專利名稱：生產(chǎn)人膠原的轉(zhuǎn)化蠶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)發(fā)明涉及到生產(chǎn)重組人膠原的轉(zhuǎn)化蠶。更詳細(xì)地講本申請(qǐng)發(fā)明是涉及到生產(chǎn)重組人膠原的轉(zhuǎn)化蠶和用于制作該轉(zhuǎn)化蠶的重組載體、以及重組人膠原的制造方法的發(fā)明。
背景技術(shù)：
膠原是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的代表性蛋白質(zhì)，除了具有所謂維持成為細(xì)胞的立足點(diǎn)的生物體結(jié)構(gòu)的機(jī)械上功能以外，還具有調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、移動(dòng)等各種各樣的生理功能。因此膠原作為用于修復(fù)生物體損傷的生物材料(J.Surg.Res.10485-491，1970)、以及作為用于使某種藥劑緩慢釋放的載體(J.Controlled Release 33307-315，1995)被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域。然而，現(xiàn)在使用的大部分膠原都是來(lái)自牛和豬等動(dòng)物組織的膠原，將這些膠原移植到人，大約在3％的患者中會(huì)發(fā)生過(guò)敏反應(yīng) (J.Immunol.136877-882，1986；Biomaterials 11176-180，1990)。另外在來(lái)自動(dòng)物組織的膠原中混入病毒和朊病毒等病原體的危險(xiǎn)性成了近年來(lái)的大問(wèn)題。因此期待著生產(chǎn)無(wú)抗原性、以及沒(méi)有病原體混入危險(xiǎn)性的重組人膠原的系統(tǒng)。于是，本申請(qǐng)的發(fā)明人發(fā)明了通過(guò)使插入了編碼人膠原的cDNA的重組病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，制造具有與人體內(nèi)膠原同樣三股螺旋結(jié)構(gòu)的重組人膠原的方法，申請(qǐng)了專利(特開(kāi)平8-23979號(hào)公報(bào))。另外利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞或酵母制造人膠原的方法也已設(shè)想出來(lái)(特表平7-501937公報(bào))。
象上述那樣，作為生產(chǎn)重組人膠原的方法，雖然想出了利用昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母的方法等，但如果利用昆蟲(chóng)細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法使產(chǎn)量提高到在醫(yī)療領(lǐng)域能夠利用的那樣高的產(chǎn)量比較難。而利用酵母的方法由于重組產(chǎn)物產(chǎn)生在菌體內(nèi)，重組人膠原的純化未必容易。
本申請(qǐng)發(fā)明是鑒于上述那樣的問(wèn)題做成的發(fā)明，將消除了以往技術(shù)上的問(wèn)題，提供具備高產(chǎn)率和純化容易的重組人膠原生產(chǎn)方法以及用于該方法的基因工程材料作為課題。

發(fā)明內(nèi)容
本申請(qǐng)的第1個(gè)發(fā)明是基因組DNA內(nèi)含有編碼人膠原的多核苷酸，作為蠶繭或絲腺內(nèi)蛋白質(zhì)的一部分生產(chǎn)重組人膠原的轉(zhuǎn)化蠶。
本申請(qǐng)的第2個(gè)發(fā)明是基因組DNA內(nèi)含有編碼人膠原和蠶絲蛋白的融合蛋白的多核苷酸，作為蠶繭或絲腺內(nèi)蛋白質(zhì)的一部分生產(chǎn)上述融合蛋白的轉(zhuǎn)化蠶。
在第1發(fā)明以及第2發(fā)明的轉(zhuǎn)化蠶中包括蠶成蟲(chóng)、幼蟲(chóng)、蛹和卵。
在第1發(fā)明以及第2發(fā)明的轉(zhuǎn)化蠶中最好的狀態(tài)是在基因組DNA內(nèi)含有編碼脯氨酸羥化酶α亞基和β亞基中至少一方的多核苷酸。
本申請(qǐng)的第3個(gè)發(fā)明是重組人膠原的制造方法，其特征是從上述第1發(fā)明的轉(zhuǎn)化蠶的繭或絲腺分離、純化重組人膠原。
本申請(qǐng)的第4個(gè)發(fā)明是重組人膠原的制造方法，其特征是從上述第2發(fā)明的轉(zhuǎn)化蠶的繭或絲腺分離重組人膠原和蠶絲蛋白的融合蛋白，然后從該融合蛋白中分離、純化重組人膠原。
本申請(qǐng)的第5發(fā)明是上述第2發(fā)明的轉(zhuǎn)化蠶生產(chǎn)的重組人膠原和蠶絲蛋白的融合蛋白。
本申請(qǐng)的第6發(fā)明是來(lái)自Autographa californica核多角體病毒的尋靶載體，該載體用于將編碼人膠原的多核苷酸與蠶基因組的任意區(qū)域進(jìn)行同源重組，做成生產(chǎn)人膠原的轉(zhuǎn)化蠶。而在本申請(qǐng)的發(fā)明中，所謂「編碼人膠原的多核苷酸」是表達(dá)膠原的人核酸分子，是人基因組DNA、由基因組DNA轉(zhuǎn)錄的mRNA、由mRNA合成的cDNA等。
第6發(fā)明的尋靶載體的一種模式是在編碼人膠原的多核苷酸的兩端具有與編碼蠶絲蛋白的基因組DNA(蠶絲蛋白基因)的任意區(qū)域相同的DNA序列。該尋靶載體將編碼人膠原的多核苷酸同源重組在蠶基因組的蠶絲蛋白基因(即內(nèi)源性的)的表達(dá)調(diào)控序列(啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列)的下游。
第6發(fā)明的尋靶載體的另一種模式是在人膠原表達(dá)盒的兩端具有與蠶基因組DNA的任意區(qū)域相同的DNA序列。該尋靶載體將人膠原表達(dá)盒同源重組在蠶基因組的任意區(qū)域。而所謂的「表達(dá)盒」意思是在蠶絲蛋白基因的表達(dá)調(diào)控序列的支配下連接了編碼人膠原的多核苷酸的融合多核苷酸。
本申請(qǐng)的第7發(fā)明是用于將編碼脯氨酸羥化酶α亞基和β亞基中至少一種的多核苷酸與蠶基因組的任意區(qū)域進(jìn)行同源重組的來(lái)自Autographa californica核多角體病毒的尋靶載體。
本申請(qǐng)的第8發(fā)明是在夾在一對(duì)來(lái)自昆蟲(chóng)DNA型轉(zhuǎn)座子的反向重復(fù)序列之間區(qū)域內(nèi)含有人膠原表達(dá)盒的重組質(zhì)粒載體。
本申請(qǐng)的第9發(fā)明是在夾在一對(duì)來(lái)自昆蟲(chóng)DNA型轉(zhuǎn)座子的反向重復(fù)序列之間區(qū)域內(nèi)含有編碼脯氨酸羥化酶α亞基和β亞基中至少一種的多核苷酸的重組質(zhì)粒載體。
本申請(qǐng)的第10發(fā)明是由上述第8發(fā)明的重組質(zhì)粒載體和具有編碼轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座酶的多核苷酸的重組質(zhì)粒載體構(gòu)成的載體盒。通過(guò)該載體盒的使用，該人膠原表達(dá)盒被轉(zhuǎn)移到蠶基因組，做成生產(chǎn)人膠原的轉(zhuǎn)化蠶。
本申請(qǐng)的第11發(fā)明是由上述第9發(fā)明的重組質(zhì)粒載體和和具有編碼轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座酶的多核苷酸的重組質(zhì)粒載體構(gòu)成的載體盒。通過(guò)使用該第11發(fā)明的載體盒和上述第10發(fā)明的載體盒做成生產(chǎn)脯氨酸被羥化的人膠原的轉(zhuǎn)化蠶。
本申請(qǐng)的第12發(fā)明是編碼具有序列2氨基酸序列的蠶脯氨酸羥化酶α亞基的多核苷酸，具體來(lái)說(shuō)是具有序列1堿基序列的DNA片段。
另外在本申請(qǐng)的各個(gè)發(fā)明中，編碼脯氨酸羥化酶α亞基的多核苷酸優(yōu)選的形式至少是具有序列1堿基序列的DNA片段的編碼區(qū)。另外作為人膠原表達(dá)盒的最好形式是在蠶絲蛋白基因的表達(dá)調(diào)控序列的支配下連接了編碼人膠原的多核苷酸的融合多核苷酸，或者是在蠶絲蛋白基因的表達(dá)調(diào)控序列的支配下連接了編碼蠶絲蛋白的多核苷酸和編碼人膠原的多核苷酸的融合多核苷酸。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1是轉(zhuǎn)移載體pMOSRA-1的限制酶譜。
圖2是整合在piggyBac質(zhì)粒載體中的小膠原基因(pMOSRA-4B、pMOSRA-5、pMOSRA-6)的限制酶譜。
圖3是表示以從陽(yáng)性F1蠶成蟲(chóng)提取的基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。1和2代表陽(yáng)性蠶的號(hào)碼。泳道M是100bp梯形標(biāo)記(ladder maker)。
圖4是表示用從陽(yáng)性F1蠶5齡幼蟲(chóng)提取的RNA進(jìn)行RT-PCR，其擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。泳道1和2中陽(yáng)性蠶的RT-PCR產(chǎn)物電泳，泳道C中野生型蠶的RT-PCR產(chǎn)物電泳。泳道M是100bp梯形標(biāo)記。
具體實(shí)施例方式
到目前為止已知膠原中存在著從I型至XIX型的19種不同類(lèi)型的膠原。這些膠原無(wú)論哪一種都是由3個(gè)亞基(α鏈)形成的三聚體分子，其特征是在該分子內(nèi)具有3股螺旋結(jié)構(gòu)。膠原中，首先合成作為前體的前膠原后，然后轉(zhuǎn)換成成熟型膠原分子。例如I、II、III型膠原等纖維性膠原都是首先合成在作為本體的3股螺旋區(qū)域的氨基末端以及羧基末端具有非3股螺旋結(jié)構(gòu)的氨基前肽和羧基前肽的前膠原，然后兩個(gè)前肽經(jīng)特異的蛋白水解酶切斷后成為成熟的膠原。另外膠原在其合成過(guò)程中，要受到包括脯氨酸的羥化、賴氨酸的羥化、賴氨酸以及羥化賴氨酸的氧化(醛化)等各種各樣的翻譯后修飾。特別是通過(guò)脯氨酸羥化酶進(jìn)行的脯氨酸的羥化對(duì)于膠原獲得生理溫度的穩(wěn)定性上非常重要。
