專利名稱：炭疽保護(hù)抗原的高水平組成性生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用補(bǔ)料分批培養(yǎng)(fed Batch culture)在大腸桿菌中高水平組成性生產(chǎn)炭疽保護(hù)抗原。
背景技術(shù)：
炭疽是一種動(dòng)物源性疾病，由革蘭氏陽(yáng)性的孢子形成細(xì)菌炭疽桿菌(Bacillusanthracis)引起。保護(hù)抗原PA是所有抗炭疽疫苗中的主要成分。至今，炭疽桿菌的培養(yǎng)上清液是純化PA的主要來(lái)源。但是，炭疽桿菌的培養(yǎng)工作需要P3級(jí)的設(shè)施，這在成本上是過(guò)高的。除此以外，從炭疽桿菌中制備PA常常污染其他炭疽毒性蛋白。研究人員試圖在其他微生物中，如枯草芽胞桿菌、桿狀病毒和大腸桿菌中表達(dá)和提純PA。從枯草芽胞桿菌中提純PA的產(chǎn)量少，要求生長(zhǎng)在豐富的培養(yǎng)基中，由于生物體分泌蛋白酶大量的PA被降解(L.W.J.Baillie等，Lett.Appl.Microbial(1994)19，225-227)。桿狀病毒載體在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)PA；但是，由于產(chǎn)量低，不可能提純。雖然PA已經(jīng)能在大腸桿菌中表達(dá)，但超量生產(chǎn)蛋白的努力尚未成功(M.H.Vodkin等，Cell，(1983)34，693-697)。研究人員也通過(guò)引導(dǎo)該蛋白到周質(zhì)間隙，但純化的PA產(chǎn)量很低。所有已知的用于保護(hù)抗原表達(dá)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是需要使用IPTG(一種昂貴的化學(xué)品)的誘導(dǎo)系統(tǒng)。
美國(guó)專利2,017,606描述了在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)炭疽桿菌并從培養(yǎng)基中分離桿菌以制備炭疽抗原。
美國(guó)專利2,151,364描述了生產(chǎn)炭疽疫苗的方法，該方法包括制備炭疽孢子懸浮液并把該懸浮液加到含明礬的無(wú)菌懸浮溶液中。
上述美國(guó)專利的缺點(diǎn)是它們都使用炭疽桿菌培養(yǎng)或孢子。炭疽桿菌是一種傳染性生物，處理時(shí)不能沒(méi)有保護(hù)設(shè)施。炭疽桿菌中保護(hù)抗原的表達(dá)水平很低。這種疫苗制備物也會(huì)被炭疽桿菌中的毒性和非毒性蛋白污染，導(dǎo)致許多副作用和致反應(yīng)性。
本發(fā)明的目的是建立使用補(bǔ)料分批培養(yǎng)在大腸桿菌中快速、有效、有成本效益和高水平生產(chǎn)炭疽保護(hù)抗原的組成型表達(dá)系統(tǒng)。
為獲得上述本發(fā)明的目標(biāo)，提供使用補(bǔ)料分批培養(yǎng)在大腸桿菌中制備炭疽保護(hù)抗原的方法包括—用含PA基因的重組組成表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞以產(chǎn)生重組DH5α細(xì)胞表達(dá)PA蛋白，—培養(yǎng)上述重組DH5α細(xì)胞并通過(guò)裂解上述細(xì)胞、接著變性凝膠電泳及使用PA抗體的蛋白質(zhì)印跡(Western Blotting)技術(shù)來(lái)測(cè)試PA的表達(dá)。
—在生物反應(yīng)器中使用下列步驟發(fā)酵上述細(xì)胞●在32-42℃多羥基化合物、碳水化合物或有機(jī)酸作為主要補(bǔ)充物加入Luria Broth培養(yǎng)基，●補(bǔ)料分批培養(yǎng)技術(shù)，和●用pH-DO靜態(tài)方法檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)喪失以產(chǎn)生表達(dá)PA蛋白的高細(xì)胞密度培養(yǎng)物，—用離心方法收集所述的細(xì)胞，以5000-10,000rpm、10-30分鐘離心所述高密度細(xì)胞培養(yǎng)物，—用6-8摩爾尿素溶液溶解所述高密度細(xì)胞培養(yǎng)物，并在環(huán)境溫度攪拌1-2小時(shí)，—在32-42℃以10,000-15,000rpm離心分離所述高密度細(xì)胞培養(yǎng)物碎片30-60分鐘，并收集含尿素變性PA的上清液，—從所述上清液中分離所述的尿素變性PA，用Ni-NTA色譜法提純所述的PA并通過(guò)逐步除去尿素而所述的PA結(jié)合在親和柱上，—洗脫所述提純的變性PA，并在-20到-70℃作為冷凍等分部分儲(chǔ)存保護(hù)抗體(PA)蛋白，溫度取決于即時(shí)使用還是長(zhǎng)期使用。
