專利名稱：重組人脂肪酸氧化蛋白及其生產(chǎn)方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組人脂肪酸氧化蛋白及其生產(chǎn)方法和用途，是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)方法克隆人游離脂肪酸氧化脂蛋白及其C-端球狀結(jié)構(gòu)域的cDNA序列，通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組人游離脂肪酸氧化蛋白及其C-端球結(jié)構(gòu)域的方法。該重組蛋白及其球狀結(jié)構(gòu)域在肥胖和糖代謝紊亂疾病中具有明確的應(yīng)用價(jià)值。
目前，已知肥胖與糖尿病、心血管疾病、某些腫瘤以及睡眠-呼吸率亂等疾病有明顯的相關(guān)關(guān)系，肥胖病已經(jīng)取代了由營(yíng)養(yǎng)不良和感染所引起的疾病，一躍成為危害人類健康的主要?dú)⑹??？梢姡逝忠呀?jīng)不僅僅是個(gè)影響人體形象的問題，而是成為一種流行病，威脅著全人類的健康。
近幾十年來，歐美學(xué)者致力于肥胖治療藥物的研究和發(fā)展，減肥藥物按其作用機(jī)制大體分為三大發(fā)展方向(1)抑制食欲；(2)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收或代謝；(3)增加能量消耗。目前已有兩大類化學(xué)藥品被美國(guó)食品、藥品管理局(FDA)或國(guó)家藥品監(jiān)督管理局(SDA)批準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng)，它們的代表分別是曲美(學(xué)名西布曲明，sibutramine)、賽尼可(學(xué)名奧利可他，orlistat)。前者主要是作用于中樞神經(jīng)，通過抑制去甲腎上腺素、5-羥色胺的攝取而增加飽食感，屬于中樞類減肥藥。后者是一種長(zhǎng)效的腸道脂肪酶抑制劑，失活的酶不能將食物中的脂肪(主要是甘油三酯)水解為可吸收的游離脂肪酸，從而減少熱量攝入，控制體重。這二類藥物都存在明顯的毒副作用，同時(shí)禁忌癥范圍廣泛。
隨著分子生物學(xué)、分子內(nèi)分泌學(xué)的發(fā)展，有關(guān)肥胖發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制也逐漸被人們認(rèn)識(shí)，這也為肥胖的治療和預(yù)防提供了新的方向和希望。近幾年，一系列研究表明脂肪細(xì)胞不僅是甘油三酯的貯藏地，而且也是具有生物學(xué)活性的細(xì)胞群體，它們合成和釋放一些具有重要功能的多肽分子，通過自分泌、旁分泌、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)脂肪代能量平衡，而肥胖正是由這些特定多肽因子缺乏或過多引起的進(jìn)食調(diào)控和能量代謝紊亂的疾病。
經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)小鼠的一種脂肪細(xì)胞補(bǔ)體相關(guān)蛋白(Adipocyte Complement-Related protein of 30Kda，ACRP30)及其蛋白水解產(chǎn)物可促進(jìn)小鼠血液中的游離脂肪酸高效氧化，阻止脂肪酸進(jìn)入脂肪細(xì)胞，使肥胖小鼠的體重減輕。為此，我們從人脂肪組織cDNA文庫中篩選到一種參與脂肪酸氧化的蛋白質(zhì)的cDNA，Nothern雜交分析表明該基因在脂肪組織上有高豐度表達(dá)，而在其他組織上不表達(dá)或低分度表達(dá)，更為重要的是，部分研究數(shù)據(jù)表明肥胖患者的體內(nèi)缺乏該基因編碼的蛋白質(zhì)。核苷酸及其相應(yīng)的氨基酸序列分析表明，該蛋白質(zhì)由244個(gè)氨基酸組成，由N-端的膠原結(jié)構(gòu)域和發(fā)揮生物學(xué)活性的C-端的球狀結(jié)構(gòu)域組成，與小鼠的ACRP30高度同源，由于其生理學(xué)的主要作用是促進(jìn)游離脂肪酸氧化，因此稱為人游離脂肪酸氧化蛋白。同曲美、賽尼可作用機(jī)理顯著不同的是，人游離脂肪酸氧化蛋白及其C-端球狀結(jié)構(gòu)域是通過氧化燃燒血液中游離脂肪酸而達(dá)到減輕體重目的，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脂肪酶無抑制作用，因此該制品的作用明確，毒副作用小。
解決本發(fā)明技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是該重組人脂肪酸氧化蛋白，由244個(gè)氨基酸組成，由N-端的膠原結(jié)構(gòu)域和發(fā)揮生物學(xué)活性的C-端的球狀結(jié)構(gòu)域組成，與小鼠的ACRP30高度同源，含有如附

