專利名稱：：一種結(jié)核分枝桿菌多價(jià)重組蛋白疫苗的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物技術(shù)和免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及一種重組抗原85復(fù)合物(recombinedAntigen85complex,rAg85com)及其制備方法，本發(fā)明還涉及用于預(yù)防分枝桿菌、特別是結(jié)核分枝桿菌感染的由重組蛋白質(zhì)類抗原組成的多價(jià)疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
：全球每年由結(jié)核分枝桿菌(J/yco6acz^r/咖to6erc"7oys,Mtb)所引起的結(jié)核病導(dǎo)致200多萬人死亡，其破壞性位居各種傳染病之首。目前，預(yù)防用的卡介苗(BacillusCalmette-Guerin，BCG)對(duì)新生兒有比較高的保護(hù)作用，而對(duì)成人的保護(hù)作用有限，特別在結(jié)核病高發(fā)區(qū)基本無效。因此，開發(fā)新型結(jié)核疫苗研究非常重要而緊迫。由Mtb的蛋白、脂類和糖類成分組成的亞單位疫苗正是目前研究的熱點(diǎn)之一。在動(dòng)物模型中的研究表明，活Mtb能夠有效地誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，而死Mtb的免疫保護(hù)作用非常弱。由此推測(cè)，活Mtb分泌的抗原，特別是蛋白類抗原可能使機(jī)體獲得免疫力。因此，從Mtb分泌蛋白或Mtb培養(yǎng)液的濾過性蛋白(FilteredProtein,FP)中可望尋找新疫苗的候選抗原。體外培養(yǎng)Mtb試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，活Mtb最先分泌到細(xì)胞外的主要是一些約30kDa的蛋白類，占菌體分泌蛋白的3040%，通常形成復(fù)合分子，也稱Ag85復(fù)合物(Antigen85Complex,Ag85Com)。最初發(fā)現(xiàn)Ag85Com中包含了Ag85A、Ag85B和Ag85C(也稱Ag85C2)三種蛋白。它們都有分枝菌?；D(zhuǎn)移酶(mycolyltransferase)活性，能催化Mtb細(xì)胞壁中"索狀因子"(海藻糖-6,6-分枝菌酰二酯，TDM)的形成，對(duì)保持分枝桿菌細(xì)胞壁的完整性起重要作用。后又發(fā)現(xiàn)，分泌蛋白中還有另外一種分子量約27kDa，與Ag85Com有免疫交叉反應(yīng)，但不具有分枝菌酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白MPT51，也稱Ag85D(RosalindA.Wilson等，TheStructureofMycobacteriumtuberculosisMPT51(FbpCl)DefinesaNewFamilyofNon-catalytica/PHydrolasesJ.Mol.Biol.335,519-530,2004)。因此，我們認(rèn)為廣義的Ag85Com應(yīng)該包括Ag85A、Ag85B、Ag85C和Ag85D四種蛋白成分，它們之間除了有免疫交叉反應(yīng)外，還都能夠同血漿或細(xì)胞表面的纖維連接蛋白(Fibronectin)結(jié)合，因此，也稱之為纖維連接蛋白結(jié)合蛋白(Fibronectinbindingprotein,Fbp)，所以也有研究者將Ag85A、Ag85B、Ag85C和Ag85D分別稱為FbpA、FbpB、FbpC(或FbpC2)和FbpD(或FbpCl)，而它們所對(duì)應(yīng)的基因就分別稱/6;^l(Rv3804c)、/■&5(Rvl886c)、Z&pC(Rv0129c)和/Z;p"(Rv3803c)，括號(hào)中的數(shù)值是相應(yīng)的基因在Mtb基因組中的編號(hào)。推測(cè)Ag85Com中各組分的纖維連接蛋白結(jié)合能力應(yīng)該有利于Mtb附著到粘膜或細(xì)胞表面，便于其感染宿主細(xì)胞。Ag85Com通常是被Mtb分泌到桿菌細(xì)胞外面的，有少部分Ag85Com結(jié)合在分枝桿菌細(xì)胞表面。研究發(fā)現(xiàn)，侵入到人或動(dòng)物體內(nèi)的Mtb也能在巨噬細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生Ag85Com。通過對(duì)Ag85Com中各成分的基因突變型Mtb的研究表明，發(fā)現(xiàn)每種成分對(duì)Mtb都有一定的作用。例如，H37Rv型Mtb的fbpA基因突變后，就不能在THP1(人)或J774.Al(小鼠)巨噬細(xì)胞株中生長(zhǎng)，體外培養(yǎng)時(shí)也必須在Sauton培養(yǎng)基中補(bǔ)加脂肪酸后才能生長(zhǎng)。也就是說，fbpA基因突變將影響Mtb的生長(zhǎng)能力。當(dāng)Mtb的fbpC基因突變后，桿菌細(xì)胞壁中分枝菌酸的含量減少約40%，而且細(xì)胞壁中的分枝菌酸同阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan)的共價(jià)結(jié)合下降，整個(gè)細(xì)胞壁的完整性受到影響。預(yù)防用的疫畝類關(guān)鍵是要能引起機(jī)體產(chǎn)生對(duì)侵入的病原體產(chǎn)生抗體，清除細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的病原體，同時(shí)最關(guān)鍵的是還能使機(jī)體形成對(duì)特定病原體的免疫記憶能力。通常，引起人B-細(xì)胞反應(yīng)需要部分或整個(gè)抗原蛋白，而蛋白抗原上的幾個(gè)抗原決定簇就能誘導(dǎo)出T-細(xì)胞反應(yīng)。所以，設(shè)計(jì)新疫苗首先要考慮如何選擇抗原蛋白。僅選用肽段(決定簇/表位)，在一定程度上可避免了完整蛋白的潛在毒性，但這類疫苗引起B(yǎng)-細(xì)胞反應(yīng)能力方面明顯不及完整蛋白，因?yàn)閱渭兊碾念惗巫畲笕毕菔敲庖咴缘?，只有線性表位，而沒有構(gòu)象表位。一般認(rèn)為，人體對(duì)Mtb的防御主要依賴細(xì)胞免疫，而對(duì)體液免疫的作用還存在著不同的看法。Ag85Cora是Mtb分泌的一組兼有較強(qiáng)細(xì)胞及體液免疫活性的分泌蛋白，它們參與補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞途徑，刺激巨噬細(xì)胞將Mtb吞噬。研究表明單用Ag85A或Ag85B免疫豚鼠模型試驗(yàn)也有一定保護(hù)作用(MamadouDaff6，Themycobacterialantigens85complex-fromstructuretofunctionandbeyondTrendsinMicrobiology8(10):438-440,2000)，但實(shí)際動(dòng)物試驗(yàn)的結(jié)果又不太理想。又例如，牛分枝桿菌(j/ycoA3"e77'咖6ok&)培養(yǎng)物中的純化蛋白衍生物(PurifiedProteinDerivative,PPD)，其主要成分是Ag85Com，用它免疫受試者，86%健康而結(jié)核菌素陽(yáng)性受試者都有T-細(xì)胞增殖反應(yīng)和IFN-y的產(chǎn)生，這也表明Ag85Com可作為抗結(jié)核亞單位疫苗。但研究者將通過純化精制后Ag85Com用于試驗(yàn)，其免疫效果只有粗提取物的1/21/3(IrajNikokar等，EvaluationofCellularImmuneResponseagainstPurifiedAntigen85inPatientswithTuberculosisIran._J.Immunol.3(2):70_77,2006)。這種似乎有點(diǎn)矛盾的結(jié)果又表明Ag85Com在不同情況下性質(zhì)不太確定。有研究者將Mtb分泌到培養(yǎng)液中蛋白進(jìn)行初步分離純化，檢測(cè)純化的各組蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞毒T-淋巴細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)Ag85Com，特別是Ag85A的作用最強(qiáng)。將分離純化獲得的CFP-25、CFP-20.5、Ag85B、Ag85A和CPF-32共五種具有免疫優(yōu)勢(shì)的抗原組分，加入DDA-MPL佐劑，制成多組分的亞單位疫苗。在C57BL/6J小鼠中試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這種多價(jià)疫苗似乎比BCG有更好的效果(SurajB.Sable等Multicomponentantituberculoussubunitvaccinebasedonimmunodominantantigensofi^ro6a"ar/咖f"i)erc〃7os7'sVaccine23:4175-4184,2005)。己發(fā)現(xiàn)，Ag85A、Ag85B和Ag85D中有誘導(dǎo)人對(duì)Mtb產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)的抗原決定簇。例如，Ag85A中的VMPVGGQSSFYSDWY肽段，是一種強(qiáng)的Th抗原決定簇，能激發(fā)CD，細(xì)胞系產(chǎn)生IFN-y(Launois，P.等,T-cellepitopemappingofthemajorsecretedmycobacterialantigenAg85AintuberculosisandleprosyInfect.Immun.62,3679,1994);Ag85B中的一段15肽FQDAY艦GGH證F，能誘導(dǎo)小鼠Thl反應(yīng)，是一種T-細(xì)胞抗原表位，它還具有佐劑功效，能同時(shí)增強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫(KiyoshiTakatsu等，TheimmunogenicpeptideforThldevelopmentInternationalImraunopharmacology3:783-800，2003)。人體對(duì)Mtb的保護(hù)性是由CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，而Ag85A中有人的CD8+T細(xì)胞識(shí)別的抗原表位，使人產(chǎn)生比較強(qiáng)的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)分泌IFN-y，水解感染了Mtb的巨噬細(xì)胞(PCTW001/058461A1)?，F(xiàn)在還發(fā)現(xiàn)，Ag85D中的LAGKGISVV肽段，能引起特異細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞(CTL)產(chǎn)生，.刺激脾臟淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-y，是一種免疫優(yōu)勢(shì)型CD8+T細(xì)胞表位(A.Rafiei等，Identificationof伶c。A3"erj'咖tuZercuios/s1CTLEpitopesRestrictedbyHLA_A*0201in,Mice/ra/2/a/7所cw7erf/ca7/o"i77a7Wf7,'2J—。鑒于Mtb體外培養(yǎng)非常困難，培養(yǎng)過程中桿菌死亡破裂釋放出菌體內(nèi)部蛋白也影響抗原的完整性和純化，所以通過培養(yǎng)Mtb提取Ag85Com很難進(jìn)行實(shí)際生產(chǎn)。至今，對(duì)Ag85Com中各成分進(jìn)行基因重組表達(dá)和純化工作并不理想。雖然也有現(xiàn)有技術(shù)從Mtb體外培養(yǎng)液中分離純化了Ag85Com，但是由于純化方法、培養(yǎng)方法以及培養(yǎng)時(shí)間等方面的變化，實(shí)際獲得的Ag85Com中往往只含有AgS5A和Ag85B，有時(shí)沒有Ag85C，更不能保證Ag85D等抗原蛋白的存在?，F(xiàn)有技術(shù)中重組表達(dá)Ag85A、Ag85B、Ag85C和Ag85D研究的情況如下K.Salim等在棒狀桿菌(Co/T/eAa"ei"/t/歷g7i^a/w'c"http://)進(jìn)行了Ag85A的可溶性表達(dá)(K.Salim等，HeterologousExpressionofthe妙c0Za"e"'"y7"Z)erci/7os/sGeneEncodingAntigen85AinCor/neZ^cteWtw^/iyf柳ic"7Z7Applied&EnvironmentalMicrobiology63(11):4392-4400,1997)。L.Kremer等通過PCR法，從結(jié)核分枝桿菌H37Rv株中獲得/6;^、/Z^C(/^C0和/知"(/^")基因，插入pET23b載體的Ndel和XhoI位點(diǎn)，構(gòu)造出表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌C41(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出可溶性的，C-端帶有His-Tag的Ag85A、Ag85C和Ag85D蛋白(LKremer等，TheM.tuberculosisantigen85complexandmycolyltransferaseactivityLettersinAppliedMicrobiology34'233-237,2002)。有學(xué)者用PCR方法從MtbErdman(ATCC35801)株中獲得含有其天然信號(hào)肽的全長(zhǎng)/Z)/v!、/&/^和/^C基因，插入pET22b(+)載體，轉(zhuǎn)化BL21(DE》pLysS宿主菌經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后，可以分泌表達(dá)Ag85A、Ag85B和Ag85C蛋白；而將通過PCR獲得Ag85A、Ag85B和Ag85C成熟蛋白的基因直接融合到pelB信號(hào)肽之后，利用pelB引導(dǎo)蛋白分泌表達(dá)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)出的蛋白有兩種形式含有pelB信號(hào)肽的和無pelB信號(hào)肽的成熟Ag85A、Ag85B和Ag85C(GunterHarth等，NovelInsightsintotheGenetics,Biochemistry,andI誦unocytochemistryofthb3CH(ilodaltonMajorExtracellularProteinof妙coZa"er/湖t"6e徹7a^InfectionandImmunity64(8):3038-3047,1996)。有研究者通過PCR方法，獲得FbpC基因，將其插入到pET23b載體的Ndel-Xhol之間，Xhol位點(diǎn)前無終止密碼子，也就是在FbpC的后面帶有His-Tag,在BL21(DE3)pLys中，表達(dá)出N-端多一個(gè)Met而C-端還有His-Tag的rAgC蛋白，該蛋白具有分枝菌酰基轉(zhuǎn)移酶活性(LKremer,等，TheM.tuberculosisantigen85complexandmycolyltransferaseactivityLettersinAppliedMicrobiology34:233-237,2002)。