所述用于表達(dá)PA蛋白的重組組成型表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌菌株DH5α細(xì)胞中為不溶解包含體。
以5000rpm對(duì)所述的高細(xì)胞密度培養(yǎng)物離心10分鐘收集所述細(xì)胞。
以10,000rpm對(duì)所述的高細(xì)胞密度培養(yǎng)物碎片離心30分鐘最大限度地收集所述細(xì)胞。
在發(fā)酵期間用作主要補(bǔ)充物加入Luria Broth培養(yǎng)基的所述的多羥基化合物是甘油。
用作主要補(bǔ)充物加入Luria Broth培養(yǎng)基的所述的碳水化合物是葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、果糖和乳糖。
用作主要補(bǔ)充物加入Luria Broth培養(yǎng)基的所述的有機(jī)酸是蘋果酸。
通過(guò)使用多羥基化合物、碳水化合物或有機(jī)酸作為L(zhǎng)uria Broth培養(yǎng)基的主要補(bǔ)充物，在搖瓶培養(yǎng)中最大細(xì)胞密度的范圍是10-14光密度單位。
通過(guò)使用含有MgSO4的補(bǔ)料分批培養(yǎng)獲得重組細(xì)胞的最大細(xì)胞密度。
用于培養(yǎng)的Luria Broth培養(yǎng)基的濃度是5-25X。
用于培養(yǎng)的Luria Broth培養(yǎng)基的濃度是25x以便在發(fā)酵時(shí)加入的補(bǔ)料體積最小化。
所述質(zhì)粒是含大腸桿菌可識(shí)別的噬菌體啟動(dòng)子的pQE系列載體。
炭疽抗原包括純化的結(jié)構(gòu)上、生物學(xué)上和功能上有活性的炭疽桿菌的重組保護(hù)抗原(PA)蛋白，這些抗原在不含多糖、死細(xì)菌、培養(yǎng)基、水溶性和不溶于水的副產(chǎn)品和懸浮的雜質(zhì)的大腸桿菌DH5α細(xì)胞中表達(dá)為6X組氨酸融合蛋白。
附圖的簡(jiǎn)要描述本發(fā)明參考下列方案和附圖進(jìn)行描述。


圖1顯示在搖瓶培養(yǎng)中最大光密度是通過(guò)使用葡萄糖作為附加的碳源獲得的，最小光密度是通過(guò)使用麥芽糖獲得的。
圖2顯示分批培養(yǎng)和使用MgSO4和不使用MgSO4的補(bǔ)料分批培養(yǎng)中獲得的光密度。
圖3顯示產(chǎn)生的重組PA在生物學(xué)上和功能上與炭疽桿菌來(lái)源的天然PA一樣有活性。
發(fā)明的詳細(xì)描述包含在pQE系列載體中克隆的PA基因的重組組成性表達(dá)質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。所述包含重組質(zhì)粒的細(xì)胞在具有100μg/ml氨芐青霉素的Luria Broth培養(yǎng)基中37℃250rpm生長(zhǎng)過(guò)夜。以5,000rpm離心20分鐘收集細(xì)胞。PA的表達(dá)和定位用SDS-PAGE確定。超過(guò)90％的重組蛋白在包含體中發(fā)現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)蛋白表達(dá)量的增長(zhǎng)與生長(zhǎng)的培養(yǎng)物中細(xì)胞密度的增長(zhǎng)成正比。
葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、蘋果酸和甘油作為七種不同的碳源在搖瓶中制備每個(gè)都是5X濃度的改良的100ml LB的復(fù)合培養(yǎng)基。只有沒(méi)有任何附加碳源的LB(培養(yǎng)基)作為對(duì)照。等摩爾量的碳原子用作碳源，濃度控制在與0.5％葡萄糖相等。還加入10mM MgSO4，100mM磷酸鉀和痕量元素。所有的燒瓶在同時(shí)接種，使用包含所述重組質(zhì)粒的過(guò)夜生長(zhǎng)的DH5α細(xì)胞接種物。樣品每小時(shí)無(wú)菌收集并測(cè)定OD600。收集培養(yǎng)物等分部分，它們的重組蛋白含量用SDS-PAGE分析。以葡萄糖作為主要碳源可獲得最高的OD600(在600毫微米的光密度)，使用LB和麥芽糖的例子中可見(jiàn)到最低的OD600(圖1)。使用蘋果酸、麥芽糖和甘油作為主要碳源可獲得最大蛋白濃度。使用Lb和乳糖的例子中可見(jiàn)到最低蛋白濃度。
配備pH、溫度、溶解氧和消沫劑探頭的5L Biostat B(B Braun BiotechInternational)發(fā)酵罐用于發(fā)酵。發(fā)酵罐與個(gè)人電腦相連。MFCS/win 2.0軟件被用來(lái)獲取數(shù)據(jù)并以批量和補(bǔ)料分批模式運(yùn)行發(fā)酵罐。