圖1所示編碼的人脂肪氧化蛋白的核苷酸序列。重組人脂肪酸氧化蛋白的C-端球狀結(jié)構(gòu)域含有如附圖2所示的cDNA序列。所述的核苷酸序列，包括該核苷酸序列的互補(bǔ)鏈。本發(fā)明利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，從人脂肪組織cDNA文庫中篩選到大片段長(zhǎng)735bp，編碼全長(zhǎng)人脂肪酸氧化蛋白的cDNA序列，在此基礎(chǔ)上獲得小片段長(zhǎng)438bp，編碼其C-端球狀結(jié)構(gòu)域的cDNA序列，并利用真核和原核表達(dá)系統(tǒng)研究了其產(chǎn)物的理化性質(zhì)和生物學(xué)活性。本發(fā)明以人脂肪組織cDNA文庫為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Retro-polymerase chainreaction，RT-PCR)技術(shù)獲得全長(zhǎng)735bp的人脂肪酸氧化蛋白的編碼序列(見附圖1)，在以該編碼的DNA序列為模板通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)獲得人脂肪酸氧化蛋白的C-端球狀結(jié)構(gòu)域的編碼序列(見附圖2)，推導(dǎo)出相應(yīng)的氨基酸序列見附圖3、附圖4，即所述的核苷酸序列能編碼具有附圖3所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其分子量為30KD，所述的核苷酸序列能編碼如附圖4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其分子量為16KD。將這兩段DNA序列分別克隆到原核和真核表達(dá)載體上，通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入原核和真核細(xì)胞中構(gòu)成工程細(xì)胞，工程細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)及誘導(dǎo)產(chǎn)生表達(dá)產(chǎn)物。表達(dá)產(chǎn)物通過離心、超濾及柱層析獲得具有生物學(xué)活性的重組人游離脂肪酸氧化蛋白及其球狀結(jié)構(gòu)域的制品。體外、體內(nèi)的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明重組人脂肪酸氧化蛋白及其球狀結(jié)構(gòu)域能加速游離脂肪酸的氧化，降低血糖，參與糖和脂類代謝平衡的調(diào)節(jié)，因而可應(yīng)用于肥胖、糖代謝紊亂等疾病的預(yù)防和治療。
本發(fā)明一種生產(chǎn)重組人脂肪酸氧化蛋白及其C-端球狀結(jié)構(gòu)域的方法，包括基因克隆、重組蛋白質(zhì)的表達(dá)和分離純化。表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性測(cè)定，重組蛋白質(zhì)的表達(dá)和分離純化包括工程細(xì)胞的發(fā)酵、發(fā)酵產(chǎn)物的超濾、濃縮、沉淀、蛋白質(zhì)柱層析純化，其特征在于將以上所述的如附圖1所示編碼的人脂肪酸氧化蛋白的DNA序列和C-端球狀結(jié)構(gòu)域含有如附圖2所示的cDNA序列插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體后，導(dǎo)入原核和真核細(xì)胞，構(gòu)成工程細(xì)胞，在合適的條件下培養(yǎng)工程細(xì)胞，并將細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過分離。純化得到重組人脂肪酸氧化蛋白及其C-端球狀結(jié)構(gòu)域。合適的載體為原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體，可在細(xì)菌、細(xì)胞及(轉(zhuǎn)基因)動(dòng)植物個(gè)體器官或組織中表達(dá)。原核細(xì)胞可為大腸桿菌，其表達(dá)產(chǎn)物通過離心得到不溶性的包涵體沉淀，該包涵體沉淀需復(fù)性才能具有生物學(xué)活性。
總之，本發(fā)明不僅公開了一種人脂肪酸及其C-端球狀結(jié)構(gòu)域的核甘酸及相應(yīng)氨基酸的序列，并提供了生產(chǎn)方法，包括工程細(xì)胞的建立及誘導(dǎo)表達(dá)方法，蛋白質(zhì)的分離和純化等一系列適合生產(chǎn)的工藝路線。通過該方法獲得的重組人脂肪酸氧化蛋白質(zhì)及其C-端結(jié)構(gòu)域純品，純度可達(dá)95％以上，其N-端氨基酸序列(如附圖5，附圖6)同依據(jù)核甘酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列一致。該制品在體內(nèi)、體外能促進(jìn)游離脂肪酸加速氧化，降低血糖，調(diào)節(jié)機(jī)體糖和脂類代謝平衡，因而提示該重組分子能應(yīng)用于臨床上治療肥胖、糖代謝紊亂等病癥。
