專(zhuān)利名稱(chēng)：用于野生生物鑒定的通用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型通用引物的鑒定，該引物可在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中擴(kuò)增任何動(dòng)物物種的細(xì)胞色素b基因片段并在物種和亞種水平揭示任何未知?jiǎng)游飦?lái)源的生物學(xué)材料的特性。本發(fā)明也提供了在未知來(lái)源的生物學(xué)材料中鑒定線粒體細(xì)胞色素b基因片段的方法。
背景技術(shù)：
進(jìn)化生物學(xué)中大量的研究利用從線粒體細(xì)胞色素b基因獲得的系統(tǒng)發(fā)育信息。該基因已鑒定為在分子分類(lèi)學(xué)中區(qū)別不同譜系到科、屬和種的系統(tǒng)發(fā)育深度的有效分子1-66。已在公共數(shù)據(jù)庫(kù)如GenBank、NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)等中積聚了大量關(guān)于不同動(dòng)物物種的細(xì)胞色素b基因的序列數(shù)據(jù)庫(kù)。我們已經(jīng)利用了細(xì)胞色素b基因的這一能力來(lái)確定動(dòng)物部分和產(chǎn)物的來(lái)源在科、屬和種水平的特性。所發(fā)展的技術(shù)基于一對(duì)通用引物，該引物可從大范圍的動(dòng)物物種中擴(kuò)增細(xì)胞色素b基因的一個(gè)小片段。
確定沒(méi)收的動(dòng)物部分和產(chǎn)物的特性對(duì)于執(zhí)法機(jī)構(gòu)是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，這是因?yàn)槠駷橹箾](méi)有可用的方法是足夠有效以無(wú)合理的疑問(wèn)地揭示動(dòng)物遺體的特性。對(duì)某些物種描述的形態(tài)標(biāo)記使得能夠鑒定動(dòng)物的完整標(biāo)本67。然而，調(diào)查機(jī)構(gòu)極少?zèng)]收完整的標(biāo)本，因此這些標(biāo)記在野生生物法醫(yī)學(xué)(forensics)中是不實(shí)用的。也已將生物化學(xué)性狀如膽汁特征68、blood heam分析69，70等用于野生生物法醫(yī)學(xué)中以鑒定單獨(dú)的物種。這些標(biāo)記的困難是這些標(biāo)記數(shù)目有限，且很少以其天然形式被發(fā)現(xiàn)，而且它們最初以該天然形式描述為特定物種的特征。
分子方法如基于微衛(wèi)星的鑒定71、對(duì)線粒體基因的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析或基于PCR的物種特異性STS標(biāo)記需要物種的預(yù)先信息以確定其特性72，73。這些方法也需要顯著量的DNA材料用于分析。我們?cè)诜ㄡt(yī)學(xué)中沒(méi)有關(guān)于沒(méi)收的動(dòng)物部分和產(chǎn)物的物種來(lái)源的預(yù)先信息，因此這些方法在野生生物鑒定中實(shí)際上是沒(méi)有用處且不實(shí)用的。由我們發(fā)明的技術(shù)是通用的，因此不需要任何背景信息以確定任何未知的沒(méi)收的遺體在科、屬和種水平的特性。作為基于PCR的程序，它可用痕量的任何生物學(xué)材料來(lái)應(yīng)用。因?yàn)閿U(kuò)增子的長(zhǎng)度是小的(472bp)；因此它用毀傷的遺體也可極佳地?cái)U(kuò)增，該遺體通常由犯罪調(diào)查機(jī)構(gòu)沒(méi)收。它不需要大量的遺傳材料即DNA以確定其特性，因此可探測(cè)血液產(chǎn)物中微量的摻雜。所描述的程序是簡(jiǎn)單且非常迅速的。由于該優(yōu)點(diǎn)，由我們發(fā)明的程序最適合于野生生物的法醫(yī)學(xué)鑒定。
發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是鑒定線粒體細(xì)胞色素b基因上的一個(gè)片段，該片段能夠顯著地區(qū)別不同動(dòng)物物種的各種進(jìn)化譜系。
另一個(gè)目的是鑒定線粒體細(xì)胞色素b基因上的一個(gè)片段，該片段在側(cè)面連接有在大范圍的動(dòng)物物種中高度保守的序列。
另外一個(gè)目的是探測(cè)線粒體細(xì)胞色素b基因上的一個(gè)片段，該片段在物種間是多樣的，但在物種內(nèi)是單態(tài)的。
另外一個(gè)目的是發(fā)展一種通用引物以用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增線粒體細(xì)胞色素b基因上的一個(gè)片段。
另外一個(gè)目的是發(fā)展一種對(duì)于任何未知來(lái)源的DNA模板(即所有動(dòng)物物種)都能通用地?cái)U(kuò)增的PCR規(guī)程。
另外一個(gè)目的是提供一種用公共數(shù)據(jù)庫(kù)如GenBank、NCBI等來(lái)鑒定分析材料(即從未知來(lái)源的沒(méi)收動(dòng)物中分離的DNA)的物種的通用方法。
另外一個(gè)目的是提供一種動(dòng)物鑒定的方法以無(wú)合理的疑問(wèn)地確定罪犯的罪行。
另一個(gè)目的是提供一種通用方法以確定從動(dòng)物偷獵者沒(méi)收的生物學(xué)材料如皮膚、角等的特性，如果該材料是瀕危物種的材料。
另外一個(gè)目的是為了在法院產(chǎn)生動(dòng)物捕獵和相關(guān)犯罪的分子證據(jù)的目的，提供一種確定瀕危動(dòng)物物種的沒(méi)收的動(dòng)物部分和產(chǎn)物的特性的通用方法，從而人們對(duì)野生生物資源的侵害可得到控制。
另外一個(gè)目的是提供一種通用技術(shù)以基于偷獵的動(dòng)物的單元型(由發(fā)明的通用引物鑒定的)來(lái)獲知發(fā)生野生生物犯罪的地理位置。
另一個(gè)目的是提供一種動(dòng)物鑒定的通用技術(shù)以由食品強(qiáng)化機(jī)構(gòu)為了食品強(qiáng)化的目的而在素食食品產(chǎn)物中探測(cè)動(dòng)物肉類(lèi)/產(chǎn)物的摻雜。
另外一個(gè)目的是提供一種通用技術(shù)，該技術(shù)用于探測(cè)在涉及如謀殺、強(qiáng)奸等犯罪的犯罪現(xiàn)場(chǎng)收集的血液或血液玷污等的來(lái)源，在罪犯可能習(xí)慣地在犯罪現(xiàn)場(chǎng)撒動(dòng)物血液以使犯罪調(diào)查機(jī)構(gòu)和法醫(yī)學(xué)家誤認(rèn)為是人血液時(shí)，用于確定在犯罪現(xiàn)場(chǎng)發(fā)現(xiàn)的血液的來(lái)源。
另一個(gè)目的是發(fā)明并鑒別一種通用技術(shù)，該技術(shù)可轉(zhuǎn)變?yōu)榛?a)‘分子試劑盒’和(b)‘DNA芯片’的應(yīng)用以滿足上述目的的要求。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明提供了新型的通用引物，該引物可在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中擴(kuò)增任何動(dòng)物物種的細(xì)胞色素b基因片段并揭示任何未知?jiǎng)游飦?lái)源的生物學(xué)材料的特性。
發(fā)明詳述考慮上述的目的，從公共數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)中獲得了代表各個(gè)科的221個(gè)關(guān)系較遠(yuǎn)的動(dòng)物物種(列于表1中)的細(xì)胞色素b基因的序列(1140bp)。將這些序列用軟件Clustal X(1.8)(NCBI，USA)進(jìn)行比對(duì)，并鑒定了一個(gè)基因的片段(472bp長(zhǎng)，比對(duì)顯示于表2中)，該片段具有在上述亞標(biāo)題‘發(fā)明目的’的1、2和3欄提及的所有特征。至于該片段的特性，我們認(rèn)為它包括Antilope cervicapra和Felis catus中398～869的核苷酸；然而在智人(Homo sapiens)物種中為399～870。除了在少數(shù)位置(在表2中標(biāo)記為星號(hào)(*))，該片段的核苷酸序列在動(dòng)物物種中是高度可變的，從而產(chǎn)生其單一的分子特征。這些分子特征是其物種的特征，并形成了用我們發(fā)明的程序揭示未知?jiǎng)游飦?lái)源的生物學(xué)材料的特性的基礎(chǔ)?？紤]Antilope cervicapra作為一種代表物種，因此提及了該片段的序列Antilope cervicapra的線粒體細(xì)胞色素b基因序列(398-869bp)“taccatgaggacaaatatctttttgaggagcaacagtcatcaccaatctcctttcagcaatcccatacatcggtacaaacctagtagaatgaatctgaggagggttctcagtagataaagcaacccttacccgatttttcgccttccactttatcctcccatttatcattgcagcccttaccatagtacacctactgtttctccacgaaacaggatccaacaaccccacaggaatctcatcagacgcagacaaaattccattccacccctactacactatcaaagatatcctaggagctctactattaattttaaccctcatgcttctagtcctattctcaccggacctgcttggagacccagacaactatacaccagcaaacccacttaatacacccccacatatcaagcccgaatgatacttcctatttgcatacgcaatcctccgatcaattcctaacaaactaggagg”.
