專(zhuān)利名稱(chēng)：抗異常型朊病毒單克隆抗體及其制造方法以及使用其的免疫測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗異常型朊病毒單克隆抗體及其制造方法以及使用其的異常型朊病毒的免疫測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
以克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布氏病(Creutzfeldt-Jakob disease，以下簡(jiǎn)稱(chēng)為CJD)、羊瘙癢病、傳染性貂腦病為主的腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的潛伏期后發(fā)病，這些疾病的主要特征在于幾乎局限于神經(jīng)系統(tǒng)的腦組織海綿狀變性以及淀粉樣斑(庫(kù)魯斑，kuru spot)，進(jìn)行性惡化直至死亡。發(fā)病的原因尚存在很多不明之處，但認(rèn)為與病毒等感染性病原體無(wú)關(guān)，是由于異常性朊病毒蛋白質(zhì)沉積引起的，所謂的“朊病毒假說(shuō)”占主流。該疾病一直通過(guò)腦切片標(biāo)本的病理學(xué)方法進(jìn)行診斷。
據(jù)說(shuō)該疾病的病原具有感染性，還報(bào)道了通過(guò)攝食腦神經(jīng)組織(庫(kù)魯病等)、電極或硬腦膜移植等醫(yī)療行為引起的感染。最近，認(rèn)為牛海綿狀腦病以及新型CJD是通過(guò)經(jīng)口感染傳播的。
正常型朊病毒蛋白質(zhì)是存在于細(xì)胞膜上的糖蛋白質(zhì)，廣泛存在于以酵母為首的真核細(xì)胞中。另外，有報(bào)道指出編碼正常型朊病毒蛋白質(zhì)的基因是單一基因，編碼的氨基酸序列在哺乳類(lèi)動(dòng)物間非常保守，特別是人、羊、牛之間的同源性為約90％以上。
關(guān)于正常型朊病毒蛋白質(zhì)的功能，雖然只能說(shuō)尚不明確，但是由于氨基酸序列保守，推測(cè)在神經(jīng)組織的生成、分化和功能方面發(fā)揮重要作用。另外，根據(jù)最近采用人工破壞了朊病毒蛋白質(zhì)基因的小鼠的研究，觀察到隨著衰老而發(fā)生的下半身的震顫等步行異常、小腦的病理性萎縮，特別是小腦普爾基涅細(xì)胞(Purkinje cell)的脫落。
盡管有報(bào)道指出對(duì)于人來(lái)說(shuō)，朊病毒蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列(一級(jí)結(jié)構(gòu))存在個(gè)體差異，但是確認(rèn)在患CJD的患者和健康正常人之間朊病毒蛋白質(zhì)的氨基酸序列沒(méi)有差異。因此認(rèn)為，異常型朊病毒蛋白質(zhì)的沉積不是由于氨基酸序列的不同引起的，而是由于立體結(jié)構(gòu)的不同引起的。因此，采用以前的技術(shù)制得的抗體中，識(shí)別氨基酸一級(jí)序列的抗體不能區(qū)別兩者。另外，由于氨基酸序列在動(dòng)物間非常保守，因而推測(cè)抗原性弱。因此，需要制作出一種抗原，該抗原是維持了立體結(jié)構(gòu)的免疫原，同時(shí)提高了抗原性。
發(fā)明公開(kāi)本發(fā)明的目的在于提供一種能夠識(shí)別正常型朊病毒和異常型朊病毒的單克隆抗體及其制造方法。另外，本發(fā)明的目的還在于提供使用該單克隆抗體對(duì)異常型朊病毒進(jìn)行免疫測(cè)定的方法。
如果要制作能夠識(shí)別正常型朊病毒和異常型朊病毒的單克隆抗體，考慮到使用異常型朊病毒作為免疫原，給動(dòng)物免疫，按照常規(guī)方法得到單克隆抗體，篩選與異常型朊病毒反應(yīng)而不與正常型朊病毒反應(yīng)的單克隆抗體。但是，朊病毒蛋白質(zhì)不僅在異常型和正常型之間氨基酸序列沒(méi)有差異，而且種特異性小，因此一般而言是難以獲得抗體的蛋白質(zhì)，而且能夠識(shí)別異常型和正常型的差異的抗體更難獲得。另外，使用異常型朊病毒作為免疫原時(shí)，是難以確保足夠量的蛋白質(zhì)。具有異常型朊病毒的疾病患病的機(jī)率小，而且作為病原體具有很強(qiáng)的感染力，因此在操作時(shí)必需非常細(xì)心，且能夠處理這種病原體的設(shè)施也是有限的。要確保大量這樣的物質(zhì)相當(dāng)困難。而且，為了作為免疫原，有必要進(jìn)行某種程度的純化，但是在純化的階段會(huì)導(dǎo)致該蛋白質(zhì)不可溶，以致不適于作為免疫原。為了用作免疫原，使用改性劑等，使之變得可溶，但是這時(shí)異常型所固有的立體結(jié)構(gòu)是否能夠保持不變則成了問(wèn)題?；谶@些理由，很難通過(guò)使用異常型朊病毒作為免疫原，制作能夠識(shí)別正常型朊病毒和異常型朊病毒的單克隆抗體。