以下結(jié)合實(shí)施例附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
圖1全長(zhǎng)人脂肪酸氧化蛋白的cDNA序列圖2人脂肪酸氧化蛋白C-端結(jié)構(gòu)域的cDNA序列圖3人脂肪酸氧化蛋白的氨基酸序列圖4人脂肪酸氧化蛋白C-端結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列圖5重組人脂肪酸氧化蛋白N-末端序列圖6重組人脂肪酸氧化蛋白C-端結(jié)構(gòu)域的N-末序列圖7重組人脂肪酸氧化蛋白及其C-端結(jié)構(gòu)域的原核細(xì)胞生產(chǎn)工藝圖8重組人脂肪酸氧化蛋白及其C-端結(jié)構(gòu)域的真核細(xì)胞生產(chǎn)工藝
1.全長(zhǎng)人脂肪酸氧化蛋白是通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法從人脂肪組織cDNA文庫中獲得，其上、下游引物分別為5′ATG CTG TTG CTG GGA GCT GTT CTA5′TCA GTT GGT TGT CAT GGT AGA GAA2.cDNA的第一條鏈的合成取人脂肪組織cDNA文庫0.5μg，加入下游引物，于65℃保溫10分鐘，迅速加入Boehringer第一鏈cDNA合成體系中混勻，室溫放置10分鐘后于42℃保溫10分鐘，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，完畢后于96℃10分鐘滅活。
3.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)取上述反應(yīng)產(chǎn)物2μl為模板，加入上游引物后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件為96℃1分鐘、58℃1分鐘和72℃1分鐘30秒，共計(jì)30個(gè)循環(huán)得到735bp人全長(zhǎng)脂肪酸氧化蛋白基因片段(基因片段的核苷酸序列見附圖1)。
4.以全長(zhǎng)脂肪酸氧化蛋白的基因片段為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，獲得其球狀結(jié)構(gòu)域的基因片段，其上、下游引物分別為上游引物5′ATG AAA GGA GAA CCT GGA GAA GGT下游引物5′TGA GTT GGT TGT CAT GGT AGA GAA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)條件94℃1分鐘、56℃1分鐘、72℃1分鐘，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物克隆于T載體后進(jìn)行全自動(dòng)序列測(cè)定，其測(cè)定的核苷酸序列見附圖2。
二、重組人脂肪酸氧化蛋白及其球狀結(jié)構(gòu)功能域的原核表達(dá)及生產(chǎn)1.原核表達(dá)載體的構(gòu)建以已獲得的全長(zhǎng)人脂肪氧化蛋白為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法獲得不含信號(hào)肽序列的人脂肪酸氧化蛋白的基因片段，其上、下游引物分別是上游引物5′ATG GTC CTT TGG TGC TGA GTT CCC GG下游引物5′TGA GTT GGT TGT CAT GGT AGA GAA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件為94℃1分鐘、58℃130秒、72℃1分鐘30秒，將產(chǎn)物克隆于T載體上進(jìn)行全序列測(cè)定。
2.將該基因片段和已獲得的人脂肪酸氧化蛋白的C-端結(jié)構(gòu)域分別克隆于二類原核表達(dá)載體上經(jīng)熱誘導(dǎo)的pBV220系統(tǒng)和經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET表達(dá)載體上，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH52和BL21，并篩選取獲得穩(wěn)定的高表達(dá)的工程細(xì)胞。
3、從4℃保存的工程菌平皿中挑取單菌落接種于5ml LB培養(yǎng)液式管中(含氨芐青霉素100μg/ml)，30℃、250轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)12小時(shí)后，按5％比例接種于搖瓶中(含氨芐青霉素100μg/ml)30℃、200轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)12小時(shí)后可作為種子液。
