二氧雜環(huán)乙烷、1，2-二甲氧基乙烷、2-甲氧基乙醚和乙二醇二乙醚；酰胺，例如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺和N-甲基-2-吡咯烷酮；和非質(zhì)子(aprotonic)極性溶劑，例如二甲基亞砜和環(huán)丁砜。
可以在室溫至150℃的溫度范圍內(nèi)進行反應(yīng)。
對于環(huán)合反應(yīng)，加入相當(dāng)于丙氧基苯化合物當(dāng)量的1/20或更多的碘化鉀、碘化鈉、冠醚等作為反應(yīng)促進劑是有效的。
步驟(h)步驟(h)是通過在有或無硼化物的條件下加熱化合物(IX)得到化合物(X)的步驟。
當(dāng)在無硼化物的條件下進行反應(yīng)時，得到式(X)化合物，其中R6是C1-C6烷基。當(dāng)在有硼化物的條件下進行反應(yīng)時，得到式(X)化合物，其中R6是BZ2。特定的硼化物的例子可以包括三氟化硼-四氫呋喃絡(luò)合物和三氟化硼-乙醚絡(luò)合物。
無硼化物的反應(yīng)可以優(yōu)選通過在100℃至200℃在溶劑-例如多磷酸-中加熱化合物(IX)進行。另一方面，有硼化物的反應(yīng)可以優(yōu)選在溶劑-例如醋酸酐或丙酸酐中加入螯合劑-例如三氟化硼-四氫呋喃絡(luò)合物和三氟化硼-乙醚絡(luò)合物并在150℃至200℃加熱化合物(IX)而進行。
步驟(i)步驟(i)是通過使化合物(X)與4-甲基-哌嗪反應(yīng)得到化合物(XI)的步驟。當(dāng)式(X)中的R6是C1-C6烷基時，優(yōu)選在堿或酸性條件下將化合物(X)水解成其相應(yīng)的羧酸后，與4-甲基-哌嗪反應(yīng)。
可以優(yōu)選在有堿的條件下進行反應(yīng)。此處所用的堿可以是無機堿，也可以是有機堿。無機堿的例子是堿金屬和堿土金屬的碳酸鹽和碳酸氫鹽。有機堿的例子是三烷基胺和含氮的雜環(huán)化合物。具體地，可以使用過量的三乙胺、三丁胺、乙基二異丙胺、4-甲基嗎啉、二甲氨基-嘧啶、4-甲基哌嗪等，而使它們也作為反應(yīng)溶劑。可以用溶劑，例如二甲基亞砜進行此反應(yīng)。
步驟(j)步驟(j)是通過水解化合物(XI)得到化合物(XII)的步驟。
可以，例如通過在無質(zhì)子(aprotonic)溶劑中有堿的條件下加熱化合物(XI)而進行此水解反應(yīng)。例如，可以將在醇性溶劑中有三烷基胺的條件下加熱作為示例性的條件。
具體地，可以在乙醇中有三乙胺存在的條件下簡單攪拌加熱化合物(XI)而完成水解反應(yīng)。
其中X1是氟原子的式(XII)化合物是左氟沙星。
實施例以下將更具體地以實施例和對比實施例為基礎(chǔ)描述本發(fā)明。然而，應(yīng)記住本發(fā)明并不僅局限于這些實施例。
通過HPLC或GC測定得到的每個化合物的光學(xué)純度(％ee)。通過與用不同方式合成的具有已知絕對構(gòu)型的相應(yīng)樣品比較，測定所得的每個化合物的絕對構(gòu)型。