設(shè)計(jì)了一對(duì)通用引物以在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中擴(kuò)增該片段。這些引物因?yàn)槠鋽U(kuò)增本發(fā)明的代表動(dòng)物物種Antilope cervicapra的線粒體細(xì)胞色素b基因在核苷酸398～869之間的區(qū)域的性質(zhì)而命名為‘mcb398’和‘mcb869’。我們之所以用該動(dòng)物物種作為代表物種，是因?yàn)楫?dāng)發(fā)明者在印度Hyderabad的Centre for Cellular andMolecular Biology研究該動(dòng)物的基因組時(shí)，他們想到要開(kāi)發(fā)這樣一種新型引物。這些引物由于其3’末端在大范圍動(dòng)物物種(在表2中顯示)中是高度保守的，所以是通用的。如上所述，由這些引物靶向的DNA片段(其序列在上面顯示)在物種間是高度多態(tài)的；然而它在相同物種的個(gè)體之間是單態(tài)的(分別為表6、7a、7b、7c、7d和8)。這些靶向的區(qū)域的獨(dú)特特征使得這些引物能夠生成單個(gè)物種的分子特征；因此，使得它們能夠區(qū)別不同物種的動(dòng)物(參見(jiàn)

圖1c)。由這些引物擴(kuò)增的片段中的變化隨兩個(gè)動(dòng)物的進(jìn)化譜系的距離的增加而增加(表8)。由本申請(qǐng)人發(fā)明的通用引物‘mcb398’和‘mcb869’擴(kuò)增的片段的獨(dú)特特征實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
因而，由我們發(fā)明的引物可生成來(lái)自未知?jiǎng)游飦?lái)源的生物學(xué)材料的分子特征，該特征實(shí)際是其科、屬和(更精確地)種的特征。當(dāng)將這些特征與已在公共數(shù)據(jù)庫(kù)(即GenBank、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)等)中可獲得的特征用BLAST軟件73進(jìn)行in-silico比較時(shí)，顯示了分析的材料的科、屬或種的特征，這反過(guò)來(lái)通過(guò)與揭示的科、屬或種的參考動(dòng)物進(jìn)行比較而在實(shí)際上得到證實(shí)，該比較是用引物“mcb398”和“mcb869”進(jìn)行分析的。分析(單詞‘分析’應(yīng)理解為為了在亞標(biāo)題‘發(fā)明目的’的1-13欄提及的目的而用逐步的程序來(lái)確定任何未知?jiǎng)游飦?lái)源的生物學(xué)遺體的特性)包含的完整步驟分別在實(shí)施例5和6中簡(jiǎn)述，以及分別闡明于圖1a、1b和1c中。
附圖和表簡(jiǎn)述圖1a.分析中包含的逐步程序的闡明。未知的生物學(xué)材料(即‘a(chǎn)dil.flesh’)指在實(shí)施例6中提及的沒(méi)收的皮膚。箭頭標(biāo)記顯示包含的逐步程序。圖1a簡(jiǎn)述如下用標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)ι飳W(xué)材料即沒(méi)收的皮膚‘a(chǎn)dil.flesh’進(jìn)行DNA分離74。將獲得的DNA用引物‘mcb398’和‘mcb869’在PCR中進(jìn)行擴(kuò)增，在2％(w/v)的瓊脂糖凝膠中分離，并用GelDocumentation System(Syngene，USA)在紫外光下進(jìn)行顯現(xiàn)和照相。在照片中顯示的泳道‘M’代表分子量標(biāo)記(Marker XIII，Boehringer mannheim)。泳道1表示用引物‘mcb398’和‘mcb869’從‘a(chǎn)dil.flesh’獲得的PCR擴(kuò)增子(472bp)。將獲得的擴(kuò)增子用“ABI Prism 3700 DNA Analyzes，PE-AppliedBiosystems”在兩鏈進(jìn)行測(cè)序。層析譜表示從‘a(chǎn)dil.flesh’獲得的序列(約80bp長(zhǎng)，即在序列(328bp)的150-230bp，從472bp長(zhǎng)的PCR產(chǎn)物中得到)。
圖1b.闡明包含于分析中的進(jìn)一步的步驟。將從‘a(chǎn)dil.flesh’中揭示的序列(328bp)在美國(guó)的國(guó)家生物學(xué)信息中心(National Centre for Biological Information)(NCBI)的nr(即非冗余的)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性搜索。產(chǎn)生顯著比對(duì)的序列與其字串值(bits score)和E值一起顯示。它顯示了在查詢的序列(即來(lái)自adil.flesh的328bp的序列)和在NCBI的nr數(shù)據(jù)庫(kù)中記錄的序列中的同源性程度。BLAST分析揭示‘a(chǎn)dil.flesh’的序列與豹(Panthera pardus)(gene bank記錄號(hào)‘AY005809’)具有最高的同源性，從而顯示adil.flesh為豹(Pantherapardus)來(lái)源的特性。圖1b進(jìn)一步闡明從參考動(dòng)物(列于表5中)中獲得的序列與從‘a(chǎn)dil.flesh’獲得的序列的多重比對(duì)?！產(chǎn)dil.flesh’的序列與‘gz1L’序列相似，進(jìn)一步證實(shí)沒(méi)收的遺體‘a(chǎn)dil.flesh’的來(lái)源為豹來(lái)源的特性。
圖1c.闡明了用CLUSTAL X(1.8)從由‘a(chǎn)dil.flesh’和列于表5的參考動(dòng)物中揭示的序列構(gòu)建的NJ-樹(shù)(鄰接樹(shù))。屬于相似物種的動(dòng)物集在一起；然而不同物種的動(dòng)物分組在不同的群中。在調(diào)查中沒(méi)收的材料(即‘a(chǎn)dil.flesh’)與‘gz1L’(即已知的正常豹Panthera pardus)集在一起，從而顯示‘a(chǎn)dil.flesh’物種為豹來(lái)源的特性。
圖2表示顯示PCR擴(kuò)增子(472bp)的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，該擴(kuò)增子用通用引物‘mcb398’和‘mcb869’從列于表5中的貓科參考動(dòng)物中獲得。不同泳道描述如下泳道1-21分別為列于表5中的動(dòng)物1-21的PCR特征。
泳道22從未知?jiǎng)游飦?lái)源即‘a(chǎn)dil.flesh’的沒(méi)收的皮膚中分離的DNA的PCR特征。
泳道23負(fù)對(duì)照(無(wú)DNA)泳道M分子量標(biāo)記(Marker X III，Boehringer mannheim)圖3.表示從列于表9中的動(dòng)物中獲得的PCR擴(kuò)增子。用于PCR的引物為‘AFF’和‘AFR’。所示的不同泳道描述如下泳道1-4分別為列于表9中的動(dòng)物1-4的PCR特征，顯示354bp長(zhǎng)的擴(kuò)增子。
泳道M分子量標(biāo)記(Marker X III，Boehringer mannheim)圖4.表示從列于表12中的動(dòng)物中獲得的PCR擴(kuò)增子。該實(shí)驗(yàn)證明我們的引物在大范圍動(dòng)物物種中的通用特性。所示的不同泳道描述如下泳道1-23分別為列于表12中的動(dòng)物1-23的PCR特征。472bp長(zhǎng)的PCR產(chǎn)物是從所有分析的動(dòng)物物種中普遍地?cái)U(kuò)增的。
泳道24負(fù)對(duì)照(無(wú)DNA)泳道M分子量標(biāo)記(Marker XIII，Boehringer mannheim)表1.用于In-silico分析以設(shè)計(jì)通用引物‘mcb398’和‘mcb869’的221個(gè)動(dòng)物物種的列表。該表也證明了‘mcb398’和‘mcb869’對(duì)于不同模板的‘P，S值’。用于該表的各種符號(hào)描述如下符號(hào)(#)指號(hào)碼符號(hào)(*)指動(dòng)物物種，該物種為保護(hù)的物種(列于Wildlife(Protection)Act，1972(Central Act NO 53 of 1972)或?yàn)闉l危/稀有的動(dòng)物物種。
符號(hào)($P，S/F)指引物‘mcb398’與不同模板(即來(lái)自不同物種來(lái)源的細(xì)胞色素b基因)匹配的概率和匹配的穩(wěn)定性。較高的P，S值指引物能以較高的概率對(duì)特定模板顯著擴(kuò)增。它是通過(guò)Amplify(1，2)軟件計(jì)算的。
符號(hào)(ψP，S/R)指引物‘mcb869’與不同模板匹配的概率和匹配的穩(wěn)定性。較高的P，S值指引物以較高的概率對(duì)特定模板顯著擴(kuò)增。它是通過(guò)Amplify(1，2)軟件計(jì)算的。
表2.列于表1中的221個(gè)動(dòng)物物種的線粒體細(xì)胞色素b基因的472bp長(zhǎng)片段(由本發(fā)明者鑒定以滿足在亞標(biāo)題‘發(fā)明目的’提及的1、2和3欄的需要)多重序列比對(duì)。比對(duì)也顯示通用引物‘mcb398’和‘mcb869’的結(jié)合位點(diǎn)。符號(hào)(*)指在列于表1中的221個(gè)動(dòng)物物種中保守的核苷酸堿基。比對(duì)是用軟件CLUSTAL X(1.8)進(jìn)行的。未標(biāo)記的核苷酸位置在分析的221個(gè)動(dòng)物物種中是可變的。這些可變位點(diǎn)一起組成了單個(gè)物種的分子特征，從而奠定由我們的引物進(jìn)行物種鑒定的基礎(chǔ)。
表3.從‘a(chǎn)dil.flesh’揭示的序列在NCBI的‘mito’數(shù)據(jù)庫(kù)中blast分析的結(jié)果。該結(jié)果顯示從沒(méi)收的皮膚片‘a(chǎn)dil.flesh’揭示的細(xì)胞色素b序列(328bp)與在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中記錄的家貓(Felis catus)細(xì)胞色素b基因序列(genbank記錄號(hào)NC_001700.1，字串值365，E值，e-101)具有最顯著的比對(duì)(字串值365，E值，e-101)。這顯示分析的材料的物種屬于貓科。這也滿足上述在亞標(biāo)題‘發(fā)明目的’中6欄提及的要求。
表4.從‘a(chǎn)dil.flesh’揭示的序列在NCBI的‘nr’數(shù)據(jù)庫(kù)中blast分析的結(jié)果。該結(jié)果顯示從沒(méi)收的皮膚片‘a(chǎn)dil.flesh’揭示的細(xì)胞色素b序列(328bp)與在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中記錄的豹細(xì)胞色素b基因序列(genebank記錄號(hào)AY005809，字串值603，E值，e-170)具有最顯著的比對(duì)。這顯示分析的材料的物種屬于豹來(lái)源。這也滿足上述在亞標(biāo)題‘發(fā)明目的’中6欄提及的要求。
表5.屬于貓科的參考動(dòng)物，選擇該參考動(dòng)物以用于與‘a(chǎn)dil.flesh’進(jìn)行比較以證實(shí)分別在表3和表4中提及的BLAST分析結(jié)果。列于SN.1-21中的動(dòng)物代表貓科的不同物種。SN.22和23是用作組外比較的靈長(zhǎng)類(lèi)物種。
表6.從‘a(chǎn)dil.flesh’中和列于表5中的參考動(dòng)物中揭示的細(xì)胞色素b序列(328bp)的多重序列比對(duì)。在研究中在所有動(dòng)物物種中具有共同核苷酸的位置用(*)標(biāo)記顯示；然而在研究中在任何動(dòng)物中有變化的位置不標(biāo)記。這些位置的核苷酸組成了單個(gè)物種的分子特征，該特征對(duì)于其物種是獨(dú)特的和高度特異性的。這些分子特征是用我們的引物‘mcb398’和‘mcb869’對(duì)單個(gè)動(dòng)物物種進(jìn)行鑒定的分子基礎(chǔ)。
表7(表7a、7b、7c和7d)。與未知?jiǎng)游飦?lái)源的沒(méi)收的皮膚‘a(chǎn)dil.flesh’一起研究的不同動(dòng)物物種分子標(biāo)記的比較。該表表明了從列于表5中的動(dòng)物中揭示的328bp片段中的可變位置(即在表6中未用星號(hào)(*)符號(hào)標(biāo)記的位置)。點(diǎn)(.)標(biāo)記代表在該位置存在與列于泳道1中(即來(lái)自‘a(chǎn)dil.flesh’的序列)相似的核苷酸。這表明每一個(gè)物種的特征是獨(dú)特的且對(duì)于該物種是特定的。‘a(chǎn)dil.flesh’的分子標(biāo)記與‘gz1L’(即已知的豹‘Pantherapardus’來(lái)源)是可比較的(除了位置37具有從‘T’到‘C’的轉(zhuǎn)換)，從而顯示沒(méi)收的皮膚‘a(chǎn)dil.flesh’為豹‘Pantherapardus’來(lái)源的特性。在已知的豹(即分別為gz1L、gz2L和gz3L)中位置153、198、223、264的核苷酸變異提示每一種動(dòng)物的地理生境。多種涉及不同動(dòng)物物種的分子進(jìn)化的研究支持該假說(shuō)75；然而，該假說(shuō)可進(jìn)一步通過(guò)從不同的地理區(qū)域獲取參考動(dòng)物并用我們的引物‘mcb398’和‘mcb869’進(jìn)行分析而證實(shí)。如果我們可以生成動(dòng)物物種的不同單元型(即生境特異性分子特征)的數(shù)據(jù)庫(kù)，則也可能使得我們的引物能夠揭示發(fā)生野生生物犯罪的地理位置。