本發(fā)明人進(jìn)行了悉心研究，結(jié)果在異常型朊病毒的立體結(jié)構(gòu)中，推測(cè)出被認(rèn)為露出到外部的區(qū)域，通過(guò)使用含有將這些區(qū)域中的多數(shù)相連結(jié)得到的肽的免疫原，成功地制作了能夠識(shí)別正常型朊病毒和異常型朊病毒的單克隆抗體，從而完成了本發(fā)明。
也就是說(shuō)，本發(fā)明提供與異常型朊病毒反應(yīng)，但與正常型朊病毒實(shí)質(zhì)上不反應(yīng)的抗異常型朊病毒單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段。另外，本發(fā)明還提供產(chǎn)生上述本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤。而且，本發(fā)明還提供通過(guò)利用上述本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段與異常型朊病毒的抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行的免疫測(cè)定，測(cè)定異常型朊病毒的方法。而且，本發(fā)明還提供用于進(jìn)行上述本發(fā)明的免疫測(cè)定方法的免疫測(cè)定用試劑盒，其中包括上述本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段。而且，本發(fā)明還提供上述本發(fā)明的抗異常型朊病毒單克隆抗體的制造方法，包括用具有下述肽的免疫原給動(dòng)物免疫，所述肽含有將異常型朊病毒的一級(jí)氨基酸序列中不連續(xù)的多個(gè)區(qū)域之間連結(jié)而成的區(qū)域；制作來(lái)源于免疫動(dòng)物的抗體產(chǎn)生細(xì)胞的雜交瘤；篩選產(chǎn)生與異常型朊病毒反應(yīng)但與正常型朊病毒實(shí)質(zhì)上不反應(yīng)的抗異常型朊病毒單克隆抗體的雜交瘤；由通過(guò)篩選選中的雜交瘤回收上述抗異常型朊病毒單克隆抗體。而且，本發(fā)明還提供該制造方法中使用的免疫原。
按照本發(fā)明，首次提供了與異常型朊病毒反應(yīng)但與正常型朊病毒實(shí)質(zhì)上不反應(yīng)的抗異常型朊病毒單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段，且按照本發(fā)明，首次能夠進(jìn)行異常型朊病毒的免疫測(cè)定。因此，認(rèn)為本發(fā)明對(duì)于感染了牛海綿狀腦病的牛或其它動(dòng)物的診斷以及CJD的診斷做出了很大的貢獻(xiàn)。


圖1是示意性地表示正常型朊病毒的立體結(jié)構(gòu)、Korth等的報(bào)道中記載的異常型朊病毒的立體結(jié)構(gòu)以及本發(fā)明人推測(cè)出的異常型朊病毒的立體結(jié)構(gòu)的圖。
發(fā)明的最佳實(shí)施方式本發(fā)明的單克隆抗體是與異常型朊病毒發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，但與正常型朊病毒實(shí)質(zhì)上不反應(yīng)的抗異常型朊病毒單克隆抗體。其中，“實(shí)質(zhì)上不反應(yīng)”是指對(duì)正常型朊病毒的反應(yīng)性與對(duì)異常型朊病毒的反應(yīng)性相比，低至可以識(shí)別的程度。因此，即使在對(duì)正常型朊病毒具有交叉反應(yīng)性的場(chǎng)合，其免疫學(xué)的反應(yīng)性與對(duì)異常型朊病毒的免疫學(xué)反應(yīng)性相比低至可識(shí)別的程度的情況，包括在本說(shuō)明書(shū)所說(shuō)的“與正常型朊病毒實(shí)質(zhì)上不反應(yīng)”的情況內(nèi)，也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。不言而喻，優(yōu)選與正常型朊病毒不具有交叉反應(yīng)性的單克隆抗體，即與異常型朊病毒反應(yīng)，但與正常型朊病毒不反應(yīng)的單克隆抗體。
