專利名稱：抗人肝癌單克隆抗體HAb18輕、重鏈可變區(qū)基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗人肝癌單克隆抗體HAb18重鏈和輕鏈可變區(qū)基因和由所述基因編碼的多肽，以及所述基因和多肽在制備用于診斷和治療腫瘤或炎癥藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝癌是我國和東南亞地區(qū)的多發(fā)病和常見病。尤其在我國，每年死亡人數(shù)高達11萬人。約占全世界肝癌總死亡人數(shù)的43％，因此研究肝癌的診斷和治療具有重要的意義。自1975年Kohler和Milstein創(chuàng)建B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)以來，各種單克隆抗體(McAb)相繼出現(xiàn)，它們在疾病診治的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用方面發(fā)揮了積極的作用，其中肝癌單抗的研制更是為這種難治性腫瘤帶來了新的希望。近二十年，關(guān)于肝癌單抗的研究大多為甲胎蛋白和鐵蛋白單抗。在肝癌單抗的制備方面，多采用傳統(tǒng)免疫方法，即以可溶性物質(zhì)或肝癌培養(yǎng)細(xì)胞為免疫原，由于腫瘤抗原的變異或部分丟失，因而該方法難以獲得高親和性、高特異性的肝癌單抗。
用腫瘤新鮮組織制備細(xì)胞懸液免疫動物制備單抗已有成功報道。該法雖然篩選麻煩，但能較好地保持抗原性，不失為免疫動物制備單抗的好方法。本發(fā)明人用該免疫方法獲得特異性肝癌單抗7株，該細(xì)胞株的建立見《單克隆抗體通訊》，1989；233-36，陳志南，劉彥仿，楊繼震等。其中特異性較好的HAb18肝癌單抗，免疫組化染色陽性率為75％，已通過了中國藥品生物制品檢定所的《人用鼠源性單克隆抗體制備及質(zhì)量控制要點》的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種抗肝癌相關(guān)抗原HAb18G的單克隆抗體HAb18重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，以便兩者重組后可表達出特異性識別和結(jié)合肝癌相關(guān)抗原HAb18G的抗體活性片段。
本發(fā)明的另一目的在于所述基因和多肽在制備用于診斷和治療腫瘤或炎癥藥物中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及一種抗肝癌相關(guān)抗原HAb18G的單克隆抗體HAb18重鏈和輕鏈可變區(qū)基因。本發(fā)明的抗肝癌單抗HAb18重鏈和輕鏈可變區(qū)基因是從能夠分泌較高活性的鼠源性抗HAb18G單抗的雜交瘤細(xì)胞株HAb18中克隆的。其中所述的重鏈可變區(qū)基因全長為445bp，其核苷酸序列如序列表中<400>1所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中<400>3所示。所述的輕鏈可變區(qū)基因全長為421bp，其核苷酸序列如序列表中<400>2所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中<400>4所示，兩個基因重組后可用于表達特異性識別和結(jié)合肝癌相關(guān)抗原HAb18G的抗體活性片段。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還涉及所述基因和多肽在制備用于診斷和治療腫瘤或炎癥藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明人應(yīng)用一套設(shè)計的引物成功地從培養(yǎng)的肝癌特異性單抗HAb18雜交瘤細(xì)胞中克隆了抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。序列分析表明，VH基因與Kasturi，K.N等發(fā)表的抗胸腺細(xì)胞和紅細(xì)胞自身抗體的重鏈可變區(qū)基因同源性最高。VL基因與O′Connor，K.C.等發(fā)表的抗DNA抗體6E6的輕鏈可變區(qū)基因的同源性最高，屬于小鼠免疫球蛋白重排的κ鏈V-J區(qū)基因。所得VH與VL基因可編碼正確的小鼠抗體可變區(qū)?；谏鲜鲆芽寺〉降目谷烁伟﹩慰笻Ab18輕、重鏈可變區(qū)基因，可以采用基因工程方法，構(gòu)建和表達多種小分子基因工程抗體，如單鏈抗體、嵌合抗體、Fab抗體等，以便用于肝癌的診斷和治療目的。


圖1為RT-PCR擴增的抗人肝癌單抗HAb18輕、重鏈可變區(qū)基因的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中A為DL-2000Marker，B為HAb18重鏈可變區(qū)基因，C為HAb18輕鏈可變區(qū)基因。