表8.通過(guò)對(duì)比對(duì)的核苷酸序列成對(duì)地進(jìn)行比較而計(jì)算的百分比相似矩陣(在表6中闡明)。從沒(méi)收材料分離的DNA的細(xì)胞色素b基因序列與從已知的正常豹來(lái)源獲得的序列具有最大的相似性(分別與動(dòng)物‘gz2L’和‘gz3L’譜系為99.7％和98.2％)，從而顯示其為豹來(lái)源的特性。該相似矩陣已用軟件PHYLIP(3.5)進(jìn)行計(jì)算。
表9.選擇用于確定最小P，S值的動(dòng)物，從而用引物‘mcb398’和‘mcb869’對(duì)不同來(lái)源的細(xì)胞色素b基因進(jìn)行有效擴(kuò)增。顯示了這些動(dòng)物的引物‘AFF’和‘AFR’的P，S值。
表10.引物‘mcb398’在NCBI的nr數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST分析。該分析證明該引物的3’末端在大范圍的動(dòng)物物種中是高度保守的。在引物和模板(即不同動(dòng)物物種的細(xì)胞色素b基因片段)中同樣顯示了顯著的同源性，從而證實(shí)我們的引物的通用性。
表11.引物‘mcb869’在NCBI的nr數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST分析。該分析證明該引物的3’末端在大范圍的動(dòng)物物種中是高度保守的。在引物和模板(即不同動(dòng)物物種的細(xì)胞色素b基因片段)中同樣顯示了顯著的同源性，從而證實(shí)我們引物的通用性。
表12.其他屬于關(guān)系較遠(yuǎn)的動(dòng)物物種的動(dòng)物，對(duì)該動(dòng)物進(jìn)行研究以證實(shí)引物‘mcb398’和‘mcb869’的通用性。表示來(lái)自這些動(dòng)物的PCR擴(kuò)增子的凝膠照片顯示于圖4中。
線粒體細(xì)胞色素b基因已極其廣泛地應(yīng)用于分子分類(lèi)學(xué)研究中。它具有以科、屬和種特異性的方式揭示動(dòng)物的不同進(jìn)化譜系的巨大能力。它也用于根據(jù)其人口統(tǒng)計(jì)分布(demographicdistribution)來(lái)對(duì)特定的物種群體進(jìn)行分類(lèi)75。不同動(dòng)物物種的細(xì)胞色素b序列的大量數(shù)據(jù)庫(kù)已在公共數(shù)據(jù)庫(kù)如GenBank和NCBI中積聚1-65。我們已利用了細(xì)胞色素b基因的這些特征以用發(fā)明的一對(duì)新型引物‘mcb398’和‘mcb869’來(lái)確定任何未知?jiǎng)游锏臎](méi)收遺體的特性，該引物可以以通用的方式擴(kuò)增大范圍動(dòng)物物種的細(xì)胞色素b基因的小片段(472bp)。這些引物因?yàn)槠?’末端靶向于高度保守的區(qū)域而可通用。
鑒定的細(xì)胞色素b基因片段具有在亞標(biāo)題‘發(fā)明目的’下所列的1、2和3欄中提及的所有特性。我們通過(guò)比對(duì)列于表1中的221個(gè)不同的動(dòng)物物種的細(xì)胞色素b基因序列(1140bp)而鑒定了該片段。這些序列在NCBI DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中是公共可用的。這些序列是用軟件CLUSTAL X(1.8)比對(duì)的。如前所述，由我們鑒定的并且具有在亞標(biāo)題‘發(fā)明目的’下所列的1、2和3欄中提及的特性的細(xì)胞色素b基因的472bp片段包括Antilope cervicapra和家貓中398～869之間的核苷酸；然而在智人物種中為399～870。除了在少數(shù)位置(在表2中標(biāo)記為星號(hào)(*))，該片段的核苷酸序列在動(dòng)物物種中是高度可變的，從而用我們發(fā)明的程序揭示了屬于未知?jiǎng)游飦?lái)源的生物學(xué)材料的特性。至于該片段的特性，我們考慮Antilopecervicapra作為代表物種，因此在此處列出了Antilopecervicapra細(xì)胞色素b基因上述片段的序列Antilope cervicapra的線粒體細(xì)胞色素b基因序列(398-869bp)
“taccatgaggacaaatatctttttgaggagcaacagtcatcaccaatctcctttcagcaatcccatacatcggtacaaacctagtagaatgaatctgaggagggttctcagtagataaagcaacccttacccgatttttcgccttccactttatcctcccatttatcattgcagcccttaccatagtacacctactgtttctccacgaaacaggatccaacaaccccacaggaatctcatcagacgcagacaaaattccattccacccctactacactatcaaagatatcctaggagctctactattaattttaaccctcatgcttctagtcctattctcaccggacctgcttggagacccagacaactatacaccagcaaacccacttaatacacccccacatatcaagcccgaatgatacttcctatttgcatacgcaatcctccgatcaattcctaacaaactaggagg表2表示221個(gè)動(dòng)物物種細(xì)胞色素b基因的上述片段的比對(duì)。表2中的每一個(gè)物種已用單一的代碼表示，該代碼在表1中譯解。我們選擇這些物種以代表關(guān)系較遠(yuǎn)的目的大量動(dòng)物科。在221個(gè)物種中，約65個(gè)是列于Wildlife(Protection)Act，1972(CentralAct NO 53 of 1972)的保護(hù)的/瀕危的或稀有的物種。這些物種在表1中以符號(hào)(*)標(biāo)記。NCBI訪問(wèn)號(hào)指其在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的記錄號(hào)，且上標(biāo)中的數(shù)字代表引用的參考文獻(xiàn)?；?21個(gè)不同的動(dòng)物物種的細(xì)胞色素b序列的比對(duì)，引物設(shè)計(jì)如下引物名 序列(5’-3’)‘mcb398’“TACCATGAGGACAAATATCATTCTG”‘mcb869’“CCTCCTAGTTTGTTAGGGATTGATCG”表2、10和11分別證明引物的3’末端在所有in-silico分析的動(dòng)物物種中(分別為在表1中所列的總共221個(gè)動(dòng)物物種和在表10和11中所列的約500個(gè)物種)是高度保守的。同樣地，引物的5’末端在細(xì)胞色素b基因的保守區(qū)域選擇以改善引物與其目標(biāo)序列(即細(xì)胞色素b基因的上述472bp長(zhǎng)的片段)匹配的概率和穩(wěn)定性。用不同的軟件即‘Amplify(1.2)’、‘Primer3 ’(http//www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi)以及手工地對(duì)引物的內(nèi)部穩(wěn)定性、環(huán)或二聚體形成進(jìn)行了徹底的檢查。我們用軟件Amplify(1.2)對(duì)于每一個(gè)模板向引物賦予了P，S值(P＝匹配的概率，S＝匹配的穩(wěn)定性)。如果所有其他的條件(該條件在‘實(shí)施例3’中提及)都是最適的，那么較高的P和S值確保了較好的擴(kuò)增?！甿cb398’的最高值為98.63(即引物與模板良好匹配的狀態(tài))；然而‘mcb869’的最高P，S對(duì)于引物和模板間的完全匹配記錄為98，68。在物種鼴鼠(Talpa europaea)中對(duì)于‘mcb398’觀察到的最低P，S值為81，50，而‘mcb869’對(duì)于該物種具有高的P，S值(92，57)。對(duì)于兩個(gè)引物之一具有最低的P，S值的另外的物種是Eumeces egregious和Equus ainus。Eumeces egregious對(duì)于‘mcb398’和‘mcb869’分別具有P，S值86，55和73，51；然而Equus ainus對(duì)于‘mcb398’和‘mcb869’的P，S值分別計(jì)算為91，61和73，51。所有其他的動(dòng)物都具有比上述物種高的P，S值。為了確保這些引物對(duì)于來(lái)自對(duì)一個(gè)引物具有最低的P，S值的動(dòng)物的DNA模板能有效作用，我們?cè)O(shè)計(jì)了另外一個(gè)實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)足以在PCR中有效擴(kuò)增的兩個(gè)引物之一的下限。我們?cè)O(shè)計(jì)了在其退火位點(diǎn)(但不是在末端)具有更多的錯(cuò)配的另一個(gè)引物對(duì)(AFF＝5’tagtagaatgaatctgaggagg3’和AFR＝5’atgcaaataggaagtatcattc3’)，該引物對(duì)因此具有較低的內(nèi)部穩(wěn)定性和對(duì)其模板較低的P，S值(列于表9中)?！瓵FF’和‘AFR’對(duì)于Platanista gangetica和野豬(Sus scrofa)的P，S值計(jì)算為低達(dá)41和49。這些物種用引物‘AFF’和‘AFR’可有效擴(kuò)增(結(jié)果表示于圖3中)(使其他條件為標(biāo)準(zhǔn)的，即在‘實(shí)施例3’中提及的條件)。我們的引物‘mcb398’和‘mcb869’的最低的P，S值(對(duì)于物種Eumeces egregious為86，55和73，51)比‘AFF’和‘AFR’對(duì)物種野豬的組合P，S值的上述范圍(87，52和87，41)高，該野豬物種可用‘AFF’和‘AFR’有效擴(kuò)增。這顯示引物‘mcb398’和‘mcb869’對(duì)于所有物種包括Eumecesegregious都可有效作用以得到PCR中預(yù)期的產(chǎn)物。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)引物‘mcb398’和‘mcb869’能夠以通用的方式擴(kuò)增大多數(shù)動(dòng)物的細(xì)胞色素b片段。
對(duì)于我們引物的進(jìn)一步的證實(shí)，我們用BLAST軟件將我們的引物對(duì)NCBI的mito和nr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了blast分析。這些分析的結(jié)果分別在表10和11中顯示。
最后，引物的通用性是在我們實(shí)驗(yàn)室中用列于表12中的另一些動(dòng)物物種進(jìn)行檢驗(yàn)的。這些引物有效地?cái)U(kuò)增了所有動(dòng)物物種，得到了預(yù)期大小的條帶(472bp)。該結(jié)果顯示于圖4中。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了P，S分析和其他in-silico分析的結(jié)果，從而顯示引物‘mcb398’和‘mcb869’是通用引物。
用引物‘mcb398’和‘mcb869’確定未知?jiǎng)游飦?lái)源的生物學(xué)材料的物種特性的流程圖未知?jiǎng)游飦?lái)源的生物學(xué)材料↓DNA分離↓用引物‘mcb398’和‘mcb869’對(duì)分離的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增↓在三份樣品(triplicate)中對(duì)兩條鏈進(jìn)行測(cè)序(用任何標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)序程序如用ABI Prism 3700，PE-Applied Bio-systems)↓揭示的序列在NCBI的mito數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST分析(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)(這通過(guò)產(chǎn)生查詢序列與在數(shù)據(jù)庫(kù)中記錄的序列間最顯著的比對(duì)而提示分析的材料的科的信息)↓揭示的序列在NCBI的nr數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST分析(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)(這通過(guò)產(chǎn)生查詢序列與在數(shù)據(jù)庫(kù)中記錄的序列間最顯著的比對(duì)而提示分析的材料的屬或更精確的種的信息)↓選擇屬于由mito和nr BLAST搜索所揭示的科/屬/和種的參考動(dòng)物↓