本發(fā)明的單克隆抗體優(yōu)選在免疫組織染色中與異常型朊病毒反應(yīng)，但與正常型朊病毒不反應(yīng)。另外，朊病毒的免疫組織染色以前是在進(jìn)行了所謂的“酸高壓處理”(將浸漬于1.0～100mM HCl溶液中的組織在121℃下高壓處理20分鐘)后進(jìn)行，但本發(fā)明的單克隆抗體優(yōu)選與未進(jìn)行這種酸高壓處理等預(yù)處理的組織中存在的異常型朊病毒反應(yīng)。作為這種抗異常型朊病毒單克隆抗體的具體實(shí)例，可以例舉下述實(shí)施例中制作的由雜交瘤EBEB4C3Ebb產(chǎn)生的單克隆抗體。另外，雜交瘤EBEB4C3Ebb已于2000年9月1日保藏在 305-8566日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(舊工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所)，保藏號(hào)為FERM P-18013(原保藏)，并于2001年11月21日基于布達(dá)佩斯條約由原保藏單位移送至國(guó)際保藏單位，該國(guó)際保藏的保藏號(hào)為FERM BP-7808。
本發(fā)明還提供上述本發(fā)明的單克隆抗體的抗原結(jié)合性片段。其中，“抗原結(jié)合性片段”是指抗體的Fab片段或F(ab’)2片段等發(fā)揮該抗體的抗原結(jié)合性的片段。這些片段可以按照常規(guī)方法，通過(guò)用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等蛋白質(zhì)分解酶將本發(fā)明的單克隆抗體分解，從而容易地得到。這種抗原結(jié)合性片段也可以與本發(fā)明的單克隆抗體同樣用于下述免疫測(cè)定。
如上所述，使用異常型朊病毒作為免疫原，難以制作與異常型朊病毒反應(yīng)但與正常型朊病毒實(shí)質(zhì)上不反應(yīng)的抗異常型朊病毒單克隆抗體。為了解決這一問(wèn)題，本發(fā)明人首先獨(dú)自推測(cè)出了異常型朊病毒的立體結(jié)構(gòu)。圖1中，表示正常型朊病毒的立體結(jié)構(gòu)(PrPc模型)、Korth等推測(cè)出的異常型朊病毒的立體結(jié)構(gòu)((PrPsc模型1)C．Korth等，Nature 39074-77，1997)以及本發(fā)明人推測(cè)出的異常型朊病毒的立體結(jié)構(gòu)(PrPsc模型2)。本發(fā)明人推測(cè)出的異常型朊病毒的立體結(jié)構(gòu)與迄今為止由Korth等推測(cè)出的立體結(jié)構(gòu)相比，p折疊結(jié)構(gòu)多。這種推測(cè)的根據(jù)在于，由cD光譜和FT-IR的結(jié)果可知，在PrPC→PrPSc的過(guò)程中，a螺旋由4O％減少至30％，p結(jié)構(gòu)由非常少增大至45％。如果由通過(guò)NMR得到的立體結(jié)構(gòu)(123-231)進(jìn)行計(jì)算，除去非常易彎曲而不能確定結(jié)構(gòu)的N末端的重復(fù)序列部分，PrPC的二級(jí)結(jié)構(gòu)為a螺旋占25％，p結(jié)構(gòu)占3.4％(以全長(zhǎng)231殘基來(lái)計(jì))。假定不能計(jì)算的N末端部分對(duì)a螺旋含量的貢獻(xiàn)為15％，如果采用Korth等的模型進(jìn)行PrPSc的計(jì)算，則a螺旋占36％，p結(jié)構(gòu)占7％。因此，按照Korth等的模型，只能解釋一部分CD光譜和FT-IR的結(jié)果。因此，嘗試考慮進(jìn)一步減少a螺旋且增加p結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)變化。如果按照根據(jù)SST所做的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量，則α螺旋占5.6％，β結(jié)構(gòu)占18％。