4、表達(dá)(熱誘導(dǎo))以1％濃度將種子液接種于25升LB改良培養(yǎng)液中(含氨芐青霉素100μg/ml，pH7.2)，30℃、300轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)3-5小時(shí)。待其菌密度達(dá)到OD600＝0.3-0.4時(shí)，迅速升高溫度至42℃誘導(dǎo)表達(dá)5小時(shí)。離心收集細(xì)菌、電泳鑒定目的蛋白表達(dá)含量。
5、表達(dá)(IPTG誘導(dǎo))以1％濃度將種子液接種于25升LB改良培養(yǎng)液中(含氨芐青霉素100μg/ml，pH7.2)，37℃、300轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)3-5小時(shí)。待其菌密度達(dá)到OD600＝0.3-0.4時(shí)，迅速加入IPTG至終濃度0.4-0.6mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)。離心收集細(xì)菌、電泳鑒定目的蛋白表達(dá)含量。
6、細(xì)菌細(xì)胞裂解4℃7,000g離心30分鐘，棄去上清。稱量細(xì)菌濕重量，按10g菌體/100ml的濃度加裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA，1mg/ml溶菌酶)，25℃作用30分鐘。然后冰浴超聲30-45秒，間歇2分鐘，共超聲三次。超聲完畢，4℃7,000g離心30分鐘，棄去上清，收集包涵體沉淀。以20mmol/L Tris-HCl 1mmol/LEDTA pH8.0洗滌一次。
7.包涵體洗滌和純化(1)以0.1％Triton X-100(20mmol/L Tris-HCl 1mmol/LEDTA pH8.0配制)重懸沉淀(20g/100ml)，室溫?cái)嚢?0分鐘。15,000g離心20分鐘，棄去上清。沉淀用20mmol/LTris-HCl 1mmol/L EDTA pH8.0洗滌一次。(2)以2.5mol/L尿素(20mmol/L Tris-HCl 1mmol/L EDTApH8.0配制)重懸步驟(1)沉淀(20g/100ml)，室溫?cái)嚢?0分鐘，15,000g離心30分鐘，棄上清。沉淀用20mmol/LTris-HCl 1mmol/L EDTA pH8.0洗滌一次，稱重。
8、包涵體裂解采用6-8mol/L尿素溶解液或6-7mol/L鹽酸胍溶解液溶解已純化的包涵體。上述溶解液由0.5-1％巰基乙醇、20mmol/LTris-HCl 1mmol/L EDTA pH6-9配制。將已純化的包涵體重懸(20-30g/100ml)，室溫?cái)嚢?0分鐘至12小時(shí)，18,000g離心30分鐘，留上清。
9、包涵體沉淀的復(fù)性可通過下列兩種方法之一完成(1)稀釋復(fù)性方法其復(fù)性液組分為0.1～1000mmol/L尿素、0.1～0.5mmol/L氧化型谷胱甘肽、1～5mmol/L還原型谷胱甘肽、10～100mmol/L的Tris-HCl緩沖液、pH3～10；將變性溶解的包涵體蛋白液逐加入復(fù)性溶液中；復(fù)性濃度應(yīng)控制在0.1-0.6mg/ml；充分復(fù)性后，經(jīng)Millipore公司的M-12超濾濃縮(分子量截留5000)，再經(jīng)10～100mmol/L的Tris-HCl緩沖液、1～10mmol/LEDTA pH6～9緩沖液充分透析。
(2)分子篩層析復(fù)性其復(fù)性液組分為0.1～1000mmol/L鹽酸胍、0.1～0.5mmol/L氧化型谷胱甘肽、1～5mmol/L還原型谷胱甘肽、10～100mmol/L的Tris-HCl緩沖液、pH3～10。Sephacryl S-300快速柱(802.6cm)。經(jīng)6-8mol/L尿素溶解液或6-7mol/L鹽酸胍溶解液變性的包涵體樣品直接上樣于經(jīng)2-4mol/L尿素(20mM Tris-HCl 2mM EDTA pH6-9)平衡后的Sephacryl S-300柱。280nm檢測(cè)洗脫蛋白峰，SDS-PAGE鑒定各峰蛋白分布情況，重組人脂肪酸氧化蛋白及其球狀結(jié)構(gòu)域在主峰。
10.復(fù)性蛋白的柱層析純化(1)強(qiáng)陽離子交換層析結(jié)合分子篩層析法選用瑞典Pharmacia公司的SP-Sepharose Fast Flow，用pH3～6 50mmol/L乙酸鈉緩沖液平衡SP-FF柱(2.6×20cm)。包涵體復(fù)性液在乙酸鈉緩沖液中充分透析后上樣。用乙酸鈉緩沖液洗脫未結(jié)合蛋白，用0～2mol/L NaCl梯度洗脫，280nm檢測(cè)洗脫蛋白峰，SDS-PAGE鑒定各峰蛋白分布情況，重組人脂肪酸氧化蛋白及其球狀結(jié)構(gòu)域在第2峰。將以上述第2峰樣品上樣于50mmol/L Tris-HCl pH8.0平衡的Sephacryl S-100快速柱脫鹽，280nm檢測(cè)洗脫蛋白峰，SDS-PAGE鑒定各峰蛋白分布情況。重組人脂肪酸氧化蛋白及其球狀結(jié)構(gòu)域在主峰中。