實施例1 (R)2-芐氧基丙酸乙酯將2-芐氧基丙酸乙酯(300mg)懸浮在0.1M磷酸鹽緩沖液中(pH6.5)(30mL)。加入“Lipase Fine Grade”(商標(biāo)名，SEIKAGAKUCORPORATION產(chǎn)品，德列馬根霉(Rhizopus delemer)；6mg)，然后在30℃攪拌24小時。向反應(yīng)混合物中加入醋酸乙酯，通過硅藻土過濾除去變性的蛋白質(zhì)。用1N氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)混合物至pH7.0，然后萃取。用5％碳酸氫鈉水溶液洗滌有機層，然后用無水硫酸鈉干燥。蒸餾除去溶劑得到油狀的標(biāo)題化合物(102mg，98.8％ee)。
1H-NMR(CDCl3)δ1.30(3H，t，J＝6.8Hz)，1.44(3H，d，J＝6.8Hz)，4.05(1H，q，J＝6.8Hz)，4.22(1H，q，
J＝6.8Hz)，4.23(1H，q，J＝6.8Hz)，4.45(1H，d，J＝11.7Hz)，4.67(1H，d，J＝11.7Hz)7.23-7.42(5H，m)實施例2 (R)-2-芐氧基-1-丙醇在40℃，將硼氫化鈉(21.8mg)懸浮在甲苯(0.8mL)中，并向此所得溶液中加入在實施例1中得到的存在于甲苯(0.8mL)中的(R)2-芐氧基丙酸乙酯(100mg，98.8％ee)。向反應(yīng)混合物中加入甲醇(0.15mL)，隨后在同樣溫度攪拌3小時。向反應(yīng)混合物中加入水，用甲苯萃取所得混合物。用水和氯化銨的飽和水溶液洗滌有機層，然后用無水硫酸鎂干燥。蒸餾除去溶劑后，將得到的殘余物經(jīng)過硅膠柱色譜，得到油狀的標(biāo)題化合物(79mg，99％ee)。
1H-NMR(CDCl3)δ1.17(3H，d，J＝6.3Hz)，2.20(1H，bs)，3.43-3.72(3H，m)，4.48(1H，d，J＝11.7Hz)，4.64(1H，d，J＝11.7Hz)，7.22-7.44(5H，m)參考例1將產(chǎn)左聚糖微桿菌(IFO 14471)接種在營養(yǎng)肉湯(100mL，Sakaguchi燒瓶中)中，并在30℃搖蕩培養(yǎng)過夜。通過離心收集細胞，然后冷凍干燥得到冷凍干燥的IFO 14471細胞。
實施例3 (R)2-芐氧基丙酸乙酯將2-芐氧基丙酸乙酯(2.0g，9.6mmol)懸浮在0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)(100mL)中。加入按參考例1所述方法制備的IFO 14471的冷凍干燥細胞(100mg)，然后在30℃攪拌。由于隨著反應(yīng)的進行pH逐步降低(是形成羧酸的結(jié)果)，加入1N氫氧化鈉以保持系統(tǒng)的pH在6.8和7.2之間。反應(yīng)14小時后，加入醋酸乙酯(100mL)。然后攪拌片刻，通過硅藻土過濾除去細胞。分層后，用醋酸乙酯(100mL)進一步萃取。收集醋酸乙酯層，然后用5％碳酸氫鈉水溶液洗滌2次，完全除去羧酸。干燥有機層，蒸餾除去溶劑，得到標(biāo)題化合物
?；衔锏?H-NMR光譜數(shù)據(jù)與實施例1中化合物的數(shù)據(jù)一致。