用于發(fā)酵的培養(yǎng)基是由含MgSO4.7H2O(10mM)磷酸鉀(5g/L)和甘油(1％)，pH7.4的Luria Broth培養(yǎng)基組成的復(fù)合培養(yǎng)基。對(duì)于補(bǔ)料分批培養(yǎng)，在高壓滅菌前加入MgSO4。甘油也在高壓滅菌前加入。用25％甘油(w/v)和25X LB制備25x補(bǔ)料并分別高壓滅菌。磷酸鉀也被單獨(dú)高壓滅菌，在達(dá)到室溫后，在開始運(yùn)行前無(wú)菌地加入。在高壓滅菌前pH探頭用pH7.0和9.2的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校準(zhǔn)。在高壓滅菌后，發(fā)酵罐培養(yǎng)基通過(guò)加入1N NaOH/1M HCL自動(dòng)調(diào)節(jié)到pH7.4，溫度被設(shè)定在37℃。DO(溶解氧)探頭的校準(zhǔn)是通過(guò)設(shè)定溶解氧的電子零值在零到+15毫微安培(nAmp)的范圍，100％DO值設(shè)定在攪拌速度為250rpm，泵抽空氣的氧張力為2vvm。發(fā)酵罐在批量相開始，工作體積為2L。含有重組質(zhì)粒的細(xì)胞在選擇性壓力的100μg/ml氨芐青霉素下的LB中，37℃、250rpm生長(zhǎng)過(guò)夜。用1％過(guò)夜生長(zhǎng)的培養(yǎng)物接種發(fā)酵罐。DO值設(shè)定在40％，攪拌器被調(diào)到級(jí)聯(lián)模式。在此模式中，在接種后，DO值開始降至40％以下，攪拌器速度自動(dòng)增加以保持DO值在40％。每隔1小時(shí)收集樣品。培養(yǎng)物等分分部被稀釋到光密度(OD600)大約0.5單位以下。當(dāng)生長(zhǎng)的培養(yǎng)物達(dá)到log中期，使用蠕動(dòng)泵(Pharmacia)加入25x補(bǔ)料開始加料。加料速度被監(jiān)控和手動(dòng)控制以保持pH值在7.2和7.4之間。在OD達(dá)到70后需要補(bǔ)充氧氣。使用發(fā)酵罐的Gasmix功能對(duì)培養(yǎng)物提供氧氣。在培養(yǎng)物生長(zhǎng)到OD600120單位后收集細(xì)胞。消沫劑一開始在高壓滅菌前加入培養(yǎng)基中，以后在需要時(shí)加入。
為了優(yōu)化培養(yǎng)基成分和連續(xù)運(yùn)行發(fā)酵的其他條件，在有甘油的改良LB的培養(yǎng)基中加入或不加入MgSO4來(lái)進(jìn)行一系列的批量培養(yǎng)。在沒(méi)有MgSO4的改良LB(以甘油為碳源)中批量運(yùn)行獲得最大OD～14，而在有MgSO4的改良LB中批量運(yùn)行可獲得超過(guò)18的OD600值?？梢酝茢郙gSO4對(duì)高密度細(xì)胞生長(zhǎng)是必需的。在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入MgSO4對(duì)發(fā)酵中獲得較高生物量產(chǎn)量是必需的(圖2)。
5ml高密度細(xì)胞培養(yǎng)物用預(yù)先稱量的試管以10,000g離心半小時(shí)。在抽取上清液后，具有離心細(xì)胞的試管在天平上稱量以確定濕細(xì)胞重量。為確定干細(xì)胞重量，相同的試管在70℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜，第二天稱重。
為了檢查發(fā)酵罐中質(zhì)粒pMW1的穩(wěn)定性，在發(fā)酵過(guò)程中每小時(shí)無(wú)菌收集培養(yǎng)物樣品。該樣品被稀釋到每個(gè)樣品的OD600～5.0，以10,000g離心一分鐘。上清液被完全抽取后，沉積物懸浮于含有100mM磷酸鉀緩沖液，8M尿素，pH8.0的100μl裂解緩沖液。這些樣品進(jìn)行SDS-PAGE以檢查重組質(zhì)粒的蛋白表達(dá)。質(zhì)粒DNA的集落制備和小量制備也被用于直接檢查表達(dá)細(xì)胞內(nèi)的重組質(zhì)粒的存在。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞的產(chǎn)生。
蛋白在變性條件下用金屬螯合親和色譜法進(jìn)行純化。簡(jiǎn)言之，100ml培養(yǎng)物的沉淀再懸浮于含有100mM磷酸鈉緩沖液，300mM氯化鈉和8M尿素(pH8.0)的100ml變性緩沖液。再懸浮的沉淀在旋轉(zhuǎn)搖床上，37℃培育2小時(shí)。該裂解物在室溫下離心兩次，每次60分鐘，上清液與50％Ni-NTA漿混合。該漿被灌到柱上并使之沉淀。流過(guò)物再加到柱上。Ni-NTA基質(zhì)用含8M尿素的500ml變性緩沖液洗滌，接著用8M-OM尿素梯度在柱上使蛋白復(fù)性。該蛋白用洗脫緩沖液中有250mM咪唑氯化物，有250mM咪唑的pH8.0的100mM磷酸鈉和300mM氯化鈉洗提。每部分10μl在SDS-PAGE上分析。含蛋白的部分被收集，集中并用含50mM NaCl的10mM HEPES緩沖液透析和等分地冷凍儲(chǔ)藏在-70℃。