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的精度另當(dāng)別論，朊病毒蛋白質(zhì)可以說(shuō)是原本與α螺旋相比容易形成β結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。如果進(jìn)一步詳細(xì)檢視，相當(dāng)于PrPC的α螺旋2的部分大約一半被判斷為β結(jié)構(gòu)，其它為C(無(wú)規(guī)卷曲，random coil)結(jié)構(gòu)，即使是α螺旋3，除后半部分含有被判斷為α螺旋的殘基外，其余為β結(jié)構(gòu)或C結(jié)構(gòu)。因此，嘗試作出了α螺旋2的前半部分和α螺旋3的后半部分改變成β結(jié)構(gòu)的模型(模型2)。
該模型與Korth等的模型不同，形成15B3的抗原表位(epitope)的E1、E2、E3部分均發(fā)生了結(jié)構(gòu)變化，在分子模型中可以使3個(gè)部分均形成β發(fā)夾結(jié)構(gòu)而聚集在一起，因此不會(huì)發(fā)生矛盾。另外，該模型的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量為α螺旋占27％，β結(jié)構(gòu)占17％，并非與CD光譜和FT-IR的結(jié)果完全一致，但是與Korth等的模型相比，顯示較為接近的值。
本發(fā)明人認(rèn)為在該獨(dú)自推測(cè)出的異常型朊病毒的立體結(jié)構(gòu)中，將向外部露出的區(qū)域，即B1區(qū)域(朊病毒的一級(jí)氨基酸序列的第128個(gè)氨基酸至第131個(gè)氨基酸，以下記作“128-131a.a.”)、B2區(qū)域(138-141a.a.)和B3區(qū)域(149-152a.a.)以及E1區(qū)域(141-149a.a.)、E2區(qū)域(164-170a.a.)和E3區(qū)域中2個(gè)以上區(qū)域連結(jié)得到的肽作為免疫原使用，能夠得到對(duì)異常型朊病毒特異反應(yīng)的單克隆抗體，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，如下述實(shí)施例具體記載的那樣，使用將E1區(qū)域和B2、B3區(qū)域連結(jié)的肽(序列號(hào)1)以及含有E2區(qū)域的肽(序列號(hào)2)分別連結(jié)在同一KLH上得到的物質(zhì)作為免疫原，得到了由上述雜交瘤EBEB4C3Ebb產(chǎn)生的單克隆抗體。另外，上述各區(qū)域可以直接連結(jié)，也可以通過(guò)1個(gè)或數(shù)個(gè)其它氨基酸間接地連結(jié)。因此，“連結(jié)”這一用語(yǔ)包括上述區(qū)域直接連結(jié)的情況以及通過(guò)1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基間接連結(jié)的情況這兩種情況。另外，上述各區(qū)域也可以缺失或添加1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸。本質(zhì)上由這些區(qū)域構(gòu)成的肽可以使用市售的自動(dòng)肽合成機(jī)容易地制備。因而，使用將蛋白質(zhì)的一級(jí)氨基酸序列中的不連續(xù)區(qū)域連結(jié)得到的物質(zhì)作為免疫原的想法是本發(fā)明人獨(dú)創(chuàng)的。另外，上述各區(qū)域的氨基酸序列如下所述。
B1Tyr Met Leu GlyB2Ile Ile His Phe
B3Tyr Tyr Arg GluE1Gly Ser Asp Tyr Glu Asp ArgE2Arg Pro Met Asp Glu Tyr Ser上述肽也可以直接作為免疫原使用，但是如果使用將上述肽結(jié)合在匙孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)或牛血清白蛋白(BSA)等載體分子上得到的物質(zhì)作為免疫原，則抗原性提高，因此優(yōu)選。另外，也優(yōu)選使用在1個(gè)載體分子上結(jié)合多種上述肽得到的物質(zhì)作為免疫原。