有研究者獲得Ag85A、Ag85B和Ag85C蛋白對(duì)應(yīng)的基因序列，進(jìn)行適當(dāng)改造后克隆到pRSETB(Invitrogen)載體之中構(gòu)造表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化JM109(DE3)(Promega)宿主菌，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的rAg85各成分均為包涵體，還帶有His-Tag等多余的部分，經(jīng)過變復(fù)性后獲得了Ag85A、Ag85B和Ag85C蛋白(DonnaRusso等，NaiveHumanTCellsDevelopintoThlEffectorsafterStimulationwith妙coZa"erz'咖t"6erc"7as7's^InfectedMacrophagesorRecombinantAg85ProteinsInfect.I隱.68(12):6826-6832，2000)。IntercellSmartVaccines禾口ChironVaccineInternational公司都是通過基6因重組的手段獲得Ag85B-ESAT6融合蛋白，但使用了不同的疫苗佐劑。還有其它研究者是將Ag85Com組分的fbpA和fbpB基因插入不同的病毒(牛痘、腺病毒)載體或牛分枝桿菌BCG中，構(gòu)造不同的基因疫苗(MAVA)或rBCG。綜上，盡管本領(lǐng)域開發(fā)了Ag85相關(guān)的疫苗，然而效果還不盡如人意。并且，盡管本領(lǐng)域己經(jīng)嘗試了多種制備和純化Ag85A、Ag85B、Ag85C或Ag85D的方法，然而還沒有通過重組技術(shù)制備各蛋白并可真正有效裝配成Ag85Com的方法。因此，本領(lǐng)域還需要進(jìn)一步研究制備Ag85Com的新方法，以生產(chǎn)出可更有效誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的疫苗。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種重組的Ag85復(fù)合物以及制備重組抗原85復(fù)合物(recombinantAntigen85Complex，rAg85Com)的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供含有所述Ag85復(fù)合物的疫苗組合物。在本發(fā)明的第一方面，提供一種重組的抗原85復(fù)合物，該復(fù)合物含有重組抗原85A(recombinantAntigen85A,rAg85A)、重組抗原85B(recombinantAntigen85B,rAg85B)、重組抗原85C(recombinantAntigen85C,rAg85C)和重組抗原85D(recombinantAntigen85D，rAg85D)，并且rAg85A:rAg85B:rAg85C:rAg85D按照重量比為1:(1-2.5):(0.3-1.3):(0.6-2)。在另一優(yōu)選例中，所述的rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D的總和占rAg85Com重量的50-100%;優(yōu)選的是80-100%;更優(yōu)選的是95-100%;進(jìn)一步優(yōu)選的是99-100%。在另一優(yōu)選例中，所述的rAg85Com由rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D組成。在另一優(yōu)選例中，所述的復(fù)合物通過包含以下步驟的方法制備將rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D按照重量比為l:(1-2,5):(0.3-1.3):(0.6-2)的比例混合，從而rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D發(fā)生組合，形成rAg85Com。在另一優(yōu)選例中，rAg85A:rAg85B:rAg85C:rAg85D按照重量比為l:(2±0.2):(1±0.1):(1.5土0.2)。在本發(fā)明的第二方面，提供一種制備所述的抗原85復(fù)合物的方法，所述方法包括將rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D按照重量比為l:(1-2.5):(0.3-1.3):(0.6-2)的比例混合，從而rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D發(fā)生組合，形成rAg85Com。在另一優(yōu)選例中，在將rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D進(jìn)行混合時(shí)，在混合體系中還加入金屬離子。在另一優(yōu)選例中，所述的金屬離子是二價(jià)金屬離子。在另一優(yōu)選例中，所述的二價(jià)金屬離子選自(但不限于)Cu2+、Ni2+、Zr^或它們的組合。在另一優(yōu)選例中，所述的金屬離子在混合體系中的濃度是O.1-50mmol/L，優(yōu)選的是l-30mmol/L，更優(yōu)選的是2-20mmol/L。在另一優(yōu)選例中，rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D在混合體系中的總蛋白濃度為8ug/mL-100mg/mL。在另一優(yōu)選例中，rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D采用酵母細(xì)胞表達(dá)，方法是(a)將含有基因表達(dá)盒的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞，其中所述的基因表達(dá)盒分別含有rAg85A的編碼分子、rAg85B的編碼分子、rAg85C的編碼分子、rAg85D的編碼分子；獲得可分別表達(dá)rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D的重組酵母細(xì)胞；(b)分別培養(yǎng)所述可表達(dá)rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D的重組酵母細(xì)胞，獲得分別含有rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D的培養(yǎng)物；(c)從培養(yǎng)物中分離純化rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D。在另一優(yōu)選例中，所述的酵母細(xì)胞是甲醇酵母細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的rAg85A具有SEQIDNO:l所示的氨基酸序列；或所述的rAg85B具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；或所述的rAg85C具有SEQIDNO:3所示的氨基酸序列；或所述的rAg85D具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，rAg85A的編碼分子具有SEQIDNO:5所示的核苷酸序列，或具有SEQIDNO:5中第1391023位所示的所示的核苷酸序列；或rAg85B的編碼分子具有SEQIDNO:6所示的核苷酸序列，或具有SEQIDNO:6中第130984位所示的所示的核苷酸序列；或rAg85C的編碼分子具有SEQIDN0:7所示的核苷酸序列，或具有SEQIDNO:7中第1481029位所示的所示的核苷酸序列；或rAg85D的編碼分子具有SEQIDNO:8所示的核苷酸序列，或具有SEQIDNO:8中第109906位所示的所示的核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，步驟(c)中，純化rAg85A的方法是將含rAg85A蛋白的溶液疏水層析，收集洗脫液后進(jìn)行陰離子交換層析，收集洗脫液后進(jìn)行分子篩層析，從而獲得純化的rAg85A蛋白；或純化rAg85B的方法是將含rAg85A蛋白的溶液疏水層析，收集洗脫液，向該洗脫液中加入鈉鹽(如NaCl)，進(jìn)行螯合層析，收集流出液再進(jìn)行疏水層析，收集洗脫液進(jìn)行陰離子交換層析，梯度洗脫獲得純化的rAg85B蛋白；或純化rAg85C的方法是將包涵體復(fù)性后的rAg85C蛋白溶液進(jìn)行疏水層析，收集洗脫液后進(jìn)行陰離子交換層析，梯度洗脫獲得純化的rAg85C蛋白；或純化rAg85D的方法是將含rAg85A蛋白的溶液進(jìn)行疏水層析，收集洗脫液后進(jìn)行陰離子交換層析，梯度洗獲得純化的rAg85D蛋白。在本發(fā)明的第三方面，提供所述的rAg85Com的用途，用于制備防治結(jié)核分枝桿菌感染的組合物。在本發(fā)明的第四方面，提供一種多價(jià)的疫苗組合物，所述的疫苗含有有效量的所述的rAg85Com和藥學(xué)上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述的疫苗還含有有效量的選自下組的佐劑或佐劑組合-鋁佐劑；鋁佐劑+CpG佐劑；DDA佐劑+CpG佐劑；鋁佐劑+DDA(雙十八烷基二甲基溴化銨)佐劑+CpG佐劑；ISA-720佐劑ISA-720佐劑+CpG佐劑；ISA-720佐劑+DDA佐劑十CpG佐劑；或聚肌苷-聚胞苷(PolyI:C)佐劑。在另一優(yōu)選例中，所述的抗原85復(fù)合物與佐劑或佐劑組合的重量比例是(1-100):(1-100)。在本發(fā)明的第五方面，提供一種制備疫苗組合物的方法，所述方法包括將所述的rAg85Com與藥學(xué)上可接受的載體混合。另一方面，本發(fā)明還提供一種預(yù)防結(jié)核分枝桿菌感染的方法，所述方法包括給需要的對(duì)象施用所述的rAg85Com。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖IA.利用Ag85D天然信號(hào)肽構(gòu)建的工程菌，在9L發(fā)酵罐中發(fā)酵時(shí)，誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)不同時(shí)間(8hrs、16hrs和24hrs)，發(fā)酵上清中Ag85D蛋白，由于糖基化程度和N-端切除信號(hào)肽的位點(diǎn)不同，出現(xiàn)兩條相近的目的蛋白條帶。圖IB.突變消除N-糖基化位點(diǎn)后，利用Ag85D天然信號(hào)肽，分泌表達(dá)無糖基修飾的突變型Ag85D(r-mut-Ag85D)蛋白，由于N-端信號(hào)肽切開的位點(diǎn)不同，出現(xiàn)兩條相近的目的條帶。M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖1A和B中，O泳道是未誘導(dǎo)時(shí)的發(fā)酵上清，而8hrs、16hrs、24hrs、48hrs為甲醇誘導(dǎo)相應(yīng)時(shí)間時(shí)的發(fā)酵上清。圖2.甲醇酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D四種抗原的工程菌在甲醇誘導(dǎo)前后，菌體總蛋白SDS-PAGE電泳。rAg85ArAg85D分別代表rAg85A/X33、rAg85B/X33、rAg85C/X33和rAg85D工程菌誘導(dǎo)前后，尖頭所指示泳道為誘導(dǎo)后酵母菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的目的抗原蛋白條帶位置。圖3.純化制備的甲醇酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的四種抗原(rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D)以及四種抗原體外按不同比例裝配出的兩種rAg85Com的SDS-PAGE電泳。rAg85ArAg85D四個(gè)泳道為純化獲得的四種抗原組分，它們有形成聚合體的傾向；rAg85Coml:為四種抗原按rAg85A:rAg85B:rAg85C:rAg85D=2:3:1:2的比例混合形成的復(fù)合物;rAg85A:rAg85B:rAg85C:rAg85D=2:4:2:3的比例混合形成的復(fù)合物。圖4.表示培養(yǎng)的接受免疫過的小鼠脾臟T-淋巴細(xì)胞再次接觸rAg85抗原后，產(chǎn)生的IFN-Y的相對(duì)量?？v坐標(biāo)表示的是每5X105T-淋巴細(xì)胞產(chǎn)生INF-Y的平均數(shù)。圖5.rAg85Com2與不同佐劑組合制備的6組疫苗(TBVlTBV6)按標(biāo)準(zhǔn)免疫操作，引起接受免疫豚鼠脾臟T-淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-y水平的比較?？v坐標(biāo)為每5X105培養(yǎng)的T-淋巴細(xì)胞產(chǎn)生INF-y的平均數(shù)。圖6.四種純化的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的抗原(rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D)以及按不同比例組成的復(fù)合物rAg85Coml和rAg85Com2，用色譜柱(型號(hào)TSK-gelG3000SWxL，7.8mmX30cm，5um，T0S0H)，采用lOOmMPB-O.15MNaC1,pH7.24為流動(dòng)相，流速為lmL/min，柱溫為30'C，波長(zhǎng)280nm，等度洗脫洗脫，每種成分上樣量約IOng。凝膠分子量標(biāo)準(zhǔn)(GelFiltrationStandard,CatNo:151-1901)為Bio-Rad公司產(chǎn)品。其中的l為甲狀腺球蛋白(670kDa)、2為牛Y-球蛋白(158kDa)、3是卵清蛋白(44kDa)、4為肌紅蛋白(17kDa)，5是維生素B12(1350Da)。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次揭示體外將rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D按照重量比為l:(1-2.5):(O.3-1.3):(0.6-2)進(jìn)行組合，可獲得rAg85Com;該rAg85Com免疫動(dòng)物比單獨(dú)采用rAg85A、rAg85B、rAg85C或rAg85D具有顯著優(yōu)異的免疫原性，且在動(dòng)物體內(nèi)的抗體滴度高、細(xì)胞免疫原性更顯著。并且，在進(jìn)行組合的體系中加入金屬離子更有利于復(fù)合體的形成。此外，本發(fā)明人還首次利用同一種表達(dá)系統(tǒng)(酵母表達(dá)系統(tǒng))成功地表達(dá)出了結(jié)核分枝桿菌的rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D四種蛋白。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期研究認(rèn)為，應(yīng)該將Ag85Com作為一種參與Mtb細(xì)胞壁裝配的"多酶復(fù)合體"分子，或?qū)⑵湟暈橐环N在體液內(nèi)引導(dǎo)Mtb侵入細(xì)胞"錨分子"，而這種"多酶復(fù)合體"或"錨分子"在Mtb生長(zhǎng)或侵入人體的不同階段，其中的組成成分會(huì)發(fā)生變化。