圖2為抗人肝癌單抗HAb18輕鏈可變區(qū)基因的測序圖譜。
圖3為抗人肝癌單抗HAb18重鏈可變區(qū)基因的測序圖譜。
具體實施例方式
抗人肝癌單抗HAb18輕、重鏈可變區(qū)基因的克隆。
所用細(xì)胞株為第四軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞工程研究中心采用傳統(tǒng)的融合方法獲得的一株高親和力、高特異性的鼠源性抗人肝細(xì)胞癌單抗HAb18雜交瘤細(xì)胞株，其抗原為HAb18G分子，其分泌的抗體分子亞型為IgG1抗HAb18G的單抗可變區(qū)基因的克隆取處于對數(shù)生長期的HAb18雜交瘤細(xì)胞(5×106)，采用異硫氰酸胍一步法提取總RNA，取少量進行紫外分光光度計定量及1％甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測。隨后以O(shè)ligo(dT)15(Promega公司)為隨機引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。然后，利用設(shè)計的一套通用引物成功擴增出肝癌單抗HAb18的輕、重鏈可變區(qū)基因(VH，VL)。擴增產(chǎn)物VH(約450bp)和VL(約420bp)經(jīng)低溶點瓊脂糖凝膠(1.5％)電泳后，切膠分離靶片段。通過凝膠純化試劑盒(promega Inc)回收純化后，凝膠電泳鑒定(見附圖1)。之后將目的片段克隆至T載體，測序分析(見附圖2，3)。
Oligo(dT)15(Promega公司)為隨機引物的反轉(zhuǎn)錄方案如下20μL反應(yīng)體系中依次加入1μg總RNA(2μL)，0.5ug隨機引物Oligo(dT)15(1μL)，4ulMgCL2(25mM)2μL5×dNTPs，2μL10×緩沖液，0.5μLRNase抑制劑，加入反轉(zhuǎn)錄酶AMV 15U(0.75μL)，用水補至20μL，混勻，42℃水浴1h，煮沸3min，反應(yīng)產(chǎn)物置于-20℃?zhèn)溆谩?br> PCR擴增反映按常規(guī)方法進行以上述產(chǎn)物為模板，分別用3對重鏈引物和5對輕鏈引物擴增抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。反應(yīng)體系為模板cDNA2.5ul，dNTP(各0.4mM)，10×Buffer 5ul，Ex Taq DNA聚合酶1.25u，5’端和3’端引物各5ul(約30pmol)，加水至50ul，混勻，瞬時離心后，加入1-2滴液體石蠟，置PCR儀上反應(yīng)。反應(yīng)條件94℃1min，54℃1min，72℃1min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。
目的片段T載體克隆測序方案如下將PCR產(chǎn)物凝膠電泳分離后回收，連入pMD18-T載體。連接反應(yīng)體系為pMD18-T載體1ul，PCR產(chǎn)物凝膠純化重鏈(或輕鏈)3ul，去離子水1ul，連接緩沖液5ul，混勻后4℃過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，篩選重組克隆，然后采用通用測序引物測序。
設(shè)計的HAb18單抗可變區(qū)基因PCR擴增引物序列如下小鼠重鏈V區(qū)5’端引物(1)5’-GGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT-3’(2)5’-GGGGATATCCACCATG(AG)ACTTCGGG(TC)TGAGCT(TG)GGTTTT-3’(3)5’-GGGGATATCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT-3’小鼠重鏈V區(qū)3’端引物5’-GAC(ACT)CATGGGG(CG)TGT(TC)GTGCTAGCTG(AC)(AG)GAGAC(AGT)GTGA-3’小鼠輕鏈V區(qū)5’端引物(1)5’-GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3’(2)5’-GGGGATATCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG-3’(3)5’-GGGGATATCCACCATGGAG(AT)CACA(GT)(AT)CTCGGGTCTTT(GA)TA-3’(4)5’-GGATATCCACCATG(GT)CCCC(AT)(AG)CTCAG(CT)TC(CT)CT(TG)GT-3’(5)5’-GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3’小鼠輕鏈V區(qū)3’端引物5’-GGATACAGTTGGTGGTGCAGTCGACTTACGTTT(GT)GTTTCA(AG)CTT-3’其中劃線處為限制性酶切位點抗人肝癌單抗HAb18輕、重鏈可變區(qū)基因在制備用于診斷和治療腫瘤或炎癥藥物中的應(yīng)用。