特定的蛋白可以用許多方法測(cè)定。使用BioRad凝膠文件管理系統(tǒng)和QuantityOne軟件進(jìn)行光密度測(cè)量。通過(guò)計(jì)算在聯(lián)合LF(1μg/ml)，37℃，3小時(shí)殺滅50％J774A.1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞(EC50)所需要的蛋白的量來(lái)確定不同階段的PA的純化倍數(shù)。通過(guò)Bradford方法和測(cè)定制備物在280nm的OD來(lái)測(cè)量純化的蛋白。PA占細(xì)胞總蛋白30％以上，在細(xì)胞中以包含體的形式存在。在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生5-8g/L的PA。
rPA(重組PA)的生物活性也用對(duì)J774A.1巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系的細(xì)胞毒性分析來(lái)確定。所有的實(shí)驗(yàn)都重復(fù)三次。簡(jiǎn)言之，不同濃度的rPA蛋白連同LF(1μg/ml)一起加到細(xì)胞中。從炭疽桿菌天然的PA連同LF一起作為陽(yáng)性對(duì)照。3小時(shí)后，用MTT染料來(lái)確定細(xì)胞存活力，所得的沉淀物溶解在含0.5％(w/v)的十二烷基硫酸鈉、在90％異丙醇中25mM HCl的緩沖液中。用微型板讀數(shù)器(microplate reader)(BioRad)在540nm讀出吸收情況，確定存活力百分比。發(fā)現(xiàn)rPA連同LF一起能完全裂解巨噬細(xì)胞，其生物活性與炭疽桿菌制備的PA相似。發(fā)現(xiàn)rPA與nPA的EC50各在～50ng/ml(圖3)。蛋白的純化倍數(shù)通過(guò)上述細(xì)胞毒性分析在純化的每個(gè)階段確定(表1)。
表1來(lái)源于大腸桿菌的PA的純化部分體積(ml)蛋白(mg/ml)活性(EC50)a純化(倍數(shù))b細(xì)胞裂解液10291 57.3 1親和純化 251.8 0.02411965aEC50定義為殺滅50％ J774A.1細(xì)胞所需的與LF(1μg/ml)一起的PA(μg/ml)濃度。在3小時(shí)培育后，存活力由MTT染料確定。結(jié)果代表三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值。
b純化倍數(shù)由細(xì)胞裂解液的EC50除以由不同柱上獲得的部分的EC50確定。
討論任何重組蛋白的超表達(dá)取決于表達(dá)系統(tǒng)的各種成分的最佳構(gòu)型。許多因素強(qiáng)烈地影響重組蛋白表達(dá)如啟動(dòng)子強(qiáng)度、質(zhì)粒穩(wěn)定性、質(zhì)?？截悢?shù)、轉(zhuǎn)錄終止子、最終增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率、翻譯終止子、基因轉(zhuǎn)錄的緊密調(diào)節(jié)、核糖體的有效性、翻譯后修飾、重組蛋白本身的穩(wěn)定性和溶解性，及宿主細(xì)胞和培養(yǎng)條件。針對(duì)異源蛋白表達(dá)的高水平的步驟使用強(qiáng)啟動(dòng)子如T5，T7，PL，PR，Ptrc，Ptac，以建立一個(gè)有效的表達(dá)系統(tǒng)。這些系統(tǒng)中的大多數(shù)攜帶可誘導(dǎo)啟動(dòng)子和在誘導(dǎo)前有一個(gè)低或無(wú)產(chǎn)物形成的階段。在誘導(dǎo)時(shí)，特定的產(chǎn)率在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到最大，蛋白連續(xù)產(chǎn)生達(dá)4-5小時(shí)。已報(bào)道在誘導(dǎo)后有許多變化如碳代謝發(fā)生變化導(dǎo)致醋酸鹽堆積，呼吸作用增加，持家蛋白(house keeping proteins)的合成下降，和出現(xiàn)熱休克樣反應(yīng)和SOS反應(yīng)。所有這些反應(yīng)導(dǎo)致重組產(chǎn)物的降解。包含體的形成使重組蛋白避免細(xì)胞蛋白酶的沖擊，否則這種沖擊會(huì)導(dǎo)致蛋白的廣泛降解，導(dǎo)致低產(chǎn)物回收。在不同時(shí)間點(diǎn)上的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡(Western Blotting)分析，證實(shí)了重組質(zhì)粒pMW1的PA表達(dá)不是泄漏的和該表達(dá)與培養(yǎng)物的OD成比例的事實(shí)。沒(méi)有明顯的降解，細(xì)胞內(nèi)的大多數(shù)蛋白是包含體形式。