從已知參考動(dòng)物的血液中分離DNA；用引物‘mcb398’和‘mcb869’進(jìn)行PCR擴(kuò)增；用相同的引物對(duì)三份樣品中的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序↓用軟件如Autoassembler(/CLUSTAL X(1.8))對(duì)已知的參考動(dòng)物和未知?jiǎng)游飦?lái)源的生物學(xué)材料的已揭示的線粒體細(xì)胞色素b基因序列進(jìn)行多重比對(duì)↓從比對(duì)的序列中鑒定與從未知?jiǎng)游飦?lái)源的生物學(xué)材料中獲得的DNA的細(xì)胞色素b基因序列同源的(或顯著相似的)序列↓該同源序列的物種就是被研究的生物學(xué)材料的物種實(shí)施例實(shí)施例1鑒定滿足在標(biāo)題‘發(fā)明概述’中亞標(biāo)題‘發(fā)明目的’中提及的1、2和3欄中的需要的細(xì)胞色素b基因片段的實(shí)施例線粒體細(xì)胞色素b分子已極其廣泛地應(yīng)用于分子分類(lèi)學(xué)研究中。作為慢速進(jìn)化的基因，它在其核苷酸序列中具有區(qū)別動(dòng)物的科、屬和種來(lái)源的巨大信息1-65。不同動(dòng)物物種的細(xì)胞色素b基因序列的大量數(shù)據(jù)庫(kù)已在NCBI的nr和mito數(shù)據(jù)庫(kù)中積聚。我們已利用了細(xì)胞色素b基因的這些性質(zhì)以確定任何未知?jiǎng)游飦?lái)源的沒(méi)收遺體的科、屬和種來(lái)源特性。為此目的，我們已鑒定了種間高度多態(tài)而在相同物種的個(gè)體中為單態(tài)的細(xì)胞色素b基因片段，因此它可將未知物種的個(gè)體與其所屬的參考物種的個(gè)體聚合成組(group)。為了從任何未知來(lái)源分離的DNA中擴(kuò)增該片段，必需的是它在側(cè)面相接有在大范圍的動(dòng)物科中高度保守的序列。為了鑒定細(xì)胞色素b基因中這種獨(dú)特的片段，我們用軟件CLUSTAL X(1.8)對(duì)代表各個(gè)科的221個(gè)關(guān)系較遠(yuǎn)的動(dòng)物物種(列于表1中)進(jìn)行了比對(duì)。這些序列是從公共數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)中獲得的。在比對(duì)的數(shù)據(jù)中，對(duì)包括于in-silico分析中的所有物種中的保守位點(diǎn)進(jìn)行了仔細(xì)的檢查。我們鑒定了滿足上述的且同樣在亞標(biāo)題‘發(fā)明目的’下所列的1、2和3欄中提及的要求的細(xì)胞色素b基因片段(472bp)。
對(duì)于該片段的特性，我們?cè)敢馓峒霸撈伟ˋntilopecervicapra和家貓中398～869之間的核苷酸；然而在智人物種中為399～870。除了在表2中標(biāo)記為星號(hào)(*)的少數(shù)位置，該片段的核苷酸序列在動(dòng)物物種中是高度可變的，從而得到其獨(dú)特的分子特征。這些分子特征是其物種的特征，并形成了由我們發(fā)明的程序揭示未知?jiǎng)游飦?lái)源的生物學(xué)材料的特性的基礎(chǔ)?？紤]Antilope cervicapra作為一種代表物種，因此提及了該片段的序列Antilope cervicapra的線粒體細(xì)胞色素b基因序列(398-869bp)“taccatgaggacaaatatctttttgaggagcaacagtcatcaccaatctcctttcagcaatcccatacatcggtacaaacctagtagaatgaatctgaggagggttctcagtagataaagcaacccttacccgatttttcgccttccactttatcctcccatttatcattgcagcccttaccatagtacacctactgtttctccacgaaacaggatccaacaaccccacaggaatctcatcagacgcagacaaaattccattccacccctactacactatcaaagatatcctaggagctctactattaattttaaccctcatgcttctagtcctattctcaccggacctgcttggagacccagacaactatacaccagcaaacccacttaatacacccccacatatcaagcccgaatgatacttcctatttgcatacgcaatcctccgatcaattcctaacaaactaggagg”實(shí)施例2開(kāi)發(fā)通用引物以擴(kuò)增在‘實(shí)施例1’中提及的片段的實(shí)施例設(shè)計(jì)了一對(duì)具有下面特征的通用引物1.它靶向鑒定的片段(在‘實(shí)施例1’中提及的)并在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增。
2.其3’和5’末端在大范圍的動(dòng)物物種中是高度保守的(在表2中標(biāo)記為星號(hào)(*))，從而確保以通用方式對(duì)上述片段的擴(kuò)增。用這些引物對(duì)擴(kuò)增的片段的測(cè)序揭示分析材料的物種的分子特征，該分子特征與已知參考動(dòng)物的序列對(duì)照揭示了被研究的未知生物學(xué)材料的物種特性。
3.兩個(gè)引物的tm(熔解溫度)幾乎是相似的(約58攝氏度)，從而確保兩個(gè)引物與其模板的顯著的退火，及因此在PCR中對(duì)靶向的區(qū)域的顯著擴(kuò)增。
4.在設(shè)計(jì)引物時(shí)確保引物的內(nèi)部穩(wěn)定性和P，S值是較高的。內(nèi)部環(huán)形成、二聚體形成等的概率也通過(guò)唯一地選擇其序列而排除。這確保引物是用于PCR以從未知?jiǎng)游飦?lái)源擴(kuò)增DNA的良好引物。
5.確保引物的3’末端具有‘G’或‘C’以增加在其3’末端強(qiáng)的結(jié)合的概率，這對(duì)于PCR中對(duì)模板的有效擴(kuò)增是必需的。這也強(qiáng)化了引物的通用性。
6.確保引物的序列為唯一的，從而它在PCR中不引起導(dǎo)致混亂的非特異性和雜質(zhì)產(chǎn)物。它改善了由我們發(fā)明的技術(shù)的效率和質(zhì)量。
7.這些引物因?yàn)槠鋽U(kuò)增本發(fā)明的代表動(dòng)物物種Antilopecervicapra的線粒體細(xì)胞色素b基因在核苷酸398～869之間的區(qū)域的性質(zhì)而命名為‘mcb398’和‘mcb869’。我們之所以用該動(dòng)物物種作為代表物種，是因?yàn)楫?dāng)發(fā)明者在印度Hyderabad的Centre forCellular and Molecular Biology研究該動(dòng)物的基因組時(shí)，他們想到要開(kāi)發(fā)這樣一種新型引物。
8.發(fā)明的通用引物的序列如下引物名 序列(5’-3’)‘mcb398’ ‘TACCATGAGGACAAATATCATTCTG”‘mcb869’ “CCTCCTAGTTTGTTAGGGATTGATCG”實(shí)施例3開(kāi)發(fā)通用PCR條件以確保PCR中任何未知來(lái)源的模板的擴(kuò)增并因此強(qiáng)化由我們發(fā)明的技術(shù)的通用性的實(shí)施例開(kāi)發(fā)的PCR條件具有下面的獨(dú)特特征1.這些條件能夠用在‘實(shí)施例2’中提及的通用引物以通用的方式擴(kuò)增任何動(dòng)物來(lái)源的DNA模板。
2.該條件是選擇來(lái)用于確保對(duì)兩個(gè)引物即‘mcb398’和‘mcb869’的可比較的退火溫度的。
3.因此標(biāo)準(zhǔn)化的PCR條件是通用的；因此由于非標(biāo)準(zhǔn)條件而導(dǎo)致對(duì)未知來(lái)源的模板的PCR失敗的概率得以排除。這確保了我們的技術(shù)在野生生物法醫(yī)學(xué)中的的通用性。
4.上述的通用條件為擴(kuò)增反應(yīng)應(yīng)該在20μl反應(yīng)體積中進(jìn)行，該體積中含有約20ng的模板DNA、100μm的每種dNTP、1.25pmol的每種引物、1.5mM的MgCl2、0.5單位的Ampli Taq Gold(Perkin-Elmer-Cetus，美國(guó))DNA聚合酶和1×PCR緩沖液(10mM Tris-HCl，pH 8.3和50mM KCl)。后面的擴(kuò)增特征應(yīng)為于95℃起始變性10分鐘，隨后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)中于95℃變性45秒，于51℃退火1分鐘并于72℃延伸2分鐘。在第35個(gè)循環(huán)中的延伸步驟應(yīng)保持10分鐘。
實(shí)施例4確定我們引物的通用性和證明我們引物同源性的實(shí)驗(yàn)證據(jù)引物‘mcb398’和‘mcb869’的通用性是通過(guò)下面的措施來(lái)保證的(a)從221個(gè)關(guān)系較遠(yuǎn)物種的動(dòng)物的比對(duì)的細(xì)胞色素b基因序列中選擇引物細(xì)胞色素b基因序列(1140bp)是用軟件CLUSTAL X(1.8)進(jìn)行比對(duì)的。將在221個(gè)動(dòng)物物種中最保守的細(xì)胞色素b基因的區(qū)域用來(lái)設(shè)計(jì)引物。
(b)在細(xì)胞色素b基因的高度保守位置選擇引物的3’和5’末端確保引物的3’和5’末端與代表大范圍動(dòng)物科的221個(gè)動(dòng)物物種的高度保守位置進(jìn)行退火。這樣做是為了確保PCR中所有物種的有效擴(kuò)增。這些位置在表2中以星號(hào)(*)標(biāo)記表示。
(c)確保在引物的3’末端為‘G’或‘C’確保引物在其3’末端有‘G’或‘C’，這是因?yàn)檫@些核苷酸由于在相互配對(duì)時(shí)有3個(gè)氫鍵而可確保在引物3’末端的強(qiáng)的結(jié)合。3’末端的強(qiáng)的結(jié)合有助于引物適當(dāng)?shù)嘏c其模板退火，從而導(dǎo)致PCR中顯著的擴(kuò)增。
(d)選擇引物序列以確保較高的內(nèi)部穩(wěn)定性、較高的P，S值并且沒(méi)有引物二聚體及環(huán)形成選擇引物序列以對(duì)大范圍動(dòng)物物種具有高的P，S值(顯示于表1)。應(yīng)注意排除可減少引物在PCR中的效率的形成環(huán)或引物二聚體的概率。
(e)選擇具有可比較的熔解溫度的引物序列選擇具有可比較的熔解溫度的引物序列，從而這些引物序列可一起在PCR中以相似的退火溫度擴(kuò)增DNA模板。兩個(gè)引物的熔解溫度為約58攝氏度，且用于PCR的退火溫度為51攝氏度。
證明引物通用性的實(shí)驗(yàn)證據(jù)(1)來(lái)自In-silico分析的證據(jù)(a)在線粒體細(xì)胞色素b基因的最保守區(qū)域中選擇引物如上所述，將引物設(shè)計(jì)為在472bp長(zhǎng)的線粒體細(xì)胞色素b基因片段的高度保守區(qū)域退火。表2表示代表大范圍動(dòng)物科的221個(gè)動(dòng)物物種的上述細(xì)胞色素b基因片段的比對(duì)。核苷酸序列的保守位置在表2中以星號(hào)(*)標(biāo)記表示。
表2也證明引物的3’末端在in-silico分析的所有動(dòng)物物種中是高度保守的。在比對(duì)的序列中，保守的核苷酸以符號(hào)(*)標(biāo)記。同樣地，在細(xì)胞色素b基因的保守區(qū)域選擇引物的5’末端以改善引物與其目標(biāo)序列(即上述的細(xì)胞色素b基因的472bp長(zhǎng)的片段)匹配的概率和穩(wěn)定性。用不同的軟件即‘Amplify(1.2)’、‘Primer3’(http//www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi)以及手工對(duì)該引物的內(nèi)部穩(wěn)定性、環(huán)或二聚體形成進(jìn)行了徹底的檢查。
(b)P，S值分析對(duì)于每一個(gè)模板，我們用軟件Amplify(1.2)給引物賦予了P，S值(P＝匹配的概率，S＝匹配的穩(wěn)定性)。如果所有其他的條件標(biāo)準(zhǔn)(在‘實(shí)施例3’中提及的)是最適的，那么較高的P和S值確保了良好的擴(kuò)增?！甿cb398’的最高分?jǐn)?shù)為98，63(即引物與模板良好匹配的狀態(tài))；然而‘mcb869’的最高P，S對(duì)于引物和模板間的完全匹配為98，68。在物種鼴鼠(Talpa europaea)中對(duì)于‘mcb398’觀察到的最低P，S值為81，50，而‘mcb869’對(duì)于該物種具有高的P，S值(92，57)。對(duì)于兩個(gè)引物之一具有最低的P，S值的另外的物種是Eumeces egregious和Equus ainus。Eumeces egregious對(duì)于‘mcb398’和‘mcb869’分別具有P，S值86，55和73，51；然而Equus ainus對(duì)于‘mcb398’和‘mcb869’的P，S值分別計(jì)算為91，61和73，51。所有其他的動(dòng)物都具有比上述物種高的P，S值。為了確保這些引物對(duì)于來(lái)自對(duì)引物中的一個(gè)具有最低的P，S值的動(dòng)物的DNA模板能有效作用，我們?cè)O(shè)計(jì)了另外一個(gè)實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)足以在PCR中有效擴(kuò)增的兩個(gè)引物之一的下限。我們?cè)O(shè)計(jì)了在其退火位點(diǎn)(但不是在末端)具有更多的錯(cuò)配的另一個(gè)引物對(duì)(AFF＝5’ctagtagaatgaatctgaggagg3’和AFR＝5’tatgcaaataggaagtatcattc3’)，該引物對(duì)因此具有較低的內(nèi)部穩(wěn)定性和對(duì)其模板較低的P，S值(列于表9中)?！瓵FF’和‘AFR’對(duì)于Platanista gangetica和野豬(Sus scrofa)的P，S值計(jì)算為低達(dá)41和49。這些物種用引物‘AFF’和‘AFR’可有效擴(kuò)增(結(jié)果表示于圖3中)(使其他條件為標(biāo)準(zhǔn)的，即在‘實(shí)施例3’中提及的條件)。我們的引物‘mcb398’和‘mcb869’的最低的P，S值(對(duì)于物種Eumecesegregious為86，55和73，51)比‘AFF’和‘AFR’對(duì)物種野豬的組合P，S值的上述范圍(87，52和87，41)高，該野豬物種可用‘AFF’和‘AFR’有效擴(kuò)增。這顯示引物‘mcb398’和‘mcb869’對(duì)于所有物種包括Eumeces egregious都可有效作用以產(chǎn)生預(yù)期的PCR產(chǎn)物。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)引物‘mcb398’和‘mcb869’能夠以通用的方式擴(kuò)增大多數(shù)動(dòng)物的細(xì)胞色素b片段。