因此，經(jīng)純化后的Ag85Com免疫原性顯著降低，就是因?yàn)槠渲械哪承┏煞?例如，Ag85C，或Ag85D等)丟失，或純化導(dǎo)致某些成分結(jié)構(gòu)改變或純化導(dǎo)致各成分的比例失常等原因，使其不再是完整的"多酶復(fù)合體"或"錨分子"的緣故。因此，目前的現(xiàn)有技術(shù)中僅純化或重組表達(dá)Ag85Com中一種成分作為抗原，不會(huì)成為理想的疫苗侯選抗原。而最理想的方式是，重組獲得Ag85Com中的各組分，體外組裝出重組型Ag85Com作為新型肺結(jié)核疫苗的抗原，這應(yīng)該能夠獲得理想的研究結(jié)果。本發(fā)明人利用同一蛋白表達(dá)系統(tǒng)(酵母表達(dá)系統(tǒng))實(shí)現(xiàn)了rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D四種蛋白的分別表達(dá)，并且重新裝配出Ag85Com，也就是獲得了rAg85Com，這從根本上解決了大量獲得Ag85Com的難題。定義Ag85Com(Antigen85Complex,抗原85復(fù)合物)是指分枝桿菌分泌表達(dá)到培養(yǎng)基或動(dòng)物或人的體液中的由多種蛋白組成的復(fù)合物分子，通常包含有Ag85A、Ag85B和Ag85C,而本發(fā)明人認(rèn)為Ag85Com還應(yīng)包含有MPT51(也稱FbpD或Ag85D)，在沒有特別說明時(shí)本發(fā)明提及的Ag85Com都包括這四種蛋白。FbpA、FbpB、FbpC和FbpD是Ag85Com中四種蛋白成分的別稱，分別對(duì)應(yīng)于Ag85A、Ag85B、Ag85C和Ag85D，它們都具有結(jié)合人或動(dòng)物體液或細(xì)胞表面的纖維連接蛋白的能力。至于/6/^、/6/^、/化C和/Z^"(縮寫的第一個(gè)字母F用小寫，整個(gè)縮寫用斜體)代表Ag85Com中四種蛋白的全基因，包括了成熟蛋白和信號(hào)肽序列氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的全部DNA序列。a《《5a、s^J幼、a^"5c和ag《^/(小寫并用斜體)代表不含信號(hào)肽序列的成熟Ag85Com中四種蛋白對(duì)應(yīng)的DNA(基因)序列。以此類推，/z/W-/Z^/}、/6;5、M;t-Z&;C和/n〃t-/Z^"或M/t-a《《5"a、/my卜a《《幼、/m;t-a^95c和/my卜ag《5^就是對(duì)應(yīng)的突變形的基因。rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D是指采用基因工程方法，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)在生物表達(dá)系統(tǒng)(真核或原核)中生產(chǎn)的Ag85A、Ag85B、Ag85C和Ag85D蛋白，本發(fā)明主要描述了甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外表達(dá)，都能夠大量制備。本發(fā)明后面實(shí)施實(shí)例中所具體使用的rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D,以由它們組成的rAg85Com，如果沒有特別說明，實(shí)際所用的都是采用甲醇酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，其氨基酸序列分別符合SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。rAg85Com是指將基因工程手段分別表達(dá)并純化的rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D按一定的比例(如，2:3:1:2或2:4:2:3等)在體外組成的復(fù)合物分子。復(fù)合體及其組裝本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，體外將rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D按照重量比為l:(1-2.5):(0.3-1.3):(0.6-2)進(jìn)行混合，獲得的rAg85Com具有良好的免疫原性，且在體內(nèi)可形成.高的抗體滴度。因此，本發(fā)明提供一種rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D重量比例為1:(1-2.5):(0.3-1.3):(0.6-2)的rAg85復(fù)合物(或稱復(fù)合體)。更為優(yōu)選的比例是1:(2±0.2):(l土O.1):(1.5土0.2),該比例形成的復(fù)合體不僅免疫原性高，抗體滴度高，而且還更為穩(wěn)定。在將Ag85A、Ag85B、Ag85C和Ag85D進(jìn)行組合時(shí)，通常將純化的各蛋白按照比例溶于常規(guī)的蛋白緩沖體系中進(jìn)行(構(gòu)成混合體系)，所述的緩沖體系例如PB。通常混合體系中rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D總蛋白濃度在8ug/mL-100mg/mL;優(yōu)選的在20ug/mL-50mg/mL。所述的Ag85A、Ag85B、Ag85C和Ag85D優(yōu)選的是重組表達(dá)的蛋白，即rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，采用同一酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D四種蛋白可良好地組裝在一起，形成復(fù)合體形式的rAg85com。利用該復(fù)合體免疫動(dòng)物比單獨(dú)采用rAg85A、rAg85B、rAg85C或rAg85D具有顯著優(yōu)異的免疫效果，并且在動(dòng)物體內(nèi)的抗體滴度更高、細(xì)胞免疫性也更顯著。表達(dá)和純化因此，本發(fā)明提供一種制備所述的抗原85復(fù)合物的方法，所述方法包括將rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D按照重量比為l:(1-2.5):(0.3-1.3):(0.6-2)的比例混合，從而rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D發(fā)生組合，形成抗原85復(fù)合物。本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，在體外組合時(shí)，在混合體系中添加金屬離子后形成復(fù)合物分子的速度更快，且形成的復(fù)合物分子更穩(wěn)定。因此，所述方法還包括在rAg85A、rAg85B、rAg85C或rAg85D的混合體系中還加入金屬離子。所述的金屬離子優(yōu)選的是二價(jià)金屬離子，選自(但不限于)Cu2+、Ni2+、或Zn2'。所述的金屬離子在混合體系中的濃度通常0.1-50咖ol/L，優(yōu)選的是l-30mmol/L，更優(yōu)選的是2-20mraol/L。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，rAg85A、rAg85B、rAg85C或rAg85D通過重組表達(dá)來制備，重組表達(dá)的體系是酵母表達(dá)體系。盡管本領(lǐng)域已經(jīng)通過重組表達(dá)的方法表達(dá)了Ag85A、Ag85B、Ag85C或Ag85D中的部分蛋白，然而還沒有找到一種能夠同時(shí)基于一個(gè)系統(tǒng)來表達(dá)所有四種蛋白的有效方法。采用不同系統(tǒng)表達(dá)的蛋白不利于組裝成Ag85復(fù)合物，而僅用其中的一種或部分則效果不夠理想。此外，采用多種表達(dá)系統(tǒng)或表達(dá)方式，不利于規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)的試驗(yàn)，做了大量的重組表達(dá)設(shè)計(jì)和酵母密碼子偏好研究，最終實(shí)現(xiàn)了利用同一蛋白表達(dá)系統(tǒng)(酵母表達(dá)系統(tǒng))表達(dá)出rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D四種蛋白。優(yōu)選的，所述的酵母表達(dá)系統(tǒng)是甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠高效地生產(chǎn)本發(fā)明的重組蛋白，且具有成本低廉、適于大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)。并且，不同于原核表達(dá)的是，利用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)獲得的重組蛋白可保留與天然蛋白基本相同的構(gòu)型,并保留良好的生物活性，表達(dá)產(chǎn)量也很高。經(jīng)過甲醇酵母喜好的密碼子設(shè)計(jì)，本發(fā)明人通過人工方法全合成了Ag85Com中Ag85A、Ag85B、Ag85C和Ag85D四種蛋白的編碼基因，這些編碼基因可以攜帶信號(hào)肽編碼序列或不攜帶信號(hào)肽編碼序列，可用于分泌表達(dá)或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)相應(yīng)的蛋白。這些編碼基因是經(jīng)過密碼子優(yōu)化的，比相應(yīng)的天然基因更易于被甲醇酵母表達(dá)且表達(dá)產(chǎn)量很高。編碼基因上信號(hào)肽編碼序列的加入與否取決于所需表達(dá)的目的基因的種類以及是否需要將目的基因分泌到細(xì)胞外，以及所用的表達(dá)載體上是否含有信號(hào)肽。為保證分泌表達(dá)獲得rAg85Com中的成分不發(fā)生酵母類型的N-糖基化修飾，還可采用常規(guī)方法將編碼基因中對(duì)應(yīng)糖基化相關(guān)位點(diǎn)的序列進(jìn)行點(diǎn)突變，獲得不含N-糖基化修飾的突變形基因。具體地，各蛋白中主要發(fā)生糖基化修飾的位點(diǎn)是Ag85A的,3位，Ag85B的N3'、N加、N2'1BN瀏位,Ag85C的N9。、N'67、if。'、N211、N戰(zhàn)和1^57位以及Ag85D的N'43、N，編號(hào)是按照成熟蛋白的氨基酸數(shù)目序列)。突變可以通過多種方式，例如將糖基化位點(diǎn)的N突變成Q或其他氨基酸殘基，以不改變蛋白的生物學(xué)活性為基本評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)選的是將N變成Q或A。也可以按常規(guī)分子生物學(xué)操作，通過PCR的方法突變各基因中的N-糖基化位點(diǎn)，獲得不會(huì)發(fā)生修飾的突變型蛋白。本發(fā)明可采用適合于在酵母系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)的任何表達(dá)載體，更優(yōu)選的是適合于在甲醇酵母系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)的表達(dá)載體。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。所述的表達(dá)載體上還含有可與待表達(dá)基因操作性相連的其它功能或結(jié)構(gòu)元件，如多克隆位點(diǎn)等。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的表達(dá)載體是pPICZa類載體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含rAg85A、rAg85B、rAg85C或rAg85D編碼序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。包含適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，從而表達(dá)蛋白質(zhì)。在表達(dá)了所述蛋白后，還需要對(duì)獲得的蛋白進(jìn)行純化。組成rAg85Com的四種蛋白在性質(zhì)有許多相似性，特別是rAg85A、rAg85B和rAg85。但是，本發(fā)明人在實(shí)際表達(dá)和純化研究過程中還發(fā)現(xiàn)，它們還有各自的特點(diǎn)，因而純化的方法也有不同。四種蛋白可以采用細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，也可以采用分泌表達(dá)對(duì)于同一蛋白，細(xì)胞內(nèi)與分泌表達(dá)的蛋白的純化在預(yù)處理方式上有差別(即細(xì)胞內(nèi)表達(dá)需要進(jìn)行破菌處理)，純化的后續(xù)步驟相似。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的rAg85A的純化可如下進(jìn)行先將破菌上清經(jīng)過疏水層析介質(zhì)，收集洗脫下rAg85A蛋白洗脫溶液，并將此洗脫液通過陰離子交換介質(zhì)，梯度洗脫獲得高濃度的rAg85A蛋白溶液。最后將其通過分子篩層析，就可以獲得高純度的rAg85A蛋白。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的rAg85B的純化可如下進(jìn)行選擇疏水層析介質(zhì)作為第一步層析，收集含rAg85B的目的洗脫液，向該洗脫液中加入鈉鹽(如，NaCl等)，再上螯合層析介質(zhì)，收集該步驟的流出液再上疏水層析介質(zhì)，該步驟中獲得洗脫液經(jīng)過陰離子交換介質(zhì)后，梯度洗脫就可以得到高純度的rAg85B蛋白。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的rAg85C的純化可如下進(jìn)行酵母表達(dá)的rAg85C形成了包涵體，按照純化包涵體的常用方法將復(fù)性后的rAg85C溶液通過疏水層析介質(zhì)，就可以洗脫出純度比較高的rAg85C溶液，再通過陰離子交換介質(zhì)，就可以獲得高純度rAg85C蛋白。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的rAg85D的純化可如下進(jìn)行破菌上清通過疏水層析介質(zhì)，洗脫出含rAg85D的目的峰，再通過陰離子交換介質(zhì)，按梯度洗脫，就可以獲得高純度的rAg85D蛋白。本發(fā)明中所描述到個(gè)各種層析介質(zhì)，都是目前科研和生產(chǎn)中常用的商業(yè)化產(chǎn)品，如GEHealthcare、MerckBiosciences、TOSOHBioscienceLLC、Bio-Rad、PALL等生產(chǎn)廠家都有相應(yīng)的各種類型的層析介質(zhì)，使用他們生產(chǎn)的離子交換、疏水和金屬螯合層析介質(zhì)都可以采用相似的層析步驟，只需要調(diào)整緩沖液的pH或電導(dǎo)率等就可以純化出特定的目的蛋白。組合物本發(fā)明還提供一種組合物，優(yōu)選的是組合物是疫苗，所述的疫苗是指將本發(fā)明的rAg85com和藥學(xué)上可接受的載體混合后獲得的可用于預(yù)防分枝桿菌感染的疫苗。所述的藥學(xué)上可接受的載體例如佐劑。所述的疫苗可用于哺乳動(dòng)物(如人)，通?？芍瞥煽诜┗蜃⑸鋭┑男问?。結(jié)核病疫苗的研制過程中，佐劑的選擇非常關(guān)鍵，應(yīng)該兼顧細(xì)胞和體液免疫，特別是細(xì)胞免疫能力。