一旦建立了強(qiáng)表達(dá)系統(tǒng)，采用不同技術(shù)的高細(xì)胞密度培養(yǎng)能明顯增加大腸桿菌中重組蛋白的產(chǎn)生。能常規(guī)獲得超過(guò)50g/l干重的細(xì)胞濃度以提供有成本效益的重組蛋白生產(chǎn)。但高細(xì)胞密度培養(yǎng)也有一些缺點(diǎn)如底物抑制、氧轉(zhuǎn)運(yùn)能力有限、生長(zhǎng)抑制副產(chǎn)物的形成和有限熱消散導(dǎo)致發(fā)酵罐混合效力的下降。高細(xì)胞密度培養(yǎng)(HCDC)中重組蛋白生產(chǎn)的一個(gè)主要問(wèn)題是醋酸鹽的堆積，它是對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有害的親脂劑。據(jù)報(bào)道在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中醋酸鹽的堆積降低了重組蛋白的生產(chǎn)。在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中已開發(fā)了許多策略來(lái)減少醋酸鹽形成，如通過(guò)限制培養(yǎng)基的必需營(yíng)養(yǎng)物如碳或氮源來(lái)控制特定的生長(zhǎng)速度，改變生長(zhǎng)條件和大腸桿菌菌株。由于發(fā)酵研究的主要目標(biāo)是有成本效益生產(chǎn)重組產(chǎn)品，開發(fā)使所需產(chǎn)品的產(chǎn)量最大化的培養(yǎng)方法是重要的。生長(zhǎng)培養(yǎng)基的成分對(duì)增加產(chǎn)品形成和減少醋酸鹽是關(guān)鍵的。醋酸鹽是大腸桿菌在氧有限的情況下或有氧情況下葡萄糖過(guò)多存在時(shí)，當(dāng)碳流動(dòng)在中心代謝通道超過(guò)其生物合成的需要和細(xì)胞內(nèi)能量產(chǎn)生的能力時(shí)產(chǎn)生的。
以生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和重組蛋白產(chǎn)量為基礎(chǔ)，從7種碳源中選出甘油作為HCDC的主要碳源，7種碳源即葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、蘋果酸和甘油。使用甘油作為碳源時(shí)不產(chǎn)生醋酸鹽，使用甘油相對(duì)容易獲得高細(xì)胞密度。與葡萄糖相比，甘油轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞的速度較低，顯然導(dǎo)致經(jīng)過(guò)糖酵解的碳流動(dòng)減少；大大減少了醋酸鹽形成，細(xì)胞在甘油中生長(zhǎng)較慢。甘油也有消沫作用，在發(fā)酵運(yùn)行過(guò)程中導(dǎo)致起泡沫少。
利用營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)料的方法對(duì)HCDC的成功也很關(guān)鍵，因?yàn)樗绊懠?xì)胞密度和細(xì)胞生產(chǎn)率。在營(yíng)養(yǎng)有限的條件下進(jìn)行恒定或間歇補(bǔ)料。雖然其他補(bǔ)料方法已經(jīng)成功應(yīng)用于大腸桿菌的HCDCs，近來(lái)已經(jīng)開發(fā)了有反饋控制方案的更復(fù)雜的補(bǔ)料方法。補(bǔ)料速度結(jié)合其他物理參數(shù)如DO(溶解氧)、pH、微生物熱和CO2放出速度(CER)。補(bǔ)料的DO靜態(tài)(DO-stat)方法是基于當(dāng)?shù)孜锖谋M時(shí)培養(yǎng)物中DO急劇增加的事實(shí)。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)水平下降和較少可被細(xì)胞利用的氧時(shí)，細(xì)胞不能迅速生長(zhǎng)。因此，在DO靜態(tài)方法中，DO上升超過(guò)預(yù)設(shè)值時(shí)通過(guò)自動(dòng)加入營(yíng)養(yǎng)物來(lái)保持底物濃度在所需的范圍內(nèi)。另一種選擇，pH靜態(tài)(pH-stat)方法是基于當(dāng)主要碳源有限時(shí)培養(yǎng)基pH變化的事實(shí)。當(dāng)碳源耗盡時(shí)，pH開始升高主要是由于細(xì)胞排出/分泌銨離子的濃度增高的結(jié)果。