(c)BLAST分析將引物的序列對(duì)NCBI的mito和nr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了blast分析以了解它與GenBank中記錄的序列的顯著比對(duì)。如所預(yù)期的，該序列最顯著的比對(duì)發(fā)現(xiàn)于不同動(dòng)物物種的細(xì)胞色素b基因區(qū)域(在‘實(shí)施例1’中提及的472bp長(zhǎng)的片段)。該分析也顯示引物的3’以及5’末端在大范圍動(dòng)物物種中是高度保守的，從而證明引物的通用性(分別為表10和11)。
(2)來(lái)自在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)臺(tái)工作(bench work)/實(shí)驗(yàn)的證據(jù)從屬于關(guān)系較遠(yuǎn)的物種(在表12中提及)的不同動(dòng)物中分離DNA并用我們發(fā)明的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即引物‘mcb398’和‘mcb869’。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中通過(guò)電泳分離并在紫外光下顯現(xiàn)。從所有動(dòng)物中獲得了預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物(472bp)，從而證明我們引物的通用性。結(jié)果表示于圖4中。
實(shí)施例5用引物‘mcb398’和‘mcb869’確定從未知?jiǎng)游飦?lái)源沒(méi)收的遺體的特性的實(shí)施例確定來(lái)自未知?jiǎng)游飦?lái)源的生物學(xué)材料的特性的逐步步驟討論如下未知?jiǎng)游飦?lái)源的生物學(xué)材料DNA分離↓用引物‘mcb398’和‘mcb869’對(duì)分離的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增↓在三份樣品(triplicate)中對(duì)兩條鏈進(jìn)行測(cè)序(用任何標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)序程序如用ABI Prism 3700，PE-Applied Bio-systems)↓
揭示的序列在NCBI的mito數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST分析(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)(這通過(guò)產(chǎn)生查詢序列與在數(shù)據(jù)庫(kù)中記錄的序列間最顯著的比對(duì)而提示分析材料的科的信息)↓揭示的序列在NCBI的nr數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST分析(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)(這通過(guò)產(chǎn)生查詢序列與在數(shù)據(jù)庫(kù)中記錄的序列間最顯著的比對(duì)而提示分析材料的屬或更精確的種的信息)↓選擇屬于由mito和nr BLAST搜索所揭示的科/屬/和種的參考動(dòng)物↓從已知參考動(dòng)物的血液中分離DNA；用引物‘mcb398’和‘mcb869’進(jìn)行PCR擴(kuò)增；用相同的引物對(duì)在三份樣品中的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序↓用軟件如Autoassembler/CLUSTAL X(1.8)對(duì)已知的參考動(dòng)物和未知?jiǎng)游飦?lái)源的生物學(xué)材料的線粒體細(xì)胞色素b基因的序列進(jìn)行多重比對(duì)↓從比對(duì)的序列中鑒定與從未知?jiǎng)游飦?lái)源的生物學(xué)材料中獲得的DNA的細(xì)胞色素b基因序列同源的(或顯著相似的)序列↓該同源序列的物種就是研究的生物學(xué)材料的物種↓應(yīng)用上述信息以實(shí)現(xiàn)在標(biāo)題‘發(fā)明概述’的亞標(biāo)題‘發(fā)明目的’的7-13欄提及的目的實(shí)施例6
發(fā)明的技術(shù)的實(shí)行作為初次應(yīng)用及為了證明本方法的簡(jiǎn)易和效用，我們研究了一個(gè)提交到我們實(shí)驗(yàn)室的法醫(yī)學(xué)鑒定的案例，該案例尋找關(guān)于動(dòng)物捕獵事實(shí)的科學(xué)意見(jiàn)。在該案例中，我們收到了未知?jiǎng)游锏牟糠譄沟倪z體，該遺體由犯罪調(diào)查機(jī)構(gòu)沒(méi)收。用標(biāo)準(zhǔn)方法74從上述材料中分離了DNA并用上述的引物(即‘mcb398’和‘mcb869’)進(jìn)行了PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)在20μl反應(yīng)體積中進(jìn)行，該體積中含有約20ng的模板DNA、100μm的每種dNTP、1.25pmol的每種引物、1.5mM的MgCl2、0.5單位的Ampli Taq Gold(Perkin-Elmer-Cetus，美國(guó))DNA聚合酶和1×PCR緩沖液(10mM Tris-HCl，pH 8.3和50mMKCl)。后面的擴(kuò)增特征應(yīng)為于95℃起始變性10分鐘，隨后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)中于95℃變性45秒，于51℃退火1分鐘并于72℃延伸2分鐘。在第35個(gè)循環(huán)中的延伸步驟應(yīng)保持10分鐘。
將獲得的PCR產(chǎn)物在自動(dòng)工作站(ABI Prism 3700，PE-Biosystems)上于三份樣品中對(duì)兩鏈進(jìn)行測(cè)序，并將所得的序列(328bp，表示于圖1a中)用BLAST程序?qū)CBI的mito數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blast分析73。該序列最顯著的比對(duì)(字串值365，E值e-101)是與家貓的細(xì)胞色素b基因序列產(chǎn)生的(表3)，從而顯示分析的材料的物種屬于貓科。進(jìn)一步地，將從沒(méi)收的遺體揭示的上述序列用BLAST程序?qū)CBI的nr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blast分析。該序列最顯著的比對(duì)(字串值603，E值e-170)是與豹的細(xì)胞色素b基因序列產(chǎn)生的(表4)，從而顯示分析的材料的特性為豹來(lái)源的?；谶@些信息，我們選擇了代表貓科不同種和亞種的列于表5中的參考動(dòng)物。將從參考動(dòng)物中分離的DNA用上述的引物對(duì)擴(kuò)增并在三份樣品中對(duì)兩鏈進(jìn)行測(cè)序。獲得的一致序列用程序CLUSTAL X(1.8)進(jìn)行比對(duì)(表6)。序列比較在所有分析的動(dòng)物中總共鑒定了113個(gè)可變位點(diǎn)(表7)。對(duì)序列進(jìn)行了成對(duì)的比較以找出研究的不同動(dòng)物中的變異。所有研究的物種都由其獨(dú)特的核苷酸序列來(lái)區(qū)別。將不同參考動(dòng)物的分子特征與沒(méi)收的皮膚‘a(chǎn)dil.flesh’的分子特征進(jìn)行了比較。表7證明adil.flesh與‘gz1L’即已知的豹(Panthera pardus)物種具有最大相似性，從而顯示沒(méi)收的皮膚adil.flesh的特性為豹來(lái)源的。我們也用PHYLIP軟件計(jì)算了顯示研究的動(dòng)物物種中成對(duì)的相似性的相似性矩陣。該矩陣表示于表8中。它證明屬于不同物種的動(dòng)物具有更多的變異；然而，相同物種的動(dòng)物在其細(xì)胞色素b序列中具有最大的相似性。從沒(méi)收的材料中分離的DNA的細(xì)胞色素b基因序列與從已知的豹來(lái)源獲得的序列具有最大的相似性(與‘gz1l’和‘gz2l’分別為99.7％和98.2％)；從而確定了沒(méi)收材料的來(lái)源為正常的豹(Panthera pardus)物種的特性。涉及上述分析的逐步步驟分別于圖1a、1b和1c中闡明。
因而，由我們發(fā)明的引物可從未知?jiǎng)游飦?lái)源的任何生物學(xué)材料中生成分子特征，這實(shí)際上是其科、屬和更精確的種的特征。當(dāng)用BLAST軟件將這些特征與已在公共數(shù)據(jù)庫(kù)(即GenBank、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)等)中可用的特征進(jìn)行比較時(shí)73，該特征即顯示分析的材料的科、屬或種特性，這反過(guò)來(lái)可通過(guò)與所揭示的科、屬或種的參考動(dòng)物進(jìn)行比較而證實(shí)，該比較是通過(guò)將這些動(dòng)物包括于用引物‘mcb398’和‘mcb869’的進(jìn)一步的分析中而實(shí)現(xiàn)的。所揭示的信息的應(yīng)用可滿足在標(biāo)題‘發(fā)明概述’的亞標(biāo)題‘發(fā)明目的’的7-13欄中提及的目的。
本發(fā)明的方法可用于確定沒(méi)收的動(dòng)物部分和產(chǎn)物的特性，該特性是法醫(yī)學(xué)野生生物鑒定中的關(guān)鍵要求之一。需要無(wú)合理疑問(wèn)地確定罪犯的犯罪以避免人類(lèi)對(duì)野生生物資源的破壞。對(duì)此目的已有各種形態(tài)生物化學(xué)和分子方法；然而，目前的方法無(wú)一是通用于探測(cè)未知來(lái)源的毀傷的動(dòng)物遺體的。我們已鑒定了線粒體細(xì)胞色素b基因上的一個(gè)片段，該片段具有大量信息以將各種動(dòng)物物種區(qū)別到科、屬和種來(lái)源。我們也發(fā)現(xiàn)該片段在側(cè)面相接有在大范圍的動(dòng)物物種中高度保守的序列。我們發(fā)明了一對(duì)通用引物，該引物可在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中從未知?jiǎng)游飦?lái)源的生物學(xué)材料中分離的DNA中擴(kuò)增該片段，從而揭示其物種和亞種來(lái)源特性。該新發(fā)明在改革野生生物法醫(yī)學(xué)鑒定和犯罪調(diào)查的整體方案中具有巨大的潛力。
表1.in-silico分析研究中所包含的動(dòng)物物種SN.代碼名稱(chēng) NCBI目錄號(hào)$P.S/FψP.S/R1 aep.melAepyceros melampus AF036289197.6094.622 ore.oreOreotragus oreotragusAF036288188.5294.623 add.nasAddax nasomaculatus AF034722197.6095.664 ory.damOryx damah AJ222685190.5895.665 hip.cquHippotragus equinus AF022060398.6385.556 alc.busAlcelaphus buselaphusAJ222681197.6098.687 sig.licSigmoceros lichtensteiniiAF034967497.6098.688 bca.hunBeatragus hunteriAF034968497.6094.629 dam.lunDamaliscus lunatus AF016635397.6077.5510 con.tauConnochaetes taurinusAF016638382.5693.6211 bis.bonBison bonasusYI5005590.5887.6312 bos.gruBas grunniens*AF091631490.5894.6213 bos.traBos tragocamelus*AJ222679190.5895.6614 buba.bub Bubalus bubalis*D34637797.6093.6415 bub.minBubalus mindorensis D82895897.6087.6216 tra.angTragelaphus angasii AF091633697.6087.6317 tra.curTragelaphus eurycerusAF036276190.5897.6418 ncm.cauNemorhaedus caudaius*UI7861995.6193.5919 pse.nayPseudois nayaur AF034732289.5589.5920 amm.lerAmmotragus lerviaAF034731294.5897.6321 cap.falCapra falconeri*D842021098.6395.6622 cap.ibeCapra ibex*AF034735298.6389.5823 hem.jemHemitragus jemlahicus*AF034733295.6190.6124 rup.pyrRupicapra pyrenaica AF034726295.6189.5925 