本發(fā)明人將rAg85Com與不同佐劑組合，在動(dòng)物模型中初步測(cè)定引起的細(xì)胞和體液免疫強(qiáng)度，檢測(cè)疫苗的保護(hù)效力，確定rAg85Com與鋁佐劑、CpG、雙十八烷基二甲基溴化銨(DDA)、MontanideISA720的組合能誘導(dǎo)受試動(dòng)物最理想的保護(hù)作用。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的疫苗可以選自如下的組合(1).rAg85Com與鋁佐劑組合；(2).rAg85Com與鋁佐劑、CpG組合;(3).rAg85Com與DDA、CpG佐劑組合;(4).rAg85Com與鋁佐劑及DDA+CpG佐劑組合；(5).rAg85Com與ISA-720佐劑組合；(6).rAg85Cora與ISA-720、CpG佐劑組合；(7).rAg85Com與ISA-720、DDA+CpG佐劑組合；或(8).rAg85Com與聚肌苷-聚胞苷(Polyl:C)佐劑組合。其中，鋁佐劑是一種傳統(tǒng)佐劑，其制備和檢測(cè)方法都是本領(lǐng)域已知的。CpG是一類脫氧核苷酸片段，它能誘發(fā)動(dòng)物體天然的免疫反應(yīng)；作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，本發(fā)明人設(shè)計(jì)了人工全合成一段分子內(nèi)含有8個(gè)CpG序列，由47個(gè)堿基組成的脫氧核苷酸片段，并命名該片段為CpG-0DN/TBV-WX，其全序列如SEQIDNO:14所示。通常CpG都是同其他佐劑混合使用，所以本發(fā)明人嘗試了將CpG-0DN/TBV-WX添加到鋁佐劑、DDA佐劑、MontanideISA-720佐劑中的研究。DDA(雙十八垸基二甲基溴化銨)是一種陽(yáng)離子表面活性劑，通常作為殺菌用途，它在溶液中可以形成"油包水型"微球，將抗原蛋白或DNA分子包裹其中。ISA-720是S印pic公司(法國(guó))的商品化疫苗佐劑，已經(jīng)在瘧疾疫苗的研究中被選用。聚肌苷-聚胞苷(PolyI:C)是一種廣譜的抗病毒類藥物，也可作為佐劑。除非另外提供或說明，本發(fā)明所用的佐劑或制備佐劑的材料均可通過商購(gòu)的途徑獲得?？呻S免疫動(dòng)物的種類不同調(diào)節(jié)rAg85Com和佐劑的使用劑量以及它們之間的使用比例。rAg85Com和佐劑的使用量還可參考臨床或其他標(biāo)準(zhǔn)，通常在用于人時(shí)，rAg85Com的使用量在10Pg5mg。最佳使用量以能引起人體發(fā)生最佳體液和細(xì)胞免疫的最低抗原劑量為準(zhǔn)。所述的rAg85Com與佐劑或佐劑組合的比例通常在(1-100):(1-100);優(yōu)選的在(1-50):(1-50);更優(yōu)選的在(1-20):(1-20);如比例可以是l:l;1:10?？赏ㄟ^試驗(yàn)來確定合適的劑型和劑量，檢測(cè)不同佐劑類型rAg85Com在受試動(dòng)物中的免疫反應(yīng)的方式例如如下(l).免疫方式采用肌肉或皮下注的方法免疫豚鼠三次，每次之間間隔3周。每次每13只豚鼠的后腿注射0.5mL待測(cè)試的抗原、佐劑或疫苗。(2).細(xì)胞免疫反應(yīng)分別在免疫后的第3和6周時(shí)，從被免疫豚鼠的脾臟中按標(biāo)準(zhǔn)方法，分離出外周血單核細(xì)胞(PBMC),并稀釋到2X10S的細(xì)胞濃度，分別培養(yǎng)于96孔板中，每孔200yL，培養(yǎng)后用不同的抗原(rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D和rAg85Com)重新刺激培養(yǎng)的細(xì)胞，加入抗原約72小時(shí)后取培養(yǎng)孔中的上清，用Elisa法測(cè)定上清中IFN-Y含量的高低，確定抗原誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫強(qiáng)弱。(3).體液免疫反應(yīng)抗體分析采用常規(guī)的免疫操作方法，用純化的四種抗原蛋白包被96孔板，采用Elisa法測(cè)定被免疫豚鼠血清的抗體滴度。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。實(shí)施例1工程菌的構(gòu)建1./々pAJ^7厭/Z!pC和/Zp"基因的設(shè)計(jì)與合成a.制備含有信號(hào)肽編碼序列的全基因序列根據(jù)GeneBank中公開的MtbH37Rv全基因組序列中有關(guān)Mtb分泌表達(dá)的Ag85Com中的Ag85A(SEQIDNO:1)、Ag85B(SEQIDNO:2)、Ag85C(SEQIDNO:3)和Ag85D(SEQIDN0:4)四種蛋白的氨基酸序列信息，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)找到甲醇酵母菌喜好的密碼子，委托上海生工生物工程公司(Sangon)人工全合成其天然的全基因序列(包含信號(hào)肽部分的編碼序列)/Z;^(SEQIDNO:5)、/Z^5(SEQIDNO:6)、/ZpC(SEQIDNO:7)和/^Z(SEQIDNO:8)全基因序列。常規(guī)方法在各基因的5.-端設(shè)計(jì)DNA限制性內(nèi)切酶AsuII識(shí)別序列TTCGAA，為增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄效率，又特別在AsuII(TTCGAA)和基因的起始密碼子ATG之間插入三個(gè)腺嘌呤堿基序列(AAA，用以增強(qiáng)表達(dá)效率)；3.-端設(shè)計(jì)了TAA和TAG雙終止密碼子，以及緊隨其后的DNA限制性內(nèi)切酶Notl位點(diǎn)GCGGCCGC。人工全合成的基因均亞克隆到通用質(zhì)粒載體pUC57(華美生物工程公司)中，從而用AsuII和Notl雙酶切就可獲得5._端為AsuII，而3.-端為Notl的/Z，;^、/6;^、/Z/C和/Z)p"基因。b.制備糖基化位點(diǎn)突變的蛋白為保證分泌表達(dá)獲得Ag85Com中的成分不發(fā)生酵母類型的N-糖基化修飾，可用常規(guī)方法將編碼基因中糖基化相關(guān)位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變，獲得不含N-糖基化修飾的突變型歷"-/ApAM/t-77"-/2^7和/K7t-Z&p"基因，利用酵母分泌表達(dá)突變型Ag85Com蛋白。c.制備成熟蛋白的基因序列利用合成的引物，通過PCR的方法，從完整的/S/vl、f&仏/&/^和/^Z基因中獲得不含信號(hào)肽的成熟蛋白部分的DNA序列，另在每個(gè)DNA序列的5.-端添加起始密碼子ATG，5._端設(shè)計(jì)DNA限制性內(nèi)切酶AsuII識(shí)別序列TTCGAA，為增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄效率，在AsuII(TTCGAA)和起始密碼子ATG之間還插入AAA堿基序列；3.-端設(shè)計(jì)TAA和TAG雙終止密碼子，以及緊隨其后的DNA限制性內(nèi)切酶Notl位點(diǎn)GCGGCCGC。最后PCR獲得四個(gè)成熟蛋白的基因序列如財(cái)《fe(SEQIDNO:10)、財(cái)《幼(SEQIDNO:11)、a-c(SEQIDNO:12)和銀艦(SEQIDNO:13)。2.表達(dá)載體構(gòu)造a.分泌表達(dá)型載體甲醇酵母(尸/c力iapssforys)表達(dá)載體pPICZaA(Invitrogen)的a-信號(hào)肽DNA序列前有內(nèi)切酶AsuII(TTCGAA)位點(diǎn)，多克隆位點(diǎn)(MCS)中有Notl切點(diǎn)。利用AsuII和Notl雙切pPICZaA載體，就可以獲得不含a-信號(hào)肽和MCS序列，而其他調(diào)控序列(如，5,端AOX,啟動(dòng)子，3.-端終止序列等)都完整的pPICZ-AsuII/Notl載體片段。該載體片段中可插入經(jīng)AsuII-Notl雙切出的ZZp4、/々p5、/6;C和/々p"基因，構(gòu)造出pPICZ-/Z，pApPICZ-/ZwApPICZ-/Z^C和pPICZ-ZZ^"四個(gè)分泌型表達(dá)載體。因?yàn)椴迦氲幕?/^A/&/5、/i^C和A/^都有自身信號(hào)肽序列，可以利用自身信號(hào)肽在酵母菌中進(jìn)行分泌表達(dá)，此時(shí)表達(dá)的蛋白將發(fā)生程度的不同的N-糖基化修飾。如果只是利用表達(dá)載體的a-信號(hào)肽，則采用常規(guī)方法重新設(shè)計(jì)引物，按照pPICZdA載體的標(biāo)準(zhǔn)操作就可以獲得在甲醇酵母中分泌表達(dá)的Ag85A、Ag85B、Ag85C和Ag85D蛋白，不過此時(shí)表達(dá)的蛋白也都將發(fā)生程度不同的N-糖基化修飾。具體是:Ag85A的N2。3位，Ag85B的N31、N2。3、N2'3和N朋位，Ag85C的N9。、N167、N加、N21、N加和『位以及Ag85D的N143、N'89位點(diǎn)等處會(huì)發(fā)生修飾，其中的氨基酸殘基的編號(hào)是按成熟蛋白的氨基酸序列。也可以按常規(guī)分子生物學(xué)操作，通過PCR的方法突變各基因中的N-糖基化位點(diǎn)，將氨基酸N突變成不會(huì)發(fā)生修飾的Q或A等氨基酸殘基，獲得不會(huì)發(fā)生修飾的突變型Ag85A、Ag85B、Ag85C和Ag85D蛋白。b.細(xì)胞內(nèi)表達(dá)型載體而將上述獲得的a《《&、堪&幼、塔《5c和堪然t/基因，經(jīng)過AsuII和NotI雙切后，插入經(jīng)AsuII和Notl雙切的pPICZaA載體中，就能構(gòu)造出pPICZ-艱《5a、pPICZ-a^9幼、pPICZ-ag《5c和pPICZ-a《&W四個(gè)酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)型載體。3.菌種的誘導(dǎo)表達(dá)篩選將按照分子生物學(xué)的常規(guī)操作，先將前述制備獲得的各重組載體進(jìn)行全基因測(cè)序，確認(rèn)序列完全正確后，用SacI線性化處理，轉(zhuǎn)化甲醇酵母宿主菌X33(購(gòu)自Invitrogen)感受態(tài)細(xì)胞，鋪YPDZ(YPD+500ug/mLZeocin)平板，挑選陽(yáng)性克隆，先在YPD培養(yǎng)液中增殖，再轉(zhuǎn)入B麗Y誘導(dǎo)培養(yǎng)液中.，誘導(dǎo)約30小時(shí)，以誘導(dǎo)前菌體為對(duì)照，電泳分析誘導(dǎo)后菌體總蛋白，選擇表達(dá)量高的用于在發(fā)酵罐中大規(guī)模發(fā)酵。試驗(yàn)例1構(gòu)建分泌型表達(dá)Ag85D的工程菌株a.目的基因的獲得采用甲醇酵母喜好密碼子，分別設(shè)計(jì)了Mtb的/XW、/ZwA/知C和/Z，p"四種蛋白的全基因序列，委托上海生工生物工程有限公司(Sangon)全基因合成這四條基因，四條基因都插入到通用的載體PUC57中，基因的5._端有AsuII位點(diǎn)，而3.-端有Notl位點(diǎn)。以pUC57-Z^Z為例，則先培養(yǎng)含pUC57-/6/^質(zhì)粒的DH5a菌，抽提質(zhì)粒，用AsuII/Notl雙切，膠回收長(zhǎng)度約920bp的酶切DNA片段(/^;^基因)作為插入載體中基因。b.表達(dá)載體的構(gòu)建用AsuII/Notl雙切pPICZaA載體，切除a-信號(hào)肽和多克隆位點(diǎn)序列(MCS)，回收載體pPICZ-AsuII/Notl大片段，作為插入用載體。將Z^/和pPICZ-AsuII/Notl建立如下連接反應(yīng)(總體積IOWJ:pPICZ-AsuII/Notl(載體)2叱；/Sp"(基因)4叱；T4連接緩沖液(10X)l叱；T4連接酶(10WeissUnit/叱)0.5叱；dH202.5叱。25'C,連接60分鐘，65'C滅活T4連接酶10分鐘后，轉(zhuǎn)化CaCl2法制備的NovaBlue(Novagen)感受態(tài)細(xì)胞，鋪LB+1.5%Agar+25^g/mlZeocin平板，挑選陽(yáng)性克隆，AsuII/Notl雙酶切篩選并用5A0X1或3A0X1通用引物(Sagon)確認(rèn)/Z^/基因序列以及插入位點(diǎn)兩端序列正確無誤。c.工程菌的表達(dá)篩選將構(gòu)建成功的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)載體pPICZ-Z^",用Sacl線性化處理，按Irwitrogen操作手冊(cè)中的標(biāo)準(zhǔn)操作電轉(zhuǎn)化(Minopeot)甲醇酵母宿主菌X33，鋪含有Zeocin的YPDZ(YPD+1.5%Agar+500tig/mlZeocin)平板，倒置平板于30。C下培養(yǎng)34天，挑選平板上的單克隆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)篩選。用YPD培養(yǎng)液增殖陽(yáng)性克隆，約68小時(shí)，當(dāng)菌體OD咖達(dá)到23時(shí)，保存一份菌液為暫留菌種，并將其余菌液4000rpm離心，上清凍存作誘導(dǎo)前對(duì)照。將菌體懸浮后轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)液BMMY，300rpm振蕩培養(yǎng)，每過24小時(shí)補(bǔ)無水甲醇至甲醇之終濃度為0.5%，如此維持甲醇誘導(dǎo)狀態(tài)約48小時(shí)。用誘導(dǎo)前上清作對(duì)照，電泳檢測(cè)誘導(dǎo)后發(fā)酵上清中rAg85D蛋白條帶出現(xiàn)。選擇多個(gè)克隆，挑選上清中表達(dá)產(chǎn)量高的菌落作為發(fā)酵用工程菌株，命名為SigD-Ag85D/X33(SigD代表/Z^Z基因的信號(hào)肽序列)。獲得酵母工程菌發(fā)酵分泌表達(dá)rAg85D的情況如圖1A。分泌型表達(dá)Ag85A、Ag85B、Ag85C的工程菌株的建立方法基本同Ag85D。d.分泌表達(dá)的rAg85D的N-端測(cè)定/6pZ基因在甲醇酵母中可以利用自身的信號(hào)肽序列進(jìn)行分泌表達(dá)，但是上清中的rAg85D蛋白SDS-PAGE電泳時(shí)有兩條非?？拷牡鞍讞l帶,其表觀分子質(zhì)量均大于30kDa，采用質(zhì)譜法測(cè)定發(fā)酵上清中rAg85D的分子質(zhì)量為30.26kDa和31.84kDa，比Ag85D的理論值(27.81kDa)略大。將其轉(zhuǎn)PVDF膜，分別測(cè)定N-端氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)兩條帶中的蛋白N-端都不均一，分別有A-E-P-T-A-K-A-A-P-Y-和A_P-Y-E-N-L-M-V-P-S-兩個(gè)N-端。這表明，利用/"/bp"基因自身信號(hào)肽序列在甲醇酵母中分泌表達(dá)時(shí)，出現(xiàn)兩條帶的原因既有N-端不均一的原因，也有N-型糖基化修飾程度差別的因素。甲醇酵母分泌表達(dá)Ag85D蛋白時(shí)，蛋白天然信號(hào)肽序列的切除方式同Mtb自然狀態(tài)下分泌方式相似，也都產(chǎn)生了有兩種類型N-端Ag85D蛋白，只是Mtb分泌表達(dá)的Ag85D蛋白沒有發(fā)生糖基化修飾，而在酵母系統(tǒng)分泌表達(dá)時(shí)產(chǎn)生的rAg85D蛋白有糖鏈修飾。