對(duì)補(bǔ)料系統(tǒng)的分析起自對(duì)探測(cè)和檢測(cè)方法的鑒定。通過(guò)檢查DO和pH對(duì)補(bǔ)料速度波動(dòng)的反應(yīng)來(lái)檢測(cè)呼吸作用中的飽和度。一旦開始補(bǔ)料，大腸桿菌進(jìn)入對(duì)數(shù)期，補(bǔ)料的消耗或多或少是指數(shù)方式。但是，必須控制補(bǔ)料速度使之不超過(guò)營(yíng)養(yǎng)需求或補(bǔ)料消耗速度。這是通過(guò)維持pH和DO靠近它們的設(shè)定值來(lái)完成的。pH和DO的下降是底物過(guò)量的征兆。pH和DO值的上升表明碳源或某一底物有限，所以需要補(bǔ)料。如果補(bǔ)料波動(dòng)/速度的增加不能產(chǎn)生任何明顯的反應(yīng)，即DO的下降或攪拌器速度的增加，一種理想的征兆是，一些其他因素如MgSO4，KH2PO4或痕量元素變得有限，這種情況下必須間歇加入。加入后上述變量會(huì)有迅速變化。當(dāng)沒(méi)有葡萄糖或任何其他主要碳源時(shí)，大腸桿菌能使用醋酸鹽作為碳源。醋酸鹽消耗的特征是預(yù)設(shè)值偏差到較低pH值和氧消耗開始出現(xiàn)循環(huán)模式，直至培養(yǎng)中逐漸恢復(fù)預(yù)設(shè)的pH值。此時(shí)補(bǔ)料重新開始。
DO靜態(tài)方法對(duì)營(yíng)養(yǎng)損耗的反應(yīng)比pH靜態(tài)方法更快。當(dāng)復(fù)合底物與碳水化合物底物一起使用時(shí)，DO的變化不比連續(xù)使用復(fù)合底物的細(xì)胞明顯。本實(shí)驗(yàn)中使用的補(bǔ)料方法是結(jié)合了pH靜態(tài)方法和DO靜態(tài)方法。同時(shí)監(jiān)測(cè)兩種參數(shù)更好地控制生長(zhǎng)培養(yǎng)的生長(zhǎng)條件。使用這種底物補(bǔ)料的方法，我們能獲得120的OD，該值比批量培養(yǎng)獲得的OD高6倍，比搖瓶培養(yǎng)高23倍。
這是首次報(bào)道補(bǔ)料分批HCDC的最優(yōu)化條件以獲得大腸桿菌中PA的高產(chǎn)量。本工作試圖獲得大量的能作為未來(lái)候選疫苗的非致反應(yīng)性的PA。本文報(bào)道的生產(chǎn)PA的方法使用新穎和有利的底物和簡(jiǎn)單容易的控制補(bǔ)料方法，這些也可以成功應(yīng)用到其他重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)以獲得高產(chǎn)量的產(chǎn)物。
權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)1.使用補(bǔ)料分批培養(yǎng)在大腸桿菌中制備炭疽保護(hù)抗原的方法包括—用含PA基因的重組組成型表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞以產(chǎn)生表達(dá)PA蛋白的重組DH5α細(xì)胞，—培養(yǎng)所述重組DH5α細(xì)胞并通過(guò)裂解所述細(xì)胞、接著變性凝膠電泳及使用PA抗體的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)來(lái)測(cè)試PA的表達(dá)。
—在生物反應(yīng)器中使用下列步驟發(fā)酵所述細(xì)胞●多羥基化合物、碳水化合物或有機(jī)酸作為主要補(bǔ)充物在32-42℃加入Luria Broth培養(yǎng)基，●補(bǔ)料分批培養(yǎng)技術(shù)，和●用pH-DO靜態(tài)方法檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)喪失以產(chǎn)生表達(dá)PA蛋白的高細(xì)胞密度培養(yǎng)物，導(dǎo)致高產(chǎn)量，—以5000-10,000rpm對(duì)所述高密度細(xì)胞培養(yǎng)物離心10-30分鐘收集所述細(xì)胞，—使用6-8摩爾尿素溶液溶解所述高密度細(xì)胞培養(yǎng)物，并在環(huán)境溫度攪拌1-2小時(shí)，—在32-42℃以10,000-15,000rpm離心分離所述高密度細(xì)胞培養(yǎng)物碎片30-60分鐘，并收集含尿素變性PA的上清液，—從所述上清液中分離所述的尿素變性PA，用Ni-NTA色譜法提純所述的PA并通過(guò)逐步除去尿素而所述的PA結(jié)合在親和柱上，以及—洗脫所述提純的變性PA，并在-20到-70℃冷凍等分部分儲(chǔ)存保護(hù)抗體(PA)蛋白，溫度取決于即時(shí)使用還是長(zhǎng)期使用。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述用于表達(dá)PA蛋白的重組組成型表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌菌株DH5α細(xì)胞中為不溶解的包含體。