除使用上述免疫原以外，可以按照常規(guī)方法制作本發(fā)明的單克隆抗體。也就是說(shuō)，可以通過(guò)用上述免疫原給動(dòng)物免疫，制作來(lái)源于免疫動(dòng)物的抗體產(chǎn)生細(xì)胞的雜交瘤，篩選產(chǎn)生與異常型朊病毒反應(yīng)但與正常型朊病毒實(shí)質(zhì)上不反應(yīng)的抗異常型朊病毒單克隆抗體的雜交瘤，由通過(guò)篩選選中的雜交瘤回收上述抗異常型朊病毒單克隆抗體進(jìn)行。使脾細(xì)胞或淋巴細(xì)胞等抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞等無(wú)限增殖化細(xì)胞融合制作雜交瘤的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。
通過(guò)利用本發(fā)明單克隆抗體和異常型朊病毒的抗原抗體反應(yīng)的免疫測(cè)定，能夠測(cè)定異常型朊病毒。另外，其中，“測(cè)定”包括檢測(cè)和定量測(cè)定兩者。免疫測(cè)定方法自身是本領(lǐng)域眾所周知的，眾所周知的任何方法均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。也就是說(shuō)，如果根據(jù)反應(yīng)形式分類(lèi)，有夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、凝集法等，如果根據(jù)標(biāo)記分類(lèi)，有酶免疫分析、放射免疫分析、熒光免疫分析等，這些方法均包括在本發(fā)明所說(shuō)的“免疫測(cè)定”中。而且，免疫組織染色、Western印跡法等也包括在本發(fā)明所說(shuō)的“免疫測(cè)定”中。
另外，這些免疫測(cè)定方法本身是眾所周知的，在本說(shuō)明書(shū)中沒(méi)有說(shuō)明的必要，如果簡(jiǎn)單記載的話，例如按照夾心法，將本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段作為第1抗體固定于固相，使之與檢體反應(yīng)，洗滌后，使之與能夠和異常型朊病毒發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的第2抗體(可以是與正常型朊病毒也發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的抗體，可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體)反應(yīng)，洗滌后，測(cè)定固相結(jié)合的第2抗體。通過(guò)預(yù)先用酶、熒光物質(zhì)、放射性物質(zhì)、生物素等標(biāo)記第2抗體，可以測(cè)定結(jié)合在固相上的第2抗體。按照上述方法對(duì)已知濃度的多種標(biāo)準(zhǔn)試樣進(jìn)行測(cè)定，基于測(cè)定的標(biāo)記量和標(biāo)準(zhǔn)試樣中異常型朊病毒量的關(guān)系制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將對(duì)于未知濃度的被測(cè)試樣的測(cè)定結(jié)果套用在該標(biāo)準(zhǔn)曲線中，可以定量被測(cè)試樣中的異常型朊病毒。另外，上述說(shuō)明中的第1抗體和第2抗體可以互換。另外，按照凝集法，將本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段固定在膠乳等粒子上，使之與檢體反應(yīng)，測(cè)定吸光度。按照上述方法對(duì)已知濃度的多種標(biāo)準(zhǔn)試樣進(jìn)行測(cè)定，基于測(cè)定的標(biāo)記量和標(biāo)準(zhǔn)試樣中異常型朊病毒量的關(guān)系制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將對(duì)于未知濃度的被測(cè)試樣的測(cè)定結(jié)果套用在該標(biāo)準(zhǔn)曲線中，可以定量被測(cè)試樣中的異常型朊病毒。
另外，各免疫測(cè)定所必要的試劑類(lèi)也是眾所周知的，除了單克隆抗體具有特征以外，可以使用常規(guī)的免疫測(cè)定試劑盒進(jìn)行免疫測(cè)定。例如通常包括緩沖液、固相、標(biāo)記第2抗體等。