因此，在設(shè)計(jì)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)rAg85D蛋白時(shí)，應(yīng)考慮在第2個(gè)信號(hào)肽切點(diǎn)，即從A-P-Y-E-N-L-M-V-P-S-處作為Ag85D的起始點(diǎn)，以避免細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)N-端不均一。試驗(yàn)例2.構(gòu)建點(diǎn)突變修改N-糖基化位點(diǎn)且分泌表達(dá)Ag85D的工程菌株a.目的基因的PCR定點(diǎn)突變根據(jù)試驗(yàn)例1中分泌表達(dá)的rAg85D蛋白有N-糖基化修飾，本發(fā)明人設(shè)計(jì)對(duì)Ag85D中的兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)突變的引物通過PCR方法，將Ag85D中第一個(gè)糖基化位點(diǎn)N"3-T-T(位點(diǎn)以成熟Ag95D蛋白的氨基酸序列計(jì))中的N突變?yōu)镼時(shí)所用的引物QTT-P5(SangonNoM90805):5，—ggtttcttgtacccateccaaaccacc—3，(SEQIDNO:15);QTT-P3(SangonNoAA90806):5'-ggtggtttgggatgggtacaagaaacc-3，(SEQIDNO:16)。將第二個(gè)糖基化位點(diǎn)N180-N-T(位點(diǎn)以成熟Ag95D蛋白的氨基酸序列計(jì))中的N突變?yōu)镼時(shí)所用的PCR引物是QNT-P5:5，-caacaaaacaccagagtctgggtctggtec-3'(SEQIDNO:17);QNT-P3:5'-ggaccagacccagactctggtgttttgttg-3，(SEQIDNO:18)。以試驗(yàn)例1中構(gòu)建的pPICZ-/&7"載體為模板，用通用引物5A0X1、3A0X1以及上述的QTT-P5、QTT-P3、QNT-P5和QNT-P3四條引物，對(duì)fbpD基因進(jìn)行分段PCR，修改其中的N-糖基化位點(diǎn)氨基酸殘基N密碼子AAC為CAA(Q)，最后獲得了無N-糖基化位點(diǎn)的突變型m;卜/Ao"基因(SEQIDNO:9)。b.表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)載體pPICZ-/m/t-/Z^"的構(gòu)建與試驗(yàn)例1中pPICZ-/6/7"構(gòu)建相似。c.工程菌的表達(dá)篩選分泌表達(dá)工程菌的篩選同試驗(yàn)例1也相似，最后獲得的工程菌命名為mut-Ag85D/X33，其分泌表達(dá)無糖基化修飾的突變型Ag85D(r-mut-Ag85D)蛋白的情況如圖1B。d.分泌蛋白的質(zhì)譜和N-端測(cè)定分泌到發(fā)酵液中的無糖基化位點(diǎn)的mut-Ag85D蛋白仍然是兩條帶，質(zhì)譜測(cè)定分子量不同的兩種蛋白:28566.73Da和27858.12Da。N-端測(cè)序發(fā)現(xiàn)，分子量偏大的蛋白條帶前10個(gè)氨基酸序列是A-E-P-T-A-K-A-A-P-Y-,而分子量偏小的蛋白條帶前10個(gè)氨基酸序列是A-P-Y-E-N-L-M-V-P-S-，兩者N-端相差A(yù)-E-P-T-A-K-A共7個(gè)氨基酸殘基。而采用類似方法表達(dá)的突變修改N-糖基化位點(diǎn)，且分泌表達(dá)的Ag85A、Ag85B、Ag85C工程菌株，實(shí)際所分泌表達(dá)的Ag85A、Ag85B和Ag85C都沒有出現(xiàn)N-端不均一的情況，其N-端序列前15個(gè)氨基酸殘基均為F-S-R-P-G-L-P-V-E-Y-L-Q-V-P-S-。試驗(yàn)例3.構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Ag85A的工程菌株a.目的基因的獲得用Sangon合成的pUC57:Z&p^載體或亞克隆方式構(gòu)建的pPICZ-ybp4分泌表達(dá)載體為模板，用重新合成的如下引物Ag85A-P5:5-catttcgaaaaaatgcatttggttgacagagtt-3(SEQIDNO:19);Ag85A-P3:5-catgcggecgetattaagcaccttgtgg-3(SEQIDNO:20)。通過PCR的方法，獲得成熟的Ag85A蛋白所對(duì)應(yīng)的DNA(基因)序列(SEQIDNO:10，為與化/^基因區(qū)別，特將此DNA片段稱a^5a基因(用小寫斜體表示，以區(qū)別Ag85A蛋白)。將PCR產(chǎn)物先進(jìn)行柱回收，再用AsuII/Notl雙酶切后膠回收s^5a基因片段，作為連接反應(yīng)用。b.表達(dá)載體的構(gòu)建采用與試驗(yàn)例1類似的方式構(gòu)造pPICZ-s《《fe細(xì)胞內(nèi)表達(dá)載體。c.工程菌的表達(dá)篩選大體構(gòu)建成功的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)載體pPICZ-a^5^a,用Sacl線性化處理，按Invitrogen操作手冊(cè)，用Cell-Porator型電轉(zhuǎn)化儀(GibcoBRLLifeTechnologies,USA)，按標(biāo)準(zhǔn)操作電轉(zhuǎn)化甲醇酵母宿主菌X33，鋪含有Zeocin的YPDZ(YPD+1.5%Agar+500wg/mlZeocin)平板，倒置平板于30'C下培養(yǎng)34天，挑選平板上的單克隆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)篩選。用YPD培養(yǎng)液增殖陽(yáng)性克隆，約68小時(shí)，當(dāng)菌體OD咖達(dá)到23時(shí)，保存一份200叱菌液為暫留菌種，另一份10(HxL菌液中的菌體凍存，作為誘導(dǎo)前菌體對(duì)照，并將其余菌液4000rpm離心，收集轉(zhuǎn)接于誘導(dǎo)培養(yǎng)液BMMY中，300rpm振蕩培養(yǎng)，約2430小時(shí)時(shí)，取少量菌體。將此時(shí)的菌體與誘導(dǎo)前凍存的菌體用lXLyticase緩沖液懸浮，各加入2ML的Lyticase(酵母破壁酶，Tiangen公司)，混勻25'C約2小時(shí)，加入等體積的2XSDS-PAGE上樣緩沖溶液，煮沸約5分鐘，再高速離心5分鐘，取上清。SDS-PAGE電泳檢測(cè)誘導(dǎo)前后菌體總蛋白條帶的區(qū)別，確定細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況。以此方法選擇多個(gè)克隆，用表達(dá)產(chǎn)量最高的為菌種，命名為rAg85A/X33。而構(gòu)造細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Ag85B、Ag85C、Ag85D的工程菌株的方式與Ag85A基本同，分別命名為rAg85B/X33、rAg85C/X33和rAg85D/X33,其誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白前后的SDS-PAGE電泳圖譜如圖2。實(shí)施例2發(fā)酵罐發(fā)酵試驗(yàn)例1.分泌表達(dá)的工程菌發(fā)酵(以Ag85D的表達(dá)為例)發(fā)酵種子液的準(zhǔn)備將2支甘油管保存的lml/管裝的Ag85D/X33菌種按1:500的比例，轉(zhuǎn)接入1瓶裝有1000mLYPD培養(yǎng)液的3L搖瓶中，30°C，300rpm培養(yǎng)24小時(shí)，使0D600達(dá)5.07.0，鏡檢證實(shí)酵母形態(tài)正常且無雜菌污染后，作為上罐用種子液。在30L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中的初始基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基BSM(85%H3P0426.7ml/L、CaS040.93g/L、K2S0418.2g/L、MgS04.7H2014.9g/L、KOH4.13g/L、甘油40g/L)體積為15L，121'C滅菌30分鐘，用氨水將pH值調(diào)為5.0，起始轉(zhuǎn)速300rpm，通氣量1.Ovvm,添加30mL微量元素培養(yǎng)基PTM,(CuS(V5H206.Og/L、Nal0.08g/L、MgS04'H203.Og/L、Na2Mo04'2H200.2g/L、H3B030.02g/L、CoCl20.5g/L、ZnCl220.Og/L、FeS04'7H2065.Og/L、Biotin0.2g/L、H2S045ml)。將種子液按1:15接種，進(jìn)行分批培養(yǎng)，菌體增殖階段溫度為30.0'C，當(dāng)罐培養(yǎng)基中的甘油耗盡后，溶氧(DO)值急劇上升。開始甘油補(bǔ)料階段，初始設(shè)定甘油補(bǔ)料速度為150mL/h，補(bǔ)料2小時(shí)后設(shè)定甘油補(bǔ)料速度為350mL/h，流加24個(gè)小時(shí)，通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速、罐壓、空氣流量、使D0不低于2(W。至菌體濕重達(dá)到180200g/L，用氨水將pH值調(diào)為6.2。開始補(bǔ)入甲醇進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，最初甲醇加入量控制在1520mL/小時(shí)，緩慢增加甲醇的加入量持續(xù)約3小時(shí)，再將甲醇加入量提高至120mL/小時(shí)。通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速、罐壓、空氣流量使溶氧不低于20%，并保持此補(bǔ)加甲醇狀態(tài)躍64小時(shí)，結(jié)束發(fā)酵，8000rpm離心15分鐘，收集發(fā)酵上清。分泌表達(dá)Ag85A、Ag85B、Ag85C的工程菌發(fā)酵方法基本同分泌表達(dá)Ag85D的工程菌發(fā)酵方法。試驗(yàn)例2.細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的工程菌發(fā)酵前述獲得的可細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的重組菌種分別命名為rAg85A/X33、rAg85B/X33、rAg85C/X33和rAg85D/X33，它們進(jìn)行發(fā)酵的過程基本相同。將種子液按l:15接種量接入裝有15LBSM培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，整個(gè)發(fā)酵的可分三個(gè)階段①菌體增殖培養(yǎng)階段生長(zhǎng)溫度30'C，起始轉(zhuǎn)速300rpm培養(yǎng)，通氣量15L/min，用氨水調(diào)將pH值調(diào)為5.0，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、通氣量、罐壓維持溶氧(DissolvedOxygen,D0)值不低于2(W。約20小時(shí)左右，DO值迅速上升，菌體濕重約120g/L時(shí)表明此階段結(jié)束。②甘油補(bǔ)料的菌體增殖階段以150350mL/h的速率補(bǔ)加50%的甘油溶液，補(bǔ)加約4小時(shí)至菌體濕重約200g/L時(shí)。停止補(bǔ)料，DO值上升，維持此狀態(tài)(饑餓)半小時(shí)，同時(shí)用氨水將pH值調(diào)為6.0，準(zhǔn)備誘導(dǎo)。③誘導(dǎo)表達(dá)階段緩慢增加甲醇的加入量，待其適應(yīng)后，以120mL/h的速率補(bǔ)加，同時(shí)維持D0值不低于20t調(diào)pH為5.0,溫度保持在2528'C，誘導(dǎo)約2832小時(shí)，結(jié)束發(fā)酵后8000rpm離心15分鐘，收集菌體。按上述方法獲得的四種抗原在誘導(dǎo)前后細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況見圖2。實(shí)施例3細(xì)胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物的具體純化過程純化前的破菌處理發(fā)酵獲得的重組酵母菌體采取相同的破菌方式，先用0.1MTris/HCl，pH8.0緩沖液，按濕菌體與破菌緩沖液為1:10(g/V)的比例懸浮菌體，用ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司(上海)的AH-100B型高壓均質(zhì)機(jī)破菌，破菌壓力為1200bar，保證整個(gè)破菌過程中破菌液的溫度不超過25T:，循環(huán)破菌三次，鏡檢破菌效率不低于90%，高速離心收集的破菌上清或沉淀。對(duì)于rAg85A/X33、rAg85B/X33和rAg85D/X33菌體的破菌上清，目的蛋白在破菌上清中，需要用00.22um膜(Satorious)過濾破菌上清，收集上清進(jìn)行后續(xù)層析純化，而rAg85C/X33菌的rAg85C蛋白(包涵體)在菌沉淀之中，則棄上清，收集離心沉淀進(jìn)行后續(xù)純化。a.rAg85A的純化先將破菌上清經(jīng)過疏水層析介質(zhì)，選擇OctylS印haroseFF疏水層析，平衡及捕獲緩沖液為20mMTris/HCl，pH8.0，用H20可以洗脫下rAg85A蛋白。將此洗脫液加入20mMPB,pH8.0,通過Q-S印haroseFF陰離子交換，可以用20mMPB，pH7.0緩沖液洗脫出高濃度的rAg85A蛋白溶液。最后將其通過Supedex75分子篩層析，用20mMPB，pH7.0緩沖液洗脫，收集主峰，從而獲得高純度的rAg85A蛋白。b.rAg85B的純化向破菌液中加入20mMTris/HCl，2MNaCl，pH8.O母液，至終濃度20mMTris/HCl,0.5MNaClpH8.0，先經(jīng)過疏水層析介質(zhì)，選擇OctylS印haroseFF疏水層析，平衡及捕獲緩沖液為20mMTris/HCl，0.5MNaCl,pH8，用20mMTris/HCl，0.3MNaCl，pH8.0除雜洗脫后，用20mMTris/HCl，pH8.0緩沖液洗脫出含rAg85B的目的峰。向該洗脫液中加入NaCl母液至終濃度為0.5M，上螯合層析介質(zhì)(如，Ni2+-ChelatingS印haroseFF，Cu"-ChelatingS印haroseFF等)，此步驟的結(jié)合緩沖為20mMTris/HCl，0.5MNaCl,pH7.5，直接收集流出液再上OctylS印haroseFF疏水層析，可用20mMTris/HCl，pH8.0緩沖液洗脫出rAg85B目的峰。最后將收集的洗脫峰通過QS印haroseFF陰離子交換層析，此步驟的結(jié)合緩沖液為20mMTris/HCl，pH8.0，用20mMTris/HCl，0.1MNaCl,pH8.5緩沖液除雜，用20mMTris/HCl，0.5MNaCl，pH8.0緩沖液洗脫出高純度的rAg85B蛋白。c.rAg85C的純化甲醇酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的rAg85C形成了類似包涵體的沉淀，對(duì)rAg85C的純化采用了純化包涵體的常用方法先用O.1MTris/HCl，8M尿素，pH8.5裂解液溶解沉淀(包涵體)，用0.1MTris/HCl，20%Glycerol，lmMEDTA，lmMGSH，0.lmMGSSG，pH8.5復(fù)性緩沖液稀釋裂解液，4'C下復(fù)性約60小時(shí)。