作為本申請(qǐng)發(fā)明對(duì)象的人膠原是包括從I型至XIX型膠原的所有膠原，也包括這些膠原的部分氨基酸序列。另外也包括對(duì)這些膠原的氨基酸序列的一部分進(jìn)行改變后的序列以及附加了不是來(lái)自于膠原的氨基酸序列的序列。另外除了成熟的膠原外還包括作為前體的前膠原或前肽的一部分被切去后得到的膠原。另外在本申請(qǐng)的發(fā)明中，包括脯氨酸羥化在內(nèi)的翻譯后修飾不完全的，或3股螺旋結(jié)構(gòu)不完全的未成熟的膠原分子也作為對(duì)象。
蠶一進(jìn)入吐絲期，吐出大量絲后制作繭。這種絲的主要成分是包括絲心蛋白、P25和絲膠(蛋白)在內(nèi)的絲蛋白，這些絲蛋白的合成量平均每只蠶也可以達(dá)到約0.5g那么大的量。絲蛋白在稱之為絲腺的器官中合成。絲腺由后部絲腺、中部絲腺以及前部絲腺構(gòu)成，在后部絲腺中特異合成分泌絲心蛋白和P25，而在中部絲腺中特異合成分泌絲膠(蛋白)。絲心蛋白是由H鏈和L鏈構(gòu)成的復(fù)合物，而在該復(fù)合物中又會(huì)合了P25(J.Biol.Chem.27540517-40528，2000)。由后部絲腺分泌的絲心蛋白和P25通過(guò)絲腺的蠕動(dòng)運(yùn)動(dòng)慢慢地被送到中部絲腺，在那里周?chē)环置诘慕z膠(蛋白)包被起來(lái)，再被送到前部絲腺以絲形式被吐出。因此，蠶絲腺是具有卓越的蛋白質(zhì)合成能力的器官，預(yù)期在該器官使重組人膠原表達(dá)時(shí)會(huì)獲得非常高的產(chǎn)率。另外由于絲線被排出體外、構(gòu)成絲線的絲蛋白質(zhì)的種類(lèi)少，以及在絲蛋白中存在量最多的絲心蛋白是不溶于水溶液的，所以從蠶吐出的繭，或從絲腺內(nèi)的蛋白質(zhì)中回收和純化合成的重組人膠原是非常容易的。
于蠶中的瞬時(shí)外源基因表達(dá)系統(tǒng)確立了利用蠶核型多角體病毒(BmNPV)作為載體的方法(特公平7-97995號(hào)公報(bào))。然而，用該方法由于病毒的感染導(dǎo)致蠶致死，所以不能將外源基因傳遞到下一世代，有用蛋白質(zhì)的表達(dá)只限于一代。因此，每次使外源基因表達(dá)都需要進(jìn)行病毒接種。另外森等人開(kāi)發(fā)了通過(guò)使Autographacalifornica核型多角體病毒(AcNPV)感染蠶幼蟲(chóng)，不使蠶致死而導(dǎo)入基因，在感染雌性蠶時(shí)有可能通過(guò)生殖細(xì)胞將外源基因傳遞到下一世代的方法(特開(kāi)平6-277051號(hào)公報(bào))。另外山尾等人在通過(guò)使整合了一部分絲心蛋白L鏈基因序列的AcNPV感染蠶幼蟲(chóng)，制作利用基因?qū)ぐ袑⑼庠椿虿迦氲叫Q基因組的絲心蛋白L鏈基因中的轉(zhuǎn)化蠶方面獲得了成功(Genes Dev.13511-516，1999)。
另外，田村等人(Nat.Biotechnol.1881-84，2000)在通過(guò)將整合了來(lái)自鱗翅目昆蟲(chóng)Trichoplusia ni的DNA型轉(zhuǎn)座子piggyBac的質(zhì)粒載體微量注射到蠶卵內(nèi)，制作插入了外源基因的轉(zhuǎn)化蠶方面獲得了成功。
在通過(guò)這些方法制作的轉(zhuǎn)化蠶中插入的外源基因不脫落維持在染色體內(nèi)，通過(guò)世代可以永久地表達(dá)重組蛋白質(zhì)。
利用本申請(qǐng)的發(fā)明可以將編碼人膠原的多核苷酸整合到AcNPV載體，或整合到以DNA型轉(zhuǎn)座子為基礎(chǔ)制作的質(zhì)粒載體中，然后利用這些載體制作將編碼人膠原的多核苷酸插入到蠶基因組序列內(nèi)的轉(zhuǎn)化蠶。
編碼人膠原的多核苷酸可以使用人膠原的基因組DNA、mRNA或由mRNA合成的cDNA等，優(yōu)選是使用cDNA。以下主要就使用cDNA的情況進(jìn)行說(shuō)明，但本發(fā)明中使用的多核苷酸并不限于cDNA。
人膠原cDNA可以是I型至XIX型膠原中的任一種cDNA。這些cDNA的堿基序列從文獻(xiàn)(例如，Essays Biochem.2749-67，1992；Annu.Rev.Biochem.64403-434，1995)報(bào)道的信息都可以獲得。例如，可以通過(guò)根據(jù)這些cDNA序列制作的多核苷酸作為探針對(duì)人cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選的方法，或通過(guò)以對(duì)應(yīng)于cDNA序列兩端的多核苷酸作為引物，以人的基因作為模板的PCR法，或通過(guò)以從人細(xì)胞中提取的RNA作為模板的RT-PCR法都可以獲得人I型～XIX型膠原的各個(gè)cDNA。
為了在蠶絲腺細(xì)胞中使人膠原cDNA表達(dá)，可以利用來(lái)自包括絲心蛋白H鏈、絲心蛋白L鏈、P25以及絲膠(蛋白)在內(nèi)的絲蛋白質(zhì)基因的表達(dá)調(diào)控序列(啟動(dòng)子和增強(qiáng)子)。通過(guò)利用這些絲蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子構(gòu)建表達(dá)盒，可以使絲腺大量特異地表達(dá)重組人膠原。例如，如果利用絲心蛋白H鏈、絲心蛋白L鏈、P25的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，可以使人膠原在后部絲腺表達(dá)，如果利用絲膠(蛋白)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子可以使人膠原在中部絲腺中表達(dá)。另外人膠原表達(dá)盒由于很容易做到由絲腺細(xì)胞分泌或吐絲，所以通過(guò)制作人膠原cDNA和包括絲心蛋白H鏈、絲心蛋白L鏈、P25以及絲膠(蛋白)在內(nèi)的絲蛋白cDNA的融合多核苷酸，將該融合多核苷酸整合到蠶基因組序列內(nèi)也可以合成人膠原和蠶絲蛋白的融合蛋白質(zhì)。此時(shí)，融合的蛋白質(zhì)可以是絲蛋白的部分氨基酸序列，也可以是全長(zhǎng)氨基酸序列。例如，若使將人膠原信號(hào)肽置換為絲蛋白信號(hào)肽的融合蛋白質(zhì)合成，可以很容易做到使人膠原從絲腺細(xì)胞中分泌。另外，例如如果使絲心蛋白L鏈全長(zhǎng)和人膠原的融合蛋白質(zhì)合成，合成的絲心蛋白L鏈和人膠原的融合蛋白質(zhì)通過(guò)絲心蛋白H鏈和二硫鍵形成復(fù)合物，可以更有效地被分泌。
基因?qū)胂到y(tǒng)是使用AcNPV載體的基因?qū)ぐ蟹〞r(shí)，通過(guò)常規(guī)方法構(gòu)建將人膠原cDNA整合到AcNPV基因組DNA內(nèi)的尋靶載體，然后用該載體感染蠶幼蟲(chóng)，通過(guò)同源重組可以將人膠原cDNA整合到蠶基因組DNA內(nèi)。通過(guò)同源重組整合人膠原cDNA的部位，例如可以是包括絲心蛋白H鏈、絲心蛋白L鏈、P25以及絲膠(蛋白)在內(nèi)的絲蛋白基因內(nèi)，或者是絲蛋白質(zhì)基因以外的任意的基因組DNA區(qū)域。
整合部位在絲蛋白質(zhì)基因內(nèi)時(shí)，將與該絲蛋白質(zhì)基因內(nèi)的兩個(gè)任意區(qū)域相同的DNA序列分別連接在人膠原cDNA的前后，構(gòu)建AcNPV尋靶載體。通過(guò)該尋靶載體的感染將人膠原cDNA整合到蠶內(nèi)源性的表達(dá)調(diào)控序列的下游，通過(guò)內(nèi)源性絲蛋白質(zhì)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的作用由cDNA表達(dá)人膠原。另外此時(shí)為了合成人膠原cDNA和絲蛋白質(zhì)的融合蛋白，也可以將人膠原cDNA整合到絲蛋白質(zhì)基因內(nèi)。例如，使氨基酸讀碼框列排在緊靠絲心蛋白L鏈基因第7外顯子內(nèi)的終止密碼子的前面那樣整合膠原cDNA，可以使絲心蛋白L鏈和人膠原的融合蛋白質(zhì)合成。此時(shí)在AcNPV載體內(nèi)的膠原cDNA的前后分別插入了大約0.5kb～6.0kb的與從絲心蛋白L鏈第7外顯子開(kāi)始的上游和下游的基因組DNA相同的DNA序列。
另外，在絲蛋白質(zhì)基因以外的任意基因組DNA序列內(nèi)對(duì)人膠原cDNA進(jìn)行同源重組時(shí)，制作在人膠原cDNA的上游連接了絲蛋白基因啟動(dòng)子的人膠原表達(dá)盒。然后，將從對(duì)表達(dá)盒進(jìn)行同源重組的蠶基因組DNA區(qū)域開(kāi)始的上游以及下游的同樣各0.5kb～6.0kb左右的相同DNA序列連接在表達(dá)盒的前后，將其整合到AcNPV載體，構(gòu)建尋靶載體。同源重組部位無(wú)論在絲蛋白基因內(nèi)時(shí)，還是在絲蛋白基因以外的任意的基因組序列時(shí)，將標(biāo)記基因與人膠原cDNA一起同時(shí)整合，使在第一世代(F1)以至第二世代(F2)中選擇轉(zhuǎn)化蠶變得容易也是可能的。作為標(biāo)記基因如GFP等熒光蛋白質(zhì)基因等，而作為用于使標(biāo)記基因表達(dá)的啟動(dòng)子可舉出例如蠶肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和果蠅HSP70啟動(dòng)子等。
用于制作整合了人膠原cDNA的轉(zhuǎn)化蠶的其他方式是利用來(lái)自昆蟲(chóng)的DNA型轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)化。已知來(lái)自piggyBac、mariner(InsectMol.Biol.9145-155，2000)以及Minos(Insect Mol.Biol.9277-281，2000)等昆蟲(chóng)DNA型轉(zhuǎn)座子在蠶細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移活性，通過(guò)以這些DNA型轉(zhuǎn)座子為基礎(chǔ)制作的質(zhì)粒載體使蠶轉(zhuǎn)化是可能的。特別是以piggyBac為基礎(chǔ)制作的質(zhì)粒載體通過(guò)微量注入蠶卵實(shí)際上使蠶轉(zhuǎn)化獲得了成功(Nat.Biotechnol.1881-84，2000)。利用來(lái)自昆蟲(chóng)的DNA型轉(zhuǎn)座子時(shí)，外源基因被整合在蠶基因組內(nèi)的任意序列。因此為了使整合在蠶基因組序列內(nèi)的人膠原cDNA在絲腺中表達(dá)，首先必須預(yù)先制作在人膠原cDNA的上游連接了來(lái)自包含絲心蛋白H鏈、絲心蛋白L鏈、P25和絲膠(蛋白)的絲蛋白質(zhì)基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的人膠原表達(dá)盒。