以下，結(jié)合實(shí)施例更具體地說(shuō)明本發(fā)明。但是，本發(fā)明并不受下述
(1)免疫原的制作Korth等人報(bào)道指出，以采用基因重組方法使牛朊病毒蛋白質(zhì)表達(dá)得到的重組抗原作為免疫原，解析抗體識(shí)別部位(表位，epitope)，朊病毒蛋白質(zhì)的主要抗原部位為上述E1區(qū)域、E2區(qū)域和E3區(qū)域3處(Kroth等，與上述相同)?；谠摻Y(jié)果，推測(cè)正常型朊病毒蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)，認(rèn)為雖然E2和E3接近，但是與E1存在距離。與此相對(duì)，如果推測(cè)如上所述采取β折疊結(jié)構(gòu)的情況，認(rèn)為由于E1采取環(huán)結(jié)構(gòu)，在形成新出現(xiàn)的2根β鏈(B2、B3)的同時(shí)，形成新的表位。因此，按照常規(guī)方法化學(xué)合成連結(jié)E1區(qū)域和B2、B3區(qū)域的E1B1肽(序列號(hào)1)以及包括E2區(qū)域的E2-1肽(序列號(hào)2)，再按照常規(guī)方法將其結(jié)合在KLH上(上述兩者肽結(jié)合在單一的KLH分子上)，使用得到的結(jié)合體作為免疫原。
(2)免疫和細(xì)胞融合將濃度0.5～1.0mg/mL的免疫原懸濁于等量的弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant)中，給BALB/C小鼠免疫2至3次，每次0.2～0.3mL/mouse。最終免疫3至4日后，摘出脾臟，將細(xì)胞分散后，采用聚乙二醇法與P3U1骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。
通過(guò)在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)，選擇雜交瘤后，使用將上述各合成肽結(jié)合在牛血清白蛋白(BSAbovine serum albumin)上得到的抗原，按照ELISA法進(jìn)行抗體產(chǎn)生細(xì)胞的篩選。也就是說(shuō)，采集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，分別注入固定有BSA結(jié)合體的ELISA板(96孔型)中，使之反應(yīng)后洗滌，再使辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗小鼠Ig(IgG+IgM)反應(yīng)，通過(guò)顯色反應(yīng)確認(rèn)有無(wú)抗體產(chǎn)生細(xì)胞。表1表示采用ELISA法得到的陽(yáng)性數(shù)。
表1

(3)異常型朊病毒特異反應(yīng)性單克隆抗體的篩選為了確認(rèn)抗體的特異性，由GSS(Gerstmann Straussler綜合癥)患者的腦制作腦的薄切片，利用免疫組織學(xué)檢索討論反應(yīng)性。標(biāo)本使用進(jìn)行了酸高壓處理作為預(yù)處理的物質(zhì)以及沒(méi)有進(jìn)行預(yù)處理的物質(zhì)，選擇對(duì)異常型朊病毒蛋白質(zhì)特異反應(yīng)的抗體無(wú)性系。另外，作為對(duì)照，使用對(duì)正常人腦的薄切片進(jìn)行酸高壓處理得到的物質(zhì)以及沒(méi)有進(jìn)行這種處理的物質(zhì)，確認(rèn)沒(méi)有反應(yīng)。該免疫組織染色的操作具體詳細(xì)敘述如下。
1、用二甲苯使組織片脫石蠟后，階段性地降低醇濃度，進(jìn)行水合。
2、用蒸餾水洗滌5分鐘。
3、浸漬于0.3％過(guò)氧化氫-甲醇溶液中，使之反應(yīng)30分鐘，除去內(nèi)因性過(guò)氧化物酶。
4、用生理磷酸緩沖液洗滌5分鐘。
5、將需要進(jìn)行酸高壓處理的組織片浸漬于10～1000mM鹽酸溶液中，在121℃下進(jìn)行高壓處理20分鐘。
6、在室溫下使之與用生理磷酸緩沖液稀釋到5％的家兔血清反應(yīng)30分鐘。
7、除去多余的血清，在室溫下使之與雜交瘤培養(yǎng)液反應(yīng)1小時(shí)。
8、用生理磷酸緩沖液洗滌5分鐘。
9、在室溫下使之與稀釋的生物素化抗小鼠免疫球蛋白家兔抗體反應(yīng)1小時(shí)。
10、用生理磷酸緩沖液洗滌5分鐘。