將復(fù)性液用00.22um膜(Satorious)過濾，上清通過OctylS印haroseFF疏水層析，上樣及平衡緩沖液為50mMTris/HCl，pH8.0，用H20洗脫出含rAg85C的目的峰。收集的目的峰通過QS印haroseFF陰離子交換層析，此步驟的平衡緩沖液為20mMTris/HCl,pH8.0,除雜緩沖液為20mMTris/HCl，0.1MNaCl,pH8.0，用20mMTris/HCl，0.25MNaCl,pH8.0洗脫出高純度的rAg85C目的蛋白。d.rAg85D的純化將經(jīng)過預(yù)處理后的破菌上清通過預(yù)先用20mMTris/HCl，pH8.5緩沖液平衡過的PhenylS印harose6FF(HS)疏水層析介質(zhì)，用水洗脫出含rAg85D的目的峰，將此洗脫峰收集到的rAg85D溶液通過QS印haroseFF陰離子交換層析，此步驟的平衡及捕獲緩沖液為20mMTris/HCl，pH8.5,除雜緩沖液為20mMTris/HCl，0.075MNaCl，pH8.5，用20mMTris/HCl，0.2MNaCl,pH8:5洗脫出高純度的rAg85D蛋白。通過上述步驟純化獲得的rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D蛋白的SDS-PAGE電泳如圖3。實(shí)施例4細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的重組蛋白rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D性質(zhì)鑒別1.分子量通過還原和非還原SDS-PAGE電泳，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，初步估計(jì)rAg85A、rAg85B和rAg85C的表觀分子質(zhì)量約30kDa,而rAg85D約2728kDa。采用MALDI-TOF測(cè)定四種在甲醇酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的重組蛋白的分子量，其結(jié)果分別為rAg85A:31642.5Da、rAg85B:30613.2Da、rAg85C:32108.4Da和rAg85D:28390.4Da。2.N-端氨基酸序列委托北京大學(xué)生命科學(xué)院，用AppliedBiosystems公司的Procise491蛋白測(cè)序儀，Edman降解法測(cè)定四種蛋白的N-端序列，其結(jié)果如下Mg85A的N-端蛋氨酸已經(jīng)在蛋白的翻譯修飾階段被切除，前5個(gè)氨基酸殘基測(cè)定結(jié)果表明甲醇酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的rAg85A有兩個(gè)N-端，分別是S-R-P-G-L-和R-P-G-L-P-,相差一個(gè)氨基酸殘基。rAg85B的N-端蛋氨酸也己經(jīng)在蛋白翻譯修飾時(shí)被切除，測(cè)定前25個(gè)氨基酸殘基的結(jié)果表明，rAg85B的N-端也不均一，分別是F-S-R-P-G_L-P-V-E_Y-L-Q-V-P-S-P-S-M-G-R-D-1-K-V-Q-和S-R-P-G-L-P-V-E-Y-L-Q-V-P-S—P-S-M-G-R-D-I-K-V-Q-F-兩個(gè)N-端，相差一個(gè)氨基酸殘基。有關(guān)rAg85A和rAg85B的N-端不均一的現(xiàn)象，有研究者也報(bào)道了某些分枝桿菌表達(dá)的類似蛋白也存在此種情況，但對(duì)Mtb分泌的Ag85A或Ag85B的是否也有不均一的問題并沒有報(bào)道。rAg85C的N-端蛋氨酸在翻譯后未被切除，N-端均一，前32個(gè)氨基酸殘基是M-F-S-R-P-G-L-P-V-E-Y-L-Q-V-P-S-A-S-M-G-R-D-1-K-V-Q-F-Q-G-G-G-P-,甲醇酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的rAg85C比Mtb自然分泌表達(dá)的Ag85C在N-端多一個(gè)蛋氨酸殘基。rAg85D的N-端蛋氨酸已經(jīng)在翻譯修飾階段被切除，且N-端均一，前5個(gè)氨基酸殘基是A-P-Y-E-N-，這與Mtb產(chǎn)生的Ag85D(MPT51或FbpD)完全一樣。3.分枝菌酰基轉(zhuǎn)移酶活性根據(jù)常規(guī)的分枝菌?；D(zhuǎn)移酶活性的測(cè)定方法，測(cè)定rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D，以及rAg85Com的分枝菌?；D(zhuǎn)移酶活性，發(fā)現(xiàn)rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85Com都有催化分枝菌?；D(zhuǎn)移的活性，而rAg85D沒有該酶活性。具體方法如下先將600化的TMM(分枝菌酰海藻糖單酯)溶于1.2mL0.1M磷酸鉀緩沖溶液，pH7.5，0.lmMDTT中形成TMM懸乳液，將該懸乳液平分為200WV管，共6份。1份為對(duì)照，僅加入HA而其余5份分別加入10(￥g的rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D和rAg85Com，充分混合后再加入"C-海藻糖(100nrao1,30.4mCi/mmo1)，混勻后37。C下溫育30分鐘。分別向每份反應(yīng)樣品中加入2mL三氯甲烷甲醇(2:1)和300uL水，充分混勻后離心，棄上層水相，收集下層有機(jī)相，用0.4mL的三氯甲烷甲醇水(3:47:48)洗滌收集的有機(jī)相兩次，最后用氮?dú)饬鞲稍?，有機(jī)相中的干物質(zhì)含有分枝菌酰基轉(zhuǎn)移酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物。用薄層層析(TLC)-放射自顯影的方法分析有機(jī)相干物質(zhì)，使用硅膠TLC板，溶劑相為三氯甲垸甲醇氨水(80:20:2)，薄層層析結(jié)束后，用KODAK公司的BioMaxLight膠片-7(TC條件下曝光16小時(shí)。用10%^-萘酚，5%硫酸乙醇溶液噴在層析完成后的硅膠板上，110。C加熱即可以看到TDM和TMM標(biāo)準(zhǔn)品的條帶位置。4.纖維連接蛋白結(jié)合能力分別用rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D蛋白包被24孔酶標(biāo)板，以人纖維連接蛋白、以及HRP-人纖維連接蛋白多抗，采用雙夾心法，測(cè)定四種重組蛋白的結(jié)合人纖維連接蛋白能力，發(fā)現(xiàn)它們都有結(jié)合能力。具體如下試驗(yàn)中所用試劑與儀器血漿纖維連接蛋白(Fibronectin，HumanPlasma,Chemicon,USA),兔抗纖維連接蛋白多抗(abeam,UK),服P-標(biāo)記抗兔IgG(晶美生物，中國(guó))，96-孔板(C0STAR,USA);MK3酶標(biāo)儀(Thermo，USA)。具體操作過程①抗原包板，每孔分別加入純化制備最終稀釋濃度均為20pg/mL的rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D抗原，另設(shè)計(jì)兩組一組加入20pg/mL的血漿纖維連接蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照，一組僅加入20mmol/LPB，pH7.4稀釋緩沖液100pl作為陰性對(duì)照，封閉；②血漿纖維連接蛋白與抗原結(jié)合反應(yīng):分別加入血漿纖維連接蛋白(10^ig/mL)各100nl，37'C孵育2小時(shí)，洗板；③兔抗纖維連接蛋白多抗與纖維連接蛋白反應(yīng)向各孔中加入兔抗纖維連接蛋白多抗，37'C孵育2小時(shí)，洗板；④顯色反應(yīng)向各孔中加入HRP-標(biāo)記抗兔IgG(l:200)100pl，37'C孵育2小時(shí)，再加入底物DAB,37'C避光放置10分鐘，加入硫酸終止反應(yīng)。在MK3酶標(biāo)儀中讀取0D45。值。如樣品0D,5。值與陰性對(duì)照的比值大于或等于2.1,則為陽(yáng)性。測(cè)定結(jié)果顯示rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D樣品均呈陽(yáng)性，即rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D四種抗原均能同人血漿纖維連接蛋白結(jié)合。實(shí)施例5rAg85Com體外組合本發(fā)明人分別以表l中所示的比例混合rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D四種蛋白，在體外組成rAg85Com。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>其中，rAg85Coml、rAg85Com2復(fù)合體的SDS-PAGE電泳見圖3;四種蛋白和由它們組成的rAg85Coml和rAg85Com2在SEC-HPLC分析的結(jié)果如圖6，rAg85Com復(fù)合物分子所處的緩沖體系是20mMPB,pH7.07.4。此外，在進(jìn)行體外組合時(shí)，本發(fā)明人還在混合體系(各重組蛋白按比例溶于pH7.0的PB緩沖液中)中添加終濃度為2mmol/LCu2+、12mmol/LCu2+、12mmol/LCu2+18mmol/LCu2+;或6mraol/L、15mmol/LNi2+;或lOmmol/LZn2'。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各混合體系在添加金屬離子后，可更快地形成的復(fù)合體分子，并且形成的復(fù)合體分子比不加入金屬離子時(shí)穩(wěn)定。并且，形成的rAg85Com2、rAg85Com3、rAg85Com4、rAg85Com5比rAg85Coml更為穩(wěn)定，其中最穩(wěn)定的是rAg85Com2。分泌表達(dá)的有糖基化修飾的Ag85A、Ag85B、Ag85C和Ag85D由于分子量大，糖基化修飾后，蛋白的某些表位被覆蓋，很難作為理想的抗原，而突變過mut-Ag85A、mut-Ag85B、niut-Ag85C和mut-Ag85D同細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的四種抗原的性質(zhì)類似。^S例6rAg85Com、rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D^^蟲fegE小^g產(chǎn)生IFNi水平比較1.組別與劑量單抗原和多價(jià)抗原均用磷酸緩沖液配制，不添加任何抗原成分，不論單抗原或多價(jià)抗原，每只小鼠每次總抗原使用劑量為24pg。單抗原四組rAg85A、rAg85B、rAg85C、rAg85D(各24pg);二價(jià)抗原一組rAg85A+rAg85B(各12嗎);三價(jià)抗原一組rAg85A+rAg85B+rAg85C(各8pg);四價(jià)抗原第一組rAg85Coml(6ugrAg85A+9ygrAg85B+3ygrAg85C+6ygrAg85D);四價(jià)抗原第二組rAg85Com2(4.2ugrAg85A+8.4ugrAg85B+4.2wgrAg85C+6.3ugrAg85D);陽(yáng)性對(duì)照組卡介苗(BCG)(每只小鼠0.lmg)。2.免疫與檢測(cè)步驟每組10只豚鼠，雌雄各半并分籠詞養(yǎng)，每組小鼠免疫后第21天，處死小鼠，取血和脾臟，離心血液收集血漿用于測(cè)定抗體滴度，按標(biāo)準(zhǔn)方法脾臟中的T-淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)，分別用該組動(dòng)物免疫時(shí)使用的抗原(單或多價(jià)抗原)刺激培養(yǎng)的細(xì)胞，24小時(shí)后檢測(cè)T-淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IFN，水平，測(cè)定結(jié)果取平均相對(duì)值，結(jié)果如圖4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有rAg85A、rAg85B、rAg85C和rAg85D四種抗原組成的rAg85Com效果最好，并且rAg85Com2比rAg85Coml更好，而單抗原或二價(jià)或三價(jià)抗原都不是很理想。引起細(xì)胞免疫原性的由強(qiáng)到弱的次序是rAg85Com2〉rAg85Coml〉rAg85ABC〉rAg85AB〉rAg85A〉rAg85D>rAg85B〉rAg85C，并且，rAg85Com比rAg85A高100倍。而引起體液免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱，按照產(chǎn)生的抗體滴度從Ixl03-2.5xl06,由高到低的排序是rAg85Com2》rAg85Coml〉rAg85Com〉rAg85ABC〉rAg85D〉rAg85AB〉rAg85A=rAg85B〉rAg85C。rAg85Coml刺激豚鼠產(chǎn)生的抗體滴度比rAg85A高1000倍，rAg85Com2較rAg85Coml的免疫原性更高，抗體滴度高10倍。實(shí)施例7幾種含有rAg85Com的TBV疫苗制備及免疫反應(yīng)測(cè)定用提外裝配成的rAg85Com抗原，與不同的佐劑組合，共形成6種疫苗制劑，免疫豚鼠，檢測(cè)體液和細(xì)胞免疫效果。.抗原rAg85Com與鋁佐劑、CpG佐劑組成的疫苗1.鋁佐劑的制備配制50mL的7.912呢AlCl3溶液，并經(jīng)00.22um的膜過濾，再配制50mL的7.112%的Na0H溶液。量取150ml注射用水，倒入500mL的干烤過的燒杯中，加熱至60'C，用SilversonL4RT型乳化儀，將轉(zhuǎn)速調(diào)為6000rpm，攪拌燒杯中的注射水，用膠頭滴管同時(shí)向燒杯的注射水中逐滴加入AlCl3和Na0H溶液，兩種溶液最后的實(shí)際加入量約25ml，滴加結(jié)束后，整個(gè)燒杯溶液的pH約7.0，繼續(xù)攪拌1小時(shí)，整個(gè)制備過程中保持溶液60'C。最后制備鋁佐劑經(jīng)過MalvernHydro2000S型粒徑儀測(cè)定，確定其平均粒徑為4ym，佐劑中的氫氧化鋁濃度2mg/ml。2.抗原rAg85Com與鋁佐劑、CpG組合用純化的抗原蛋白原液和人工合成CpG(CpG-0DN/TBV-WX，序列見SEQIDNO:14)，配制成rAg85Com+00溶液(每毫升含120ugrAg85A、180ugrAg85B、60ygrAg85C、120ugrAg85D和60ygCpG-0DN/TBV-WX)。將rAg85Com+CpG溶液與鋁佐劑按1:1混合，用SilversonL4RT型乳化儀，轉(zhuǎn)速為4000rpm，保持在室溫下乳化2分鐘，就制備出了rAg85C咖-鋁-CpG佐劑型疫苗。.rAg85Com與.DDA+CpG佐劑組成的疫苗1.DM溶液的準(zhǔn)備按2.5mg/mL的量稱取DDA(先端科技有限公司，中國(guó)廈門)加入注射用水中，在磁力攪拌器上，攪拌的同時(shí)加熱到80'C，約20分鐘待DDA全部溶于水中后，冷卻DDA溶液至室溫下備用。