(2)陰離子交換層析結(jié)合分子篩層析法選用瑞典Pharmacia公司的DEAE-Sepharose FF陰離子交換柱。柱先用50mmol/L Tris-HCl pH6～9流洗平衡。包涵體復(fù)性液直接上樣，上樣濃度1mg/ml，用50mmol/LTris-HCl pH6～9緩沖液洗脫未結(jié)合相。用0～1mol/L NaCl梯度洗脫，280nm檢測(cè)洗脫蛋白峰，SDS-PAGE鑒定各峰蛋白分布情況，重組人脂肪酸氧化蛋白及其球狀結(jié)構(gòu)域在主峰。將以上主峰樣品上于已平衡的Sephacryl S-100快速柱，280nm檢測(cè)洗脫蛋白峰，SDS-PAGE鑒定各峰蛋白分布情況。重組人脂肪酸氧化蛋白及其球狀結(jié)構(gòu)域在主峰。
三、重組人脂肪酸的氧化蛋白及其結(jié)構(gòu)功能域的真核表達(dá)及生產(chǎn)1.真核表達(dá)載體的構(gòu)建和工程細(xì)胞的建立將已獲得的全長(zhǎng)人脂肪酸氧化蛋白的基因片段克隆于真核表達(dá)載體pSVL上，經(jīng)脂質(zhì)體法導(dǎo)入真核細(xì)胞CHO-K細(xì)胞上，并經(jīng)氨甲蝶呤加壓篩選獲得高表達(dá)的工程細(xì)胞。
2.工程細(xì)胞的培養(yǎng)和表達(dá)產(chǎn)物的收集工程細(xì)胞經(jīng)多孔微載體無血清灌注培養(yǎng)，連續(xù)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，并對(duì)上清進(jìn)行生物學(xué)活性測(cè)定。
3.表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化將細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行膜澄清，上清通過5000-1萬分子量的膜進(jìn)行超濾濃縮，濃縮產(chǎn)物加入飽和硫酸胺溶液，最終硫酸胺濃度達(dá)到26～38％，離心去除沉淀的雜蛋白，收集離心上清，隨后采用下列柱層析進(jìn)行進(jìn)一步分離(a)疏水層析Phenyl Sepharose 6 Fast Flow，洗脫條件為100％-0％硫酸胺梯度，目標(biāo)蛋白在峰2中；(b)將峰2收集的目標(biāo)蛋白進(jìn)行離子交換層析QSepharose Fast Flow，洗脫條件為0-1M NaCl梯度洗脫，目標(biāo)蛋白在主峰上；(c)將收集的目標(biāo)蛋白進(jìn)行脫鹽，柱層析介質(zhì)為GH-25四、重組人脂肪酸氧化蛋白及其球狀結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性測(cè)定1.體內(nèi)活性測(cè)定將10周齡C57BL/6J小鼠18只，采用高脂肪、高糖的飼料連續(xù)喂養(yǎng)30天，然后隨機(jī)合成分成三組，每組6只，并記錄體重。A組注射生理鹽水；B組注射10微克/天的全長(zhǎng)人脂肪酸氧化蛋白；C組注射10微克/天的全長(zhǎng)人脂肪酸氧化蛋白的球狀結(jié)構(gòu)域。同時(shí)小鼠持續(xù)進(jìn)行高脂肪、高糖的飼養(yǎng)喂養(yǎng)10天，每天測(cè)定小鼠血液中的游離脂肪酸、葡萄糖和三油酸脂(Triglyceride，TG)。結(jié)果表明A組體重?zé)o明顯變化，B組體重減輕2.8％(P＝0.025)；C組體重減輕11％(P＝0.001)。同時(shí)B組、C組小鼠血液中的游離脂肪酸、葡萄糖和TG水平顯著降低(P＝0.01)。2.體外活性測(cè)定培養(yǎng)的C2C12骨骼肌細(xì)胞在DMEM25％胎牛血液培養(yǎng)七天，實(shí)驗(yàn)前1小時(shí)移取培養(yǎng)基，加入1ml的下列混合液(3mM葡萄糖、0.25mMHepes、0.25mMoleate 1％FFA-Free BSA，并加入[14C]標(biāo)記的oleicaeid，細(xì)胞在分別加入5ug/ml全長(zhǎng)人脂肪酸氧化蛋白和其結(jié)構(gòu)域孵育90分鐘，分析14CO2。結(jié)果表明人脂肪酸氧化蛋白結(jié)構(gòu)域顯著增加油酸的氧化(p＝0.001)，人脂肪酸氧化蛋白能增加油酸的氧化(p＝0.05)。
序列表<110>湖南盈程生命科學(xué)研究所有限公司<120>重組人脂肪酸氧化蛋白及其生產(chǎn)方法和用途<160>6<210>1<211>735<212>DNA<213>人類(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(1)...