rup.rupRupicapra rupicapra AF034725295.6194.6426 pan.hodPantholops hodgsoni AF034724298.6395.6627 bud.tax.taxBudorcas taxicolor taxicolor*UI7868990.5395.6628 ovi.ammOvis ammon*AF034727298.6397.6429 ovi.vigOvis vignei*AF034729298.6397.6430 cap.criCapcornis crispus*AJ3045021198.6394.6331 ovi.mosOvibos moschatus UI7862998.6392.6132 ore.ameOreamnos americanus AF1906321298.6394.6233 cep.dorCephalophus dorsalis AF09163497.5890.6134 cep.maxCephalaphus marwelliiAF0966291397.6088.5335 alc.alcAlccs alces AJ0000261495.6193.5936 hyd.ineHydropotes inermis AJ0000281497.6090.6337 mun.munMuntiacus muntjak*AF0427181390.5893.6438 cer.ele.kanCervus elaphus kansuensis*AB0210981498.6382.5939 cer.ele.kanCervus elaphus kanthopysus*AB0210971498.6382.5940 cer.ele.canCervus elaphus canadcnsis*AB0210961698.6390.6141 cer.nip.ce Cervus nippon ccmrralis AB0210941498.6390.6142 cer.nip.ye Cervus nippon ycsocnsis AB0210951498.6390.6143 cer.nip.ke Cervus nippon keramae AB0210911498.6390.61
44 cer.nip.pu Cervus nippon pulchellusAB0210901498.6390.6145 cer.nip.ni Cervus nippon nipponAB0210931498.6390.6146 cer.ela.sc Cervus elaphus scolicus AB0210991698.6390.6147 cer.damCervus dama AJ0000221498.6388.5348 ran.tarRangifer tarandus AJ0000291498.6389.5749 mos.fusMoschus fuscus*AF0268881790.5990.6150 mos.leuMoschus leucogaster*AF0268891790.5990.6151 mos.chrMoschus chrysogcster*AF0268871790.5990.6152 mos.berMoschus berctovskii*AF0268861790.5990.6153 mos.mosMoschus moschiferus*AF0268831790.5992.6154 kob.ellKobus ellipsiprymnusAF022059391.6195.6655 kob.megKobus megaceros AJ222686191.6183.5656 red.aruRedunca arundinum AF0966281391.6194.6257 red.fulRedunca fulvorufula AF036284189.5794.6258 neo.mosNeotragus moschctus AJ222683189.5794.6259 pel.capPelea copreolus AF022055391.61 90.6160 ant.cerAntilope cervicapra*AF022058382.56 93.6461 sai.catSaiga tatarica AF0644871891.6192.6162 gaz.damGacella damaAF025954391.61 92.6163 our.ourOurebia ourebi AF036288182.56 82.5964 gaz.gazGacela gacellc*AJ222682191.61 89.5765 rap.melRaphicerus melcnotisAF022053381.54 80.5066 mad.kirMadoqua kirkii AF022070390.58 97.6567 ant.ameAntilocapra americana AF091629698.63 98.6868 tra.javTragulus javanicus*D321891986.57 86.5969 tra.napTragulus napu*X562882081.52 93.5870 bal.acuBalaenoptera acutorostrata X757532189.56 97.6171 bal.bonBalaenoptera bonaerensisX755812189.56 93.5972 bal.borBalaenoptera borealis*X755822189.56 93.5973 bal.ediBalaenoptera edeni X755832189.56 88.5474 csc.robEschrichtius robustus*X755852197.61 86.5775 bal.musBalaenoptera musculus*NC_0016012297.57 93.5976 meg.novMegaptera novaeangliae*X755842197.61 94.6377 bal.phyBalaenoptera physalus*NC_0013212197.57 94.6378 cap.marCaperea marginataX755862193.55 91.5379 cep.comCephalorhynchus commersanii AF0840732485.51 88.5580 cep.cutCephalorhynchus eutropia*AF0840722485.51 92.5981 lag.oblLagenorhynchus obliquidens AF0840672494.59 92.5982 cep.hcaCephalorhynchus hcavisidii AF0840702489.56 97.6383 cep.heccephalorhynchus hectoi*AF0840712489.56 92.5984 log.ausLagenorhynchus australisAF0840692486.54 92.5985 log.cruLagenorhynchus cruciger AF0840682486.54 92.5986 log.obsLagenorhynchus obscurus AF0840662486.54 92.5987 lis.borLissodclphis borcalis AF0840642485.51 92.5988 lis.perLissodclphis peroniiAF0840652486.54 92.5989 glo.macGlobiccphala macrorhynchus AF0840552494.59 88.5590 glo.melGlobiccphala mclas AF0840522494.59 88.5591 fer.attFeresa attenuata*AF0840522494.59 92.59
92 pep.ele Peponoccphala clcctra*AF0840532494.59 88.5593 gra.gri Grampus griscus AF0840592497.61 89.5994 pse.cra Pscudorca crassidcns*AF0840572494.59 92.5995 lag.acu Lagenorhynchus acutusAF0640752498.63 89.5996 orci.bre Orcinus orca AF0840612486.57 82.5297 orca.bre Orcaella brcvirostrisAF0840632486.57 91.5498 del.cop Delphinus capcnsis AF0840872496.54 97.6399 del.tro Delphinus tropicalis AF0840882497.57 97.63100 del.del Delphinus delphisAF0840852497.57 97.63101 sten.cly Stenella clymene AF0840832497.57 97.63102 sten.coe Stenella coeruleoclbaAF0840822497.57 97.66103 tur.adu Tursiops aduncus AF0840922497.57 97.63104 sten.fro Stenella frontalis AF0840902497.57 97.63105 saus.chi Sousa chinensis AF0840802497.57 88.59106 sten.lon Stenella longirostrisAF0841032497.61 97.63107 turs.tru Tursiops truncatus AF0840952497.57 96.59108 lage.alb Lagenorhynchus alborostris AF0840742497.61 97.66109 sten.bre Steno bredanensisAF0840772497.61 94.64110 sota.flu Sotalia fluviatilis AF3040672597.61 97.63111 del.leu Delphinapterus leucasU720372697.61 95.66112 mono.mon Monodon monocerosU720382697.61 95.66113 plat.gan Platanista gangetica*AF3040702597.61 86.59114 plat.min Platanista minor*X925432797.61 86.59115 kogi.bre Kogia breviceps U720402697.59 90.63116 kogi.sim Kogia simus AF3040722396.55 92.63117 phys.cat Physeter catodon AF3040732597.57 80.58118 lipo.vex Lipotes vexillifer*AF3040712589.56 88.53119 phoc.sin phocoena sinus AF0840512487.49 92.62120 bera.bai Berardius bairdiiX925412796.55 90.59121 ziph.car Ziphius cavirostris X925402797.61 89.57122 meso.eur Mesoplodon europaeus X925372797.57 90.61123 meso.bid Mesoplodon bidensX925382797.61 92.61124 meso.den Mesoplodon densirostris X925362791.61 94.63125 hype.amp Hyperoodon ampullatus*X925392797.61 90.65126 meso.per Mesoplodon peruvianusAF3040742997.61 86.58127 pont.bla Pontoporic blainvillei AF3040692592.59 88.55128 hipp.amp Hippopotomus amphibius Y088132992.58 95.66129 hex.lib Hexaprotodon libericnsis Y088142998.63 97.66130 rhin.son Rhioceros sondaicus*AJ2457253090.59 87.61131 cera Ceratatherium simum NC_00180S3290.59 90.63132 dic.sum Dicerorhinus sumutrcnsis AJ2457233090.59 86.57133 equu Equus asinus NC_0017883191.61 73.51134 baby.bob Babyrousa babyrussa Z501063399.56 85.56135 phac.afr Phacochocrus ofriconus Z500901190.59 87.54136 sus.scr.cwSus scrofa haplorypc εWBj*AF1365493497.57 83.54137 sus.bar Sus barbatus Z501073197.57 85.55138 lama.gla Lama glama U064293189.55 85.53139 lama.gua lama guanicoeY088122488.54 86.57
