專利名稱：用高通量肽芯片進行雜交瘤細胞篩選的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將高通量肽芯片應(yīng)用于大量蛋白功能和結(jié)構(gòu)的研究中，具體說是一種用高通量肽芯片進行雜交瘤細胞篩選的方法。
背景技術(shù)：
在進行蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)的研究中，常要進行某一蛋白的單克隆抗體的制備。按傳統(tǒng)單克隆抗體的制備方法，首先需要進行免疫小鼠，即用待研究的蛋白或肽段免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生特異抗體細胞。取該小鼠的脾細胞，脾細胞中含有產(chǎn)生特異抗體細胞，將脾細胞與小鼠的骨髓瘤細胞進行體外融合，成為雜交瘤細胞。該雜交瘤細胞兼具有兩種親本細胞的特點，既能分泌抗體，又能大量培養(yǎng)增殖。不過要得單克隆抗體，還需要反復(fù)克隆化，才能得到抗體分泌旺盛的雜交瘤細胞。由于早期雜交瘤細胞不穩(wěn)定，容易丟失染色體變?yōu)榉欠置谛?；強陽性株多次傳代后也可變?yōu)槿蹶栃灾?，即使長期培養(yǎng)的雜交瘤也可出現(xiàn)這種情況。因此需要不斷的克隆化，以保持雜交瘤細胞的穩(wěn)定性。從背景技術(shù)可以看出傳統(tǒng)的制備篩選雜交瘤細胞效率低，一次實驗只能獲得一種單克隆抗體的雜交瘤細胞。如果面對成千上萬種蛋白質(zhì)的話，顯然這種方法效率低，不能滿足實際研究的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對傳統(tǒng)的篩選雜交瘤細胞的方法效率低的問題。將高通量肽芯片應(yīng)用于雜交瘤細胞篩選的過程中，該方法先用多種抗原，甚至是成千上萬種的蛋白質(zhì)分子或合成肽，同時免疫一只小鼠，提取脾細胞后，體外和骨髓瘤細胞進行體外融合，產(chǎn)生多樣性的雜交瘤細胞庫，再用肽芯片從雜交瘤細胞庫中篩選相應(yīng)的雜交瘤細胞株。篩選出來的雜交瘤細胞株，可以進行單克隆抗體的生產(chǎn)。由于篩選的肽芯片上聯(lián)接有待研究的并免疫小鼠的蛋白質(zhì)分子或合成肽分子。因此，可以選到與待研究蛋白質(zhì)分子或合成肽分子相對應(yīng)的單克隆雜交瘤細胞。該技術(shù)的基本原理B細胞在產(chǎn)生分泌型抗體的同時，在其細胞膜表面也表達大量的IgM抗體，兩類抗體具有相同的抗原結(jié)合性。當骨髓瘤細胞與B細胞融合后，融合的雜交瘤細胞繼承了B細胞表面的IgM抗體，這樣，肽芯片上的特異抗原和雜交瘤細胞上的IgM抗體結(jié)合，將雜交瘤細胞滯留在肽芯片上的相應(yīng)位置上。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為1、用高通量肽芯片進行雜交瘤細胞篩選的方法，其特殊之處在于所述的篩選方法包括以下工藝步驟1)、制備含有蛋白分子或肽分子固定點的肽芯片；2)、用混合抗原免疫動物，使動物產(chǎn)生對多種抗原的抗體B細胞，建立雜交瘤細胞庫；免疫動物可采用小鼠或兔子等小動物。
3)、用肽芯片在雜交瘤細胞庫進行抗原的篩選。2、上述的制備含有肽芯片包括以下工藝步驟1)、肽芯片的結(jié)構(gòu)設(shè)計；2)、芯片材料的預(yù)處理；3)、蛋白分子或肽段的修飾；4)、蛋白分子或肽分子的定點固定。3、上述的建立雜交瘤細胞庫包括以下工藝步驟1)、混合抗原免疫小鼠；2)、免疫脾細胞的制備；
3)、脾細胞與骨髓細胞融合；4)、融合細胞的早期培養(yǎng)。4、上述的用肽芯片在雜交瘤細胞庫進行抗原的篩選包括以下工藝步驟1)、將培養(yǎng)的雜交瘤細胞懸液轉(zhuǎn)入10ml離心管中，1500r/min離心5分鐘，輕輕吸取上清液。
2)、加入5ml HT培養(yǎng)液，并輕輕將雜交瘤細胞重新懸浮，再將懸液1500r/min離心5分鐘，輕輕吸去上清液。
3)、重復(fù)第2)步兩次。