肝癌單抗應(yīng)用方面的研究主要集中在(1)肝癌單抗在肝癌相關(guān)抗原研究中的應(yīng)用單克隆抗體的發(fā)展提供了一個發(fā)現(xiàn)新腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤抗原新位點的有效手段。這些抗原可用于臨床血清學(xué)檢查，具有一定的診斷和評價治療效果的意義。(2)肝癌單抗導(dǎo)向藥物研究以單抗為載體的放免顯像診斷、導(dǎo)向化療和導(dǎo)向放療近年取得了實質(zhì)性進展。主要有①化學(xué)藥物—單抗交聯(lián)物；②細(xì)胞毒素—單抗交聯(lián)物；③放射性核素—單抗交聯(lián)物等。
以本發(fā)明所述的輕、重鏈可變區(qū)基因重構(gòu)成一定形式的蛋白藥物，可直接用于有關(guān)疾病特別是腫瘤、炎癥的診斷及導(dǎo)向治療。另外，以本發(fā)明所述的輕、重鏈可變區(qū)基因編碼的多肽及其衍生物作為載體，交聯(lián)上細(xì)胞毒性藥物、毒素、放射性核素、酶和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑等作為導(dǎo)向藥物，可用于有關(guān)疾病特別是腫瘤的診斷及治療。
從本發(fā)明所述的輕、重鏈可變區(qū)基因編碼的多肽出發(fā)，可重組成的新型抗體主要有下列幾種形式(1)嵌合抗體。是用鼠MAb的V區(qū)與人Ig的C區(qū)連接而成為人-鼠嵌合抗體。由于其完整地保留了鼠MAb的特異性和親和力，同時降低了HAMA等不良反應(yīng)，故在腫瘤等疾病的治療中顯示出良好的效果。(2)人源化抗體。針對可變區(qū)基因結(jié)構(gòu)的人源化改造，包括CDR移植、表面氨基酸殘基鑲飾、骨架區(qū)交換、定位保留和表位導(dǎo)向選擇等，從而不但降低了可變區(qū)的鼠源性同時又保持了鼠MAb的特異性和親和力。(3)小分子抗體。主要有由VH-CH1和VL-Cl組成Fab抗體、用一多肽(GLy4Ser)3接頭連接VH基因和VL基因而成的單鏈抗體、由VH和VL以非共價鍵結(jié)合而成Fv片段抗體、由VH或VL一個功能結(jié)構(gòu)域組成的單域抗體、由單個CDR構(gòu)成的最小識別單位等。(4)多價微型抗體。主要有雙鏈抗體、(ScFv)2、Flex微型抗體、LD微型抗體、F(ab’)2、F(ab’)3、(ScFv)4等。由于有多價抗原結(jié)合位點，親和力高，分子大小適中，既能穿透腫瘤組織，亦在腎臟中的清除率較慢的特點而具有較高的臨床應(yīng)用價值。(5)雙特異性抗體。是一類具有雙重特異性和雙重功能的抗體，又稱雙功能抗體。(6)重組抗體融合蛋白。把Fab或Fv等基因片段，與非抗體的毒素或酶等其它蛋白基因連接形成的具有把特定的生物活性導(dǎo)向靶部位的一種重組蛋白。(7)重組免疫毒素。將編碼抗體和毒素的基因重組而產(chǎn)生，特點是高效，非特異毒性低，體內(nèi)穩(wěn)定性好，易穿透腫瘤及體內(nèi)使用較安全。(8)噬菌體抗體。把Ig的V區(qū)基因與絲狀噬菌體DNA上基因III或基因VIII連接經(jīng)轉(zhuǎn)染宿主菌后，使其在膜表面外殼蛋白表達Fab或ScFv的融合蛋白產(chǎn)物。通過對此產(chǎn)物多輪相關(guān)抗原的親和吸附，從中淘篩出所需的特異性抗體。
以上述由輕、重鏈可變區(qū)基因編碼的多肽重組或衍生的抗體分子為載體，交聯(lián)上各種抗癌或抗炎癥的效應(yīng)物質(zhì)而形成的免疫偶聯(lián)物或?qū)蛩幬镏饕邢铝袔追N形式(1)抗體-核素偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物可將核素有效地導(dǎo)向腫瘤組織局部，從而減少了因放療外照射引起的正常組織損傷及有關(guān)的不良反應(yīng)，并可對腫瘤進行定位診斷和導(dǎo)向治療。這種方法即為放射免疫顯像和放射免疫治療。與單抗偶聯(lián)的常用核素有125I，131I，111In，90Y，99Tcm，188Re和186Re等。(2)抗體-化療藥物偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物能特異地導(dǎo)向腫瘤，可減低對正常組織的損傷，減少化療藥物的毒副作用。常偶聯(lián)的化療藥物如烷化劑中的磷酸酰胺；抗代謝中的氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶；抗生素類阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素；植物類長春新堿、絲裂霉素等。(3)抗體-毒素偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物又稱免疫毒素。