(735)<400>1atgctgttgc tgggagctgt tctactgcta ttagctctgc ccggtcatga ccaggaaacc 60acgactcaag ggcccggagt cctgcttccc ctgcccaagg gggcctgcac aggttggatg 120gcgggcatcc cagggcatcc gggccataat ggggccccag gccgtgatgg cagagatggc 180acccctggtg agaagggtga gaaaggagat ccaggtctta ttggtcctaa gggagacatc 240ggtgaaaccg gagtacccgg ggctgaaggt ccccgaggct ttccgggaat ccaaggcagg 300aaaggagaac ctggagaagg tgcctatgta taccgctcag cattcagtgt gggattggag 360acttacgtta ctatccccaa catgcccatt cgctttacca agatcttcta caatcagcaa 420aaccactatg atggctccac tggtaaattc cactgcaaca ttcctgggct gtactacttt 480gcctaccaca tcacagtcta tatgaaggat gtgaaggtca gcctcttcaa gaaggacaag 540gctatgctct tcacctatga tcagtaccag gaaaataatg tggaccaggc ctccggctct 600gtgctcctgc atctggaggt gggcgaccaa gtctggctcc aggtgtatgg ggaaggagag 660cgtaatggac tctatgctga taatgacaat gactccacct tcacaggctt tcttctctac 720catgacacca actga 735<210>2<211>438<212>DNA<213>人類(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(1)...(438)<400>2atgaaaggag aacctggaga aggtgcctat gtataccgct cagcattcag tgtgggattg 60gagacttacg ttactatccc caacatgccc attcgcttta ccaagatctt ctacaatcag 120caaaaccact atgatggctc cactggtaaa ttccactgca acattcctgg gctgtactac 180tttgcctacc acatcacagt ctatatgaag gatgtgaagg tcagcctctt caagaaggac 240aaggctatgc tcttcaccta tgatcagtac caggaaaata atgtggacca ggcctccggc 300tctgtgctcc tgcatctgga ggtgggcgac caagtctggc tccaggtgta tggggaagga 360gagcgtaatg gactctatgc tgataatgac aatgactcca ccttcacagg ctttcttctc 420taccatgaca ccaac tga 438<210>3<211>244<212>PRT<213>人類(Homo sapiens)<400>3Met Leu Leu Leu Gly Ala Val Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Gly1 5 10 15His Asp Gln Glu Thr Thr Thr Gln Gly Pro Gly Val Leu Leu Pro20 25 30Leu Pro Lys Gly Ala Cys Thr Gly Trp Met Ala Gly Ile Pro Gly35 40 45His Pro Gly Hi s Asn Gly Ala Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly50 55 60Thr Pro Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Asp Pro Gly Leu Ile Gly65 70 75Pro Lys Gly Asp Ile Gly Glu Thr Gly Val Pro Gly Ala Glu Gly80 85 90Pro Arg Gly Phe Pro Gly Ile Gln Gly Arg Lys Gly Glu Pro Gly95 100 105Glu Gly Ala Tyr Val Tyr Arg Ser Ala Phe Ser Val Gly Leu Glu110 115 120Thr Tyr Val Thr Ile Pro Asn Met Pro Ile Arg Phe Thr Lys Ile125 130 135Phe Tyr Asn Gln Gln Asn His Tyr Asp Gly Ser Thr Gly Lys Phe140 145 150His Cys Asn Ile Pro Gly Leu Tyr Tyr Phe Ala Tyr His Ile Thr155 160 165Val Tyr Met Lys Asp Val Lys Val Ser Leu Phe Lys Lys Asp Lys170 175 180Ala Met Leu Phe Thr Tyr Asp Gln Tyr Gln Glu Asn