140 vic.vic Vicugna vicugna U064303389.55 85.53141 cam.boc Camelus bactrianus U064273394.58 86.58142 arc.for Arctocephalus forsteri X822933497.60 87.64 144 cum.jub Eumatopics jubatus X823113497.57 86.57145 zal.cal Zolophus californianus X823103489.55 86.57146 odo.ros Odobenus rosmorusX822993691.61 81.52147 pho.vit Phoca vitulina X823063690.58 87.64148 pho.fasciaPhoca fascicta X823023698.63 95.66149 pho.gro Phoca groenlandica X823033692.59 90.61150 cys.cri Cystophora cristata X822943689.56 87.64151 hyd.lep Hydrurga leptonyxX822973689.55 82.54152 lep.wed Leptonychotes weddelli X720053798.63 91.66153 mir.leo Mirounga leonina X822983689.55 82.59154 cri.bar Erignathus barbasus X822953689.56 87.63155 mon.sch Monachus schauinslandi X722093791.61 87.60156 hela.mal Helarcros malayanus*U188993884.54 90.63157 sel.thi Selenarctos thibetanus*AB0209103989.57 87.64158 ail.ful Ailurus fulgen*sX949194093.55 87.64159 fel Felis carus NC_0017004185.56 90.63160 can Canis familiaris NC_0020084298.58 84.54161 tal Talpa europaea NC_0023914381.50 92.57162 gla.sab Glaucomys sabrinus AF0117384490.59 82.54163 gla.vol Glaucomys volans AB0302614590.59 87.60164 hyl.pha Hylopetes phayrei*AB0302594591.61 81.50165 pet.set Petinomys setosus*AB0302604591.61 81.50166 bel.pea Belomys pearsonii*AB0302624591.61 87.64167 pte.mom Pteromys momonga*AB0302634597.61 90.63168 gala.demi Galagoides demidoff AF2714114697.58 87.64169 pero.pot Perodicticus potto AF2714134697.60 87.63170 gala.mat Galago matschiei AF2714094697.60 90.61171 gala.moh Galago monoliAF2714104697.57 95.66172 oto.gar Otolemur garnettii AF2714124492.58 87.60173 lor.tar Loris tardigradus*U535814797.60 93.59174 nyc.cou Nycticebus caucang*U535804797.60 95.66175 mus Mus musculus NC_0015694897.60 86.59176 gorr Gorilla gorilla NC_0016454989.57 80.58177 homo Homo sapiens sapiens NC_0018075096.55 84.64178 dug.dug Dugong dugong*U075645197.60 89.59179 ele.max Elephas maximus*AB0024125297.60 76.57180 afr.con Afropavo congcnsis AF0137605397.58 87.63181 pavo.mui Pavo muticus*AF0137635397.57 87.63182 tra.bly Tragopan blythii*AF2007225489.55 85.57183 tra.sat Tragopan satyra*AF2298375489.55 86.61184 tra.cob Tragopan coboti AF2007235489.55 86.61185 tra.tcm Tragopon icmmunchii*AF0288025589.55 81.56186 arg.arg Argusianus argas AF0137615589.55 87.63187 cat.wal Catrcus wallichi*AF0287925588.54 85.57
188 cro.croCrossoptilon crossoptilon*AF0287945389.55 85.57189 sym.reeSyrmaticus reevesi*AF0288015389.55 85.57190 bam.thoBambusicola thoracica*AF0287905380.48 94.64191 fra.fraFraneolinus francolinus AF0137625397.5886.61192 ith.crufthaginis cruentus*AF0681935398.63 85.57193 ant.parAnthropoides paradisca U275575685.56 82.58194 ant.virAnthropoides virgo U275455684.54 82.52195 gru.ant.an Grus antigone antigone U110605790.53 87.63196 gru.ant.gi Grus antigone gillae U110645790.58 87.63197 gru.any.sh Grus antigone sharpeiU110615790.58 87.63198 gru.leuGrus leucogeranus*U275495690.58 87.63199 gru.can.pr Grus canadensis pratensisU275535697.60 87.63200 gru.can.ro Grus canadensis rowani U275525697.60 87.63201 gru.can.ta Grus canadensis tabida U275515698.63 87.63202 gru.can.ca Grus canadensis cancdensis U275545697.61 87.63203 gru.ameGrus americana U275555690.58 87.63204 gru.gruGrus grusU275465689.54 87.63205 gru.monGrus monacha*U275485690.58 87.63206 gru.nigGrus nigricollis*U275475690.58 87.63207 gru.japGrus japonensis U275505681.54 87.63208 cic.boyCiconia boyciana*NC_0021965894.58 79.60209 rhe.ameRhea americana AF0903395993.63 79.60210 ant.albAnthracoceros albirostris*U891906097.61 86.59211 fal.famFalco femoralis U833106197.61 86.60212 fal.verFalca verpertinusU833116197.61 85.57213 fal.parFalco peregrinus*U833076197.61 84.52214 fal.spaFalco sparverius U833066192.59 80.51215 ayt.ameAythya americana NC_0008776298.63 94.62216 smi.shaSmithornis sharpei NC_0008795997.58 90.61217 vid.chaVidua chalybeata NC_0008805997.60 87.64218 chry.pic Chrysemys picta NC_0020736389.56 86.57219 emy.orb.ku Emys orbicularis AJ1314256490.59 94.63220 che.mudChelonia mydas*AB0121046590.58 94.63221 eum.egrEumeces egregius AB0166066586.55 73.51
表2.221個(gè)動(dòng)物物種的線粒體細(xì)胞色素b基因的472bp片段的多重序列比對(duì)






























比對(duì)



DatabaseSequences from complete micochondrial genomesPosted dateJun 28，2000 1056 AMNumber of letters in database3,264,247Number of sequences in database129Lambda KH1.370.7111.31GappedLambda KH1.370.7111.31Matrixblastn matrix1 -3Gap PenaltiesExistence5，Extension2Number of Hits to DS766Number of Sequences129Number of extensions788Number of successful exteasions168Number of sequences hetter than 10.077length of query328length of database3,164,247effective HSP length15effective length of query313effective lengch of database3,162,312effective search space989803656effective search space used989603656T0A30X16(11.9 bits)X215(29.7 bits)S112(24.3 bits)S214(28.2 bits)
表4
比對(duì)




DatabasentPosted dateMar 2，2001 1220 AMNumber of letters in database2,863,827,885Number of sequences in database807,597LambdaK H1.37 0.711 1.31GappedLambdaK H1.37 0.711 1.31Matrixblastn matrix1 -3Gap PenaltiesExistence5.Extension2Number of Hits to DB460542Number of Sequences807597Number of extensions460542Number of successful extensions22671Number of sequences better than 10.06487length of query328length of database2,863,827,885effective HSP length20effective length of query308effective length of dacabase2,847,675,945effective search space877084191060effective search space used877084191060T0A30X16(11.9 bits)X215(29.7 bits)S112(24.3 bits)S219(38.2 bits)
表5.研究中包含的參考動(dòng)物和所分配的代碼SN.代碼 動(dòng)物名稱(chēng) 動(dòng)物學(xué)名稱(chēng)1 bhz25t Indian tiger Panthera tigris tigris2 bhz26t Indian tiger Panthera tigris tigris3 bhz30t Indian tiger Panthera tigris tigris4 bhz45t Indian tiger Panthera tigris tigris5 bhz56t Indian tiger Panthera tigris tigris6 bhz63t Indian tiger Panthera tigris tigris7 bhz20wt Indian white tigerPanrhera tigris bengalensis8 bhz22wt Indian white tigerPanthera tigris bengalensis9 bhz23wt Indian white tigerPanthera tigris bengalensis10 bhz28wt Indian white tigerPanthera tigris bengalensis11 gz11Normal leopardPanthera pardus12 gz21Normal leopardPanthera pardus13 gz31Normal leopardPanthera pardus14 gz21cl Clouded leopard Neofelis nebulosa15 gz22cl Clouded lecpard Neofelis nebulosa16 darz14slSnow leopard Panthera unicia17 darz15slSnow leopard Panthera unicia18 darz16slSnow leopard Panthera unicia19 sbz22al Asiatic lion Panthera leo persica20 sbz38al Asiatic lion Panthera leo persica21 sbz39al Asialic lion Panthera leo persica22 humsk Human Homo sapiens sapiens23 chimss ChimpanzeePan sp.