實施例4 (R)2-芐氧基丙酸乙酯將2-芐氧基丙酸乙酯(2.0g，9.6mmol)懸浮在0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)(100mL)中。加入按與參考例1類似的方式制備的ATCC14579的冷凍干燥細胞(100mg)，然后在30℃攪拌。由于隨著反應(yīng)的進行pH逐步降低(是形成羧酸的結(jié)果)，加入1N氫氧化鈉以保持系統(tǒng)的pH在6.8和7.2之間。反應(yīng)16小時后，加入醋酸乙酯(100mL)。然后攪拌片刻，通過硅藻土過濾除去細胞。分層后，用醋酸乙酯(100mL)進一步萃取。收集醋酸乙酯層，然后用5％碳酸氫鈉水溶液洗滌2次，完全除去羧酸。干燥有機層，蒸餾除去溶劑，得到標(biāo)題化合物
。化合物的1H-NMR光譜數(shù)據(jù)與實施例1中化合物的數(shù)據(jù)一致。
實施例5 2-芐氧基丙酸乙酯(外消旋化步驟)收集在實施例3中用醋酸乙酯萃取時全部的水層，然后用10％鹽酸調(diào)整至pH2。然后用醋酸乙酯(100mL)萃取水層2次。合并且干燥有機層后，蒸餾除去溶劑得到(S)-芐氧基丙酸
。將等份的(S)-芐氧基丙酸溶解在乙醇(10mL)中，隨后加入濃硫酸(0.01mL)。然后將由此制備的混合物回流加熱。8小時后，蒸餾除去溶劑，用醋酸乙酯(20mL)萃取殘余物。用5％碳酸氫鈉水溶液(10mL)和水(10mL)洗滌萃取物，干燥有機層，蒸餾除去溶劑得到(S)-芐氧基丙酸乙酯。它溶解在甲苯(10mL)中，并在冰冷卻條件下攪拌，加入乙醇鈉(0.33g，1.1eq)，然后在室溫攪拌14小時。通過使用光學(xué)活性柱的氣相色譜，證實完成了外消旋化。然后，將反應(yīng)混合物滴加到10％檸檬酸水溶液(10mL)中。用水(10mL)洗滌有機層并干燥后，蒸餾除去溶劑得到標(biāo)題化合物(0.74g)?；衔锏?H-NMR光譜數(shù)據(jù)與實施例1中化合物的數(shù)據(jù)一致。外消旋體可以作為實施例1-4非對稱酯水解的原料。
對比實施例1 (R)2-芐氧基丙酸甲酯在-30℃，溴化芐(9.86g)和60％氫化鈉(2.11g)溶解在二甲基甲酰胺(DMF)和四氫呋喃(THF)的混合溶液中(50mL，體積比3∶2)。向溶液中加入(R)乳酸甲酯(5.0g，99％ee)。在同樣溫度下，將所得混合物攪拌30分鐘。然后，在室溫將混合物攪拌30分鐘，并進一步在50℃攪拌30分鐘。向反應(yīng)混合物中加入水和二異丙基醚，用水洗滌有機層，然后用無水硫酸鎂干燥。蒸餾除去溶劑后，將所得殘余物經(jīng)過硅膠柱色譜得到黃色油狀的標(biāo)題化合物(8.87g，92.1％ee)。
1H-NMR(CDCl3)δ1.44(3H，d，J＝6.8Hz)，3.75(3H，s)，4.07(1H，q，J＝6.9Hz)，4.45(1H，d，J＝11.7Hz)，4.69(1H，d，J＝11.7Hz)，7.22-7.37(5H，m)實施例6 (R)-3，4-二氟-2-(2-芐氧基丙氧基)硝基苯在冰冷卻下，將氫氧化鉀(5.40g)和碳酸鉀(3.33g)懸浮在甲苯(180mL)中。向得到的懸浮液中加入在實施例2得到的(R)-2-芐氧基-1-丙醇(4.0g)的溶液，和2，3，4-三氟硝基苯(4.13g)的甲苯溶液(40mL)，然后在同樣溫度下攪拌1小時。向反應(yīng)混合物中加入水，然后用甲苯萃取。用水洗滌有機層，然后用無水硫酸鎂干燥。蒸餾除去溶劑后，將所得殘余物經(jīng)過硅膠柱色譜得到黃色油狀的標(biāo)題化合物(7.55g)。
1H-NMR(CDCl3)δ1.29(3H，d，J＝6.4Hz)，3.93-4.