另外，在整合人膠原和絲蛋白的融合多核苷酸時(shí)，預(yù)先制作在該融合多核苷酸的上游連接了來(lái)自絲蛋白基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的表達(dá)盒。以下，以piggyBac為例，對(duì)其性質(zhì)以及導(dǎo)入人膠原表達(dá)盒的方法進(jìn)行說(shuō)明，在本發(fā)明中使用的來(lái)自昆蟲(chóng)的DNA型轉(zhuǎn)座子并不限定于piggyBac，也可以使用包括mariner以及Minos在內(nèi)的其他的DNA型轉(zhuǎn)座子。使用piggyBac以外的那些轉(zhuǎn)座子時(shí)的導(dǎo)入人膠原表達(dá)盒的方法基本上與以下記載的使用piggyBac的方法相同。
PiggyBac是從鱗翅目昆蟲(chóng)Trichoplusia ni的培養(yǎng)細(xì)胞TN-368分離的DNA型轉(zhuǎn)座子。由位于中部的轉(zhuǎn)座酶ORF和存在于其兩端的13bp的反向重復(fù)序列構(gòu)成，長(zhǎng)度約2.5kb。由轉(zhuǎn)座酶ORF合成轉(zhuǎn)座酶蛋白質(zhì)，通過(guò)該酶的作用可以使夾在反向重復(fù)序列之間的區(qū)域(piggyBac自身)轉(zhuǎn)移到靶序列TTAA(Virology 1618-17，1989)。在利用這樣的piggyBac的性質(zhì)將人膠原表達(dá)盒插入到蠶基因組序列內(nèi)時(shí)，可以利用例如與田村等人的方法(Nat.Biotechnol.1881-84，2000)同樣的方法進(jìn)行。即將piggyBac的一對(duì)反向重復(fù)序列整合到適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體，插入人膠原表達(dá)盒使其被一對(duì)反向重復(fù)序列夾著。然后將該質(zhì)粒載體與piggyBac的轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體(輔助質(zhì)粒)一起微量注入蠶卵中。該輔助質(zhì)粒是缺失了piggyBac的反向重復(fù)序列的一方或兩方，實(shí)質(zhì)上是只整合了piggyBac轉(zhuǎn)座子基因區(qū)域的重組質(zhì)粒載體。在該輔助質(zhì)粒中，用于使轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的啟動(dòng)子可以直接利用內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座酶啟動(dòng)子，或者利用蠶肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或果蠅HSP70啟動(dòng)子等也可以。為了使下一世代蠶的篩選容易進(jìn)行，可以在整合了膠原表達(dá)盒的載體內(nèi)預(yù)先同時(shí)整合標(biāo)記基因。此時(shí)在標(biāo)記基因的上游可以整合例如蠶肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或果蠅HSP70啟動(dòng)子等的啟動(dòng)子序列，通過(guò)他們的作用使標(biāo)記基因表達(dá)。
使用來(lái)自F1世代的蠶以及AcNPV載體時(shí)從F2世代的蠶選拔轉(zhuǎn)化蠶例如可以使用PCR法和sorthern blot法進(jìn)行。而在整合標(biāo)記基因的時(shí)候，利用其表達(dá)性狀進(jìn)行選拔也是可能的。例如作為標(biāo)記基因利用GFP等熒光蛋白質(zhì)時(shí)，可以用激發(fā)光照射F1和F2世代的蠶卵或幼蟲(chóng)，通過(guò)檢測(cè)熒光蛋白發(fā)出的熒光進(jìn)行選拔。這樣選拔出來(lái)的蠶是在其染色體內(nèi)整合了人膠原cDNA的轉(zhuǎn)化蠶。因此，在使這些蠶與野生型蠶，或轉(zhuǎn)化蠶之間進(jìn)行交配的子孫中也可以不消失地傳遞人膠原cDNA，通過(guò)世代可以生產(chǎn)人膠原或膠原和絲蛋白的融合蛋白質(zhì)。
在生產(chǎn)上述的人膠原的轉(zhuǎn)化蠶中，如果以在絲腺中能夠表達(dá)編碼脯氨酸羥化酶的多核苷酸的形態(tài)導(dǎo)入的話，可以在生理溫度下生產(chǎn)完全熱穩(wěn)定的人膠原。導(dǎo)入的脯氨酸羥化酶多核苷酸(例如cDNA)可以是來(lái)自人或其他動(dòng)物的多核苷酸，也可以是來(lái)自蠶的脯氨酸羥化酶多核苷酸。脯氨酸羥化酶是α亞基和β亞基的復(fù)合物，如果不形成復(fù)合物就沒(méi)有酶活性。α亞基是具有催化劑活性的亞基，存在于產(chǎn)生原來(lái)膠原的細(xì)胞中。而β亞基是與作為催化蛋白質(zhì)二硫鍵結(jié)構(gòu)變換的酶蛋白二硫鍵異構(gòu)酶相同的多肽，普遍存在于所有的細(xì)胞中，而且存在的量比較多。蠶絲腺細(xì)胞由于不是大量產(chǎn)生膠原的細(xì)胞，所以α亞基存在量很少，但β亞基存在量比較多。為了向蠶中導(dǎo)入脯氨酸羥化酶多核苷酸，使脯氨酸羥化酶在蠶絲腺中表達(dá)，有如上述那樣利用來(lái)自人等動(dòng)物的脯氨酸羥化酶多核苷酸的方法和利用蠶的脯氨酸羥化酶多核苷酸的方法。使用來(lái)自人等動(dòng)物的脯氨酸羥化酶多核苷酸時(shí)，必需分別編碼α亞基和β亞基的兩種多核苷酸。由于昆蟲(chóng)的β亞基幾乎不能與來(lái)自人等動(dòng)物的α亞基形成活性型的復(fù)合物，所以不能只通過(guò)來(lái)自人等動(dòng)物的α亞基表達(dá)使活性型的酶合成。另外，使用蠶的脯氨酸羥化酶多核苷酸時(shí)，只使用α亞基就可以。在絲腺中進(jìn)行表達(dá)的α亞基是由于能夠與存在量比較多的內(nèi)源性β亞基形成活性型復(fù)合物的緣故。
本申請(qǐng)?zhí)峁┚幋a蠶的脯氨酸羥化酶α亞基(序列2)的新的多核苷酸。該多核苷酸是具有序列1堿基序列的cDNA以及從基因組DNA中分離、純化的DNA片段以及RNA片段?；蚪MDNA片段和RNA片段可以通過(guò)利用根據(jù)序列1的堿基序列做成的多核苷酸等的篩選或PCR法得到。
在將編碼脯氨酸羥化酶的多核苷酸導(dǎo)入蠶染色體內(nèi)之后使酶在蠶絲腺中表達(dá)時(shí)，在絲腺中使基因表達(dá)利用可能的啟動(dòng)子。作為滿足該條件的啟動(dòng)子，可以舉出如含有只在絲腺中可以使基因表達(dá)的絲心蛋白、P25以及絲膠(蛋白)的絲蛋白的啟動(dòng)子或在任一組織都能表達(dá)的啟動(dòng)子-蠶肌動(dòng)蛋白、果蠅HSP70啟動(dòng)子和AcNPV的IE1等的啟動(dòng)子。為了將脯氨酸羥化酶多核苷酸導(dǎo)入蠶染色體，可以通過(guò)與上述的為使人膠原cDNA導(dǎo)入的方法同樣的方法，即，使用AcNPV的基因?qū)ぐ蟹ɑ驅(qū)⒁詐iggyBac等的DNA型轉(zhuǎn)座子為基礎(chǔ)制作的質(zhì)粒載體微量注入蠶卵的方法進(jìn)行。為了制作含有人基因和脯氨酸羥化酶兩方的多核苷酸的蠶，可以將脯氨酸羥化酶多核苷酸導(dǎo)入含有人膠原多核苷酸的轉(zhuǎn)化蠶中，反之也可以將人膠原多核苷酸導(dǎo)入含有脯氨酸羥化酶多核苷酸的轉(zhuǎn)化蠶中?；蛘叻謩e制作只含有人膠原多核苷酸的轉(zhuǎn)化蠶和含有脯氨酸羥化酶多核苷酸的轉(zhuǎn)化蠶，通過(guò)使他們交配，選擇含有兩方的多核苷酸的轉(zhuǎn)化蠶也可以。另外通過(guò)AcNPV載體分別導(dǎo)入兩方的多核苷酸，或者通過(guò)DNA轉(zhuǎn)座子載體分別導(dǎo)入兩方的多核苷酸，利用AcNPV尋靶載體導(dǎo)入人膠原多核苷酸，利用DNA轉(zhuǎn)座子型的質(zhì)粒載體導(dǎo)入脯氨酸羥化酶多核苷酸也可以，或者反向操作也可以。
含有人膠原cDNA的轉(zhuǎn)化蠶一達(dá)到5齡期(fifth-instarstage)，同時(shí)合成內(nèi)源性絲蛋白和人膠原，作為蠶絲的一部分將人膠原分泌到繭中。繭中的人膠原例如可以通過(guò)0.5M醋酸很簡(jiǎn)單地提取。另外，例如合成人膠原與蠶絲心蛋白L鏈的融合蛋白時(shí)，通過(guò)使之變成還原狀態(tài)，切斷融合蛋白質(zhì)和絲心蛋白H鏈之間的二硫鍵可以提取。另外繭中含有的人膠原是纖維性的膠原，在只對(duì)三股螺旋區(qū)域部分(atelo collager)進(jìn)行純化時(shí)，用胰蛋白酶等蛋白分解酶對(duì)繭中的蛋白質(zhì)進(jìn)行處理。通過(guò)該操作可以提取沒(méi)有被蛋白分解酶消化的atelo collagen，而且由于其他許多蛋白質(zhì)都是受到胰蛋白酶的消化，可以使以后的純化容易進(jìn)行。另外用與蠶繭的情況同樣的方法也可以從轉(zhuǎn)化蠶的絲腺提取、純化人膠原。通過(guò)解剖蠶可以很簡(jiǎn)單地對(duì)絲腺進(jìn)行分離，由于含有的蛋白質(zhì)幾乎都是絲蛋白質(zhì)，可以象蠶繭那樣很容易地提取、純化人膠原。
實(shí)施例以下列舉涉及到人III型膠原的制造方法的實(shí)施例對(duì)申請(qǐng)的發(fā)明進(jìn)行更具體的說(shuō)明，但該申請(qǐng)發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1通過(guò)使用AcNPV載體的基因?qū)ぐ蟹ㄖ谱鬓D(zhuǎn)化蠶編碼人III型前膠原的cDNA根據(jù)以本申請(qǐng)的發(fā)明人克隆的cDNA(特開(kāi)平8-23979號(hào)公報(bào)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)X14420)為基礎(chǔ)，而蠶絲心蛋白L鏈基因以及其下游的蠶基因組DNA序列以已知的蠶絲心蛋白L鏈基因的堿基序列(Gene 100151-158，1992GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)M76430)為基礎(chǔ)按照以下方法進(jìn)行分離。
在以下記載中，人III型前膠原的cDNA以及蠶絲心蛋白L鏈基因的堿基編號(hào)是依據(jù)上述GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)記載的堿基編號(hào)。