Asn Val Asp185 190 195Gln Ala Ser Gly Ser Val Leu Leu Hi s Leu Glu Val Gly Asp Gln200 205 210Val Trp Leu Gln Val Tyr Gly Glu Gly Glu Arg Asn Gly Leu Tyr2l5 220 225Ala Asp Asn Asp Asn Asp Ser Thr Phe Thr Gly Phe Leu Leu Tyr230 235 240His Asp Thr Asn244<210>4<211>10<212>PRT<213>人類(Homo sapiens)<220><221>ACETYLATION<400>4Met Leu Leu Leu Gly Ala Val Leu Leu Leu1 5 10<210>5<211>145<212>PRT<213>人類(Homo sapiens)<400>5Met Lys Gly Glu Pro Gly Glu Gly Ala Tyr Val Tyr Arg Ser Ala1 5 10 15Phe Ser Val Gly Leu Glu Thr Tyr Val Thr Ile Pro Asn Met Pro20 25 30Ile Arg Phe Thr Lys Ile Phe Tyr Asn Gln Gln Asn His Tyr Asp35 40 45Gly Ser Thr Gly Lys Phe His Cys Asn Ile Pro Gly Leu Tyr Tyr50 55 60Phe Ala Tyr His Ile Thr Val Tyr Met Lys Asp Val Lys Val Ser65 70 75Leu Phe Lys Lys Asp Lys Ala Met Leu Phe Thr Tyr Asp Gln Tyr80 85 90Gln Glu Asn Asn Val Asp Gln Ala Ser Gly Ser Val Leu Leu His95 100 105Leu Glu Val Gly Asp Gln Val Trp Leu Gln Val Tyr Gly Glu Gly110 115 120Glu Arg Asn Gly Leu Tyr Ala Asp Asn Asp Asn Asp Ser Thr Phe125 130 135Thr Gly Phe Leu Leu Tyr His Asp Thr Asn140 145<210>6<211>10<212>PRT<213>人類(Homo sapiens)<220><221>ACETYLATION<400>6Met Lys Gly Glu Pro Gly Glu Gly Ala Tyr1 5 10
權(quán)利要求
1.一種重組人脂肪酸氧化蛋白，由244個(gè)氨基酸組成，由N-端的膠原結(jié)構(gòu)域和發(fā)揮生物學(xué)活性的C-端的球狀結(jié)構(gòu)域組成，與小鼠的ACRP30高度同源，含有如附圖1所示編碼的人脂肪氧化蛋白的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人脂肪酸氧化蛋白，其特征在于C-端球狀結(jié)構(gòu)域含有如附圖2所示的cDNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人脂肪酸氧化蛋白，其特征在于所述的核苷酸序列，包括該核苷酸序列的互補(bǔ)鏈。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組人脂肪酸氧化蛋白，其特征在于所述的核苷酸序列能編碼具有附圖3所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其分子量為30KD。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組人脂肪酸氧化蛋白，其特征在于所述的核苷酸序列能編碼如附圖4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其分子量為16KD。
6.一種生產(chǎn)重組人游離脂肪酸氧化蛋白及其C-端球狀結(jié)構(gòu)域的方法，包括基因克隆、重組蛋白質(zhì)的表達(dá)和分離純化。表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性測(cè)定，重組蛋白質(zhì)的表達(dá)和分離純化包括工程細(xì)胞的發(fā)酵、發(fā)酵產(chǎn)物的超濾、濃縮、沉淀、蛋白質(zhì)柱層析純化，其特征在于將權(quán)利要求1或2所述的DNA序列插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體后，導(dǎo)入原核和真核細(xì)胞，構(gòu)成工程細(xì)胞，在合適的條件下培養(yǎng)工程細(xì)胞，并將細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過分離。