03(2H，m)，4.53-4.65(2H，m)，6.90-6.99(1H，m)，7.23-7.35(5H，m)，7.60-7.66(1H，m)實施例7 (R)-3，4-二氟-2-(2-芐氧基丙氧基)硝基苯在冰冷卻下，將叔丁醇鈉(63.6mg)懸浮在甲苯(0.5mL)中。向得到的懸浮液中加入在實施例2得到的(R)-2-芐氧基-1-丙醇(100mg)。然后在冰冷卻下將得到的懸浮液加入2，3，4-三氟硝基苯(103.5mg)的甲苯溶液中(0.5mL)中，攪拌1小時。向反應(yīng)混合物中加入水，然后用甲苯萃取。用水洗滌有機層，然后用無水硫酸鎂干燥。蒸餾除去溶劑后，將所得殘余物經(jīng)過硅膠柱色譜得到黃色油狀的標(biāo)題化合物(161.2mg)?；衔锏?H-NMR光譜數(shù)據(jù)與實施例6中化合物的數(shù)據(jù)一致。
實施例8 (R)-3，4-二氟-2-(2-羥基丙氧基)苯胺在室溫，將在實施例6得到的(R)-3，4-二氟-2-(2-芐氧基丙氧基)硝基苯(1.0g)溶解在乙醇(10mL)中。加入7.5％Pd-C(1.0g)，然后在氫氣氛中攪拌6小時。過濾除去Pd-C后，減壓濃縮如此得到的濾液，將所得殘余物經(jīng)過硅膠柱色譜得到油狀的標(biāo)題化合物(600mg，99.0％ee)。
1H-NMR(CDCl3)δ1.23(3H，d，J＝6.3Hz)，3.81-4.
89(1H，m)，4.06-4.17(2H，m)，6.37-6.44(1H，m)，6.77-6.87(1H，m)實施例9 (R)-3，4-二氟-2-(2-羥基丙氧基)苯胺在室溫，將在實施例6得到的(R)-3，4-二氟-2-(2-芐氧基丙氧基)硝基苯(0.3g)溶解在甲苯(3mL)中。加入10％Pd-C(90mg)，然后在氫氣氛中在80℃攪拌4小時。過濾除去Pd-C后，減壓濃縮如此得到的濾液，將所得殘余物經(jīng)過硅膠柱色譜得到油狀的標(biāo)題化合物(181.0mg，99.0％ee)?；衔锏?H-NMR光譜數(shù)據(jù)與實施例8中化合物的數(shù)據(jù)一致。
實施例10 2，3-二氟-6-(2，2-二乙氧基羰基乙烯基)-氨基-[(R)-2-羥基丙氧基]苯在100℃，將在實施例8得到的(R)-3，4-二氟-2-(2-羥基丙氧基)苯胺(1.02g)，和乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯(1.14g)在無溶劑的條件下攪拌1小時。在輕微減壓下除去產(chǎn)生的乙醇時，再將混合物攪拌30分鐘。使反應(yīng)混合物冷卻，然后減壓濃縮。將所得殘余物經(jīng)過硅膠柱色譜得到白色結(jié)晶狀的標(biāo)題化合物(1.83mg，99.0％ee)。
熔點52-55℃1H-NMR(270MHz，CDCl3)δ1.22-1.46(m，9H)、3.
55(d，1H，J＝4.5Hz)、3.88-4.43(m，7H)、6.75-7.