其殺傷細(xì)胞作用強且不依賴于生物輔助機制。其殺傷腫瘤機制與放療，化療不同，所以一般放療、化療效果差的腫瘤可用，應(yīng)用前景廣闊。常用的毒素有篦麻毒素、白喉毒素、紅豆毒素、肥皂草毒素、假單孢菌外毒素、鏈球菌溶血素、穿孔素等。(4)抗體-生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(BRM)偶聯(lián)物。BRM單獨調(diào)節(jié)機體的免疫能力和殺傷腫瘤細(xì)胞已取得較好的療效。但由于其輸入體內(nèi)后僅有部分到達腫瘤靶部位，其殺傷作用得不到充分發(fā)揮且有毒副作用。將BRM與單抗偶聯(lián)，通過單抗攜帶其到達靶部位而發(fā)揮殺傷腫瘤的作用，使這些因子的作用更強，且更加專一。常用的BRM有INF和IL-2等。(5)抗體導(dǎo)向酶解前藥。將抗體與藥物專一性活化酶的偶聯(lián)物注入體內(nèi)，間隔一定時間后注入前藥，使其在腫瘤部位轉(zhuǎn)化成高濃度抗癌活性藥以殺傷腫瘤細(xì)胞。目前，可作為前藥的有苯甲酸氫芥的谷氨酰胺衍生物、磷酸鬼臼乙叉戒、磷酸絲裂霉素、葡糖苷酸柔紅霉素、阿霉素、5-氟胞嘧啶和頭孢菌素氮芥等?；罨赣恤入拿窯2、堿性磷酸酶、青霉素酰胺酶、β-內(nèi)酰胺酶、胞嘧啶脫氨酶、β-葡糖苷酶和氨基肽酶等。(6)免疫脂質(zhì)體。將MAb偶聯(lián)到脂質(zhì)體的表面能充分將MAb與抗原特異性結(jié)合的導(dǎo)向性及脂質(zhì)體能包裹大量藥物的特性融為一體，再包埋上有關(guān)藥物，則可提高藥物靶向性和療效。
序列表<110>陳志南<120>抗人肝癌單克隆抗體HAb18輕、重鏈可變區(qū)基因及其應(yīng)用<160>4<210>1<211>445<212>DNA<213>小鼠<220><221>V_region<222>(14)...(445)<400>1ggggatatcc acc atg aac ttc ggg ctg agc tgg gtt ttc ata gtt att 49ctc tta aaa ggt gtc cag agt gaa gtg aag ctt gag gag tct gga gga 97ggc ttg gtg caa cct gga gga tcc atg aaa ctg tct tgt gtt gcc tct 145gga ttc act ttt agt gac gcc tgg atg gac tgg gtc cgc cag tct cca 193gag aag gga ctt gag tgg gtt gct gaa att aga agc aaa gct aat aat 241cat gca cca tac tat act gag tct gtg aaa ggg agg ttc acc atc tca 289cga gat gat tcc aaa agt att atc tac ctg caa atg aac aac tta aga 337gct gaa gac act ggc att tat tac tgt acc agg gat agc acg gct acc 385cac tgg ggc caa ggg act ctg gtc act gtc tct tca gct agc acg aca 433gcc cca tca gtc 445<210>2<211>421<212>DNA<213>小鼠<220><221>V_region<222>(14)...(408)<400>2ggggatatcc acc atg gac tca cat act cag gtc ttt ata ttt cta ctg 49ctc tgt gtg tct ggt gcc cat ggg agt att gtg atg acc cag act ccc 97aca ttc ctg gtt gta tca gca gga gac agg gtt acc ata acc tgc aag 145gcc agt cag agt gtg att aat gat gta gct tgg tac caa cag aag cca 193ggg cag tct cct aaa ctg ctg ata ttc tat gca tcc aat cgc aac act 241gga gtt cct gat cgc ttc act ggc agt gga tat ggg acg gat ttc act 289ttc acc atc agc act gtg cag gct gaa gac ctg gca gtt tat ttc tgt 337cag cag gat tat agt cct cca ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ctg 385gaa atc aaa cgc aag tcg act gca cca act gta tcc 421<210>3<211>144<212>PRT<213>小鼠<220><221>V_segment<400>3Met