(1)蠶絲心蛋白L鏈基因以及其下游的蠶基因組DNA序列的分離利用PCR法對(duì)絲心蛋白L鏈內(nèi)含子6內(nèi)的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR引物使用依據(jù)上述數(shù)據(jù)庫(kù)的序列合成的多核苷酸(序列3和序列4)，模板使用蠶tokai x asahistrain的基因組DNA。然后用得到的DNA片段作為探針，按照常規(guī)方法對(duì)通過(guò)λEMBL3構(gòu)建的蠶kinshux showa strain基因組文庫(kù)進(jìn)行篩選。結(jié)果得到從絲心蛋白L鏈基因的第9600位堿基開(kāi)始的下游含有約15kb區(qū)域的蠶基因組DNA片段(pRI/10k)。
(2)通過(guò)部位特異的突變導(dǎo)入制作限制酶識(shí)別序列為了在蠶絲心蛋白L鏈基因外顯子7內(nèi)連上III型前膠原cDNA，通過(guò)部位特異的突變導(dǎo)入，在絲心蛋白基因中設(shè)置新的限制酶切位點(diǎn)。突變導(dǎo)入使用clontech公司的Mutagenests Kit。突變導(dǎo)入用引物(序列5)設(shè)計(jì)為在緊靠蠶絲心蛋白L鏈基因外顯子7的終止密碼的前面設(shè)置限制酶XhoI位點(diǎn)(序列5的位置8-12)。對(duì)于模板質(zhì)粒，是使用了將來(lái)自pRI/10k的EcoRI-SphI片段(堿基序列12000-14800)亞克隆到pUC18后產(chǎn)物(pRISphI/2.9k)的(MutpRISphI-XhoI)。同樣，為了插入蠶絲心蛋白L鏈基因下游區(qū)片段(堿基序列14200-18900)，通過(guò)突變導(dǎo)入新設(shè)置XbaI位點(diǎn)。突變導(dǎo)入用引物(序列6)設(shè)計(jì)為在緊靠蠶絲心蛋白L鏈基因外顯子7的終止密碼的前面設(shè)置XbaI位點(diǎn)(序列6的位置12-17)。對(duì)于模板質(zhì)粒，是使用了與前面同樣的pRISphI/2.9k的(Mut pRISphI-XhoI)。
在編碼III型前膠原cDNA的氨基前肽的堿基序列內(nèi)也利用上述同樣的部位特異的突變法導(dǎo)入限制酶XhoI的位點(diǎn)。突變導(dǎo)入用引物(序列7)的堿基序列對(duì)應(yīng)于III型前膠原cDNA的292至324號(hào)堿基序列，插入限制酶XhoI位點(diǎn)(序列7的位置17-22)。
(3)轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建用限制酶SmaI和EcoRI消化Clontech公司的泡病毒轉(zhuǎn)移載體pBacPAK9，接著與從pCaSepR-hsp(GeneBank登錄號(hào)U59056)切出的果蠅HSP70啟動(dòng)子和連接了EGFP cDNA(Clontech)的DNA片段(EcoRV-EcoRI)進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(pBacPAKhsEGFP)。連接使用TaKaRa公司的Ligation KitVer.1，轉(zhuǎn)化等按照常規(guī)方法進(jìn)行。
從先前完成的突變體質(zhì)粒Mut pRISphI-XhoI切出插入序列的片段(EcoRV-XhoI)，與III型前膠原cDNA的XhoI位點(diǎn)(通過(guò)突變導(dǎo)入構(gòu)建)連接。然后將通過(guò)PCR由pCEP4(Invitrogen公司)擴(kuò)增的附加SV40 polyA的信號(hào)序列插入到膠原cDNA的下游(BgII位點(diǎn))。然后將完成的絲心蛋白·膠原·附加polyA信號(hào)序列片段(EcoRV-BgII)連接到pBacPAKhsEGFP的EcoRV-BgII位點(diǎn)。接下來(lái)將絲心蛋白L鏈基因的內(nèi)含子2的一部分～外顯子7的一部分(堿基序號(hào)約10000-13100)插入到EcoRV部位(pBacPAKhsEGFP-Fib1)。
接下來(lái)從突變體質(zhì)粒Mut pRISphI-XbaI切出插入序列的片段EcoRV-SphI 1.7kbp(堿基序號(hào)約13100-14800)，插入到pRI/10k的SmaI-SphI(經(jīng)部分消化)位點(diǎn)。將從完成的Mut RI/10k切出的XbaI消化片段(絲心蛋白基因外顯子7的一部分和其下游區(qū)/堿基序號(hào)約14200-18900)插入到pBacPAKhsEGFP-Fib1(pMOSRA-1圖1)。
(4)重組病毒的制作通過(guò)制作的尋靶載體-pMOSRA-1和泡病毒DNA共轉(zhuǎn)化甘藍(lán)夜蛾培養(yǎng)細(xì)胞Sf9，制作重組病毒。向7μl的0.4μg/μl pMOSRA-1、1μl的0.1μg/μl線狀泡病毒DNA(Pharmingen)中加入4μl脂(質(zhì))轉(zhuǎn)染試劑(Gibco)、4μl水后充分混合，然后滴到置換成無(wú)血清培養(yǎng)基SF900-II(Gibco)的1×106個(gè)Sf9細(xì)胞的上面，進(jìn)行培養(yǎng)。24小時(shí)后添加1ml的加入了10％血清的Grace’s培養(yǎng)基，再培養(yǎng)3天后回收培養(yǎng)上清。
(5)重組病毒的篩選和純化將上述病毒液100μl加入到1×106個(gè)Sf9細(xì)胞中，于28℃下感染1小時(shí)。除去上清，加入含有1％低沸點(diǎn)瓊脂糖溶液(SEAPLAQUE，F(xiàn)MC)的Grace培養(yǎng)基1ml使其固化。培養(yǎng)3天后，用波長(zhǎng)360nm的激發(fā)光照射生成的噬斑，將10個(gè)發(fā)出綠色熒光的噬斑，即表達(dá)EGFP的細(xì)胞的噬斑分別從瓊脂中切出。然后將從這些噬斑中回收的重組病毒再次感染1×106個(gè)Sf9細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)的DNA，進(jìn)行斑點(diǎn)印跡。探針使用識(shí)別絲心蛋白L鏈基因的探針和識(shí)別前膠原cDNA的探針這2種。結(jié)果，來(lái)自4個(gè)噬斑的病毒克隆為陽(yáng)性。然后使這些陽(yáng)性病毒感染1×106個(gè)Sf9細(xì)胞，3日后回收培養(yǎng)上清。同樣再用培養(yǎng)上清中的病毒感染Sf9細(xì)胞，得到高效價(jià)的病毒貯存液。
(6)重組泡病毒對(duì)5齡蠶幼蟲(chóng)的感染向5齡蠶第1天的雌幼蟲(chóng)皮下注射50μl的病毒液(5×106pfu)。接種的幼蟲(chóng)于蛹化后第3～4天給予10μl溶解于甲醇的20-hydroxyecdysone(2mg/ml)。羽化后，與正常雄性蠶蛾交配，使其產(chǎn)卵。
(7)F1蠶的篩選將一只雌性蠶產(chǎn)的F1卵(100～300粒)作為1組，從各個(gè)組取出約50卵粒作為樣品，剩下的卵繼續(xù)飼養(yǎng)。按照常規(guī)方法從樣品卵中提取DNA，通過(guò)PCR法判定有無(wú)外源基因。PCR使用引物組(序列8和9)，用于檢測(cè)附加SV40polyA信號(hào)肽，或使用引物組(序列10和11)用于檢測(cè)HSP70啟動(dòng)子。
對(duì)總計(jì)1800組的卵進(jìn)行篩選，結(jié)果有15組為陽(yáng)性。使這些組的剩下的卵孵化，將孵化的F1幼蟲(chóng)飼養(yǎng)到5齡。從處于5齡第3天的各個(gè)幼蟲(chóng)采取100μl的體液，通過(guò)離心操作從這些體液中分離體液細(xì)胞，提取DNA后利用PCR法進(jìn)行篩選。對(duì)總計(jì)3400只5齡幼蟲(chóng)進(jìn)行篩選，結(jié)果8只為陽(yáng)性。這些蠶繼續(xù)飼養(yǎng)，使羽化后的蠶蛾與正常蠶蛾交配，使其產(chǎn)卵。
(8)F2蠶的篩選F2蠶的篩選通過(guò)綠色熒光進(jìn)行。對(duì)于1齡幼蟲(chóng)期照射波長(zhǎng)360nm的激發(fā)光，選擇發(fā)出EGFP綠色熒光的個(gè)體，即選擇表達(dá)作為標(biāo)記基因插入的EGFP的個(gè)體。對(duì)8組F2卵進(jìn)行篩選，結(jié)果可以得到2只陽(yáng)性蠶。
(9)重組人膠原的檢測(cè)將陽(yáng)性F2蠶飼養(yǎng)到吐絲期，將他們加到SDS-樣品緩沖液(0.125M Tris-HCl緩沖液pH6.8/4％SDS/10％2-巰基乙醇/20％甘油)中，混合后通過(guò)于100℃下的5分鐘熱處理提取蠶繭中的蛋白質(zhì)。將該樣品進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(Nature 227680-685，1970)，按照Matudaira等人的方法(J.Biol.Chem.26110035-10038，1987)將電泳后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜BA85(S&S公司)上。然后將轉(zhuǎn)移有蛋白質(zhì)的硝酸纖維素膜用封閉液(3％BSA/50mMTris-HCl緩沖液pH7.5/150mM NaCl)于4℃下處理16小時(shí)后，與用封閉液稀釋了200倍的抗人/牛III型膠原抗體于室溫下反應(yīng)1小時(shí)。用VECTASTAIN ABC試劑盒(Vectorlaboratory公司)檢測(cè)這些抗體進(jìn)行反應(yīng)的蛋白質(zhì)。結(jié)果從繭中檢測(cè)出人III型膠原。
實(shí)施例2通過(guò)向卵微量注入piggyBac載體的方法制作轉(zhuǎn)化蠶(1)piggyBac質(zhì)粒載體的制作將人III型前膠原cDNA(堿基序號(hào)92-4550GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)X14420)用XhoI消化，去除堿基編號(hào)為1075-3545的堿基序列區(qū)后，通過(guò)自連接將切斷的末端連上，制作小III型膠原cDNA。該小III型膠原cDNA是由氨基前肽、三重螺旋區(qū)的一部分(大約為全長(zhǎng)膠原三股螺旋區(qū)的1/5)以及編碼羧基前肽的堿基序列構(gòu)成的，以此為基礎(chǔ)構(gòu)建以下3種載體。