08(m，2H)，8.48(d，1H，J＝14.5Hz)實施例11 2，3-二氟-6-(2，2-二乙氧基羰基乙烯基)-氨基-[(R)-2-甲烷磺?；醣趸鵠苯將由實施例10得到的2，3-二氟-6-(2，2-二乙氧基羰基乙烯基)-氨基-[(R)-2-羥基丙氧基]苯(3.00g)溶解在1，2-二氯乙烷(30mL)中。在冰冷卻下攪拌加入三乙胺(0.98g)，并在同樣溫度下，進一步攪拌加入甲磺酰氯(1.01g)。在室溫將由此得到的混合物攪拌2小時，過濾除去不溶的物質(zhì)。用1，2-二氯乙烷將濾液稀釋。用水洗滌得到的溶液，然后用無水硫酸鎂干燥。向干燥后的有機層加入硅膠(1.5g)，然后攪拌30分鐘，過濾除去不溶的物質(zhì)。減壓蒸餾除去溶劑，使殘余物從異丙醚中結(jié)晶。然后過濾收集結(jié)晶，得到標(biāo)題化合物(3.27g)。
1H-NMR(CDCl3)δ1.22-1.47(6H，m)，1.58(3H，d，J＝7Hz)，1.50(3H，d，J＝7Hz)，3.13(3H，s)，3.98-4.60(6H，m)，4.95-5.35(1H，m)，6.79-7.14(2H，m)，8.41(1H，d，J＝13.5Hz)實施例12 (S)(7，8-二氟-3-甲基-3，4-二氫-2H-[1，4]苯并噁嗪-4-基)亞甲基-丙二酸二乙酯將由實施例11得到的2，3-二氟-6-(2，2-二乙氧基羰基乙烯基)-氨基-[(R)-2-甲烷磺?；醣趸鵠苯(3.00g)溶解在無水DMF(15mL)中，然后加入碳酸鉀(0.92g)。在80℃將由此得到的混合物攪拌2小時。減壓蒸餾除去溶劑，用醋酸乙酯萃取殘余物，用水洗滌得到的萃取物，然后用無水硫酸鎂干燥。減壓蒸餾除去溶劑，使殘余物經(jīng)過硅膠柱色譜，得到標(biāo)題化合物(2.14g)。
1H-NMR(CDCl3)δ1.22-1.42(9H，m)，3.90-4.44(7H，m)，6.74-6.88(2H，m)，7.78(1H，s)實施例13 (3S)-9，10-二氟-3-甲基-7-氧代-2，3-二氫-7H-吡啶并[1，2，3-de][1，4]苯并噁嗪-6-羧酸-二氟化硼鰲合物將由實施例12得到的(S)(7，8-二氟-3-甲基-3，4-二氫-2H-[1，4]苯并噁嗪-4-基)亞甲基丙二酸二乙酯(2g)，和醋酸酐(2mL)在140℃混和，加入47％三氟化硼-四氫呋喃絡(luò)合物(0.8mL)。在同樣溫度下，將殘余物攪拌加熱1小時。當(dāng)將產(chǎn)生的低沸點產(chǎn)物蒸餾除去后，使反應(yīng)混合物冷卻到室溫。向反應(yīng)混合物中加入丙酮(10mL)，然后在同樣溫度下攪拌30分鐘。收集沉淀的結(jié)晶并用丙酮洗滌得到標(biāo)題化合物(1.55g)。
實施例14 (3S)-(-)-9-氟-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪基)-7-氧代-2，3-二氫-7H-吡啶并[1，2，3-de][1，4]苯并噁嗪-6-羧酸(左氟沙星)將由實施例13得到的(3S)-9，10-二氟-3-甲基-7-氧代-2，3-二氫-7H-吡啶并[1，2，3-de][1，4]苯并噁嗪-6-羧基-二氟化硼鰲合物(310mg)溶解在二甲基亞砜(6mL)中，然后加入三乙胺(0.32mL)和N-甲基哌嗪(0.13mL)。在室溫將得到的混和物攪拌17小時，然后減壓蒸發(fā)至干。用乙醚洗滌殘余物后，將殘余物溶解在含有三乙胺(0.5mL)的95％乙醇(20mL)中。將如此得到的溶液回流加熱8小時。使反應(yīng)混合物冷卻，然后減壓蒸發(fā)至干。將殘余物溶解在稀鹽酸(5％)中。隨后加入氯仿，使得到的混合物分層。用氫氧化鈉(1mol/L)將水層調(diào)節(jié)到pH11，然后用鹽酸(1mol/L)調(diào)節(jié)到pH7.4。用氯仿萃取如此制備的混合物(50mL×3)。合并萃取物，用硫酸鈉干燥，蒸餾除去氯仿。從乙醇-乙醚中重結(jié)晶所得粉末，得到透明的細針狀標(biāo)題化合物(120mg)。
熔點225-227℃對C18H20FN3O4·1/2H2O的元素分析計算值C 58.37；H 5.72；N 11.35