11、在室溫下使之與稀釋的ABC試劑(Vector公司制)反應(yīng)30分鐘。
12、用生理磷酸緩沖液洗滌5分鐘。
13、在室溫下使之與過(guò)氧化物酶基質(zhì)溶液反應(yīng)5～30分鐘。
14、用蒸餾水洗滌。
15、用Lillie-Mayer蘇木精進(jìn)行對(duì)比染色后，進(jìn)行洗滌、密封。
通過(guò)上述操作選擇的細(xì)胞株如表2所示。
表2

(表中，高壓處理一行中，+表示進(jìn)行了高壓處理，-表示沒(méi)有進(jìn)行高壓處理，各單克隆抗體的行中，+表示陽(yáng)性，-表示陰性，+W表示弱陽(yáng)性)(4)結(jié)果以上結(jié)果，得到了與異常型朊病毒反應(yīng)，但與正常型朊病毒實(shí)質(zhì)上不反應(yīng)，能夠識(shí)別這兩者的單克隆抗體。產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤EBEB4C3Ebb如上所述保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所，其保藏號(hào)為FERM BP-7808。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的單克隆抗體由于與異常型朊病毒發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，但與和正常型朊病毒實(shí)質(zhì)上不反應(yīng)的抗異常型朊病毒不發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，因而按照本發(fā)明，首次能夠進(jìn)行異常型朊病毒的免疫測(cè)定。因此，認(rèn)為本發(fā)明對(duì)感染了牛海綿狀腦病的?；蚱渌鼊?dòng)物的診斷以及CJD的診斷作出了很大的貢獻(xiàn)。
序列表<110>富士瑞必歐株式會(huì)社<120>抗異常型朊病毒單克隆抗體，其制造方法，以及使用其的免疫測(cè)定方法<130>01PF231<160>7<210>1<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>作為用于產(chǎn)生抗異常型朊病毒單克隆抗體的免疫原而使用的肽<400>1Ile Ile His Phe Gly Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu1 5 10 15<210>2<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>作為用于產(chǎn)生抗異常型朊病毒單克隆抗體的免疫原而使用的肽<400>2Val Tyr Try Arg Pro Met Asp Glu Tyr Ser Asn Cys1 5 10<210>3<211>4<212>PRT<213>人<400>3Tyr Met Leu Gly1<210>4<211>4<212>PRT<213>人<400>4Ile Ile His Phe1<210>5<211>4<212>PRT<213>人<400>5Tyr Tyr Arg Glu1<210>6<211>7<212>PRT<213>人<400>6Gly Ser Asp Tyr Glu Asp Arg1 5<210>7<211>7<212>PRT<213>人<400>7Arg Pro Met Asp Glu Tyr Ser1 權(quán)利要求
1.一種抗異常型朊病毒單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段，其與異常型朊病毒反應(yīng)，但與正常型朊病毒實(shí)質(zhì)上不反應(yīng)。
2.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段，在免疫組織染色中，與異常型朊病毒反應(yīng)，但與正常型朊病毒不反應(yīng)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段，與未進(jìn)行預(yù)處理的異常型朊病毒反應(yīng)。
4.如權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段，其來(lái)源于將含有序列號(hào)2所示氨基酸序列的肽結(jié)合在載體上得到的物質(zhì)作為免疫原進(jìn)行了免疫的動(dòng)物。