Asn Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Ile Val Ile Leu Leu Lys Gly Val1 5 10 15Gln Ser Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly20 25 30Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala35 40 45 50Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala55 60 65Glu Ile Arg Ser Ala Asn Asn His Ala Pro Tyr Tyr Tyr Thr Glu Ser Val70 75 80 85Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile Ile Tyr Leu90 95 100Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Arg105110115Asp Ser Thr Ala Thr His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser120 125 130 135Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser Val140<210>4<211>136<212>PRT<213>小鼠<220><221>V_segment<400>4Met Asp Ser His Thr Gln Val Phe Ile Phe Leu Leu Leu Cys Val Ser Gly1 5 10 15Ala His Gly Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Thr Phe Leu Val Val Ser20 25 30Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ile Asn35 40 45 50Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile55 60 65Phe Tyr Ala Ser Asn Arg Asn Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser70 75 80 85Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala Glu Asp90 95 100Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Pro Pro Phe Thr Phe Gly105110115Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Lys Ser Thr Ala Pro Thr Val Ser120125 13013權(quán)利要求
1.一種抗肝癌單克隆抗體HAb18的重鏈可變區(qū)基因，其具有序列表<400>1的序列。
2.由權(quán)利要求1基因編碼的多肽產(chǎn)物，其具有序列表<400>3的序列。
3.一種抗肝癌單克隆抗體HAb18的輕鏈可變區(qū)基因，其具有序列表<400>2的序列。
4.由權(quán)利要求3基因編碼的多肽產(chǎn)物，其具有序列表<400>4的序列。
5.權(quán)利要求1或3所述的基因在制備用于診斷和治療腫瘤或炎癥藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗人肝癌單克隆抗體HAb18重鏈和輕鏈可變區(qū)基因和由所述基因編碼的多肽,以及所述基因和多肽在制備用于診斷和治療腫瘤或炎癥藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明人應(yīng)用一套設(shè)計的引物成功地從培養(yǎng)的肝癌特異性單抗HAb18雜交瘤細(xì)胞中克隆了抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。所得重鏈和輕鏈可變區(qū)基因可編碼正確的小鼠抗體可變區(qū)?；谏鲜鲆芽寺〉降目谷烁伟﹩慰笻Ab18輕、重鏈可變區(qū)基因,可以采用基因工程方法,構(gòu)建和表達多種小分子基因工程抗體,如單鏈抗體、嵌合抗體、Fab抗體等,以便用于肝癌的診斷和治療目的。
文檔編號C12N1/15GK1381461SQ0211447
公開日2002年11月27日 申請日期2002年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月15日
發(fā)明者陳志南, 邢金良, 張思河 申請人:陳志南