測定值C 58.17；H 5.58；N 11.27實施例15(1)破裂細胞(法式重壓法(French press))將通過在Sakaguchi燒瓶中(培養(yǎng)基量1,200mL)振蕩培養(yǎng)得到的ATCC 14579細胞，懸浮在20mM磷酸緩沖液(80mL)(pH7.0；含有1Mm EDTA和DTT)，通過法式重壓(French press)，施加15,000psi的壓力，以使細胞破裂。
通過離心分離器將破裂的細胞離心(10,000G，30分鐘)得到細胞提取物(85.0mL)(總活性123單位，特異活性0.032單位/mg)。
(2)陰離子交換色譜在下述陰離子交換色譜的純化條件下，將細胞提取物分離。測定各級分對2-芐氧基丙酸乙酯的水解活性(206mL)來獲得活性級分(總活性88單位，特異活性0.058單位/mg，活性產(chǎn)率72％)。
陰離子交換色譜柱純化條件載體“Source Q”(商標(biāo)名，Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品)400mL色譜柱直徑50mm，長200mm流動相溶液A20mM磷酸緩沖液(pH7.0，含有1mM EDTA和DTT)900mL溶液B溶液A+1.0M NaCl，900mLA→B線性梯度洗脫檢測器280nm；溫度4℃收集15分鐘的各級分，然后對2-芐氧基丙酸乙酯進行水解。
(3)疏水性色譜向由陰離子交換色譜收集的活性級分(206mL)中，以小份方式加入硫酸銨(54.4g，2.0M當(dāng)量)。攪拌30分鐘后，離心除去所得沉淀(10,000G，30分鐘)。用下述疏水性色譜純化條件將由此得到的上清液分級分離。測定各級分對2-芐氧基丙酸乙酯的水解活性，并確定活性級分(251-308分鐘)。通過超濾除去這些活性級分中的鹽并將其濃縮，得到活性的中心級分(1.0mL)(總活性16.8單位，特異活性3.23單位/mg，活性產(chǎn)率19％)。
疏水性色譜純化條件載體“Resource ETH”(商標(biāo)名，Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品)100mL色譜柱直徑45mm，長60mm流動相溶液A20mM磷酸緩沖液(pH7.0，含有1mM EDTA和DTT)600mL溶液B溶液A+2.0M硫酸胺，600mLB→A線性梯度洗脫檢測器280nm；溫度4℃收集7分鐘的各級分，然后對2-芐氧基丙酸乙酯進行水解。
(4)陰離子交換色譜(“Mono Q”商標(biāo)名，Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品)用“Mono Q”陰離子交換色譜將通過疏水性色譜收集的活性級分(1.0mL)分級分離。測定各級分對2-芐氧基丙酸乙酯的水解活性，并確定活性級分(23-25分鐘)。通過超濾除去這些活性級分中的鹽并將其濃縮，得到活性的中心級分(1.0mL)(總活性5.9單位，特異活性4.54單位/mg，活性產(chǎn)率35％)。發(fā)現(xiàn)活性蛋白質(zhì)的分子量約為38,000(SDS PAGE)或40,000(凝膠過濾法)。
陰離子交換色譜純化條件(“Mono Q”)色譜柱陰離子交換柱(“Mono Q”)1mL流動相溶液A20mM磷酸緩沖液(pH7.0)溶液B溶液A+1.0M NaCl，600mLA→B線性梯度洗脫流速1.0mL/min；檢測器280nm；
溫度室溫收集1分鐘的各級分，然后對2-芐氧基丙酸乙酯進行水解。
ATCC 14579分離純化結(jié)果

用如上所述來源于微生物的，經(jīng)過純化的酶，進行如實施例1、2、3和4的非對稱性酯水解反應(yīng)。有效地得到光學(xué)純度為99％ee或更高的(R)-2-芐氧基丙酸乙酯。
工業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明的方法，可以通過較少的步驟，以較低的成本得到有高光學(xué)純度的光學(xué)活性丙氧基苯胺衍生物(V)。因此本發(fā)明提供了一種制備左氟沙星化合物的工業(yè)上有益的方法，它有光學(xué)純度方面的高質(zhì)量，并因此能用作抗菌劑。
權(quán)利要求