i)pMOSRA-4B該載體含有的插入DNA片段由蠶絲膠(蛋白)啟動(dòng)子、小膠原cDNA以及蠶絲心蛋白L鏈附加polyA信號(hào)肽構(gòu)成。通過(guò)使用5’末端附加BgIII切斷序列的引物(序列12)和引物(序列13)的蠶基因組DNA作為模板的PCR分離蠶絲膠(蛋白)啟動(dòng)子(堿基編號(hào)1299-1622GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)AB007831)，將他連接在小膠原cDNA上游。另外通過(guò)引物(序列14)和5’末端附加BgIII切斷序列的引物(序列15)的蠶基因組DNA作為模板的PCR分離蠶絲心蛋白L鏈附加polyA信號(hào)肽(堿基編號(hào)為14141-14624的堿基序列；GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)M76430)，將他連接在小膠原cDNA下游(圖2)。用BgIII將這樣得到的插入DNA片段的兩個(gè)末端切斷，再用T4DNA聚合酶將切斷的末端平末端化，然后插入到用XhoI切斷后的切斷末端平滑后的pPIGA3GFP載體(Nat.Biotechnol.1881-84，2000)。另外在pPIGA3GFP載體中整合作為標(biāo)記的EGFPcDNA和為使該cDNA表達(dá)的蠶肌動(dòng)蛋白(A3)啟動(dòng)子。
ii)pMOSRA-5該載體含有的插入DNA片段由蠶絲心蛋白L鏈啟動(dòng)子、蠶絲心蛋白L鏈信號(hào)肽cDNA、小膠原cDNA、以及蠶絲心蛋白L鏈附加polyA信號(hào)肽構(gòu)成。通過(guò)使用引物(序列16)和5’末端整合了XhoI切斷序列的引物(序列17)的以蠶絲腺cDNA作為模板的PCR分離蠶絲心蛋白L鏈信號(hào)肽cDNA(堿基編號(hào)為28-160的堿基序列；GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)X17291)。另外使用與實(shí)施例1(2)記載的同樣方法將XhoI切斷序列導(dǎo)入編碼前膠原氨基前肽的區(qū)域內(nèi)，另外將從cDNA5’末端開(kāi)始到該XhoI切斷部位的區(qū)域置換為絲心蛋白L鏈信號(hào)肽cDNA。再通過(guò)使用5’末端附加X(jué)baI和BgIII切斷序列的引物(序列18)和引物(序列19)的以蠶基因組DNA作為模板的PCR分離蠶絲心蛋白L鏈啟動(dòng)子(堿基號(hào)為428-1061的堿基序列；GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)M76430)，然后將他連接在蠶絲心蛋白L鏈信號(hào)肽cDNA的上游，而將蠶絲心蛋白L鏈附加polyA信號(hào)肽連接在小膠原cDNA的下游(圖2)。用BgIII將上述得到的插入DNA片段的兩個(gè)末端切斷，再用T4DNA聚合酶將切斷的末端平末端化，插入到用XhoI切斷后的切斷末端平滑后的pPIGA3GFP載體。
iii)pMOSRA-6該載體含有的插入DNA片段由蠶絲心蛋白L鏈啟動(dòng)子、蠶絲心蛋白L鏈全長(zhǎng)cDNA、小膠原cDNA以及蠶絲心蛋白L鏈附加polyA信號(hào)肽構(gòu)成。通過(guò)使用引物(序列20)和5’末端整合了XhoI切斷序列的引物(序列21)的以蠶絲腺cDNA作為模板的PCR分離蠶絲心蛋白L鏈全長(zhǎng)cDNA(堿基編號(hào)30-820Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)X17291)，然后將該cDNA如pMOSRA-5那樣置換成從小膠原cDNA5’末端開(kāi)始直至導(dǎo)入到氨基前肽內(nèi)的XhoI切斷部位的區(qū)域。將位于蠶絲心蛋白L鏈cDNA的上游的蠶絲心蛋白L鏈啟動(dòng)子與位于小膠原cDNA下游的蠶絲心蛋白L鏈附加polyA信號(hào)肽連接(圖2)。用XbaI將這樣得到的插入DNA片段的兩個(gè)末端切斷，再用T4DNA聚合酶將切斷的末端平末端化，插入到用XhoI切斷后的切斷末端平滑后的pPIGA3GFP載體。
(2)向蠶卵微量注入質(zhì)粒載體用氯化銫超離心法對(duì)上述3種小膠原載體(pMOSRA-4B、pMOSRA-5、pMOSRA-6)進(jìn)行純化后，將該3種載體與輔助質(zhì)粒pHA3PIG(Nat.Biotechnol.1881-84，2000)混合，再進(jìn)行乙醇沉淀后，溶解于注入緩沖液(0.5mM磷酸緩沖液pH7.0，5mM KCl)中，使小膠原載體的各個(gè)濃度為66.7μg/ml(合計(jì)200μg/ml)，pHA3PIG的濃度為200μg/ml。將該DNA溶液微量注入產(chǎn)卵后2～8小時(shí)的前胚盤(pán)葉期的蠶卵(蠶胚)，注入的溶液量為每只卵約15～20nl。對(duì)總計(jì)1078個(gè)卵進(jìn)行了微量注入。
(3)F1幼蠶的篩選將微量注入了載體DNA的卵于25℃下進(jìn)行溫育，結(jié)果有518個(gè)卵孵化。對(duì)孵化的卵繼續(xù)進(jìn)行飼養(yǎng)，得到了413只可能有生殖能力的成蟲(chóng)，對(duì)他們進(jìn)行交配，得到213組的F1卵塊。然后使這些F1卵塊孵化，用螢光顯微鏡對(duì)每一組孵化的幼蟲(chóng)進(jìn)行觀察。結(jié)果可以從26組中得到發(fā)綠色熒光的幼蟲(chóng)。陽(yáng)性組中含有的陽(yáng)性蠶數(shù)相當(dāng)于每1組為1頭～30頭，總計(jì)為240頭。對(duì)這些陽(yáng)性F1蠶進(jìn)行飼養(yǎng)，使他們與野生型蠶進(jìn)行交配，可以得到下一世代(F2)蠶。在F2蠶當(dāng)中約有1/2的蠶發(fā)綠色熒光，整合的EGFP和小膠原基因沒(méi)有脫落，根據(jù)孟德?tīng)柗▌t可以確認(rèn)已經(jīng)傳遞到下一世代。另外從產(chǎn)卵后的F1蠶成蟲(chóng)提取基因組DNA，通過(guò)使用引物組(序列22和23)的PCR擴(kuò)增小膠原DNA片段，或通過(guò)使用引物組(序列24和25)的PCR擴(kuò)增EGFP，結(jié)果可以從發(fā)綠色熒光的陽(yáng)性蠶中檢測(cè)小膠原以及EGFP DNA片段(圖3)。另外進(jìn)行sorthern blot解析，可以確認(rèn)這些外源基因已經(jīng)整合到了蠶基因組DNA中。
(4)小膠原mRNA和重組小膠原的檢測(cè)對(duì)達(dá)到5齡期的陽(yáng)性F1幼蟲(chóng)進(jìn)行解剖，取出絲腺，利用鹽酸胍酚氯仿法提取總RNA，以對(duì)其中的200ng的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，進(jìn)行30循環(huán)的PCR(RT-PCR)，反應(yīng)條件為94℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃1分鐘。引物使用上述引物組(序列號(hào)22和23)結(jié)果可以檢測(cè)到小膠原mRNA，證實(shí)整合到蠶基因組DNA的小膠原基因在絲腺細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行了表達(dá)(圖4)。
以下嘗試對(duì)重組小膠原蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。將陽(yáng)性F1蠶飼養(yǎng)到吐絲期，加SDS-樣品緩沖液(0.125M Tris-HCl緩沖液pH6.8/4％SDS/10％2-巰基乙醇/20％甘油)，混合后通過(guò)100℃下的5分鐘熱處理提取吐出的繭中的蛋白質(zhì)。將該樣品進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(Nature 227680-685，1970)，按照Matudaira等人的方法(J.Biol.Chem.26110035-10038，1987)將電泳后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜BA85(S&S公司)上。然后將轉(zhuǎn)移有蛋白質(zhì)的硝酸纖維素膜用封閉液(3％BSA/50mMTris-HCl緩沖液pH7.5/150mMNaCl)于4℃下處理16小時(shí)后，與用封閉液稀釋了200倍的抗人/牛III型膠原抗體于室溫下反應(yīng)1小時(shí)。用VECTASTAIN ABC試劑盒(Vector laboratory公司)檢測(cè)這些抗體進(jìn)行反應(yīng)的蛋白質(zhì)。結(jié)果從繭中可以檢測(cè)出重組小膠原蛋白質(zhì)。
實(shí)施例3蠶脯氨酸羥化酶α亞基cDNA的克隆首先通過(guò)使用混合引物的簡(jiǎn)并PCR法對(duì)蠶脯氨酸羥化酶α亞基cDNA的部分序列進(jìn)行克隆。對(duì)已經(jīng)報(bào)道的人、果蠅以及線蟲(chóng)的脯氨酸羥化酶α亞基基因的氨基酸序列進(jìn)行比較，以種間保守區(qū)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)具有由氨基酸序列推定的堿基序列的混合引物P3(序列26)、P5II(序列27)。而在混合引物序列中，n表示a、c、g或t，r表示a或g，y表示c或t，s表示c或g，w表示a或t。接下來(lái)為了制作PCR的模板，從蠶培養(yǎng)細(xì)胞BmN4細(xì)胞和蠶2齡幼蟲(chóng)分別提取總RNA。以對(duì)其中的200ng的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，進(jìn)行40循環(huán)的PCR，反應(yīng)條件為94℃1分鐘，58℃1分鐘，72℃1分鐘。結(jié)果無(wú)論BmN4細(xì)胞還是蠶2齡幼蟲(chóng)都能通過(guò)電泳可以確認(rèn)約150bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，將該擴(kuò)增產(chǎn)物亞克隆到Invitrogen公司的pCR2.1中，利用雙脫氧法確定堿基序列，結(jié)果該cDNA片段無(wú)論是在堿基序列水平，還是在由堿基序列推測(cè)的氨基酸序列水平與其他動(dòng)物的脯氨酸羥化酶α亞基都有很高的同源性，顯然是蠶脯氨酸羥化酶cDNA的部分片段。
接下來(lái)，為了對(duì)全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行克隆，利用RACE(RapidAmplification cDNA Ends)法對(duì)得到的蠶脯氨酸羥化酶α亞基cDNA片段的上游、下游進(jìn)行分離。由cDNA片段的堿基序列設(shè)計(jì)5’RACE用引物GSP1(序列28)、3’RACE用引物GSP2(序列29)。RACE使用clontech公司SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit進(jìn)行。RACE的結(jié)果通過(guò)電泳可以確認(rèn)5’區(qū)約1.7kb、3’區(qū)約1.2kb的cDNA片段。將這些cDNA片段象上述那樣進(jìn)行亞克隆，對(duì)其堿基序列進(jìn)行解析，結(jié)果含有全部編碼蠶脯氨酸羥化酶α亞基的序列。得到的全長(zhǎng)cDNA堿基序列如序列1所示，該cDNA編碼的蠶脯氨酸羥化酶α亞基的氨基酸序列如序列2所示。