表6.參考動(dòng)物的細(xì)胞色素b序列與從沒(méi)收的動(dòng)物遺體獲得的序列的多重序列比對(duì)


表7a
表7b
表7c
表7d
表8.來(lái)自“adil.flesh”和不同貓科動(dòng)物的細(xì)胞色素b基因序列的成對(duì)比較而計(jì)算得到的相似性百分比矩陣
表10

表9.為證實(shí)在PCR中有效擴(kuò)增DNA模板的最小P’S值而選擇的動(dòng)物SL. 名稱(chēng) P.S/AFFP.S/AFR1 Indian black buck(Antilope cervicapra) 97.58 96.542 Sheep(Ovis 87.53 96.543 Pig(Sus scrofa) 87.52 87.414 Fresh water dolphin(Platanista gangetica)86.49 82.47







比對(duì)






DatabasentPosted dateMar 2，2001 1220 AMNumber of letters in database2,863,827,885Number of sequences in database807,597Lambda K H1.37 0.711 1.31GappedLambda K H1.37 0.711 1.31Matrixblastn matrix1 -3Gap PenaltiesExistence5，Extension2Number of Hits to DB39355Number of Sequences807597Number of extensions39355Number of successful extensions15066Number of sequences better than 10.05706length of query25length of database2,863,827,885effective HSP length17effective length of query8effective length of database2,850,098,736effective search space22800789888effective search space used22800789888T0A30X16(11.9 bits)X215(29.7 bits)S112(24.3 bits)S216(32.2 bits)
表11.引物“mcb869”在NCBI的nr數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST分析。證明了該引物的3’末端在大范圍的動(dòng)物物種中是高度保守的。也顯示了引物和模板(即不同動(dòng)物物種的細(xì)胞色素b基因片段)的顯著同源性，從而確證了我們的引物的通用性。








比對(duì)






Lambda K H1.37 0.711 1.31GappedLambda K H1.37 0.711 1.31Matrixblastn matriix1 -3Gap PenaltiesExistence5，Extension2Number of Hits to DB19068Number of Sequences807597Number of extensions19068Number of successful extensions7580Number of sequences better than 10.02441length of query26length of database2,863,827,885effective HSP length17effective 1ength of query9effective 1ength of database2,850,098,736effective search space25650888624effeccive search space used25650688624T0A30X16(11.9 bits)X215(29.7 bits)S112(24.3 bits)S216(32.2 bits)
表12.用我們的引物分析以證實(shí)其通用性的關(guān)系較遠(yuǎn)的其它動(dòng)物SN.動(dòng)物名稱(chēng)1. Indian black buck no.12. Indian black buck no 23 sheep4 pig5 dog6 chimpanzee(chimss)7 human(humsk)8 Hamster9 crocodile nol10 crocodile no211 turtle nol12 turtle no213 mouse14 varanus15 Naga-aags snake16 Indian elepbant17 hen18 dugong19 lizard20 weaver bird nol21 weaver bird no222 buffalo no 123 buffalo no 權(quán)利要求
1.命名為‘mcb398’和‘mcb869’的通用引物，該引物能夠在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中擴(kuò)增任何動(dòng)物物種的細(xì)胞色素b基因的片段，并在物種和亞種水平上揭示未知來(lái)源的任何動(dòng)物的生物學(xué)材料的特性，該引物具有序列引物名 序列(5’-3’)mcb 398 “TACCATGAGGACAAATATCATTCTG”mcb 869 “CCTCCTAGTTTGTTAGGGATTGATCG
2.如在權(quán)利要求1中所述的引物，其中線粒體細(xì)胞色素b基因的片段能夠顯著地區(qū)別不同動(dòng)物物種的各種進(jìn)化譜系。
3.如在權(quán)利要求1中所述的引物，其中線粒體細(xì)胞色素b基因的片段在側(cè)面相接有在大范圍的動(dòng)物物種中高度保守的序列。
4.如在權(quán)利要求1中所述的引物，其中線粒體細(xì)胞色素b基因的片段在物種間是多態(tài)的，但在物種內(nèi)是單態(tài)的。
5.如在權(quán)利要求1中所述的引物，其中在Antilopecervicapra物種中，權(quán)利要求1中提及的片段的序列如下Antilope cervicapra的線粒體細(xì)胞色素b基因序列(398-869bp)“taccatgaggacaaatatctttttgaggagcaacagtcatcaccaatctcctttcagcaatcccatacatcggtacaaacctagtagaatgaatctgaggagggttctcagtagataaagcaacccttacccgatttttcgccttccactttatcctcccatttatcattgcagcccttaccatagtacacctactgtttctccacgaaacaggatccaacaaccccacaggaatctcatcagacgcagacaaaattccattccacccctactacactatcaaagatatcctaggagctctactattaattttaaccctcatgcttctagtcctattctcaccggacctgcttggagacccagacaactatacaccagcaaacccacttaatacacccccacatatcaagcccgaatgatacttcctatttgcatacgcaatcctccgatcaattcctaacaaactaggagg”
6.一種從生物學(xué)樣品中鑒定動(dòng)物的方法，該方法包含步驟(a)用在權(quán)利要求1中所述的引物從要檢驗(yàn)的生物學(xué)樣品中分離并擴(kuò)增DNA，(b)對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，(c)用BLAST程序?qū)⒃诓襟E(b)中得到的序列對(duì)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的mito數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blast分析，并確定生物學(xué)樣品動(dòng)物來(lái)源的最可能的科，(d)用BLAST程序?qū)⒃诓襟E(b)中得到的序列對(duì)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的非冗余(nr)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blast分析，并確定生物學(xué)樣品動(dòng)物來(lái)源的最可能的屬、種或更精確的亞種，(e)鑒定得到的序列與分別在步驟(c)和(d)中鑒定的動(dòng)物的細(xì)胞色素b基因序列最顯著的比對(duì)，并選擇這些動(dòng)物作為進(jìn)一步分析的‘參考動(dòng)物’，(f)用如在權(quán)利要求1中所述的引物在三份樣品中在兩鏈上分離、擴(kuò)增來(lái)自參考動(dòng)物的DNA序列并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，(g)用CLUSTRAL程序比對(duì)所得的序列，并在分析的動(dòng)物中鑒定可變位點(diǎn)，(h)成對(duì)地比較核苷酸序列以確定分析的動(dòng)物中的變異，并將與生物樣品的DNA序列具有最大相似性的核苷酸序列鑒定為生物樣品的動(dòng)物來(lái)源。
7.一種如在權(quán)利要求6中所述的方法，其中通用的PCR規(guī)程能用任何未知?jiǎng)游飦?lái)源的DNA模板和在4欄提及的通用引物通用地進(jìn)行。
8.一種如在權(quán)利要求6中所述的方法，其中擴(kuò)增反應(yīng)在20μl反應(yīng)體積中進(jìn)行，該體積中含有約20ng的模板DNA、100μm的每種dNTP、1.25pmol的每種引物、1.5mM的MgCl2、0.5單位的Ampli Taq Gold(Perkin-Elmer-Cetus，美國(guó))DNA聚合酶和1×PCR緩沖液(10mM Tris-HCl，pH 8.3和50mM KCl)，后面的擴(kuò)增特征應(yīng)為于95℃起始變性10分鐘，隨后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)中于95℃變性45秒，于51℃退火1分鐘并于72℃延伸2分鐘，在第35個(gè)循環(huán)中的延伸步驟應(yīng)保持10分鐘。
9.一種如在權(quán)利要求6中所述的方法，其中該方法使得能夠用公共數(shù)據(jù)庫(kù)如GenBank、NCBI等鑒定分析材料(即從未知來(lái)源的沒(méi)收動(dòng)物遺體中分離的DNA)的物種。
10.一種如在權(quán)利要求6中所述的方法，其中該方法用于動(dòng)物鑒定從而能夠無(wú)合理的疑問(wèn)地確定罪犯的犯罪。
11.一種如在權(quán)利要求6中所述的方法，其中該方法用于確定從動(dòng)物偷獵者沒(méi)收的生物學(xué)材料如皮膚、角等的特性，如果該動(dòng)物是瀕危物種。
12.一種如在權(quán)利要求6中所述的方法，其中該方法用于為了在法院產(chǎn)生動(dòng)物捕獵和相關(guān)犯罪的分子證據(jù)的目的，確定瀕危動(dòng)物物種的沒(méi)收的動(dòng)物部分和產(chǎn)物的特性，從而控制人們對(duì)野生生物資源的侵害。
13.一種如在權(quán)利要求6中所述的方法，其中該方法基于由發(fā)明的通用引物鑒定的偷獵動(dòng)物的細(xì)胞色素b基因的單元型來(lái)獲知發(fā)生野生生物犯罪的地理位置。
14.一種如在權(quán)利要求6中所述的方法，其中該方法用于動(dòng)物鑒定以由食品強(qiáng)化機(jī)構(gòu)為了食品強(qiáng)化的目的而在食品產(chǎn)物中探測(cè)動(dòng)物肉類(lèi)的摻雜。
15.一種如在權(quán)利要求6中所述的方法，其中該方法用于提供一種探測(cè)在涉及如謀殺、強(qiáng)奸等犯罪的犯罪現(xiàn)場(chǎng)收集的血液或血液玷污等的來(lái)源的通用技術(shù)，在罪犯可能習(xí)慣地在犯罪現(xiàn)場(chǎng)撒動(dòng)物血液以使犯罪調(diào)查機(jī)構(gòu)和法醫(yī)學(xué)家誤認(rèn)為血液時(shí)，用于確定在犯罪現(xiàn)場(chǎng)發(fā)現(xiàn)的血液的來(lái)源。
16.一種如在權(quán)利要求6中所述的方法，其中使用該方法以將其轉(zhuǎn)變?yōu)榛?a)商業(yè)的‘分子試劑盒’和(b)‘DNA芯片’的應(yīng)用，從而在法醫(yī)學(xué)中鑒定野生生物。
全文摘要
本發(fā)明提供了可在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中擴(kuò)增任何動(dòng)物物種的細(xì)胞色素b基因并揭示任何未知?jiǎng)游飦?lái)源的生物學(xué)材料的特性的新型通用引物，以及一種從給定的生物學(xué)樣品鑒定特定動(dòng)物的方法。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1505684SQ01823181
公開(kāi)日2004年6月16日 申請(qǐng)日期2001年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月28日
發(fā)明者S·K·維爾馬, L·辛格, S K 維爾馬 申請(qǐng)人:科學(xué)與工業(yè)研究會(huì)