1.制備用下式(I-a)表示的光學(xué)活性化合物的方法 其中R1代表有1-6個碳原子的烷基，R2代表羥基保護基團，該方法包括用有非對稱性酯水解能力的酶、培養(yǎng)的有非對稱性酯水解能力的微生物的培養(yǎng)基、所述微生物的細胞或所述微生物細胞的加工產(chǎn)物處理用下式(I)代表的化合物， 其中，R1和R2有與上述定義相同的意義，得到混合物，并從混合物中分離和收集所述的光學(xué)活性化合物(I-a)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中R2是取代或非取代芳烷基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中R2是芐基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中R2是乙基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中所述的酶是脂酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中所述的微生物是細菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述的細菌選自芽孢桿菌屬細菌、微桿菌屬細菌、微球菌屬細菌、假單胞菌屬細菌、棒狀桿菌屬細菌和鏈霉菌屬細菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述的細菌是芽孢桿菌屬細菌或微桿菌屬細菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述的細菌是蠟狀芽孢桿菌或產(chǎn)左聚糖微桿菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述的細菌是蠟狀芽孢桿菌(DSC0007)、蠟狀芽孢桿菌(ATCC 14579)或產(chǎn)左聚糖微桿菌(IFO14471)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中所述的酶是有非對稱性酯水解能力，并通過在高壓下使有非對稱性酯水解能力的微生物的細胞破裂，然后連續(xù)用強陰離子色譜、疏水性色譜和強陰離子色譜純化由此破裂的細胞而得到的酶。
12.一種制備用下式(V)表示的化合物的方法 其中X1和X2各自獨立地代表鹵原子，該方法包括用有非對稱性酯水解能力的酶、培養(yǎng)的有非對稱性酯水解能力的微生物的培養(yǎng)基、所述微生物的細胞或所述微生物細胞的加工產(chǎn)物處理用下式(I)代表的化合物 其中，R1代表有1-6個碳原子的烷基，R2代表羥基保護基團，得到混合物，并從所述混合物中分離、收集和獲得用下式(I-a)代表的光學(xué)活性化合物 其中R1和R2有與上述定義相同的意義；在有存在于非醇溶劑中的伯醇的條件下，用金屬氫硼化物處理所述化合物(I-a)，得到用下式(II)代表的化合物 其中R2有與上述定義相同的意義；在有堿存在的條件下處理化合物(II)和用下式(III)代表的化合物 其中X1和X2有與上述定義相同的意義，X3獨立地代表鹵原子，得到用下式(IV)代表的光學(xué)活性化合物 其中R2、X1和X2有與如上定義相同的意義；并且將所述化合物(IV)中的硝基轉(zhuǎn)化處理成氨基，并同時除去R2。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中在用下式(IV)代表的所述光學(xué)活性化合物中所述硝基向所述氨基的所述轉(zhuǎn)化，及除去R2，在還原條件下同時進行 其中X1和X2各自獨立地代表鹵原子，R2代表羥基保護基團，得到用下式(V)代表的化合物 其中X1和X2有與上述定義相同的意義。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的方法，其中所述的非醇溶劑是芳香烴。
15.根據(jù)權(quán)利要求12-14中任一項的方法，其中所述的伯醇是甲醇。
16.根據(jù)權(quán)利要求12-15中任一項的方法，其中所述的金屬氫硼化物是硼氫化鈉。
17.根據(jù)權(quán)利要求12-16中任一項的方法，其中R2是取代或非取代的芳烷基。
18.根據(jù)權(quán)利要求12-17中任一項的方法，其中R2是芐基。