4)、將雜交瘤細胞懸浮于5ml HT培養(yǎng)液中。
5)、5ml雜交瘤細胞加入肽芯片中，并于37℃，30r/min的速度運轉(zhuǎn)30min，使雜交瘤細胞與肽芯片上的特異分子結(jié)合，從而被固定在特異的位置上。
本發(fā)明對照現(xiàn)有技術(shù)，其有益效果為本發(fā)明將高通量肽芯片應(yīng)用于雜交瘤細胞篩選的過程中，該方法用多種抗原同時免疫一只小動物，建立雜交瘤細胞庫；再用高通量肽芯片進行篩選，因而一次實驗就能篩選出多種雜交瘤細胞株，大大簡化了傳統(tǒng)的單克隆細胞技術(shù)，提高了研究開發(fā)的效率。


圖1為本發(fā)明的工藝流程示意圖；圖2為本發(fā)明的用于雜交瘤細胞篩選的肽芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；具體實施方式
參見圖1，圖2，若現(xiàn)有A，B，C，D…等10種抗原或肽分子，將這10種抗原或肽分子分別固定在芯片上，制備成肽芯片備篩選之用；另外將這10種分子混合后，免疫小鼠，通過細胞融合技術(shù)，最終得到雜交瘤細胞。之后將雜交瘤細胞懸液與肽芯片進行接觸，瘤細胞懸液中含有對上述10種抗原特異的雜交瘤細胞，那么那些能在細胞膜上表達抗A分子的單克隆細胞就和芯片上的A點結(jié)合，從而被固定在A點處，同樣，細胞膜上表達抗B、抗C或抗D等抗體分子的雜交瘤細胞將分別被固定在芯片的B點、C點或D點上。最后小心用PBS洗芯片3次，將雜質(zhì)和未被固定的細胞洗掉，用細胞吸取針吸取各點上的細胞，進一步進行培養(yǎng)鑒定。其具體操作步驟如下(一)、制備含有蛋白分子或肽分子固定點的肽芯片；肽芯片制備包括肽芯片的結(jié)構(gòu)設(shè)計，芯片材料的預(yù)處理，蛋白分子或肽段的修飾，蛋白分子或肽分子的定點固定。
1、肽芯片的結(jié)構(gòu)設(shè)計參見圖2，在玻璃方盒1的底部上開設(shè)芯片的點樣區(qū)3，底部是檢測分子固定區(qū)，四周是玻璃壁，主要功能是為了儲留樣品液，它呈方形槽，長度、寬度、高度為10mm、10mm、5mm，最多可容納450μL樣品。盒子配有蓋子2。具體尺寸也可由具體要求而定。
2、芯片材料的處理在超凈工作罩中，用無水乙醇蕩洗芯片載體-芯片玻璃方盒(方盒底部作為芯片載體，方盒大小為10mm×10mm×5mm)蕩洗3次，倒去無水乙醇，在超純凈工作罩中干燥10min，將芯片載體用常規(guī)的APS和PDC處理。APS3-胺丙基三甲氧基硅烷(3-aminopropyltrimethoxysilane；APS)，PDS1.4-苯二異硫氰酸鹽(1.4-phenylenediisothiocyanate；PDS)，芯片玻璃盒用APS-PDS處理的方法1)將400μL0.5％APS丙酮溶液加入芯片玻璃盒中，蓋上芯片盒蓋，將盒上下顛倒蕩洗10次，室溫下放置5min。
2)將芯片盒中的有機溶劑倒入廢液缸中，芯片玻璃盒敞開蓋放于1000C烘烤30min。
3)將400μL0.01％PDS加入芯片盒中，蓋上蓋子，上下顛倒10次，室溫下浸泡40分鐘。
4)倒去盒中液體，用丙醇浸泡5min。
5)50℃烘箱內(nèi)放置備用。
3、抗原(肽段)的修飾與固定將抗原肽用吡咯基團修飾(標記方法按常規(guī))。將處理好的芯片放置超凈工作臺中，用手動芯片點樣儀沾取修飾并純化好的抗原肽2μl，點于芯片玻璃盒的底部，0.2mm直徑的點，間距為1mm共點8×8＝64點。點樣時在底部標記的點樣位置點樣，以便在后續(xù)取細胞時能準確定位。點好的芯片玻璃盒用PBS PH7.0蕩洗3次，拋凈盒內(nèi)液體，于370C干燥箱內(nèi)干燥1h，封裝備用。
本發(fā)明的肽芯片是以篩選為目的，而且篩選的不是簡單的分子，而是細胞，因此為了滿足此目的，芯片上的每一個點上必須有足夠的、可以和目的細胞結(jié)合的肽分子，才能固定特異細胞，為此，在制備該芯片時，芯片上的點樣量要比一般的肽芯片的點樣量大。另外，由于目的的要求，該芯片的外形結(jié)構(gòu)也與一般的芯片有很大的差異，外形結(jié)構(gòu)可為方行盒子并配有盒蓋，適應(yīng)樣品與芯片長時間的接觸。