就象上述詳細(xì)說(shuō)明的那樣，通過(guò)本申請(qǐng)的發(fā)明可以提供作為繭或絲腺內(nèi)所含蛋白質(zhì)的一部分生產(chǎn)重組人膠原的轉(zhuǎn)化蠶，該蠶生產(chǎn)的重組人膠原。重組人膠原由于從轉(zhuǎn)化蠶吐出的繭或絲腺中回收，容易提取，所以可以容易地得到純度高的膠原。另外轉(zhuǎn)化蠶生產(chǎn)的重組人膠原沒(méi)有病毒和朊病毒等病原體混入的危險(xiǎn)，另外由于是對(duì)人沒(méi)有抗原性的安全人膠原，所以可以在醫(yī)療、食品、化妝品等各種各樣的產(chǎn)業(yè)中利用。
序列表<110>科學(xué)技術(shù)振興集團(tuán)；財(cái)團(tuán)法人廣島產(chǎn)業(yè)振興機(jī)構(gòu)；泰爾茂株式會(huì)社；株式會(huì)社高研；和獨(dú)立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所<120>生產(chǎn)人膠原的轉(zhuǎn)化蠶<130>01-F-027PCT<140>PCT/JP01/04906<141>2001-06-11<150>JP2000-361563<151>2000-11-28<160>29<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2483<212>DNA<213>家蠶<220>
<221>CDS<222>(228)..(1880)<400>1tacgcggggg aaccgaccga cgtcgggctg cgtggacgca cgtatctttg ccagattgtc 60gctttattta acgtttataa ttgtgaattg attgcaattc aatttgtggt gaatgaggtt 120aaactgcaat acgtttttct aataatcctt aatgatgtac gtttgtctgt aaaacaattt 180gctgatctgc aagttctaga atcgttttca tatttatttc tgcaaaa atg gaa aca 236Met Glu Thr1gta aga gcg ata gct ttt ttg ctt ctg ttt ttc ttt act tgg gcc aaa 284Val Arg Ala Ile Ala Phe Leu Leu Leu Phe Phe Phe Thr Trp Ala Lys5 10 15
gca gag cta ttc aca gcc ata acg gat gtt gaa ccg cta ctg gaa acc 332Ala Glu Leu Phe Thr Ala Ile Thr Asp Val Glu Pro Leu Leu Glu Thr20 25 30 35cac aag agg atc ata gac gat tta gat gat tac ctg caa aaa gaa gag 380His Lys Arg Ile Ile Asp Asp Leu Asp Asp Tyr Leu Gln Lys Glu Glu40 45 50agg aga ctt ttc act ttg aag aaa cac ttg aat tta tat aaa agg gaa 428Arg Arg Leu Phe Thr Leu Lys Lys His Leu Asn Leu Tyr Lys Arg Glu55 60 65cac gaa agg gct atg gat gac atc cct aac tac ctc ggc aac ccg atc 476His Glu Arg Ala Met Asp Asp Ile Pro Asn Tyr Leu Gly Asn Pro Ile70 75 80aat gct ttc acg ttg ata aaa aga tta acg gcc gac ctt gat ttt ata 524Asn Ala Phe Thr Leu Ile Lys Arg Leu Thr Ala Asp Leu Asp Phe Ile85 90 95gag gat agc att aaa att gga aca gaa tac ata aag aac gtc aca atg 572Glu Asp Ser Ile Lys Ile Gly Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Val Thr Met100 105 110 115aac cac gtg gac gtg aaa tat ccg tca ttg gaa gat ctg acg gga gca 620Asn His Val Asp Val Lys Tyr Pro Ser Leu Glu Asp Leu Thr Gly Ala120 125 130gct cag gcg ctg act cgg ttg cag gaa acc tac tat tta aat gta cac 668Ala Gln Ala Leu Thr Arg Leu Gln Glu Thr Tyr Tyr Leu Asn Val His135 140 145gat cta gcc gag ggt ata ttg aat gga gtt tca tac agt act cct atg 716Asp Leu Ala Glu Gly Ile Leu Asn Gly Val Ser Tyr Ser Thr Pro Met150 155 160acg gcg agc gat tgt tac gaa ctc ggc cgg act cta tac aac gat aaa 764Thr Ala Ser Asp Cys Tyr Glu Leu Gly Arg Thr Leu Tyr Asn Asp Lys165 170 175gat tac aca aac gcc ttg gcc tgg atg aaa gaa gcg cta agg aaa tat 812Asp Tyr Thr Asn Ala Leu Ala Trp Met Lys Glu Ala Leu Arg Lys Tyr180 185 190 195
aaa gat gaa aac gtc atg tac ccg ttc acc gaa gtc gat atc ttg gaa 860Lys Asp Glu Asn Val Met Tyr Pro Phe Thr Glu Val Asp Ile Leu Glu200 205 210tat ata gga ttc gca tat tat tta aac gga gac gtc aaa acc gct ctg 908Tyr Ile Gly Phe Ala Tyr Tyr Leu Asn Gly Asp Val Lys Thr Ala Leu215 220 225gaa tgg act cag aga ctt ctg tcc gtc gat ccg aag cac gta cga gcg 956Glu Trp Thr Gln Arg Leu Leu Ser Val Asp Pro Lys His Val Arg Ala230 235 240cgg ggc aac ata ccg cac tat cag aag acg ata gcc gaa caa gag gcc 1004Arg Gly Asn Ile Pro His Tyr Gln Lys Thr Ile Ala Glu Gln Glu Ala245 250255gaa tta aag aag caa caa cgt ggg gaa acc tcg gat gag cct gaa gaa 1052Glu Leu Lys Lys Gln Gln Arg Gly Glu Thr Ser Asp Glu Pro Glu Glu260 265 270 275gaa gat ggt caa gat tac gaa tta tca gag tac gca aag gaa cgc aaa 1100Glu Asp Gly Gln Asp Tyr Glu Leu Ser Glu Tyr Ala Lys Glu Arg Lys280 285 290gtt tac gaa tcg ctg tgt cgg gga gaa atg gaa ata ccc cat gag att 1148Val Tyr Glu Ser Leu Cys Arg Gly Glu Met Glu Ile Pro His Glu Ile295 300 305act aag agg ttg aaa tgt tgg tac gtc acc gac acg cat ccg ttt tta 1196Thr Lys Arg Leu Lys Cys Trp Tyr Val Thr Asp Thr His Pro Phe Leu310 315 320aag ttg gcc cca atc aaa gtg gag cag atg tac gtg aag ccc gac ata 1244Lys Leu Ala Pro Ile Lys Val Glu Gln Met Tyr Val Lys Pro Asp Ile325 330 335ttt atg ttc cac gaa gtg atg acc gac gac gag att gag ttc atc aaa 1292Phe Met Phe His Glu Val Met Thr Asp Asp Glu Ile Glu Phe Ile Lys340 345 350 355aaa cga gca aag ccg agg ttc aaa cgg gct gtc gtt cac gac cct aaa 1340Lys Arg Ala Lys Pro Arg Phe Lys Arg Ala Val Val His Asp Pro Lys360 365 370act ggt gag ctg aca ccg gcc cat tac cgc atc agc aag tcg tcg tgg 1388
Thr Gly Glu Leu Thr Pro Ala His Tyr Arg Ile Ser Lys Ser Ser Trp375 380 385ctc cgc gac gag gag tct ccg gtc ata gcg cgc atc acg cag cgc gtc 1436Leu Arg Asp Glu Glu Ser Pro Val Ile Ala Arg Ile Thr Gln Arg Val390 395 400acc gac atg acc ggg ctc agc atg ctg cac gcc gag gag ctt cag gtc 1484Thr Asp Met Thr Gly Leu Ser Met Leu His Ala Glu Glu Leu Gln Val405 410 415gtc aac tac ggc ata ggg gga cac tac gaa ccg cac ttc gac ttc gct 1532Val Asn Tyr Gly Ile Gly Gly His Tyr Glu Pro His Phe Asp Phe Ala420 425 430 435agg aaa cgt gag aat cca ttc acg aaa ttc ggc ggc aac aga ata gcc 1580Arg Lys Arg Glu Asn Pro Phe Thr Lys Phe Gly Gly Asn Arg Ile Ala440 445 450acc gtc ctc ttc tac atg tct gac gtg gcg cag ggc ggc gct aca gtg 1628Thr Val Leu Phe Tyr Met Ser Asp Val Ala Gln Gly Gly Ala Thr Val455 460 465ttc acc gaa ctt gga ctc agt ttg ttt cca ata aaa cga gct gcg gcg 1676Phe Thr Glu Leu Gly Leu Ser Leu Phe Pro Ile Lys Arg Ala Ala Ala470 475 480ttc tgg ttg aac ctg cac gcg tcg ggc gaa gga gac ctc gcc acc agg 1724Phe Trp Leu Asn Leu His Ala Ser Gly Glu Gly Asp Leu Ala Thr Arg485 490 495cat gcc gcc tgc ccc gtg ctc agg gga tcc aag tgg gtg tca aat aaa 1772His Ala Ala Cys Pro Val Leu Arg Gly Ser Lys Trp Val Ser Asn Lys500 505 510 515tgg ata cat caa ggc ggg caa gag ctg ttg agg ccc tgc gac ctt gag 1820Trp Ile His Gln Gly Gly Gln Glu Leu Leu Arg Pro Cys Asp Leu Glu520 525 530tac cag gag gag ggc atc atc cgc aag att cct cgt cca gtg ccg aag 1868Tyr Gln Glu Glu Gly Ile Ile Arg Lys Ile Pro Arg Pro Val Pro Lys535 540 545aca tcc agg tag actccgagca acgtgtgacc gaacggaact gatcataaat1920Thr Ser Arg
550tgttcggtat agtgcatttt ttttttaaat aaaatagatt aaatattaca tagtataata 1980gaatgttggg tctgtgtagt acacgtattc gacttctgtg tctcgtgcga ttttacgaat 2040aaccacaagc ataatcgact agaatgcata atttttaatt agttatgggt caagaaagaa 2100gattctcatt atgaaagacg ccaagaaaat tacgccaact aacttttagg agatgtttta 2160aataaccaat aatttgagtg caatttatac tatactttta atatatttat taaattgttc 2220caatttcttt actttcccct atttagaacg tatagtttaa gttaacgttg atttgtttga 2280ttgtaaaata ttaacagtaa actcacacca ggcacacaca aaaaaccatc tattgttgcg 2340aacaaattca caaataaaca tatctaataa aaaaaaatgt taaataataa ataagttgca 2400atgaaacact aatatatttt aacatattat atattatagt gatatcttag aataaaccat 2460cgtggctcga tggctcgtgg cta 2483<210>2<211>550<212>PRT<213>家蠶<400>2Met Glu Thr Val Arg Ala Ile Ala Phe Leu Leu Leu Phe Phe Phe Thr1 5 10 15Trp Ala Lys Ala Glu Leu Phe Thr Ala Ile Thr Asp Val Glu Pro Leu20 25 30Leu Glu Thr His Lys Arg Ile Ile Asp Asp Leu Asp Asp Tyr Leu Gln35 40 45Lys Glu Glu Arg Arg Leu Phe Thr Leu Lys Lys His Leu Asn Leu Tyr50 55 60Lys Arg Glu His Glu Arg Ala Met Asp Asp Ile Pro Asn Tyr Leu Gly65 70 75 80Asn Pro Ile Asn Ala Phe Thr Leu Ile Lys Arg Leu Thr Ala Asp Leu85 90 95Asp Phe Ile Glu Asp Ser Ile Lys Ile Gly Thr Glu Tyr Ile Lys Asn100 105 110Val Thr Met Asn His Val Asp Val Lys Tyr Pro Ser Leu Glu Asp Leu115 120 125
Thr Gly Ala Ala Gln Ala Leu Thr Arg Leu Gln Glu Thr Tyr Tyr Leu130 135 140Asn Val His Asp Leu Ala Glu Gly Ile Leu Asn Gly Val Ser Tyr Ser145 150 155 160Thr Pro Met Thr Ala Ser Asp Cys Tyr Glu Leu Gly Arg Thr Leu Tyr165 170 175Asn Asp Lys Asp Tyr Thr Asn Ala Leu Ala Trp Met Lys Glu Ala Leu180 185 190Arg Lys Tyr Lys Asp Glu Asn Val Met Tyr Pro Phe Thr Glu Val Asp195 200 205Ile Leu Glu Tyr Ile Gly Phe Ala Tyr Tyr Leu Asn Gly Asp Val Lys210 215 220Thr Ala Leu Glu Trp Thr Gln Arg Leu Leu Ser Val Asp Pro Lys His225 230 235 240Val Arg Ala Arg Gly Asn Ile Pro His Tyr Gln Lys Thr Ile Ala Glu245 250 255Gln Glu Ala Glu Leu Lys Lys Gln Gln Arg Gly Glu Thr Ser Asp Glu260 265 270Pro Glu Glu Glu Asp Gly Gln Asp Tyr Glu Leu Ser Glu Tyr Ala Lys275 280 285Glu Arg Lys Val Tyr Glu Ser Leu Cys Arg Gly Glu Met Glu Ile Pro290 295 300His Glu Ile Thr Lys Arg Leu Lys Cys Trp Tyr Val Thr Asp Thr His305 310 315 320Pro Phe Leu Lys Leu Ala Pro Ile Lys Val Glu Gln Met Tyr Val Lys325 330 335Pro Asp Ile Phe Met Phe His Glu Val Met Thr Asp Asp Glu Ile Glu340 345 350Phe Ile Lys Lys Arg Ala Lys Pro Arg Phe Lys Arg Ala Val Val His355 360 365Asp Pro Lys Thr Gly Glu Leu Thr Pro Ala His Tyr Arg Ile Ser Lys370 375 380Ser Ser Trp Leu Arg Asp Glu Glu Ser Pro Val Ile Ala Arg Ile Thr385 390 395 400Gln Arg Val Thr Asp Met Thr Gly Leu Ser Met Leu His Ala Glu Glu405 410 415Leu Gln Val Val Asn Tyr Gly Ile Gly Gly His Tyr Glu Pro His Phe420 425 430Asp Phe Ala Arg Lys Arg Glu Asn Pro Phe Thr Lys Phe Gly Gly Asn435 440 445Arg Ile Ala Thr Val Leu Phe Tyr Met Ser Asp Val Ala Gln Gly Gly450 455 460Ala Thr Val Phe Thr Glu Leu Gly Leu Ser Leu Phe Pro Ile Lys Arg465 470475 480Ala Ala Ala Phe Trp Leu Asn Leu His Ala Ser Gly Glu Gly Asp Leu
485 490 495Ala Thr Arg His Ala Ala Cys Pro Val Leu Arg Gly Ser Lys Trp Val500 505 510Ser Asn Lys Trp Ile His Gln Gly Gly Gln Glu Leu Leu Arg Pro Cys515 520 525Asp Leu Glu Tyr Gln Glu Glu Gly Ile Ile Arg Lys Ile Pro Arg Pro530 535 540Val Pro Lys Thr Ser Arg545 550<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<213>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>3tcgtaactgc ctacacgttt gc 22<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<213>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>4agacgtgaac ctggctggct 20<210>5<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<213>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>5tttagactcg agcct 15