19.制備用下式(XII)代表的化合物的方法 其中X1代表鹵原子，此方法包括用有非對稱性酯水解能力的酶、培養(yǎng)的有非對稱性酯水解能力的微生物的培養(yǎng)基、所述微生物的細胞或所述微生物細胞的加工產(chǎn)物處理用下式(I)代表的化合物 其中R1代表有1-6個碳原子的烷基，R2代表羥基保護基團，得到混合物，并從混合物中分離、收集和得到用下式(I-a)代表的光學(xué)活性化合物 其中R1和R2有與上述定義相同的意義；在有存在于非醇溶劑中的伯醇的條件下，用金屬氫硼化物處理此化合物(I-a)，得到用下式(II)代表的化合物 其中R2有與上述定義相同的意義；用堿處理所述化合物(II)和用下式(III)代表的化合物 其中X1有與上述定義相同的意義，X2和X3各自獨立地代表鹵原子，得到用下式(IV)代表的光學(xué)活性化合物 其中R2、X1和X2有與如上定義相同的意義；將所述化合物(IV)中的硝基轉(zhuǎn)化成氨基，并同時除去R2，得到用下式(V)代表的化合物 其中X1和X2有與上述定義相同的意義，使化合物(V)與用下式(VI)代表的化合物反應(yīng) 其中Y代表有1-6個碳原子的烷氧基、鹵原子或二(C1-C6烷基)氨基，R3和R4分別獨立地代表有1-6個碳原子的烷基，得到用下式(VII)代表的化合物 其中X1、X2、R3和R4有與上述定義相同的意義；使化合物(VII)與磺?；衔锓磻?yīng)，得到用下式(VIII)代表的化合物 其中R5代表取代的或非取代的烷基磺?；衔锘蛉〈幕蚍侨〈姆蓟酋；衔?，X1、X2、R3和R4有與上述定義相同的意義；在堿性條件下使化合物(VIII)進行閉環(huán)反應(yīng)，得到用下式(IX)代表的化合物 其中X1、X2、R3和R4有與上述定義相同的意義；在有或無硼化物的條件下加熱化合物(IX)，得到用下式(X)代表的化合物 其中R6代表有1-6個碳原子的烷基或BZ2，其中Z代表鹵原子、C1-C6烷氧基或C2-C7烷基羰基氧基(alkylcarbonyloxy)，X1和X2有與上述定義相同的意義；使所述化合物(X)與4-甲基丙拉嗪反應(yīng)得到用下式(XI)代表的化合物 其中X1和R6有與上述定義相同的意義；并水解所述化合物(XI)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中在用下式(IV)代表的所述光學(xué)活性化合物中，所述硝基向所述氨基的所述轉(zhuǎn)化，及所述的除去R2，在還原條件下同時進行 其中X1和X2各自獨立地代表鹵原子，R2代表羥基保護基團，得到用下式(V)代表的化合物 其中X1和X2有與上述定義相同的意義。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其中所述的非醇溶劑是芳香烴。
22.根據(jù)權(quán)利要求19-21中任一項的方法，其中所述的伯醇是甲醇。
23.根據(jù)權(quán)利要求19-22中任一項的方法，其中所述的金屬氫硼化物是硼氫化鈉。
24.根據(jù)權(quán)利要求19-23中任一項的方法，其中R2是取代的或非取代芳烷基。
25.根據(jù)權(quán)利要求19-24中任一項的方法，其中R2是芐基。
26.根據(jù)權(quán)利要求19-25中任一項的方法，其中X1是氟原子。
27.有非對稱性酯水解能力的酶，通過使有非對稱性酯水解能力的微生物的細胞在高壓下破裂，然后用強陰離子色譜法、疏水性色譜法和強陰離子色譜法連續(xù)純化如此破裂的細胞而得到。
全文摘要
用有非對稱性酯水解能力的酶等物質(zhì)處理乳酸酯衍生物，可以特異地水解作為外消旋衍生物的成對化合物存在的異構(gòu)體的酯部分。使用通過此水解得到的化合物，能夠以比常規(guī)技術(shù)更短的過程產(chǎn)生光學(xué)活性丙氧基苯胺衍生物。
文檔編號C12P41/00GK1496409SQ0280609
公開日2004年5月12日 申請日期2002年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月7日
發(fā)明者佐藤耕司, 八木努, 久保田和夫, 井村明弘, 和夫, 弘 申請人:第一制藥株式會社