3.權(quán)利要求1所述的步驟，其特征在于以5000rpm對(duì)所述的高密度細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行離心10分鐘收集所述細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于以10,000rpm對(duì)所述的高密度細(xì)胞培養(yǎng)物碎片進(jìn)行離心30分鐘，以最大限度地收集所述細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在發(fā)酵中用作主要補(bǔ)充物在37℃加入Luria Broth培養(yǎng)基的所述的多羥基化合物是甘油。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于用作主要補(bǔ)充物在37℃加入LuriaBroth培養(yǎng)基的所述的碳水化合物是葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、果糖和乳糖。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于用作主要補(bǔ)充物在37℃加入LuriaBroth培養(yǎng)基的所述的有機(jī)酸是蘋果酸。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于通過(guò)使用多羥基化合物、碳水化合物或有機(jī)酸作為L(zhǎng)uria Broth培養(yǎng)基的主要補(bǔ)充物，在搖瓶培養(yǎng)中最大細(xì)胞密度的范圍是10-13光密度單位。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于通過(guò)使用含有MgSO4的補(bǔ)料分批培養(yǎng)獲得重組細(xì)胞的最大細(xì)胞密度。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于用于補(bǔ)料的Luria Broth培養(yǎng)基的濃度是5-25X。
11.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于用于補(bǔ)料的Luria Broth培養(yǎng)基的濃度是25x以便使發(fā)酵時(shí)加入的補(bǔ)料體積減少到最小。
12.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述質(zhì)粒是含大腸桿菌可識(shí)別的噬菌體啟動(dòng)子的pQE系列載體。
13.無(wú)論什么時(shí)候按照上述權(quán)利要求制備，純的炭疽保護(hù)抗原蛋白在安全的宿主大腸桿菌中表達(dá)。
14.炭疽抗原包括純化的結(jié)構(gòu)上、生物學(xué)上和功能上有活性的炭疽桿菌的重組保護(hù)抗原(PA)蛋白，這些抗原在不含多糖、死細(xì)菌、培養(yǎng)基、水溶性和不溶于水的副產(chǎn)品和懸浮的雜質(zhì)的大腸桿菌DH 5α細(xì)胞中表達(dá)為6X組氨酸融合蛋白。
權(quán)利要求
1.使用補(bǔ)料分批培養(yǎng)在大腸桿菌中制備炭疽保護(hù)抗原的方法包括-用含PA基因的重組組成型表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞以產(chǎn)生表達(dá)PA蛋白的重組DH5α細(xì)胞，-培養(yǎng)所述重組DH5α細(xì)胞并通過(guò)裂解所述細(xì)胞、變性凝膠電泳及使用PA抗體的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)來(lái)測(cè)試PA的表達(dá)。-在生物反應(yīng)器中使用下列步驟發(fā)酵所述細(xì)胞●多羥基化合物、碳水化合物或有機(jī)酸作為主要補(bǔ)充物在32-42℃加入Luria Broth培養(yǎng)基，●補(bǔ)料分批培養(yǎng)技術(shù)，和●用pH-DO靜態(tài)方法檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)喪失以產(chǎn)生表達(dá)PA蛋白的高細(xì)胞密度培養(yǎng)物，-以5000-10,000rpm對(duì)上述高密度細(xì)胞培養(yǎng)物離心10分鐘收集所述細(xì)胞，-使用6-8摩爾尿素溶溶解所述高密度細(xì)胞培養(yǎng)物液，并在環(huán)境溫度攪拌1-2小時(shí)，-在32-42℃以10,000-15,000rpm離心分離所述高密度細(xì)胞培養(yǎng)物碎片，30-60分鐘，并收集含尿素變性PA的上清液，-從所述上清液中分離所述的尿素變性PA，用Ni-NTA色譜法提純所述的PA并通過(guò)逐步除去尿素而所述的PA結(jié)合在柔和柱上，以及-洗脫所述提純的變性PA，并在-20到-70℃冷凍等分部分儲(chǔ)存保護(hù)抗體(PA)蛋白，溫度取決于即時(shí)使用還是長(zhǎng)期使用。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述用于表達(dá)PA蛋白的重組組成型表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌菌株DH5α細(xì)胞中為不溶解的包含體。