2.rAg85Com與DDA+CpG佐劑組合配制的Ag85Com+CpG溶液(每毫升含60ngrAg85A、90ugrAg85B、30PgrAg85C、60ugrAg85D和30ugCpG-0DN/TBV-WX)與鋁佐劑按10:1的比例混合，用SilversonL4RT型乳化儀，轉(zhuǎn)速為4000rpm，保持在室溫下乳化30秒，就制備出了rAg85Com-DDA+CpG佐劑型疫苗，4'C存放備用。.rAg85Com與鋁佐劑、DDA+CpG佐劑組成的疫苗參照前述制備rAg85Com-DM+CpG組合，其中各組分的含量每毫升為120ugrAg85A、180ugrAg85B、60PgrAg85C、120ugrAg85D、60ugCpG-ODN/TBV-WX和500PgDDA。將配制的rAg85Com-DDA+CpG組合與鋁佐劑按1:1混合，就制備出了rAg85Com-鋁佐劑-DDA+CpG佐劑疫苗，其中每毫升中含60ygrAg85A、90ugrAg85B、30PgrAg85C、60ygrAg85D、30ugCpG-ODN/TBV-WX和250ugDDA，4'C存放備用。.rAg85Com與ISA7加+CpG佐劑組成的疫苗按7:3(V/V)比例，將rAg85Com原液與ISA720佐劑混合，用SilversonL4RT型乳化儀，轉(zhuǎn)速為4000rpm,保持在室溫下乳化3分鐘，經(jīng)過MalvernHydro2000S型粒徑儀測(cè)定，其平均粒徑約lym，其中各抗原的含量隨研究目的不同可以以調(diào)整為不同的濃度。.rAg85Com與ISA720+DDA+CpG佐劑組成的疫苗參照前述方法制備rAg85Com-DDA+CpG組合，其中各組分的含量可以調(diào)整。將rAg85Com-DDA+CpG組合與ISA720佐劑按7:3混合，就制備出了rAg85Com-ISA720-DDA+CpG佐劑組成的疫苗，4'C存放備用。.rAg85Com與聚肌苷-聚胞苷(Polyl:C)佐劑組成的疫苗聚肌苷-聚胞苷(PolyI:C)佐劑母液的制備以制備20mL的Polyl:C佐劑母液為例，先稱取8.7mg的聚肌苷酸(PolyI)，7.3mg的聚胞苷酸(PolyC)，用10mL的注射用水，37°C下約30分鐘則全部溶解，加入10mmol/L的CaC12溶液lmL,用注射水定容到20mL，00.22Pm的膜過濾除菌，備用。將確定濃度的抗原rAg85Com與上面配置好的Polyl:C佐劑母液等體積混合，4'C下，磁力攪拌充分泡合佐劑與rAg85Com抗原約30分鐘。將上面6組疫苗按標(biāo)準(zhǔn)操作程序免疫豚鼠(體重250350g)，每組疫苗受試動(dòng)物10只，雌雄各半，雌雄豚鼠均分籠飼養(yǎng)第一次免疫動(dòng)物前，對(duì)每只受試動(dòng)物取血作為正常對(duì)照備檢；分別在第0天、21天、42天三次免疫受試豚鼠，并在第21天、42天取血備檢測(cè)，而第72天時(shí)處死豚鼠，大量取血和脾臟。選擇卡介苗(BCG,上海生物制品所，批號(hào)200707001)為陽(yáng)性對(duì)照疫苗，只是在其他豚鼠的第42天免疫時(shí)對(duì)受試豚鼠免疫一次，30天后，也就是待研究疫苗組動(dòng)物的第72天，處死受試動(dòng)物，大量取血和脾臟。檢測(cè)血清中抗體滴度，并按標(biāo)準(zhǔn)操作培養(yǎng)脾臟T-淋巴細(xì)胞，檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞上清液中分泌出的IFN-Y相對(duì)含量高低。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，疫苗TBV3和TBV4、TBV5疫苗免疫后的豚鼠血清中抗體滴度都很高，而TBV3和TBV5所引起的細(xì)胞免疫效應(yīng)最強(qiáng)(圖5)。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>上海萬興生物制藥有限公司<120〉一種結(jié)核分枝桿菌多價(jià)重組蛋白疫苗的制備<130〉077684<160>20<170〉Patentlnversion3.3<210>1<211>295<212〉PRT<213>結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)<400〉1PheSerArgProGlyLeuProValGluTyrLeuGinValProSerPro151015SerMetGlyArgAsplieLysValGinPheGinSerGlyGlyAlaAsn202530SerProAlaLeuTyrLeuLeuAspGlyLeuArgAlaGinAspAspPhe354045SerGlyTrpAsplieAsnThrProAlaPheGluTrpTyrAspGinSer505560GlyLeuSerValValMetProValGlyGlyGinSerSerPheTyrSer65707580AspTrpTyrGinProAlaCysGlyLysAlaGlyCysGinThrTyrLys859095TrpGluThrPheLeuThrSerGluLeuProGlyTrpLeuGinAlaAsn100105110ArgHisValLysProThrGlySerAlaValValGlyLeuSerMetAla115120125AlaSerSerAlaLeuThrLeuAlalieTyrHisProGinGinPheVal130135140TyrAlaGlyAlaMetSerGlyLeuLeuAspProSerGinAlaMetGly145150155160ProThrLeulieGlyLeuAlaMetGlyAspAlaGlyGlyTyr1_ysAla165170SerAspMetTrpGlyProLysGluAspProAlaTrpGinArgAsnAsp180185190ProLeuLeuAsnValGlyLysLeulieAlaAsnAsnThrArgValTrp195200205ValTvrCysGlyAsnGlyLysProSerAspLeuGlyGlyAsnAsnLeu210215220ProAlaLysPheLeuGluGlyPheValArgThrSerAsnlieLysPhe225230235240GinAspAlaTyrAsnAlaGlyGlyGlyHisAsnGlyValPheAspPhe245250255ProAspSerGlyThrHisSerTrpGluTyrTrpGlyAlaGinLeuAsn260265270AlaMetLysProAspLeuGinArgAlaLeuGlyAlaThrProAsnThr275280285GlyProAlaProGinGlyAla290295<210>2<211>285<212〉PRT<213〉結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)<400〉2PheSerArgProGlyLeuProValGluTyrLeuGinValProSerPro151015SerMetGlyArgAsplieLysValGinPheGinSerG1yGlvAsnAsn202530SerProAlaValTyrLeuLeuAspGlyLeuArgAlaGinAspAspTyr354045AsnGlyTrpAsplieAsnThrProAlaPheGluTrpTyrTyrGinSer505560GlyLeuSerlieValMetProValGlyGlyGinSerSerPheTyrSer65707580AspTrpTyrSerProAlaCysGlyLysAlaGlvCysGinThrTyrLys85909^25TrpGluThrPhe100LeuThrSerGluLeu105ProGinTrpteuSer110AlaAsnArgAlaVal115LysProThrGlySer120AlaAlalieGlyLeu125SerMetAlsGlySer130SerAlaMetlieLeu'135AlaAlaTyrHisPro140GinGinPhelieTyrAlaGlySerLeuSerAlaLeuLeuAspProSerGinGlyMetGly14515015516bProSerLeulieGly165LeuAlaMetGlyAsp170AlaGlyGlyTyrLysAla175AlaAspMetTrp180GlyProSerSerAsp185ProAlaTrpGluArg190AsnAspProThrGinGinlieProLysLeuValAlaAsnAsnThrArgLeuTrp195200205ValTyr210CysGlyAsnGlyThr215ProAsnGluLeuGly220GlyAlaAsnlieProAlaGluPheLeuGluAsnPheValArgSerSerAsnLeuLysPhe225230235240GinAspAlaTyrAsn245AlaAlaGlyGlyHis250AsnAlaValPheAsnPhe255ProProAsnGly260ThrHisSerTrpGlu265TyrTrpGlyAlaGin270LeuAsnAlaMetLys275GlyAspLeuGinSer280SerLeuGlyAlaGly285<210>3〈211>294<212〉PRT<213>結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)〈400>3PheSerArgProGlyLeuProValGluTyrLeuGinValProSerAla151015SerMetGlyArg20AsplieLysValGin25PheGinGlyGlyGlv30ProHisAlaValTyr35LeuLeuAspGlyLeu40ArgAlaGinAspAsp45TyrAsnGlyTrpAsplieAsnThrProAlaPheGluGlu丁yrTvrGinSerGlyLeu5055SerVallieMetProValGlyGlyGinSerSerPheTyrThrAspTrp65707580TyrGinProSerGin85SerAsnGlyGinAsn90TyrThrTyrLysTrpGlu95ThrPheLeuThr100ArgGluMetProAla105TrpLeuGinAlaAsn110LysGlyValSerPro115ThrGlyAsnAlaAla120ValGlyLeuSerMet125SerGlyGlySerAlaLeulieLeuAlaAlaTyrTyrProGinGinPheProTyrAla130135140AlaSerLeuSerGlyPheLeuAsnProSerGluGlyTrpTrpProThr145150155160LeulieGlyLeuAla165MetAsnAspSerGly170GlyTyrAsnAlaAsnSer175MetTrpGlyPro180SerSerAspProAla185Trp匕ysArgAsnAsp190ProMetValGinlie195ProArgLeuValAla200AsnAsnThrArglie205TrpValTyrCysGly210AsnGlyThrProSer215AspLeuGlyGlyAsp220AsnlieProAlaLysPheLeuGluGlyLeuThrLeuArgThrAsnGinThrPheArgAsp225230235240ThrTyrAlaAlaAsp245GlyGlyArgAsnGly250ValPheAsnPheProPro255AsnGlyThrHis260SerTrpProTyrTrp265AsnGluGinLeuVal270AlaMetLysAlaAsplieGinHisValLeuAsnGlyAlaThrProProAlaAla275280285ProAla290AlaProAlaAla<210>4<211〉266<212>PRT<213〉結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)26<400〉4AlaProTyrGluAsnLeuMetValProSerProSerMetGlyArgAsp151015lieProValAla20PheLeuAlaGlyGly25ProHisAlaValTyr30LeuLeuAspAlaPhe35AsnAlaGlyProAsp40ValSerAsnTrpVal45ThrAlaGlyAsnAla50MetAsnThrLeuAla55GlyLysGlylieSer60ValValAlaProAlaGlyGlyAlaTyrSerMetTyrThrAsnTrpGluGinAspGlySer65707580LysGinTrpAspThr85PheLeuSerAlaGlu90LeuProAspTrpLeu95AlaAlaAsnArgLeuAlaProGlyGly105HisAlaAlaValGlvlibAlaAlaGinGlyGly115TyrGlyAlaMetAla120LeuAlaAlaPheHis125ProAspArgPheGly130PheAlaGlySerMet135SerGlyPheLeuTyr140ProSerAsnThrThrThrAsnGlyAlalieAlaAlaGlyMetGinGinPheGlyGlyVal145150155160AspThrAsnGlyMet165TrpGlyAlaProGin170LeuGlyArgTrpLys175TrpHisAspProTrpValHisAlaSerLeuLeuAlaGinAsnAsnThrArg180185190ValTrpVal195TrpSerProThrAsn200ProGlyAlaSerAsp205ProAlaAlaMetlie210GlyGinAlaAlaGlu215AlaMetGlyAsnSer220ArgMetPheTyrAsnGinTyrArgSerValGlyGlyHisAsnGlvHisPheAspPhePro22523023^240AlaSerGlyAspAsn245GlyTrpGlySerTrp250AlaProGinLeuGly255AlaMetSerGlyAsp260lieValGlyAlalie265Arg〈210〉5<211〉1036<212>DNA<213〉人工序列<221〉misc—feature〈223〉A(chǔ)g85S編碼分子<220〉〈221>misc—feature<223>Ag85^編碼分子(含信號(hào)肽編碼分子)〈400〉5ttcgaaaaaattggttgttgactgctactgtccccatccagctttgtactaccccagcttcaatcciccttacaagtggggtcaagccaattggctatctccatcccsagaaggcttccgUgaacgtcgaagccatccg3CCtCC38C3gacttcccag幼gccagactgcitaatagctgcagttggtgtgctgttggctggtgcttttgggtag柳tgttggacggtcgagtggtatctactccgaagaccttcttccggttccgc3CC3CCC3CaCt3tgggtCCgtsagttgattc幼gttccaactccggtactgcaaagagcggccgc<210〉6<211〉997<212>DNA<213>人工序列tgacagagtttgctgctttgctctagaccacatcaaggtcUtgagggctcgaccaatccctggtatcaagacctccgagtgtcgtcggtacaattcgtcaaccttgatctCC3犯gg3gcgctaacaactsacaacttgagacgcttactcactcctggUtgggtgctagaggtgctggtUctggttggtttgccagcaattccaatcaagaicgactggtttgtccgccagcttgtgttgccaggttttgtccatggtacgctggtgggtttggctagacccagcttaccagagtctccagctaagt犯cgctggtggagtactgggacccc幼ac3ttactggtattggttggtgctcgagtacttccggaggtgctctccggttgtcgtcatgccgtaaggctggggttgcaagcctgcttcctcctatgtccggtgggtgacgcggcaaagaaaigggtCt3CtgtCttgg3ggggtggtc3casgtgctcaattccggtccagcgtctagaagatgttggtggtgc幼gtcccataactccccaggacatcaacagtcggtggtttgtcaaacctaacELgacaccgctttgacctttgttggactggtggttaccgacccsttgtggtaacggttttcgtcagacggtgtcttcg幼CgCt3tgtccacaaggt60120180240300360420■54060066072078084090096010201036<221〉miscfeature27<223>Ag85B編碼分子<220〉<221>misc一feature<223〉A(chǔ)g85S編碼分子(含信號(hào)肽編碼分子)<400〉6ggtactgctggctggtgctt3tgggt3gElgttgttggacgttcgagtggtttctactctggagaccttctaccggttctgt3CC3CCC3Cggtatgggtcga_catgtgggCC站3gttgggstgttgggtgttgaagttccccaaacggtatgactgacgtctgctgttgttctctagaccacatcaaggtgtttgagggcactaccaatcsctggtactctgacctctgactgctatcggaacaattcatcatctttgatgtccatcttctcgctaacaagtgctaacat犯g3cgcttactcactcttgctUgggtgctttgccaggtaggtttgccaccaattccaatcaagacgactggUtgtcttccagcttgtgttgccacaatttgtctatgctacgctggtcggtttggcttgacccagctcacc3gattgcccagctgagcaacgctgctggagtactggtggttaatagatcagagcttttggttggttgtcgagtacttctggaggtatacaacggtt3tCgtC3tgCggt犯ggctgtggttgtctggctggttctttctttgtctg3tgggtg3Cgtgggagag幼tgggtctactttcttggagaggtggtcacaggtgctc幼tcggccgcggggtag犯gtggctggtggtgcaagtcccacaactctcccagtcggtgggttgtcaaacctaacagagcctgctatg3tCtttgttgg3ctggtggtt3acgsccc幼cgtggt33Cgg3cttcgtcagacgctgtctttgaacgctatattgeitgatctgctgctact3tctccatctagctgtctaccaccccagcttcaatcttctctacaagtggtgtcaagccacttggctgctcccatctcaacaaggctgctccaac犯atctactccaaacgtcttctaaccaacttcccagaagggtgac<210>7<211〉1042<212>腿<213>人工序列<221>misc—feature<223〉A(chǔ)g855編碼分子<220〉<221>misc—feature<223>Ag855編碼分子(含信號(hào)肽編碼分子)<400>7ttcgaaaaaaccaagaagatttcggtggtccaagtcccatcacgctgtctaacEiccccagggtcaatcctacctacaagtggtgtctcccatcttggctgaacccatccgtacaacgctaatggtccaaaggtactccatttgagaaccattcaacttccatgaaggctgccagctgctttgactttctttggctatcgccagctactgcccgcttccatacttgttggactttcgaggaccttctacacgggagaccttcaaccggtaacttactacccagggttggtg3CtCC3tgtgtcccaagattccgacttgggaccaaaccttcaccaaacgg貼t3gcggcccgagcaggtttgctstgggttggtgctttcgggtagagaccggtttgagagtactaccaacgactggtatcttgaccagacgctgctgtcacaacaat"tcgccaaccttggggtccatccggtcgct犯ctggtgacaaccagagacacctactcactcccgtcttgaacgcagaagsttgagctgttttggtccagaccagatcaaggtccgcacaagacgtccggtttgtcaeiccatcccg柳tgccagggtttgtccaccatacgctg3tcggtttggtccgacccag幼caccagaaatcccagctatacgctgctgtggccaiactggtgctacccgatctgctgctttacggtttgtttgccagtaattccaaggactacaacggccgtcatcatastccsacggcttggttgcatgtccggtggcttccttgtcct3tgascg3cttggaagagtctgggtcta3gUcttgg3acggtggtagggaacgagcacaccagctgctactactttgggttggtactcgagtacttgtggaggtccattgggacatcgccagtcggttcaaaactac站ctaac幼gttccgctttgcggtttcttgctccggtggt幼3CgElCCC3ctgtggtaacgggtttgaccaaacggtgtcattggtcgcttccagctgct<210〉8<211>919<212>DNA〈213〉人工序列<221>misc一feature<223>Ag855編碼分子<220><221>misc—feature<223>Ag855編碼分子(含信號(hào)肽編碼分子)<400〉8ttcgaaaaaattcggtttggaacttgatggggtccacacggtcaccgctggctggtggtgaccttcttgitgaagggtaggtggtgtcgctcccstccccctgtctacttgtaacgctatcttactccatccgctgagttatccgctttgtgtcgctgctatccatgggtgttggacgctgaacsiccttggtacsccaacgccagactggttgagagcttgagcc幼ccgagagacatccttcaacgctggctggtaaggtgggagc幼gUggctgctatgtggatcgcctaaggctgccagtcgctttgtccagacgtgtatctccgtacggttccEiaacagaggUttgctttgtcctccatacgag6012018024030036042048054060066072078084090096099760120180240300360420480540600660720780840900960翻1042ctccaactggcgtcgctccagcaatgggacggctccaggt6012018024030036042028ggtcacgctgctgtcggtgctgctcaaggtggtt3Cggtgctatggctttggctgctttc480C3CCC3g3C3gattcggtttcgctggttccatgtxcggtttcttgtaccc5403CC3CC犯Cggtgctatcgctgctggtatgcaacaattcggtggtgtcgacaccaacggt6003tgtggggtgctccacaattgggtagatggaagtggcacgacccatgggtccacgcttcc卿ttgttggctcaaaacaacscc柳gtctgggtctggtccccaacc犯cccaggtgcttcc720gacccagctgctat,gatcggtcaagctgctgaggctatgggtaactccagastgttctac780犯cc33tacagatccgtcggtggtcacaacggtcacttcgacttcccagcttccggtgac840aacggttggggttcctgggctccacaattgggtgctatgtccggtgacatcgtcggtgct900atcagat33tagcggccgc919<210〉9<211〉919<212〉DNA<213〉人工序列<221〉miscfeature<223〉A(chǔ)g855編碼分子<400〉9ttcgaaaaaatg犯gggtagatccgctttgttgag3gctttgtggatcgctgctttgtcc60Ucggtttgggtggtgtcgctgtcgctgctgagcc犯ccgctaaggctgctccatacgag120aacttgatggtcccatccccatccstgggt3gagac3tcccagtcgctttcttggctggt180ggtccacacgctgtctacttgttggscgctUcaacgctggtccagacgtctccaactgg240gtcaccgctggtsacgcteitg33caccttggctggtaagggtatctccgtcgtcgctcca300gctggtggtgcttactccatgtacaccaactgggagcaag3cggttccaagcaatgggac360accttcttgtccgctgagttgccagactggttggctgctaacagaggtttggctccaggt420ggtC3CgCtgctgtcggtgctgctcaaggtggUacggtgctatggctttggctgcUtc480caccc3gac3gattcggtttcgctggttccatgtccggtttcttgtaccc3tccca犯cc5408CC3CCa3Cggtgctstcgctgctggtatgcaacaattcggtggtgtcgacaccaacggt6003tgtggggtgctccacaattgggt柳tggaagtggcacgacccatgggtccacgcttcc660ttgttggctc3ac3犯acaccagagtctgggtctggtcccaggtgcttcc720gacccagctgctatgatcggtc犯gctgctg3gg由tgggtaactccagaatgttctac780gatccgtcggtggtcacaacggtcacttcgacttcccagcttccggtgac840犯cggttggggttcctgggctccacaattgggtgctatgtCCggtgElC3tcgtcggtgct900atcagataatagcggccgc919<210>10〈211〉1039〈212〉■<213〉人工序列<221〉miscfeature<223〉A(chǔ)g85S編碼分子<婦10ttcgaaaaaatgcagttggttgac柳gtt3gaggtgctgttactggtatgtCt柳3g360ttggttgttggtgctgttggtgctgctttggtttctggtttggttggtgctgttggtggt120actgctactgctggtgctttcttctccagaccaggtttgccagtcgagtacttgcaagtc180CC3tCCCC3tCC3tgggt3gagacatcaaggtccaattccaatccggaggtgctaactcc240ccagctttgtacttgttggacggtttgagggctcaagacgacttctccggttgggacatc300ELElCacCCCagctttcgagtggtacgaccaatccggtttgtccgtcgtcatgccagtcggt360ggtcaatcctccttctactccgactggtatc肌ccagctttggttgtcaa420acctacaagtgggagaccttcttgacctccgagttgccaggttggttgcaagctaacaga480cacgtc幼gccaaccggttccgctgtcgtcggtttgtCC3tggctgcttcctccgctttg540accttggctatctaccacccacaacaattcgtctacgctggtgctatgtccggtttgttg600gacccatcccaagctatgggtccaaccttgatcggtttggctsitgggtgacgctggtggt660tac3aggcttccgacatgtggggtccaaaggaggacccagCttggC3犯g幼3CgeiCCC3720ttgttg犯cgtcggtaagttgatcgct犯caacaccagagtctgggtctactgtggtaac780ggtaagccatccgacttgggtggtaacaacttgccagctaagttcttggagggtttcgtc840agaacctccaacatcaagitccaagacgcttacaacgctggtggtggtcacascggtgtc900ttcgacttcccagactccggtactcactccggggtgctcaattgaacgct960atgseigccagacttgcaaagagctttgggtgctaccccaaacaccggtccagctccacaa1020ggtgc壬taatagcggccgc1039<210>11<211>997<212>腿<213>人工序列<221>miscfeature<223>Ag85g編碼分子<400〉11ttcg犯犯aatgactgacgtttctagaaagatcagagcttggggtagaagattgatgatc60ggtactgctgctgctgttgttttgccaggtttggttggtttggctggtggtgctgctact120gctggtgctttctctcgaccaggtttgccagtcgagtacttgc犯gtcccatctccatct180atgggtagagacatcaaggtccaattccaatctggaggtaacaactctccagctgtctac240ttgttggacgttcgagtggtttctactctggagaccttctaccggttctgtaccacccacggtatgggtcgacstgtgggccasagttgggagttgggtgttgsagttccccaaacggtattgcaatcttgtttgagggcactaccaatcactggtactctgacctctgactgctatcggaacaattcatcatctttgatgtccatcttctcgctaacaagtgct犯cata3gacgcttactcactcttgctttgggtgctggtttgtcttccagcttgtgttgccacaatttgtctatgctacgctggtcggtttggcttgacccagctcaccagattgcccagctgagcaacgctgctggagtactggtggttaatagtscaacggttatcgtcatgcggtaaggctggctggttctttctttgtctgatgggtgacgtgggageig犯tgggtctactttcttggagaggtggtC3C3ggtgctcaatcggccgcgggacatcaacagtcggtgggttgtcaaacctaacagagcctgctatgatctttgttggactggtggttaacgacccsacgtggt幼cggacttcgtcagacgctgtctttgaacgctatcaccccagcttcaatcttctctacaagtggtgtcaagccacttggctgctcccatctcaaca郎gctgcttactccaaacgtcttctaaccaacttcccag犯gggtgac<210>12<211〉1042<212>DNA<213>人工序列<221〉misc—feature<223〉A(chǔ)g85G編碼分子<400〉12ttcgaaaaaaccaagaagatttcggtggtccaagtcccatcacgctgtct￡ia_C3CCCC3gggtC2l3tCCtacctacaagtggtgtctcccatcttggctgaacccatccgtac幼cgctaatggtccaaaggtactccatttgagaaccattcaacttcc3tg幼ggCtgCC3gC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