5.一種單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段，由雜交瘤EBEB4C3Ebb(FERM BP-7808)產(chǎn)生。
6.如權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段，為單克隆抗體。
7.一種雜交瘤，產(chǎn)生權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的單克隆抗體。
8.一種測(cè)定異常型朊病毒的方法，利用權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)所述的單克隆抗體與異常型朊病毒的抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行免疫測(cè)定，從而測(cè)定異常型朊病毒。
9.用于進(jìn)行權(quán)利要求8所述的方法的免疫測(cè)定用試劑盒，其中包括權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段。
10.權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)所述的抗異常型朊病毒單克隆抗體的制造方法，包括用具有下述肽的免疫原給動(dòng)物免疫，所述肽本質(zhì)上由將異常型朊病毒的一級(jí)氨基酸序列中不連續(xù)的多個(gè)區(qū)域連結(jié)而成的區(qū)域構(gòu)成；制作來(lái)源于免疫動(dòng)物的抗體產(chǎn)生細(xì)胞的雜交瘤；篩選產(chǎn)生與異常型朊病毒反應(yīng)但與正常型朊病毒實(shí)質(zhì)上不反應(yīng)的抗異常型朊病毒單克隆抗體的雜交瘤；由通過(guò)篩選選擇出的雜交瘤回收上述抗異常型朊病毒單克隆抗體。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，上述免疫原是將上述肽結(jié)合在載體上得到的物質(zhì)。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，上述免疫原是將多種上述肽結(jié)合在載體上得到的物質(zhì)。
13.如權(quán)利要求10至12中任意一項(xiàng)所述的方法，上述肽包括將選自E1區(qū)域、E2區(qū)域、B1區(qū)域、B2區(qū)域和B3區(qū)域中的2個(gè)以上區(qū)域連結(jié)而成的區(qū)域。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，上述肽具有序列表中序列號(hào)1所示的氨基酸序列。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，上述免疫原是將具有序列表中序列號(hào)1所示的氨基酸序列的肽以及具有序列號(hào)2所示的氨基酸序列的肽結(jié)合在載體上得到的物質(zhì)。
16.按照權(quán)利要求10至15中任意一項(xiàng)所述的方法制造的抗異常型朊病毒單克隆抗體。
17.權(quán)利要求10至15中任意一項(xiàng)所述的方法中使用的免疫原。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了能夠識(shí)別正常型朊病毒和異常型朊病毒的單克隆抗體及其制造方法。本發(fā)明的抗異常型朊病毒單克隆抗體與異常型朊病毒反應(yīng)，但與正常型朊病毒實(shí)質(zhì)上不反應(yīng)。本發(fā)明的抗異常型朊病毒單克隆抗體可以通過(guò)使用具有下述肽的免疫原得到，所述肽包含將異常型朊病毒的一級(jí)氨基酸序列中不連續(xù)的多個(gè)區(qū)域連結(jié)而成的區(qū)域。
文檔編號(hào)C12N15/02GK1479748SQ01820260
公開(kāi)日2004年3月3日 申請(qǐng)日期2001年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月8日
發(fā)明者倉(cāng)野義裕, 梅谷淳, 宮腰秀夫, 柳谷孝幸, 夫, 幸 申請(qǐng)人:富士瑞必歐株式會(huì)社