<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<213>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>6tacagttctt atctagacgt gaacc 25<210>7<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<213>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>7gacataatat gtgacgctcg agaattagac tgc33<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<213>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>8ggatccagac atgataagat ac 22<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<213>人工序列描述合成的寡核苷酸
<400>9gatcataatc agccatacca c21<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<213>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>10gatcccccta gaatcccaaa ac 22<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
<213>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>13cccgatgata agacgactat g21<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
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<213>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>20acagaccact aaaatgaagc c21
<210>21<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<213>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>21ctcgagcctg gctggctgct tgtgcaa 27<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<213>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>22tgttccacgg aaacactggt g21<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<213>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>23catcctccag aactgtgtag g21<210>24<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<213>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>24
cacaacgtct atatcatggc cg 22<210>25<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<213>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>25atgttgtggc ggatcttgaa g21<210>26<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
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<213>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>29ggcatagggg gacactacga accgc2權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)化蠶，其中，基因組DNA內(nèi)含有編碼人膠原的多核苷酸，作為蠶繭或絲腺內(nèi)蛋白質(zhì)的一部分生產(chǎn)重組人膠原。
2.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)化蠶，其中基因組DNA內(nèi)還含有編碼脯氨酸羥化酶α亞基和β亞基中至少一方的多核苷酸。
3.權(quán)利要求2的轉(zhuǎn)化蠶，其中編碼脯氨酸羥化酶α亞基的多核苷酸是含有序列1堿基序列的DNA片段的至少編碼區(qū)。
4.轉(zhuǎn)化蠶，其中，基因組DNA內(nèi)含有編碼人膠原和蠶絲蛋白的融合蛋白質(zhì)的多核苷酸，作為繭或絲腺內(nèi)蛋白質(zhì)的一部分生產(chǎn)上述融合蛋白。
5.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)化蠶，其中基因組DNA內(nèi)還含有編碼脯氨酸羥化酶α亞基和β亞基中至少一方的多核苷酸。
6.權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)化蠶，其中編碼脯氨酸羥化酶α亞基的多核苷酸是含有序列1堿基序列的DNA片段的至少編碼區(qū)。
7.重組人膠原的制造方法，其特征是從權(quán)利要求1、2或3的轉(zhuǎn)化蠶的繭或絲腺分離、純化重組人膠原。
8.重組人膠原的制造方法，其特征是從權(quán)利要求4、5或6的轉(zhuǎn)化蠶的繭或絲腺分離重組人膠原和蠶絲蛋白的融合蛋白質(zhì)，然后從該融合蛋白質(zhì)中分離、純化重組人膠原。
9.權(quán)利要求4、5或6的轉(zhuǎn)化蠶生產(chǎn)的重組人膠原和蠶絲蛋白的融合蛋白。
10.含有編碼人膠原的多核苷酸的來(lái)自Autographa californica核型多角體病毒的尋靶載體。
11.權(quán)利要求10的尋靶載體，其中多核苷酸是人膠原表達(dá)盒。
12.權(quán)利要求11的尋靶載體，其中人膠原表達(dá)盒是連接有在蠶絲蛋白質(zhì)基因的表達(dá)調(diào)控序列的支配下編碼人膠原的多核苷酸的融合多核苷酸。
13.權(quán)利要求11的尋靶載體，其中人膠原表達(dá)盒是連接有在蠶絲蛋白質(zhì)基因的表達(dá)調(diào)控序列的支配下編碼蠶絲蛋白的多核苷酸和編碼人膠原的多核苷酸的融合多核苷酸。
14.含有編碼脯氨酸羥化酶α亞基和β亞基中至少一方的多核苷酸的來(lái)自Autographa californica核型多角體病毒的尋靶載體。
15.權(quán)利要求14的尋靶載體，其中編碼脯氨酸羥化酶α亞基的多核苷酸是含有序列1堿基序列的DNA片段的至少編碼區(qū)。
16.在夾在一對(duì)來(lái)自昆蟲(chóng)DNA型轉(zhuǎn)座子的反向重復(fù)序列之間區(qū)域內(nèi)含有人膠原表達(dá)盒的重組質(zhì)粒載體。
17.權(quán)利要求16的重組質(zhì)粒載體，其中人膠原表達(dá)盒是連接有在蠶絲蛋白質(zhì)基因的表達(dá)調(diào)控序列的支配下編碼人膠原的多核苷酸的融合多核苷酸。
18.權(quán)利要求16的重組質(zhì)粒載體，其中人膠原表達(dá)盒是連接有在蠶絲蛋白質(zhì)基因的表達(dá)調(diào)控序列的支配下編碼蠶絲蛋白的多核苷酸和編碼人膠原的多核苷酸的融合多核苷酸。
19.在夾在一對(duì)來(lái)自昆蟲(chóng)DNA型轉(zhuǎn)座子的反向重復(fù)序列之間區(qū)域內(nèi)含有編碼脯氨酸羥化酶α亞基和β亞基中至少一方的多核苷酸的重組質(zhì)粒載體。
20.權(quán)利要求19的重組質(zhì)粒載體，其中編碼脯氨酸羥化酶α亞基的多核苷酸是含有序列1堿基序列的DNA片段的至少編碼區(qū)。
21.由權(quán)利要求16、17或18的重組質(zhì)粒載體和含有編碼轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座酶的多核苷酸的重組質(zhì)粒載體構(gòu)成的載體試劑盒。
22.由權(quán)利要求19或20的重組質(zhì)粒載體和含有編碼轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座酶的多核苷酸的重組質(zhì)粒載體構(gòu)成的載體試劑盒。
23.編碼具有序列2氨基酸序列的蠶脯氨酸羥化酶α亞基的多核苷酸。
24.權(quán)利要求23的多核苷酸，其是含有序列1堿基序列的DNA片段。
全文摘要
本發(fā)明提供在基因組DNA內(nèi)含有編碼人膠原的多核苷酸，作為繭或絲腺內(nèi)蛋白質(zhì)的一部分生產(chǎn)重組人膠原的轉(zhuǎn)化蠶，利用該轉(zhuǎn)化蠶制造重組人膠原的方法，以及在轉(zhuǎn)化蠶制作中使用的重組載體。由于從該轉(zhuǎn)化蠶吐出的繭和絲腺中可以回收人膠原，可以很簡(jiǎn)便地大量獲得高純度的膠原。另外由于轉(zhuǎn)化蠶生產(chǎn)的重組人膠原沒(méi)有病毒和朊病毒等病原體混入的危險(xiǎn)，是對(duì)人沒(méi)有抗原性的安全人膠原，所以可以在醫(yī)療、食品、化妝品等各種各樣的產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N9/02GK1516734SQ0182320
公開(kāi)日2004年7月28日 申請(qǐng)日期2001年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月18日
發(fā)明者吉里勝利, 富田正浩, 佐藤勉, 森肇, 田村俊樹(shù), 安達(dá)敬泰, 宗綱洋人, 人, 樹(shù), 泰, 浩 申請(qǐng)人:科學(xué)技術(shù)振興事業(yè)團(tuán), 財(cái)團(tuán)法人廣島縣產(chǎn)業(yè)振興機(jī)構(gòu), 泰爾茂株式會(huì)社, 株式會(huì)社高研, 獨(dú)立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所