3.權(quán)利要求1所述的步驟，其特征在于以5000rpm對(duì)所述的高密度細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行離心10分鐘收集所述細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于以10,000rpm對(duì)所述的高密度細(xì)胞培養(yǎng)物碎片進(jìn)行離心30分鐘，以最大限度地收集所述細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在發(fā)酵中用作主要補(bǔ)充物在37℃加入Luria Broth培養(yǎng)基的所述的多羥基化合物是甘油。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于用作主要補(bǔ)充物在37℃加入LuriaBroth培養(yǎng)基的所述的碳水化合物是葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、果糖和乳糖。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于用作主要補(bǔ)充物在37℃加入LuriaBroth培養(yǎng)基的所述的有機(jī)酸是蘋果酸。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于通過(guò)使用多羥基化合物、碳水化合物或有機(jī)酸作為L(zhǎng)uria Broth培養(yǎng)基的主要補(bǔ)充物，在搖瓶培養(yǎng)中最大細(xì)胞密度的范圍是10-13光密度單位。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于通過(guò)使用含有MgSO4的補(bǔ)料分批培養(yǎng)獲得重組細(xì)胞的最大細(xì)胞密度。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于用于補(bǔ)料的Luria Broth培養(yǎng)基的濃度是5-25X。
11.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于用于補(bǔ)料的Luria Broth培養(yǎng)基的濃度是25x以便使發(fā)酵時(shí)加入的補(bǔ)料體積減少到最小。
12.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述質(zhì)粒是含大腸桿菌可識(shí)別的噬菌體啟動(dòng)子的pQE系列載體。
13.無(wú)論什么時(shí)候按照上述權(quán)利要求制備，純的炭疽保護(hù)抗原蛋白在安全的宿主大腸桿菌中表達(dá)。
14.炭疽抗原包括純化的結(jié)構(gòu)上、生物學(xué)上和功能上有活性的炭疽桿菌的重組保護(hù)抗原(PA)蛋白，這些抗原在不含多糖、死細(xì)菌、培養(yǎng)基、水溶性和不溶于水的副產(chǎn)品和懸浮的雜質(zhì)的大腸桿菌DH5α細(xì)胞中表達(dá)為6X組氨酸融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用補(bǔ)料分批培養(yǎng)在大腸桿菌中制備炭疽保護(hù)抗原蛋白的方法。該方法建立了在大腸桿菌中快速、有效、有成本效益和高水平生產(chǎn)炭疽保護(hù)抗原(PA)的組成型表達(dá)系統(tǒng)。該方法的步驟涉及用含PA基因的重組組成型表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α細(xì)胞以獲得重組DH 5α細(xì)胞和通過(guò)裂解所述細(xì)胞、接著變性凝膠電泳及使用PA抗體的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)來(lái)測(cè)試PA的表達(dá)。接著發(fā)酵并收集高細(xì)胞密度的細(xì)胞。所述的細(xì)胞用6－8摩爾尿素溶解并離心分離。尿素變性的PA從上述上清液中分離、純化并此后洗脫。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1582298SQ01823922
公開日2005年2月16日 申請(qǐng)日期2001年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月5日
發(fā)明者拉凱什·巴特納格爾, S·M·瓦西德, V·喬漢 申請(qǐng)人:拉凱什·巴特納格爾