(二)、用混合抗原免疫小動物，使動物產(chǎn)生對多種抗原的抗體B細胞，建立雜交瘤細胞庫；免疫動物可采用小鼠或兔子等小動物。
混合抗原制備雜交瘤細胞庫的基本方法與傳統(tǒng)方法相同，不同的是本發(fā)明是使用混合抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生對多種抗原的抗體B細胞。具體的操作
1、混合抗原免疫小鼠1)取0.1ml抗原溶液(抗原濃度100μg/0.1ml鹽水)與0.1完全福氏佐劑攪拌成乳漿。
2)注射小鼠腹腔。
3)12天后免疫小鼠剪尾端放血，測定血清抗體活性。
4)從尾靜脈注入100μg抗原加強免疫5)四天后殺死免疫小鼠取出脾臟，制備脾細胞懸液。即可與胃髓瘤細胞融合。
2、免疫脾細胞的制備1)以頸椎脫臼法殺死小鼠并浸入70％酒精中，浸泡后取出置解剖臺上，擦干腹部殘余的酒精，以無菌剪刀剪開腹部取出脾臟，置于無菌的含少量培養(yǎng)液的平皿中。
2)撥離脾臟包膜，使脾細胞全部洗入培養(yǎng)液中。
3)吸出脾細胞懸液傾于一支試管中，靜置片刻，吸取細胞懸液于1500r/min離心7分鐘。
4)去除上清液，加無小牛血清培養(yǎng)液面再次洗滌細胞，1500r/min離心7min，去除上清，加少量培養(yǎng)液，計數(shù)脾細胞(控制在1×108細胞/ml左右)。
3、脾細胞與骨髓細胞融合1)融合前一天將PEG放于CO2培養(yǎng)箱中調(diào)整PH值2)將PEG和培養(yǎng)液置37℃水溶箱中溫熱3)將骨髓瘤細胞和免疫脾細胞以1∶3的比例用小玻棒輕輕地混合于無血清培養(yǎng)液中。1500r/min離心10分鐘。4)去除所有的上清液，保持細胞團完整。5)將試管放在恒溫干浴中保持37℃，用1ml吸管慢慢地將37℃預(yù)溫的50％PEG(分子量1500)溶液0.8ml加至密集的細胞團中。用吸管尖端慢慢攪動使PEG與細胞混合，但不要吹吸。6)試管保持在干浴中，用吸管尖端緩緩攪動1min7)在1min內(nèi)加完1ml預(yù)溫的培養(yǎng)液，試管仍放在干浴中以保持溫度8)在1min內(nèi)再加完1ml37℃的培養(yǎng)液9)于2min內(nèi)加完10ml37℃預(yù)溫的培養(yǎng)液10)1500r/min離心10min11)去除上清液，重新將細胞懸浮于培養(yǎng)液中，使最后濃度1×106細胞/0.12ml(相當于5ml吸管的2滴)。12)用無菌的5ml吸管，將細胞懸液加于已在前一天接種了飼養(yǎng)細胞(含1×104飼養(yǎng)細胞/0.1ml)的培養(yǎng)瓶中。
4、融合細胞的早期培養(yǎng)1)從融合那天起為零天，將融合后的細胞培養(yǎng)于含有飼養(yǎng)細胞的RPMH-1640培養(yǎng)液中。2)次日即第一天，培養(yǎng)瓶中加5ml HAT培養(yǎng)液。3)第4天吸出上清1/2，加入1/2HAT培養(yǎng)液。4)第7天吸出上清1/2HAT培養(yǎng)液。5)第8天以后有規(guī)律地每隔3~5天，同上清吸去1/2HAT培養(yǎng)液換入HT培養(yǎng)液。6)第10-20天后，在顯微鏡下觀察、應(yīng)出現(xiàn)細胞克隆。(三)、用肽芯片在雜交瘤細胞庫進行特異雜交瘤細胞篩選。
1)將培養(yǎng)的雜交瘤細胞懸液轉(zhuǎn)入10ml離心管中，1500r/min離心5分鐘，輕輕吸取上清液。
2)加入5ml HT培養(yǎng)液，并輕輕將雜交瘤細胞重新懸浮。再將懸液1500r/min離心5分鐘，輕輕吸去上清液。
3)重復(fù)2)步兩次。
4)將雜交瘤細胞懸浮于5ml HT培養(yǎng)液中。
5)5ml雜交瘤細胞加入肽芯片中。于37℃，30r/min的速度運轉(zhuǎn)30min。使雜交瘤細胞與肽芯片上的特異分子結(jié)合，從而被固定在特異的位置上，用臺盼藍染色，用例置顯微鏡觀察，并用吸取針吸取被固定的雜交瘤細胞，供擴大培養(yǎng)和小鼠腹腔接種。