純化得到重組人游離脂肪酸氧化蛋白及其C-端球狀結(jié)構(gòu)域。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于合適的載體為原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體，可在細(xì)菌、細(xì)胞及(轉(zhuǎn)基因)動(dòng)植物個(gè)體器官或組織中表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于原核細(xì)胞為大腸桿菌，其表達(dá)產(chǎn)物通過離心得到不溶性的包涵體沉淀，該包涵體沉淀需復(fù)性才能具有生物學(xué)活性。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于包涵體沉淀的復(fù)性可通過下列兩種方法之一完成(a)稀釋復(fù)性，其復(fù)性液組分為0.1～1000mmol/L尿素、0.1～0.5mmol/L氧化型谷胱甘肽、1～5mmol/L還原型谷胱甘肽、10～100mmol/L的緩沖液、pH3～10；(b)分子篩層析復(fù)性，其復(fù)性液組分為0.1～1000mmol/L鹽酸胍、0.1～0.5mmol/L氧化型谷胱甘肽、1～5mmol/L還原型谷胱甘肽、10～100mmol/L的緩沖液、pH3～10。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的純化是采用柱層析純化復(fù)性蛋白，柱層析介質(zhì)采用陰離子交換介質(zhì)，洗脫采用0～2mol/L的鹽梯度洗脫，目標(biāo)蛋白在主峰中。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的純化是采用柱層析純化復(fù)性蛋白，柱層析介質(zhì)采用陽離子交換介質(zhì)，洗脫采用0～2mol/L的鹽梯度結(jié)合pH值梯度(pH3-10)洗脫，目標(biāo)蛋白在第2峰中。
12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于真核細(xì)胞為CHO-細(xì)胞，培養(yǎng)采用多孔微載體無血清灌注培養(yǎng)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于采用5000～1萬分子量的膜對(duì)收集的上清進(jìn)行濃縮，濃縮后上清經(jīng)20～65％硫酸胺沉淀除去大部分非目標(biāo)蛋白。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于采用如下柱層析純化重組蛋白(a)采用疏水層析介質(zhì)純化經(jīng)硫酸胺沉淀而分離的蛋白質(zhì)樣品，采用鹽梯度洗脫(0～2mol/L硫酸胺)，目標(biāo)蛋白在第2個(gè)峰中；(b)將上述采用疏水層析分析的目標(biāo)蛋白樣品，通過陰離子交換層析進(jìn)行下一步的精制，采用0～2mol/L鹽梯度洗脫，目標(biāo)蛋白在主峰；(c)將上述經(jīng)陰離子交換收集的目標(biāo)蛋白樣品經(jīng)分子篩GH-25脫鹽。
15.權(quán)利要求1或2或3或4或5所述的重組人游離脂肪酸氧化蛋白及其C-端球狀結(jié)構(gòu)域制品，其特征在于可作為功能性食品或藥品用于治療和預(yù)防肥胖、糖代謝紊亂。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組人脂肪酸氧化蛋白及其生產(chǎn)方法和用途。該重組人脂肪酸氧化蛋白，由244個(gè)氨基酸組成，由N－端的膠原結(jié)構(gòu)域和發(fā)揮生物學(xué)活性的C－端的球狀結(jié)構(gòu)域組成，含有編碼人脂肪酸氧化蛋白的核苷酸序列，C－端球狀結(jié)構(gòu)域含有cDNA序列。其生產(chǎn)方法是(a)通過PCR方法篩選到兩種基因片段大片段長(zhǎng)735堿基對(duì)，編碼全長(zhǎng)人脂肪酸氧化蛋白；小片段長(zhǎng)438堿基對(duì)，編碼人脂肪酸氧化蛋白球狀結(jié)構(gòu)域；(b)將上述兩種基因片段分別克隆，并獲得表達(dá)；(c)建立工程細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)、超濾、柱層析一整套表達(dá)產(chǎn)物分離、純化工藝，獲得重組人脂肪酸氧化蛋白及其球狀結(jié)構(gòu)域純品。該產(chǎn)品能用于預(yù)防和治療肥胖、糖代謝紊亂等疾病。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1477113SQ0211435
公開日2004年2月25日 申請(qǐng)日期2002年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月21日
發(fā)明者寧云山, 肖燦鵬, 隋杰, 盧捷, 龔平, 楊浩 申請(qǐng)人:湖南盈程生命科學(xué)研究所有限公司