6)同時將第1)步吸出的雜交瘤細胞培養(yǎng)上清加入于另一肽芯片上，于37℃ 30r/min，培養(yǎng)30min，使上清中的分泌型抗體與肽芯片上的特異肽分子結(jié)合，然后去除液體并用PBS洗滌芯片3次，然后加入膠體金標記的A蛋白3ml(濃度適量)，37℃反應(yīng)30min，用PBS洗滌芯片3次，每次5ml，每次30s。用芯片閱讀儀判讀芯片，將結(jié)果與固定的雜交瘤細胞的位置進行比較。以便進一步確定單克隆雜交瘤的存在。
該方法應(yīng)注意由于芯片制備過程中的污染，會造成單克隆細胞的中毒而培養(yǎng)不出來；另外由于在篩選過程中有些剛?cè)诤系募毎淠ど媳磉_的抗體分子量少，因此會由于在芯片特定的抗原點上固定不牢固，容易被沖洗掉，因而應(yīng)注意。
權(quán)利要求
1.一種用高通量肽芯片進行雜交瘤細胞篩選的方法，其特征在于所述的篩選方法包括以下工藝步驟(1)、制備含有蛋白分子或肽分子固定點的肽芯片；(2)、用混合抗原免疫小動物，使小動物產(chǎn)生對多種抗原的抗體B細胞，建立雜交瘤細胞庫，免疫動物可采用小鼠或兔子等；(3)、用肽芯片在雜交瘤細胞庫進行抗原的篩選。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用高通量肽芯片進行雜交瘤細胞篩選的方法，其特征在于制備含有肽芯片包括以下工藝步驟(1)、肽芯片的結(jié)構(gòu)設(shè)計；(2)、芯片材料的預(yù)處理；(3)、蛋白分子或肽段的修飾；(4)、蛋白分子或肽分子的定點固定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用高通量肽芯片進行雜交瘤細胞篩選的方法，其特征在于建立雜交瘤細胞庫包括以下工藝步驟(1)、混合抗原免疫小鼠；(2)、免疫脾細胞的制備；(3)、脾細胞與骨髓細胞融合；(4)、融合細胞的早期培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用高通量肽芯片進行雜交瘤細胞篩選的方法，其特征在于用肽芯片在雜交瘤細胞庫進行抗原的篩選包括以下工藝步驟(1)、將培養(yǎng)的雜交瘤細胞懸液轉(zhuǎn)入10ml離心管中，1500r/min離心5分鐘，輕輕吸取上清液。(2)、加入5ml HT培養(yǎng)液，并輕輕將雜交瘤細胞重新懸浮，再將懸液1500r/min離心5分鐘，輕輕吸去上清液。(3)、重復(fù)第(2)步兩次。(4)、將雜交瘤細胞懸浮于5ml HT培養(yǎng)液中。(5)、5ml雜交瘤細胞加入肽芯片中，并于37℃，30r/min的速度運轉(zhuǎn)30min，使雜交瘤細胞與肽芯片上的特異分子結(jié)合，從而被固定在特異的位置上。
全文摘要
本發(fā)明涉及將高通量肽芯片應(yīng)用于大量蛋白功能和結(jié)構(gòu)的研究中，具體說是一種用高通量肽芯片進行雜交瘤細胞篩選的方法。在進行蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)的研究中，常要進行某一蛋白的單克隆抗體的制備，傳統(tǒng)的制備篩選雜交瘤細胞方法，一次實驗只能獲得一種單克隆抗體的雜交瘤細胞。如果面對成千上萬種蛋白質(zhì)，這種方法效率太低，不能滿足實際研究的要求。本發(fā)明將高通量肽芯片應(yīng)用于雜交瘤細胞篩選的過程中，該方法先用多種抗原，甚至是成千上萬種的蛋白質(zhì)分子或合成肽，同時免疫小動物，建立雜交瘤細胞庫，再用肽芯片從雜交瘤細胞庫中篩選相應(yīng)的雜交瘤細胞株。因此，一次能篩選出多種雜交瘤細胞，大大地提高了工作效率。
文檔編號C12Q1/02GK1446923SQ0211447
公開日2003年10月8日 申請日期2002年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月22日
發(fā)明者閻小君, 郭晏海 申請人:閻小君, 郭晏海